CN112533624A - 用于治疗癌症的pla2-g1b辅因子抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用PLA2‑GIB辅因子的抑制剂治疗哺乳动物，特别是人类受试者中癌症的新的治疗方法。

Description

用于治疗癌症的PLA2-G1B辅因子抑制剂

本发明涉及治疗或预防哺乳动物，尤其人类受试者中癌症的新的治疗方法。本发明提供基于抑制各种病原体在哺乳动物中起作用的新的机制的治疗方法。本发明可单独或与其他治疗组合用于预防性或治愈性方法中，并且适合于对抗任何癌症。

引言和背景

发明人已证明sPLA2-GIB与HIV感染的患者中CD4 T细胞的失活有关(参见WO2015/097140)。因此，发明人提议且证明sPLA2-GIB调节剂对治疗哺乳动物的疾病，例如与免疫缺陷有关的病症有效。

继续进行其研究，申请人现已发现sPLA2-GIB的作用可由患病的受试者中存在的辅因子介导及/或放大，且此类辅因子通过gC1q受体在T细胞表面起作用。具体而言，本发明人现已显示病原体产生或激活结合至gC1qR的辅因子，从而使CD4 T细胞对经极低剂量的sPLA2-GIB的失活敏感。在感染此类病原体的患者中，CD4 T细胞变得对经生理量的sPLA2-GIB的失活敏感，而在非感染受试者中，CD4 T细胞仍保持对经此类生理浓度的sPLA2-GIB的失活有抗性。本发明人已鉴别来自包括病毒或细菌(诸如HIV、HCV或金黄色葡萄球菌(S.aureus))的各种病原体的此类结合gC1qR的辅因子。申请人还证实所述辅因子可使CD4T细胞对经sPLA2-GIB的失活敏感，且体内阻断此类辅因子可恢复或维持CD4 T细胞对经sPLA2-GIB的失活有抗性。申请人因此鉴别一种新的通用机制，许多病原体通过该机制，即通过诱导CD4 T细胞对经PLA2-GIB的失活敏感而在哺乳动物中诱发疾病或病理性状况。此类出人意料的发现允许申请人提供新的治疗方法，该方法基于此类辅因子的调节，诸如其阻断或抑制，由此阻止、避免或至少降低许多病原体的病原性作用。

发明概述

本发明的一个目的为提供治疗哺乳动物受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用PLA2-GIB辅因子的抑制剂。

本发明的另一目的为PLA2-GIB辅因子的抑制剂，其用于治疗哺乳动物受试者中的癌症。

本发明的另一目的涉及PLA2-GIB辅因子的抑制剂在制备用于治疗哺乳动物受试者中癌症的药物中的用途。

抑制剂可单独使用或与任何其他活性剂组合使用。具体而言，抑制剂可以用于具有至少一种其他抗癌治疗的联合疗法或治疗方案中。

本发明可用于任何哺乳动物，尤其人类受试者中。

附图说明

图1.病毒血症血浆含有导致CD4 T细胞对PLA2-GIB活性敏感的辅因子。A-使从4个健康供体纯化的CD4 T细胞持续30分钟暴露于含5nM或75nM PLA2-GIB(GIB)或不含PLA2-GIB(w/o GIB)的PBS BSA1％缓冲液(缓冲液)、先前用抗PLA2-GIB抗体进行消减以去除CD4T细胞上的内源性PLA2-GIB活性的1％的健康供体血浆(pHD)或病毒血症患者血浆(pVP)中。然后用IL-7处理细胞15分钟且通过共聚焦显微术评估pSTAT5的核易位(pSTAT5 NT)。结果呈现经缓冲液中响应于IL-7的pSTAT5 NT标准化的pSTAT5 NT的百分比。使用未配对的t检验将病毒血症患者血浆对5nM PLA2-GIB的作用的统计分析与健康供体血浆相比。B-使纯化的CD4 T细胞暴露于先前用抗PLA2-GIB抗体进行消减的1％的健康供体血浆(pHD)或病毒血症患者血浆(pVP)，且分级成分子量为大于及小于30kDa和大于及小于10kDa或在30kDa与10kDa之间的各别级分。

图2.AT-2失活的HIV-1颗粒导致CD4 T细胞对PLA2-GIB活性敏感。用PBS BSA1％缓冲液、HIV-1AT-2失活的颗粒或模拟对照的类似稀释液将纯化的CD4 T细胞预处理15分钟。HIV-1颗粒以5000、500、50及5pg的p24/10e⁶个细胞使用，其分别表示1、0.1、0.01及0.001的感染复数(MOI)。然后将细胞用含5nM、75nM或250nM PLA2-GIB的PBS BSA1％处理30分钟或不处理作为PLA2-GIB抑制条件的对照，或用5nM具有HIV-1颗粒或模拟的PLA2-GIB处理或不处理。然后用IL-7处理细胞15分钟且通过共聚焦显微术评估pSTAT5的核易位(pSTAT5 NT)。结果为在大于3个独立区域上计算的响应于IL-7的pSTAT5 NT的百分比及SEM变化。在具有GIB相对于无PLA2-GIB的IL-7处理的条件之间，**p<0.01且***p<0.001。在具有逐渐增加量的HIV-1颗粒和5nM的PLA2-GIB的条件之间，#p<0.05、###p<0.001。使用未配对的t检验及韦尔奇校正(Welch’s correction)进行统计分析。

图3.重组gp41蛋白质导致CD4 T细胞对PLA2-GIB关于响应于IL-7的pSTAT5 NT的抑制活性敏感。A-重组gp41蛋白质对PLA2-GIB关于响应于IL-7的pSTAT5 NT的活性的剂量作用。来自健康供体的纯化CD4 T细胞用若干量的gp41或缓冲液(PBS BSA1％)预处理15分钟，在有5nM PLA2-GIB(GIB)或无PLA2-GIB(w/o GIB)下温育30分钟且用IL-7刺激15分钟。通过共聚焦显微术分析pSTAT5 NT。B.关于用0.5μg/ml的gp41处理15分钟，用5nM的PLA2-GIB处理30分钟(GIB)或不用PLA2-GIB处理(w/o GIB)且用IL-7刺激15分钟的CD4 T细胞的3个独立健康供体的实验的概述。A和B，结果呈现经缓冲液中响应于IL-7的pSTAT5 NT标准化的pSTAT5 NT的抑制百分比。用未配对的t检验对gp41和5nM PLA2-GIB相对于无PLA2-GIB的单独gp41的抑制的差异进行统计分析，**意指p<0.01。

图4.用抗gp41抗体对病毒血症患者血浆进行免疫消减消除PLA2-GIB对CD4 T细胞中的pSTAT5 NT的抑制活性(即恢复CD4 T细胞对经PLA2-GIB失活的抗性)。来自3个独立健康供体的纯化CD4 T细胞在3个独立实验中持续30分钟用单独PLA2-GIB(作为对PLA2-GIB敏感的阳性对照)、先前用抗gp41多克隆抗体(pAb抗gp41)、对照多克隆抗体(pAb ctrl)进行消减或无抗体处理(仅)的健康供体(HD)血浆或病毒血症患者(VP)血浆处理，且用IL-7刺激15分钟。结果呈现pSTAT5 NT抑制百分比，对于PLA2-GIB，该百分比经缓冲液中响应于IL-7的pSTAT5 NT标准化，或对于病毒血症患者血浆处理的样品，该百分比经健康供体血浆的相同百分比标准化。在pAb ctrl相对于pAb抗gp41处理的病毒血症血浆的pSTAT5 NT抑制的差异的未配对的t检验下，***意指p<0.001。

图5.PEP3肽诱导对PLA2-GIB关于用IL-7刺激的CD4 T细胞中的pSTAT5 NT的抑制活性敏感。A-所研究的PEP3和对照(CTL)肽的氨基酸序列。B-PEP3和CTL肽对关于响应于IL-7的pSTAT5 NT抑制百分比的PLA2-GIB活性的剂量作用。来自健康供体的纯化CD4 T细胞用若干量的PEP3或CTL肽或缓冲液(PBS BSA1％)预处理15分钟，在有5nM PLA2-GIB(5nM G1B)或无(w/o G1B)下温育30分钟且用IL-7刺激15分钟。通过共聚焦显微术分析pSTAT5 NT。C-关于用0.5μg/ml的PEP3在有5nM的PLA2-GIB(G1B 5nM)或无(w/o G1B)下处理45分钟且用IL-7刺激15分钟的CD4 T细胞的3个独立健康供体的实验的概述。B和C，结果呈现经缓冲液中响应于IL-7的pSTAT5 NT标准化的pSTAT5 NT抑制百分比。用未配对的t检验对PEP3和5nMPLA2-GIB相对于无PLA2-GIB下单独PEP3的抑制的差异进行统计分析，*意指p<0.05。

图6.gC1qR在C1q和PEP3对PLA2-GIB的辅因子活性中起关键作用，且与病毒血症患者血浆抑制活性有关。A-C1q对PLA2-GIB具有辅因子活性，且针对gC1qR的60.11以及74.5.2抗体阻断CD4 T细胞上的C1q PLA2-GIB辅因子活性。纯化的CD4 T细胞在60.11、74.5.2或小鼠对照IgG1(IgG1 ctrl)下或在无抗体(w/o)下预温育，用10μg/ml的C1q在无(w/o)或有5nMPLA2-GIB(G1B 5nM)下处理，且分析响应于IL-7的pSTAT5 NT。B-抗gC1qR 74.5.2抗体，而非60.11抗体阻断CD4 T细胞上的PEP3肽PLA2-GIB辅因子活性。细胞如A中一般用0.5μg/mlPEP3在无(w/o)或有5nM PLA2-GIB(G1B 5nM)下处理。C-抗gC1qR 74.5.2抗体，而非60.11抗体，降低用IL-7刺激的CD4 T细胞中的pSTAT5 NT的抑制。细胞如A中一般用抗gC1qR或对照抗体预处理，用1％或3％病毒血症患者(pVP)或健康供体(pHD)血浆处理45分钟且分析响应于IL-7的pSTAT5 NT。在一个代表性实验中，A、B和C中的结果呈现为pSTAT5 NT抑制百分比±SEM，其在A中经在IgG1 ctrl和5nM G1B与C1q下，或在B中经在PEP3下和在C中经在IgG1ctrl与1％或3％的病毒血症患者血浆下的抑制百分比标准化。统计分析是至少三个独立区域上不同条件下未配对的t检验和韦尔奇校正的结果。在各实验条件下，在A和B中，在有PLA2-GIB相对于无PLA2-GIB下，或在C中，在有各百分比的病毒血症患者血浆相对于有相同百分比的健康供体血浆下，#p<0.05、##p<0.01和###p<0.001。在各实验条件中，相对于用对照IgG1抗体处理的细胞，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

图7.gp41增加CD4 T细胞膜上的PLA2-GIB酶活性。使用[3H]花生四烯酸标记的纯化的CD4 T细胞暴露于若干浓度的单独重组gp41或连同63nM、200nM的PLA2-GIB、或暴露于PLA2-GIB但无gp41(仅培养基)。结果呈现为各gp41浓度一式三份由于通过PLA2-GIB的[3H]花生四烯酸的释放所致的刺激减去单独培养基中的活性的平均值cpm/ml±SEM，且表示具有类似结果的4个独立实验中的一个实验。统计分析是未配对的t检验，在有gp41和PLA2-GIB相对于单独PLA2-GIB的实验条件之间，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

图8.HCV核心蛋白质增加CD4 T细胞膜上的PLA2-GIB酶活性。A-HCV核心蛋白质对[3H]花生四烯酸释放和PLA2-GIB酶活性的剂量作用。使用[3H]花生四烯酸标记的纯化的CD4 T细胞暴露于若干浓度的单独HCV核心蛋白质(仅HCV核心)或连同63nM、200nM的PLA2-GIB、或暴露于PLA2-GIB而无HCV核心(仅缓冲液)。结果呈现为一个实验的各蛋白质浓度一式两份由于通过PLA2-GIB的[3H]花生四烯酸的释放所致的刺激减去单独有缓冲液的培养基中的活性的平均值cpm/ml。B-HCV核心蛋白质增加PLA2-GIB活性。使用[3H]花生四烯酸标记的纯化的CD4 T细胞暴露于10μg/ml的单独HCV核心蛋白质(0nM)或连同63nM、200nM的PLA2-GIB、或暴露于PLA2-GIB但无HCV核心(缓冲液，等效于10μg/ml)。结果呈现为三个独立实验在一式三份由于通过PLA2-GIB的[3H]花生四烯酸的释放所致的刺激减去单独有缓冲液(等效于10μg/ml的HCV核心蛋白质)的培养基中的活性下的平均值cpm/ml±SEM。统计分析是未配对的t检验，分别在具有单独HCV核心蛋白质或连同PLA2-GIB相对于单独培养基或于缓冲液中的PLA2-GIB的实验条件之间，***p<0.001。

图9.金黄色葡萄球菌蛋白质A(SA蛋白质A)增加CD4 T细胞膜上的PLA2-GIB酶活性。使用[3H]花生四烯酸标记的纯化的CD4 T细胞暴露于若干浓度的单独SA蛋白质A(w/oG1B)或连同63nM、200nM的PLA2-GIB、或暴露于PLA2-GIB但无SA蛋白质A。A-SA蛋白质A增加基础和PLA2-GIB诱导的[3H]花生四烯酸释放。结果呈现为3个独立实验在一式三份由于通过单独SA蛋白质A或连同PLA2-GIB的[3H]花生四烯酸释放所致的刺激下的平均值cpm/ml±SEM。统计分析是未配对的t检验，在具有单独SA蛋白质A相对于单独培养基的实验条件之间，##p<0.01和###p<0.001，且在具有SA蛋白质A连同PLA2-GIB相对于单独PLA2-GIB的实验条件之间，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。B-SA蛋白质A增加CD4 T细胞上的PLA2-GIB活性。结果呈现为由3个独立实验在一式三份用SA蛋白质A和PLA2-GIB的刺激减去用单独SA蛋白质A或单独培养基的刺激下所获得的PLA2-GIB活性所致的平均值cpm/ml±SEM。在具有SA蛋白质A连同PLA2-GIB相对于单独PLA2-GIB的实验条件之间，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

图10.对CD4 T细胞膜上的PLA2-GIB活性的gp41和其他辅因子作用的简化模型。使诸如HIV-1颗粒、gp41、PEP3、C1q、HCV核心或SA蛋白质A的PLA2-GIB辅因子与gC1qR结合，触发细胞内囊泡的胞吐作用。这些囊泡与浆膜的融合改变脂质组合物，且引起CD4 T细胞膜上的PLA2-GIB活性。由于PLA2-GIB活性，膜流动性增加且细胞因子受体聚集于异常膜域中，从而使得细胞因子信号传导显著降低且使得CD4 T细胞无反应。

图11.PEP3对PLA2GIB具有辅因子作用。

图12.PEP3结合gC1qR。

图13.gC1qR与PEP3辅因子作用有关。

图14.HCV核心蛋白质对PLA2-GIB具有辅因子作用。

图15.牙龈卟啉单胞菌对PLA2-GIB具有辅因子作用。

图16.来自胰脏癌患者的血浆对PLA2GIB具有辅因子作用。

表1.含有可充当PLA2-GIB辅因子的潜在gC1qR结合元件的蛋白质。

表2.可充当PLA2-GIB辅因子的gC1qR配体的清单。

表3.含有潜在gC1qR结合元件的来自人类病原体的蛋白质。该表源自表1且列举可充当PLA2-GIB辅因子的来自人类病原体的蛋白质和肽及相关疾病。

发明详述

本发明通常涉及用于治疗有此需要的哺乳动物受试者的新的治疗性组合物和方法，其包括施用调节PLA2-GIB辅因子的治疗。治疗可包含施用辅因子本身；或辅因子的激活剂、激动剂或模拟表位；或辅因子的抑制剂或免疫原。此类治疗优选以直接或间接调节PLA2-GIB对CD4 T细胞的作用的方式进行(且优选以直接或间接调节PLA2-GIB对CD4 T细胞的作用的量施用治疗)，通常以可维持或恢复受试者中CD4 T细胞对经PLA2-GIB的失活有抗性或导致受试者中CD4 T细胞对经PLA2-GIB的失活敏感的方式进行。

定义

如本文所用，术语“PLA2-GIB”(或“PLA2-G1B”)表示基团IB胰腺磷脂酶A2。PLA2-GIB已得以鉴别且克隆自各种哺乳动物物种克隆。人类PLA2-GIB蛋白质公开于例如Lambeau和Gelb(2008)中。序列可以Genbank号NP_000919获得。

以下显示示例性人类PLA2-GIB的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。

SEQ ID NO:1的氨基酸1至15(加下划线)是信号序列，且SEQ ID NO:1的氨基酸16至22(呈粗体)是前肽序列。

在本发明的上下文内，术语“PLA2-GIB”优选表示人类PLA2-GIB。

人类PLA2-GIB蛋白质可以两种不同形式存在：前形式(前-sPLA2-GIB)，其通过前肽的蛋白水解裂解激活，产生成熟分泌形式(sPLA2-GIB)。术语PLA2-GIB包括任何形式的蛋白质，诸如前形式和/或成熟形式。通常，成熟分泌形式包含SEQ ID NO:1或其任何天然变体的氨基酸残基23-148的序列。

蛋白质的天然变体包括例如由多态性或剪接产生的变体。天然变体还可包括包含SEQ ID NO:1的序列，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基23-148的序列和一个或若干个(通常1、2或3个)氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失的任何蛋白质。变体包括与SEQ ID NO:1具有例如至少90％氨基酸序列一致性的天然存在的变体。特定变体与SEQ IDNO:1相比含有一个或若干个(通常1、2或3个)氨基酸残基的不超过10个氨基酸取代、添加和/或缺失。典型天然存在的变体保留PLA2-GIB的生物活性。就此而言，在一些实施方案中，PLA2-GIB具有至少一种选自以下的活性：诱导来自健康受试者的CD4 T细胞中的膜微结构域(MMD)形成，或使健康受试者的CD4T细胞难以进行白介素信号传导，诸如难以进行IL-2信号传导或难以进行IL-7信号传导或难以进行IL-4信号传导。在一些实施方案中，使健康受试者的CD4 T细胞难以进行白介素-7信号传导包含所述细胞中的STAT5A和/或B磷酸化降低至少约10％、至少约20％、至少约30％或至少约40％。在一些实施方案中，使健康受试者的CD4 T细胞难以进白介素-7信号传导包含磷酸-STAT5A和/或磷酸-STAT5B的核易位速率降低至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。

术语“序列一致性”在应用于核酸或蛋白质序列时是指使用标准化算法对比对的至少两个序列之间的核苷酸或氨基酸残基匹配的定量化(通常百分比)，该标准化算法诸如Smith-Waterman比对(Smith和Waterman(1981)J Mol Biol 147:195-197)、CLUSTALW(Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res 22:4673-4680)或BLAST2(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res 25:3389-3402)。BLAST2可以标准化和可再现方式用以在序列之一中插入空位以优化比对且在其之间获得更有意义的比较。

关于CD4 T细胞的术语“失活”指示此类细胞失去其至少一部分有助于发生有效免疫应答的能力。失活可为部分或完全、瞬时或永久的。失活优选表示CD4 T细胞的功能，尤其pSTAT5核易位和/或CD4 T细胞免疫刺激活性降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。通常，无活性的CD4 T细胞并无有效pSTAT5核易位。在一个具体的实施方案中，无活性的CD4 T细胞为无反应性CD4 T细胞。

术语CD4 T细胞对经sPLA2-GIB的失活“有抗性”(或“不敏感”)指示在本发明的上下文内，CD4 T细胞在体外在5nM sPLA2-GIB存在下温育时基本上不是失活的。有抗性指示例如CD4 T细胞在体外在5nM sPLA2-GIB和白介素-7存在下温育时保留pSTAT5的活性核易位。CD4 T细胞对sPLA2-GIB有抗性(或不敏感)还可指示在体外与5nM PLA2-GIB一起温育的CD4 T细胞仍保持免疫功能，例如并不变得无反应性。

辅因子作用

本发明人已发现许多病原体通过使CD4 T细胞对经PLA2-GIB的失活敏感而起作用。据信此类机制涉及(诱导)使病原体的分子结合至CD4 T细胞表面的gC1qR，导致CD4 T细胞对经生理浓度的PLA2-GIB的失活敏感。具体而言，分析通过PLA2-GIB使CD4 T细胞失活的机制，本发明人发现gC1qR的激动剂使CD4 T细胞对低剂量的PLA2-GIB敏感。因而，在此类辅因子和生理量的PLA2-GIB存在下，CD4 T细胞变为无活性的(例如无反应性)，而在仅生理量的PLA2-GIB存在下其保持活性。本发明人证实gC1qR的天然配体gC1q展现此类辅因子作用，且抗gC1q抗体可阻断此类辅因子作用。本发明人还出人意料地发现，包括病毒和细胞的许多病原体实际上含有或产生或激活使得CD4 T细胞对经sPLA2-GIB的失活敏感的此类辅因子。具体而言，本发明人已显示(i)HCV核心蛋白质可结合gC1qR，且导致CD4 T细胞对经sPLA2-GIB的失活敏感，(ii)葡萄球菌蛋白质A可结合gC1qR且导致CD4 T细胞对经sPLA2-GIB的失活敏感，(iii)HIV gp41可结合gC1qR且导致CD4 T细胞对经sPLA2-GIB的失活敏感，和(iv)来自癌症患者的血浆导致CD4 T细胞对经sPLA2-GIB的失活敏感。

申请人因此鉴别出一种新的通用机制，许多病原体通过该机制，即通过产生或激活诱导CD4 T细胞对经PLA2-GIB的失活敏感的辅因子而在哺乳动物中诱发疾病或病理性状况或(至少暂时性)免疫缺陷。本发明人尤其发现癌症中的PLA2GIB辅因子，表明此类机制还与癌症的发生和发展有关。此类出人意料的研究结果允许申请人基于所述机制的调节(例如阻断或抑制或刺激)提供新的治疗方法，由此阻止、避免或至少降低许多病原体的病原性作用，或诱导免疫抑制。

因此本发明的目的为提供用于治疗哺乳动物受试者中癌症的方法和组合物，其包括向受试者施用PLA2-GIB辅因子的抑制剂。

本发明的另一目的涉及PLA2-GIB辅助因子的抑制剂，其用于治疗哺乳动物受试者中的癌症。

本发明的进一步的目的为提供用于恢复/维持患有癌症的哺乳动物中CD4 T细胞对经PLA2-GIB的失活有抗性的方法和组合物。

本发明还涉及PLA2-GIB辅因子的抑制剂在制备用于治疗有此需要的受试者中的癌症的药物中的用途。

PLA2-GIB辅因子

本发明人已出人意料地发现，许多不同类型的病原体充当(或产生或激活)PLA2-GIB的辅因子，该PLA2-GIB的辅因子与PLA2-GIB组合导致CD4 T细胞的失活。具体而言，如图8所示，HCV核心蛋白质导致CD4 T细胞对经低浓度的sPLA2-GIB的失活敏感。类似地，如图9所示，葡萄球菌蛋白质A导致CD4 T细胞对经低浓度的sPLA2-GIB的失活敏感，且如图3-7所示，HIV gp41导致CD4 T细胞对经低浓度的sPLA2-GIB的失活敏感。图15显示来自牙龈卟啉单胞菌的肽具有PLA2GIB辅因子作用，且图16进一步表明来自癌症患者的血浆具有PLA2GIB辅因子作用。本发明人已进一步发现这些辅因子分子是gC1qR的配体，且抑制其与gC1qR结合还抑制辅因子作用(图6B和6C)。

本发明人因此鉴别通过病原体和/或在病原性状况中产生的可结合gC1qR且充当sPLA2-GIB的辅因子的各种分子。

在本发明的上下文内，术语PLA2-GIB的“辅因子”因此表示增强或放大或介导PLA2-GIB的作用，尤其PLA2-GIB对CD4 T细胞的作用的任何分子或药剂。优选辅因子是可使CD4 T细胞对经低浓度的PLA2-GIB的失活敏感的分子。

在本发明的一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是gC1qR的配体。本发明人确实已表明，CD4 T细胞表面的gC1qR的配体充当PLA2-GIB的辅因子，从而使细胞对经PLA2-GIB的失活更敏感。更具体而言，PLA2-GIB辅因子是gC1qR的激动剂，例如可经由gC1qR诱导信号传导，更具体而言可诱导gC1qR介导的胞吐作用。

在这方面，本发明人已鉴别可充当PLA2-GIB的辅因子的各种蛋白质，如表1-3中所列举。在本发明的一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是选自表1或2的蛋白质的蛋白质或此类蛋白质的gC1qR结合元件。更具体而言，辅因子可为包含SEQ ID NO:2-44中的任一个或选自ID NO:45-71的蛋白质，更优选地选自SEQ ID NO:3、43、44和ID 45-61中的任一个，甚至更优选地选自SEQ ID NO:3、43、44和ID 45-55中的任一个或其任何片段或模拟表位的任何蛋白质。

关于此类辅因子的术语“片段”优选表示含有此类蛋白质的gC1qR结合元件的片段和/或保留结合gC1qR能力的片段。优选片段含有至少5个，通常5与100个之间的连续氨基酸残基。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是病原体的组分或营养物，优选来自病原体的蛋白质或肽。在一个更具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是病毒或细菌或真菌或寄生物蛋白质或肽。此类辅因子的优选实例列举于表2和3中。

在一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是HCV核心蛋白质或其片段或模拟表位。在一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:43组成的蛋白质或肽或其模拟表位或片段。

SEQ ID NO:43

GenBank:ARQ19013.1

MSTNPKPQRKTKRNTIRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGMGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYVPLVGAPLGGAARALAHGVRALEDGVNYATGNLPGCSFSISLWXLLSCLTIPASA

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是葡萄球菌蛋白质A或其片段或模拟表位。在一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:44组成的蛋白质或肽或其模拟表位或片段。

SEQ ID NO:44

NCBI参考序列：YP_498670.1

MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是HIV gp41或rev，或其片段或模拟表位。在一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:3或ID NO:51组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与HIV感染有关。

SEQ ID NO:3

GenBank参考号AAC31817.1

AAIGALFLGFLGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSGIVQQQNNLLRAIESQQHMLRLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGFWGCSGKLICTTTVPWNASWSNKSLDDIWNNMTWMQWEREIDNYTSLIYSLLEKSQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIKIFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSLQTRPPVPRGPDRPEGIEEEGGERDRDTSGRLVHGFLAIIWVDLRSLFLLSYHHLRDLLLIAARIVELLGRRGWEVLKYWWNLLQYWSQELKSSAVSLLNAAAIAVAEGTDRVIEVLQRAGRAILHIPTRIRQGLERALL

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:45组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与EBV感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:46组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与腺病毒感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:47组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与汉坦病毒(Hantaan virus)感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:48组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与HSV感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:49或50组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与风疹病毒(Rubella virus)感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:52组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:53组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与肺炎链球菌(S.pneumoniae)感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:54组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与蜡状芽孢杆菌(B.cereus)感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:55组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)感染有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:7或8组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与牙龈卟啉单胞菌有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:14组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与奇异变形杆菌(P.mirabilis)有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:18组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与韦氏钩端螺旋体菌株(L.weilii str)有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:28组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与甘油利用泰瑞孢子菌(T.glycolicus)有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:29或30组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与脆弱拟杆菌(B.fragilis)有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:33组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与光滑假丝酵母(C.glabrata)有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:38组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与伴放线凝聚杆菌(A.actinomycetemcomitans)有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:41组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与索氏卟啉单胞菌(P.somerae)有关。

在另一个具体的实施方案中，PLA2-GIB辅因子是包含或由SEQ ID NO:42组成的蛋白质或肽或其片段或模拟表位。此类辅因子尤其与嗜沫凝集杆菌(A.aphrophilus)有关。

辅因子的其他说明性实例是癌症患者血浆中的分子或药剂，或其变体或衍生物，其可对PLA2GIB发挥辅因子作用。

调节辅因子作用的治疗

本发明提供使用PLA2-GIB辅因子的抑制剂治疗受试者中的癌症和/或恢复/增强患有癌症的受试者的CD4 T细胞活性的方法和组合物。

术语PLA2-GIB辅因子的“抑制剂”在本发明的上下文内表示可直接或间接抑制或中和或拮抗PLA2-GIB辅因子的表达或活性的任何分子。因此，抑制剂可以是抑制PLA2-GIB辅因子的产生或PLA2-GIB辅因子与靶标结合的化合物；或PLA2-GIB辅因子的免疫原(其诱导抗辅因子抗体)，或针对辅因子或针对生产生物体的细胞毒剂。

在一个具体的实施方案中，术语辅因子的“抑制剂”表示引起(直接或间接)抑制辅因子的表达或功能(例如辅因子与gC1qR的结合或辅因子使CD4T细胞对PLA2-GIB敏感的能力)的任何分子或治疗。抑制辅因子优选表示辅因子的表达或功能降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，以及完全阻断或抑制所述表达或功能。根据情况，抑制可为瞬时、持续或永久性的。

在一个具体的实施方案中，辅因子的抑制剂是gC1qR抑制剂。实际上，辅因子结合作为靶受体的gC1qR。使用gC1qR抑制剂阻断或降低或阻止辅因子与gC1qR的结合可影响辅因子作用。术语“gC1qR抑制剂”表示引起(直接或间接)抑制gC1qR的功能(例如gC1qR介导的胞吐作用)的任何分子或治疗。

gC1qR表示细胞、尤其CD4 T细胞的表面的补体C1q的受体，尤其所述受体的人类形式。gC1qR还称为C1q结合蛋白(C1QBP)、ASF/SF2相关蛋白p32(SF2P32)；糖蛋白gC1qBP；玻尿酸结合蛋白1(HABP1)；粒线体基质蛋白p32；gC1q-R蛋白；p33；C1qBP和GC1QBP。受体的氨基酸序列公开于本领域中。人类gC1qR的示例性氨基酸序列如下再现(SEQ ID NO:2)：

MLPLLRCVPRVLGSSVAGLRAAAPASPFRQLLQPAPRLCTRPFGLLSVRAGSERRPGLLRPRGPCACGCGCGSLHTDGDKAFVDFLSDEIKEERKIQKHKTLPKMSGGWELELNGTEAKLVRKVAGEKITVTFNINNSIPPTFDGEEEPSQGQKVEEQEPELTSTPNFVVEVIKNDDGKKALVLDCHYPEDEVGQEDEAESDIFSIREVSFQSTGESEWKDTNYTLNTDSLDWALYDHLMDFLADRGVDNTFADELVELSTALEHQEYITFLEDLKSFVKSQ

术语gC1qR表示以上SEQ ID NO:2的任何受体(登录号UniProtKB/Swiss-Prot：Q07021.1)，以及其加工形式和变体。变体包括与SEQ ID NO:2具有例如至少90％氨基酸序列一致性的天然存在的变体。

在结合辅因子时，gC1qR触发导致细胞内囊泡的胞吐作用的信号传导途径。不受理论束缚，据信这些囊泡与细胞质膜的融合可改变脂质组合物且增加CD4 T细胞膜上的sPLA2-GIB活性，使得抑制磷酸STAT5信号传导(参见图10)。具体而言，这些囊泡与浆膜的融合可改变脂质组合物且引起CD4 T细胞膜上的sPLA2-GIB活性。因而，膜流动性增加且细胞因子受体聚集于异常膜域中，使得细胞因子信号传导显著降低且CD4 T细胞无反应。

术语gC1qR抑制剂因此包括结合gC1qR或gC1qR的配偶体且抑制gC1qR的功能，诸如gC1qR介导的胞吐作用的任何分子。

在另一个实施方案中，辅因子抑制剂是直接抑制辅因子活性，例如结合辅因子和/或抑制辅因子与其受体的结合的分子。

辅因子抑制剂的优选实例包括例如抗体和其变体、合成的特定配体、肽、小药物或抑制性核酸。

抗体

在第一实施方案中，辅因子抑制剂是基本上具有相同抗原特异性的抗体或抗体变体/片段，或编码此类抗体或变型/片段的核酸。抗体可结合辅因子、或gC1qR、或gC1qR的配偶体、或其gC1qR结合元件，且优选抑制同源抗原(例如gC1qR或辅因子)的功能。

抗体可为合成的、单克隆的或多克隆的，且可通过本身在本领域中熟知的技术制得。

术语“抗体”意指包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段(诸如F(ab’)2和Fab片段、单链可变片段(scFv)、单域抗体片段(VHH或纳米抗体)、二价抗体片段(双功能抗体))以及任何以重组方式和以合成方式产生的结合配偶体、人类抗体或人源化抗体。

优选地，若抗体以大于或等于约10⁷M-1的Ka的结合至同源抗原，则其定义为特异性结合。抗体的亲和力可容易使用常规技术测定，例如通过Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,51:660(1949)所述的那些。

多克隆抗体可容易由多种来源(例如马、奶牛、驴、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠、仓鼠或大鼠)使用本领域中已熟知的规程产生。一般而言，通常经由肠胃外注射向宿主动物施用任选地适当缀合的纯化的免疫原。免疫原的免疫原性可经由使用佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂而增强。在加强免疫之后，收集小血清样品且测试对抗原多肽的反应性。适用于此类测定的各种分析的实例包括Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Lane(编),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988中所述的那些；以及规程，诸如对流免疫电泳(CIEP)、放射免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、点印迹测定法和夹心测定法。参见美国专利号4,376,110和4,486,530。

单克隆抗体可容易使用熟知规程制备。参见例如美国专利号RE 32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993；Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension inBiological Analyses,Plenum Press,Kennett,McKeam和Bechtol(编),1980中所述的规程。举例而言，诸如小鼠的宿主动物可用经分离和纯化的免疫原任选地在佐剂存在下腹膜内注射至少一次，且优选以约3周时间间隔至少两次。小鼠血清然后通过常规点印迹技术或抗体捕获(ABC)测定以确定哪种动物最佳融合。大致两至三周后，给予小鼠静脉内蛋白质或肽的加强免疫剂。随后将小鼠处死且遵循已建立的方案使脾细胞与诸如Ag8.653(ATCC)的市售骨髓瘤细胞融合。简言之，骨髓瘤细胞用培养基洗涤若干次，且以约三个脾细胞与一个骨髓瘤细胞的比率与小鼠脾细胞融合。融合剂可为本领域中所用的任何适合的药剂，例如聚乙二醇(PEG)。将融合物接种于含有允许融合的细胞选择性生长的培养基的板中。然后可允许融合的细胞生长大致八天。收集来自所得杂交瘤的上清液，且添加至首先包被有山羊抗小鼠Ig的板中。在洗涤之后，将标记物添加至各孔，之后进行温育。随后可检测阳性孔。阳性克隆可在大量培养物中生长且随后经蛋白A柱(Pharmacia)纯化上清液。单克隆抗体还可使用替代技术产生，诸如通过Alting-Mees等人,"Monoclonal Antibody ExpressionLibraries:A Rapid Alternative to Hybridomas",Strategies in Molecular Biology3:1-9(1990)所述的那些，其通过引用并入本文。类似地，结合配偶体可使用重组DNA技术构建以掺入编码特异性结合抗体的基因的可变区。此类技术描述于Larrick等人,Biotechnology,7:394(1989)中。

本发明还涵盖可通过常规技术产生的抗体的抗原结合片段。此类片段的实例包括(但不限于)Fab和F(ab’)2片段。还提供通过遗传工程技术产生的抗体片段和衍生物。

本发明的单克隆抗体还包括嵌合抗体，例如鼠单克隆抗体的人源化形式。此类人源化抗体可通过已知技术制备，且在向人类施用抗体时提供降低免疫原性的优点。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体包含鼠抗体的可变区(或仅其抗原结合位点)和源自人类抗体的恒定区。或者，人源化抗体片段可包含鼠单克隆抗体的抗原结合位点和源自人类抗体的可变区片段(缺少抗原结合位点)。用于产生嵌合和经进一步工程化改造的单克隆抗体的规程包括Riechmann等人(Nature 332:323,1988)、Liu等人(PNAS 84:3439,1987)、Larrick等人(Bio/Technology 7:934,1989)以及Winter和Harris(TIPS 14:139,May,1993)中所描述的那些。以转基因方法产生抗体的规程可见于GB 2,272,440、美国专利号5,569,825和5,545,806。可使用可用标准重组DNA技术制造的包含人类与非人类部分两者的通过遗传工程方法产生的抗体(诸如嵌合和人源化单克隆抗体)。此类嵌合和人源化单克隆抗体可通过遗传工程使用本领域中已知的标准DNA技术，例如使用以下中所述的方法产生：Robinson等人的国际公开号WO 87/02671；Akira等人,欧洲专利申请0184187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请0171496；Morrison等人的欧洲专利申请0173494；Neuberger等人的PCT国际公开号WO86/01533；Cabilly等人美国专利号4,816,567；Cabilly等人的欧洲专利申请0125023；Better等人,Science 240:1041 1043,1988；Liu等人,PNAS 84:3439 3443,1987；Liu等人,J.Immunol.139:3521 3526,1987；Sun等人PNAS 84:214 218,1987；Nishimura等人,Canc.Res.47:999 1005,1987；Wood等人,Nature 314:446 449,1985；和Shaw等人,J.Natl.Cancer Inst.80:1553 1559,1988)；Morrison,S.L.,Science 229:1202 1207,1985；Oi等人,BioTechniques 4:214,1986；Winter的美国专利案号5,225,539；Jones等人,Nature 321:552 525,1986；Verhoeyan等人,Science 239:1534,1988；和Beidler等人,J.Immunol.141:4053 4060,1988。

与合成和半合成抗体结合，此类术语旨在涵盖但不限于抗体片段、同种型转换抗体、人源化抗体(例如小鼠-人类、人类-小鼠)、杂合物、具有多个特异性的抗体和全合成抗体样分子。

人类单克隆抗体还可通过使用由源自受试者淋巴细胞的mRNA制备的免疫球蛋白轻链和重链cDNA构建诸如Fab噬菌体展示文库或scFv噬菌体展示文库的组合免疫球蛋白文库来制备。参见例如McCafferty等人的PCT公开WO 92/01047；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581 597；和Griffths等人(1993)EMBO J 12:725 734。另外，抗体可变区的组合文库可通过使已知人类抗体突变产生。举例而言，已知结合gC1qR的人类抗体的可变区可通过例如使用随机改变的诱变的寡核苷酸而突变，以产生突变的可变区的文库，其然后可经筛选以结合至gC1qR。诱导免疫球蛋白重链和/或轻链的CDR区内的随机诱变的方法、使随机分组的重链和轻链交叉以成对的方法和筛选方法可见于例如Barbas等人的PCT公开WO 96/07754；Barbas等人(1992)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89:4457 4461中。

本发明的抗体可针对gC1qR、gC1qR配体或C1qR配偶体，且导致抑制通过gC1qR介导的信号传导。对于制备本发明的抗体，可使用包含gC1qR、gC1qR配体或gC1qR配偶体或其片段、变体或融合分子的免疫原。

gC1qR的抗体

本发明的特定抗体结合gC1qR表位，和/或已通过用选自成熟gC1qR蛋白质或包含至少8个其连续氨基酸残基的gC1qR的片段的包含gC1qR表位的多肽免疫接种产生。优选本发明的抗gC1qR抗体结合gC1qR内的配体结合位点的表位，由此干扰配体的结合。在一个具体的实施方案中，抗体结合包含于SEQ ID NO:2的氨基酸残基76-282之间的表位，其含有gC1qR配体结合位点。结合至gC1qR的C1q可涉及gC1qR上的至少三种不同基序，即：氨基酸残基75-96、190-202和144-162(参考SEQ ID NO:2)。结合至gC1qR的HCV核心蛋白质可涉及gC1qR上的至少两种不同基序，即：氨基酸残基144-148和196-202(参考SEQ ID NO:2)。结合至gC1qR的HIV gp41可涉及gC1qR上的至少氨基酸残基174-180(参考SEQ ID NO:2)。

因此优选使用结合含有至少一个氨基酸残基的表位的抗体(或其变体)，该至少一个氨基酸残基含于所述表位之一中或接近所述表位之一。此类抗体的实例包括抗体60.11，其结合至gC1qR的残基75-96；以及抗体74.5.2，其结合至具有残基204至218的表位。

优选gC1qR抑制剂因此是针对gC1qR、更优选针对定位于蛋白质的氨基酸残基76-282(参考SEQ ID NO:2)内的gC1qR的表位，甚至更优选含有选自氨基酸75-96、144-162、174-180和190-210的氨基酸残基的表位的单克隆抗体。优选抗体是中和(或拮抗剂)抗体，即其防止或抑制或减小天然配体与受体的结合和/或经由受体的信号传导。

PLA2-GIB辅因子的抗体

本发明的其他特定抑制剂是结合PLA2-GIB辅因子的抗体，和/或已通过用PLA2-GIB辅因子或其片段免疫接种产生，且优选至少部分抑制此类辅因子的活性，优选此类辅因子与gC1qR的结合。

本发明的特定抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或其变体，其结合选自表1和2中所列举的蛋白质的蛋白质，且至少部分抑制所述蛋白质与gC1qR的结合。本发明的优选抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或其变体，其结合选自表2和3中所列举的蛋白质的蛋白质，且至少部分抑制所述蛋白质与gC1qR的结合，甚至更尤其结合选自表2中所列举的蛋白质的蛋白质，且至少部分抑制所述蛋白质与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，C1qR抑制剂是抗体或其变体，其结合选自SEQ ID NO:2-44和ID NO:45-71，更优选地选自SEQ ID NO:2、3、43、44和选自ID NO:45-61，甚至更优选地选自SEQ ID NO:3、43、44和ID NO:45-55的蛋白质，且至少部分抑制所述蛋白质与gC1qR的结合。

本发明的特定抗体或变体结合C1qR配体内的表位，该表位含于所述配体的gC1qR结合元件或域中(或与其重叠)，通常包含至少1个与所述配体与gC1qR的结合有关的所述配体的氨基酸残基。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:7或8的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在另一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:14的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在另一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:18的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:28的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:29或30的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:33的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:38的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:41的蛋白质或肽的抗体或其变体优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合包含SEQ ID NO:42的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由SEQ ID NO:3或ID45组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由SEQ ID NO:43组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:51组成的蛋白质或肽的抗体或其变体优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:46组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:47组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:48组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:49或50组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由SEQ ID NO:44组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:52组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:53组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:54组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

在一个具体的实施方案中，抑制剂是结合含有或由ID NO:55组成的蛋白质或肽的抗体或其变体。优选地，此类抗体抑制所述蛋白质与靶受体或细胞，尤其与gC1qR的结合。

抑制性核酸

在一个替代的实施方案中，辅因子抑制剂是抑制性核酸。优选抑制性核酸包括经设计以结合辅因子或gC1qR或gC1qR的配偶体且抑制其功能的适体。

其他核酸是编码如上文所定义抗体的核酸。

肽

在一个替代的实施方案中，辅因子抑制剂是抑制辅因子的功能的肽。肽通常是选择性结合辅因子、gC1qR或gC1qR的配偶体的分子。

肽优选含有4至30个氨基酸残基，且其序列可与gC1qR的域或辅因子的域相同(诱饵肽)，或其序列可含有与gC1qR的域的序列或辅因子的域相比的变化(肽拮抗剂)。

本发明的优选肽含有SEQ ID NO:2(gC1qR)或选自SEQ ID NO:3-71中的任一个的辅因子的4至30个连续氨基酸残基，且可含有至少1处修饰。

修饰可由氨基酸取代组成。此类取代的实例包括但不限于经诸如丙氨酸的更为中性的残基置换带电或反应性氨基酸残基，或相反。修饰替代地(或另外地)可由诸如将化学基团添加至肽的一个(或两个)末端、或其侧链、或肽键中的化学修饰组成。就此而言，本发明的肽可包含肽、非肽和/或修饰的肽键。在一个具体的实施方案中，肽包含至少一个选自以下的拟肽键：嵌入亚甲基(-CH₂-)或磷酸盐(-PO₂-)基团、仲胺(-NH-)或氧(-O-)、alpha-氮杂肽、alpha-烷基肽、N-烷基肽、膦酰胺、缩肽、羟基亚甲基、羟基乙烯基、二羟基乙烯基、羟乙基胺、逆反肽、亚甲基氧基、酮亚甲基(cetomethylene)、酯、亚膦酸盐、次膦酸基(phosphinics)或膦酰胺。此外，肽可包含例如通过酰化和/或酰胺化和/或酯化得到的经保护N-端和/或C-端官能基。

此类肽的实例包括例如具有SEQ ID NO:2(gC1qR)的氨基酸残基144-162的肽和具有SEQ ID NO:2(gC1qR)的氨基酸残基204-218的肽。

本发明的此类肽的其他实例包括包含SEQ ID NO:7、8、14、18、28-30、33、38、41或42中的任一个的序列和一个氨基酸取代，更优选至少一个选自W、I或K的氨基酸经丙氨酸置换的肽。

本发明的此类肽的其他实例包括包含SEQ ID NO:7、8、14、18、28-30、33、38、41或42中的任一个的序列和一个中心氨基酸缺失的肽。

本发明的肽的其他实例包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列和以下修饰中的至少一个的肽：E3A、W6A、S10A、I14A(为了清晰起见，E3A意指位置3中的氨基酸E经氨基酸A置换)。

本发明的肽的其他实例包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和以下修饰中的至少一个的肽：S1A、K4A、W6A、S10A、I14A(为了清晰起见，S1A意指位置1中的氨基酸S经氨基酸A置换)。

本发明的肽可通过诸如化学、生物学和/或遗传合成的本身在本领域中已知的技术产生。

呈分离形式的这些肽中的每一个表示本发明的特定目的。如本文所用，术语“分离的”是指自其天然环境的组分移出、分离或分隔，且至少60％不含、优选75％不含且最优选90％不含其天然相关的其他组分的分子(例如核酸或氨基酸)。“分离的”多肽(或蛋白质)是例如自其自然环境的组分分隔的多肽，且优选如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或逆相HPLC)迁移所测定纯化至大于90％或95％的纯度。“分离的”核酸是指自其天然环境组分分隔和/或组装于不同构建体(例如载体、表达盒、重组宿主等)中的核酸分子。

小药物

其他抑制剂是小药物抑制剂，诸如是选择性结合gC1qR或辅因子的烃化合物。

小药物优选可通过一种方法获得，该方法包括：(i)使测试化合物与表达gC1qR的细胞接触，(ii)选择结合gC1qR的测试化合物，和(iii)选择抑制gC1qR活性的(ii)的化合物。此类方法表示本发明的特定目的。

gC1qR可溶性受体

在一个替代的实施方案中，辅因子抑制剂是gC1qR的可溶形式。

细胞生长抑制或细胞毒性剂

在另一个实施方案中，抑制剂是针对PLA2-GIB辅因子或针对表达PLA2-GIB辅因子的原核或真核细胞或病毒的细胞生长抑制或细胞毒性剂。

在辅因子是细菌或细菌的一部分或通过细菌产生的情况下，抑制剂可为针对所述细菌的抗生素。通过杀死细菌，避免产生辅因子。抗生素可为任何广谱抗生素，或具有针对靶标细菌的特定光谱的抗生素。抗生素的实例包括但不限于阿莫西林(amoxicillin)、克拉霉素(clarithromycin)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢力新环丙沙星(cephalexinciprofloxacin)、克林达霉素(clindamycin)、多西环素(doxycycline)、甲硝哒唑(metronidazole)、特比萘芬(terbinafine)、左氧氟沙星(levofloxacin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、四环素(tetracycline)、青霉素(penicillin)和阿奇霉素(azithromycin)。

在辅因子是真核细胞或真核细胞的一部分或通过真核细胞产生的情况下，抑制剂可为针对所述细胞的细胞毒性剂。通过杀死细胞，避免产生辅因子。

在辅因子是真菌或真菌的一部分或通过真菌产生的情况下，抑制剂可为抗真菌剂。通过杀死真菌，避免产生辅因子。抗真菌剂的实例包括但不限于克霉唑(clotrimazole)、布替萘芬(butenafine)、布康唑(butoconazole)、环吡酮(ciclopirox)、氯碘羟喹(clioquinol)、氯碘羟喹(clioquinol)、克霉唑、益康唑(econazole)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黄霉素(griseofulvin)、卤苯炔醚(haloprogin)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)、萘替芬(naftifine)、耐丝菌素(nystatin)、奥昔康唑(oxiconazole)、硫康唑(sulconazole)、特比萘芬(terbinafine)、特康唑(terconazole)、噻康唑(tioconazole)和托萘酯(tolnaftate)。

在辅因子是病毒或病毒的一部分或通过病毒产生的情况下，抑制剂可为针对所述病毒的细胞毒性剂或抗病毒剂。通过杀死病毒，避免产生辅因子。抗病毒剂的实例包括但不限于齐多夫定(zidovudine)、地达诺新(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、田诺弗(tenofovir)、奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦定(delavirdine)、依法韦仑(efavirenz)、沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、沙奎那韦(saquinavir)、安普那韦(amprenavir)和洛匹那韦(lopinavir)。

在另一个实施方案中，辅因子的抑制剂是微生物组的调节剂。微生物组的组成/多样性的调节可用以降低或抑制辅因子的产生。

就这一点而言，本发明还提供了一种通过通常在治疗之前、期间和/或之后分析所述受试者中的微生物组来确定受试者的癌症治疗功效或癌症进展的方法。该方法可以包括检测或测量所述微生物组中PLA2GIB辅因子的存在、不存在或活性，其中所述存在或活性的降低指示受试者和/或治疗功效的改善。更一般地，在来自受试者的任何样品中检测或测量PLA2GIB辅因子的存在、不存在或活性可以用于确定所述受试者的癌症治疗功效或癌症进展。

免疫原

在一个替代的(或累积的)实施方案中，受试者中辅因子的抑制通过使用辅因子的免疫原(例如受试者以其接种疫苗或免疫)而获得。因而，受试者产生抑制辅因子的抗体(或细胞)。具体而言，施用辅因子免疫原(例如辅因子的任何免疫原性部分)可在治疗的受试者中产生抗体。这些抗体将作为免疫疗法或疫苗预防抑制辅因子作用。

本发明的目的因此在于一种受试者接种疫苗的方法，其包括向受试者施用PLA2-GIB辅因子的免疫原。

本发明的另一目的涉及一种PLA2-GIB辅因子的免疫原，其用以有此需要的受试者接种疫苗。

在一个具体的实施方案中，用于接种疫苗的PLA2-GIB辅因子抗原的免疫原是受试者中诱导针对辅因子的免疫应答的失活的免疫原性分子。失活可例如通过以化学或物理方式改变辅因子、或通过蛋白质突变或截断、或两者获得；且免疫原性可由于失活和/或通过使蛋白质进一步缀合适合的载体或半抗原(诸如KLH、HSA、聚赖氨酸、病毒性类毒素等)，和/或通过聚合化等获得。免疫原因此可以化学或物理方式修饰，例如以改善其免疫原性。

在一个优选的实施方案中，本发明的PLA2-GIB辅因子的免疫原包含整个辅因子。

在一个替代的实施方案中，PLA2-GIB辅因子的免疫原包含有包含至少6个连续氨基酸残基且含有其免疫原性表位的辅因子的片段。在一个优选的实施方案中，免疫原包含至少6至20个氨基酸残基。本发明的优选免疫原包含或由蛋白质的4至30个选自SEQ ID NO:2-44和ID NO:45-71中的任一个的连续氨基酸残基(或天然变体的对应序列)组成。

免疫原可呈各种形式，诸如呈游离形式、聚合、以化学或物理方式修饰和/或与载体分子偶联(即连接)。与载体偶联可增加免疫原的免疫原性且(进一步)抑制生物活性。就此而言，载体分子可为常规用于免疫学中的任何载体分子或蛋白质，诸如KLH(钥孔戚血蓝素(Keyhole limpet hemocyanin))、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、病毒性或细菌性类毒素(诸如破伤风类毒素、白喉类毒素B型霍乱毒素、其突变体(诸如白喉毒素CRM 197))、外膜囊泡蛋白质、聚赖氨酸分子或病毒样颗粒(VLP)。在一个优选的实施方案中，载体是KLH或CRM197或VLP。

免疫原与载体的偶联可通过共价化学使用连接化学基团或反应物(诸如例如戊二醛、生物素等)进行。优选地，使缀合物或免疫原经受用甲醛处理以使辅因子完全的失活。

免疫原的免疫原性可通过各种方法测试，诸如通过移植人类免疫细胞的非人类动物的免疫接种，之后证实抗体的存在，或通过夹心ELISA使用人类或人源化抗体测试。生物活性的缺乏可通过本申请中所描述的活性测试中的任一个证实。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种失活且免疫原性PLA2-GIB辅因子。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种与载体分子，优选与KLH缀合的PLA2-GIB辅因子蛋白质或其片段。

在另一方面中，本发明涉及一种疫苗，其包含PLA2-GIB辅因子的免疫原、适合的赋形剂和任选地适合的佐剂。

本发明的另一目的涉及一种用于诱导中和有此需要的受试者的PLA2-GIB辅因子的活性的抗体的产生的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的如上文所定义的免疫原或疫苗。

施用本发明的免疫原或疫苗可通过任何适合途径，诸如通过注射，优选肌肉内、皮下、经皮、静脉内或动脉内注射；通过经鼻、经口、经黏膜或直肠施用。

治疗的组合物和方法

本发明还涉及一种组合物，其包含如上文所定义的辅因子或调节剂和优选药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

“药物组合物”是指本发明化合物(活性成分)和用于将生物活性化合物递送至有此需要的受试者的本领域中通常可接受的介质的配制剂。此类载体因此包括所有药学上可接受的载体、稀释剂、介质或支持物。常规药物实践可用于向受试者提供例如呈单位剂型的适合的配制剂或组合物。

根据本发明的化合物或组合物可以软膏、凝胶、糊剂、液体溶液、悬浮液、锭剂、明胶胶囊、胶囊、栓剂、散剂、鼻滴剂或气溶胶形式，优选以可注射溶液或悬浮液形式配制。对于注射剂，化合物通常以液体悬浮液形式包装，其可经由例如注射器或灌注来注射。在这方面，通常将化合物溶解于与药物用途相容且本领域技术人员已知的盐水、生理学、等张或缓冲的溶液中。因此，组合物可含有一种或多种药剂或选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的赋形剂。可用于液体和/或可注射配制剂中的药剂或赋形剂尤其是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯胶等。载体还可选自例如甲基-beta-环糊精、丙烯酸的聚合物(诸如卡波姆(carbopol))、聚乙二醇和聚丙二醇的混合物、单乙醇胺和羟甲基纤维素。

组合物通常包含有效量的本发明的抑制剂，例如有效直接或间接抑制PLA2-GIB的作用的量。抑制剂通常以有效维持/恢复CD4 T细胞对经PLA2-GIB的失活有抗性的量使用。一般而言，根据本发明的组合物包含约1μg至1000mg的抑制剂，诸如0.001-0.01、0.01-0.1、0.05-100、0.05-10、0.05-5、0.05-1、0.1-100、0.1-1.0、0.1-5、1.0-10、5-10、10-20、20-50和50-100mg，例如0.05与100mg之间、优选0.05与5mg之间，例如0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4或5mg。剂量可通过本领域技术人员根据药剂和疾病而调节。

本发明的组合物可进一步包含一种或多种用于分开、同时或顺序使用的另外的活性化合物。另外的活性化合物的实例包括但不限于化学治疗药物、抗生素、抗寄生物药剂、抗真菌剂或抗病毒剂。

在一个具体的实施方案中，抑制剂与化学疗法或激素疗法组合使用。

在另一个具体的实施方案中，抑制剂与放射疗法、超声疗法或纳米颗粒疗法组合使用。

在另一个具体的实施方案中，抑制剂与检查点抑制剂、免疫疗法或抗癌疫苗组合使用。

在另一个具体的实施方案中，抑制剂与PLA2-GIB的抑制剂组合使用。

PLA2-GIB抑制剂的实例公开于例如WO2015/097140、WO2017/037041或WO2017/060405中，其通过引用并入本文。

在一个具体的实施方案中，PLA2-GIB抑制剂是针对PLA2-GIB的抗体，尤其是针对PLA2-GIB的单克隆抗体，或其衍生物或片段，诸如scFv、纳米抗体、Fab、双特异性抗体等。抗体或衍生物或片段可为人类或人源化的。

在一个具体的实施方案中，本发明的方法或组合物使用(i)PLA2GIB辅因子的抑制剂和(ii)针对PLA2GIB的抗体(或其衍生物或片段)的组合。在另一个具体的实施方案中，PLA2GIB辅因子的抑制剂是针对辅因子的抗体、或抗生素、或抗真菌剂、或抗病毒剂。

在另一个具体的实施方案中，本发明的方法或组合物使用(i)PLA2GIB辅因子的抑制剂和(ii)PLA2GIB的基于吲哚的抑制剂((诸如3-(2-氨基-1,2-二氧乙基)-2-乙基-1-(苯甲基)-1H-吲哚-4-基)氧基)乙酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药，诸如其钠盐(伐瑞拉迪(Varespladib)))的组合。在另一个具体的实施方案中，PLA2GIB辅因子的抑制剂是针对辅因子的抗体、或抗生素、或抗真菌剂、或抗病毒剂。

在另一个具体的实施方案中，本发明的方法或组合物使用(i)PLA2GIB辅因子的抑制剂和(ii)PLA2GIB的五肽抑制剂(诸如选自FLSYK、FLSYR和(2NapA)LS(2NapA)R的环肽)的组合。在另一个具体的实施方案中，PLA2GIB辅因子的抑制剂是针对辅因子的抗体、或抗生素、或抗真菌剂、或抗病毒剂。

本发明还涉及一种用于制备药物组合物的方法，该方法包括混合如先前所述的辅因子或调节剂和药学上可接受的稀释剂或赋形剂，以及将组合物配制于任何适合形式或容器(注射器、安瓿、烧瓶、瓶子、袋等)。

本发明还涉及试剂盒，其包含(i)包含如先前所述的辅因子或调节剂的组合物，(ii)至少一个容器，和任选地(iii)使用试剂盒的书面说明书。

本发明的化合物和组合物可用以治疗多种疾病，诸如感染性疾病和与不适当(例如有缺陷或不当的)免疫应答，尤其与不适当CD4 T细胞活性相关的疾病，以及免疫性增加可改善受试者状况的任何疾病。这些疾病在本申请中有时称为“免疫病症”。这包括免疫缺陷情形(例如由病毒感染、病原性感染、癌症等所导致)、自身免疫疾病、移植物、糖尿病、炎性疾病、癌症、过敏、哮喘、牛皮癣、荨麻疹、湿疹等。

在一个具体的实施方案中，本发明是针对刺激有此需要的受试者的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用辅因子抑制剂或免疫原。

在另一个具体的实施方案中，本发明是针对治疗有此需要的受试者的免疫缺陷或相关病症的方法，其包括向该受试者施用优选有效维持/恢复CD4 T细胞对经PLA2-GIB的失活有抗性的量的辅因子抑制剂或免疫原。

免疫缺陷和相关病症指示特征为受试者中的免疫功能或反应降低和/或通过其所导致的任何状况或病理学。免疫缺陷可由例如病毒感染(例如，HIV、乙型肝炎、丙型肝炎等)、细菌感染、癌症或其他病理性状况所导致。术语“免疫缺陷相关病症”因此表示由免疫缺陷所导致或与免疫缺陷有关的任何疾病。本发明尤其适用于治疗与CD4-T细胞相关的免疫缺陷，和相关疾病。

本发明尤其涉及治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用抑制PLA2-GIB辅因子的化合物。本发明人已显示PLA2-GIB辅因子存在于患有癌症的患者的血浆中，所述辅因子连同PLA2-GIB一起诱导免疫细胞的失活。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及治疗有此需要的受试者的癌症或赘瘤形成的方法，其包括向受试者施用抑制PLA2-GIB辅因子的化合物。

本发明还涉及一种抑制PLA2-GIB辅因子的化合物，其用于治疗有此需要的受试者的癌症或赘瘤形成。

在一个具体的实施方案中，本发明的方法用于预防有此需要的受试者，诸如具有赘瘤形成或癌症的风险的受试者的癌症或降低癌症发生率。就此而言，本发明可用于治疗癌症的风险因素，由此避免或降低癌症的发生风险/发生率。此类风险因素包括但不限于口腔、胃和/或肠炎症和感染，诸如胰腺炎。

本发明还涉及抑制PLA2-GIB辅因子的化合物，其用于预防有此需要的受试者的癌症或降低癌症发生率。

在另一个具体的实施方案中，本发明的方法用于降低患有癌症的受试者的癌症进展速率。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及抑制PLA2-GIB辅因子的化合物，其用于降低患有癌症的受试者的癌症进展速率。

在另一个具体的实施方案中，本发明的方法用于减轻或预防或治疗患有癌症的受试者的癌转移或用于杀死癌细胞。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种抑制PLA2-GIB辅因子的化合物，其用于减轻或预防或治疗患有癌症的受试者的癌转移或用于杀死患有癌症的受试者的癌细胞。

本发明可用于治疗任何癌症。

在一个具体的实施方案中，癌症为实体癌。

在一个具体的实施方案中，该方法用于治疗患有癌症且表达PLA2-GIB辅因子的受试者。在一个优选的实施方案中，该方法用于治疗受试者的癌症，其中所述受试者中存在PLA2-GIB辅因子或表达PLA2-GIB辅因子的原核或真核细胞或病毒。

在另一个具体的实施方案中，该方法用于治疗患有癌症的受试者，其中癌症微环境或血液中存在PLA2-GIB或PLA2-GIB辅因子。

本发明还尤其适用于治疗患有PLA2GIB相关的CD4 T细胞缺乏症的受试者的癌症或赘瘤形成。

本发明可用以治疗任何发展阶段的癌症。就此而言，大多数实体癌经由四个阶段发展：

.I期.此阶段通常是尚未深入地生长至邻近组织中的小癌症或肿瘤。其还尚未扩散至淋巴结或身体的其他部分。其通常称为早期癌症。

.II期和III期.一般而言，这2个阶段指示已更深入地生长至邻近组织中的较大癌症或肿瘤。其还可已扩散至淋巴结中但尚未扩散至身体的其他部分。

.IV期.此阶段意指癌症已扩散至身体的其他器官或部分。其还可称为晚期或转移性癌症。

一些癌症还具有0期。0期癌症仍位于开始的位置，且尚未扩散至邻近组织。此阶段的癌症通常通过用手术去除整个肿瘤高度可治愈。

本发明可用于治疗0、I、II、III或IV期的肿瘤或癌症。

本发明可用以预防或减轻或治疗0、I、II或III期癌症的转移。

本发明可用以降低0、I、II、III或IV期癌症的进展速率。

本发明尤其可用于治疗选自以下的实体癌：胰腺癌、黑素瘤、肺癌、食管癌或咽癌、视网膜母细胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌、肾癌、胃癌、十二指肠癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、脑癌或结肠直肠癌。

在一个具体的实施方案中，本发明的方法用于治疗胰腺癌。胰腺癌根据胰腺的哪部分受影响而进行分类：产生消化物质的部分引起外分泌癌症，产生胰岛素和其他激素的部分引起内分泌癌症。尽管存在若干不同类型的胰腺癌，但95％的病例是由外分泌癌症胰腺导管腺癌(PDAC)所导致。

在由癌症致死亡的主要原因中PDAC排名第四。研究人员预计，2030年PDAC将变为美国癌症相关死亡的第二最主要原因，发生率在30年内已增加一倍以上且目前每年增加5％。5年的相对存活率是大约5％且手术操作是治疗PDAC的最有效的选项。诊断方法的可利用性有限且作为仅有的治愈选项的手术的存活可能性仅是诊断患者的10％增加了此疾病的可怕程度。疾病的不良预后可通过不存在用于筛选和早期检测的有效生物标志物以及侵袭性特性和对目前可用化学疗法的耐受性解释。

本发明显示PLA2-GIB抑制可用以治疗胰腺癌。本发明表示预防胰腺癌进展和癌转移的新的策略。本发明可用于任何类型/阶段的胰腺癌，诸如胰腺导管腺癌、神经内分泌肿瘤、导管内乳头状黏液性赘瘤、黏液性囊性赘瘤和严重囊性赘瘤。本发明尤其适合于治疗任何阶段的胰腺导管腺癌。

本发明还尤其适合于治疗结肠直肠癌、肺癌以及快速生长癌症。结肠直肠癌是所有性别的最常见癌症之一。在所有阶段，5年存活率是约55％。(Bossard N,2007)。实际上，在法国、日本、美国、德国、意大利、西班牙和英国，在2010年诊断出大于180 000例新的直肠癌病例。将结肠直肠癌分类为四个阶段：I期，其是最早期的且主要通过手术处理，II和III期，其患者经历组合放射化学疗法(RCT)，和IV期，其是极晚期且发生转移的阶段。当患者诊断患有局部晚期(II或III期)结肠直肠癌时，患者通常在手术切除之前用RCT治疗。本发明适合于治疗I、II、III和IV期结肠直肠癌。本发明尤其适合于治疗II、III或IV期的结肠直肠癌。

本发明还适用于治疗诱发胃肠和代谢病变的癌症。

对于用于本发明，PLA2-GIB辅因子抑制剂可通过任何适合途径施用。优选地，通过注射，诸如系统或肠胃外注射或灌注(例如肌肉内、静脉内、动脉内、皮下、瘤内等)施用。施用通常是重复或连续的。在一个具体的实施方案中，在治疗的过程期间测量肿瘤或体液中PLA2-GIB或PLA2-GIB辅因子的水平以指导治疗方案。

PLA2-GIB辅因子抑制剂可单独或与其他癌症治疗组合使用。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法，其包括与化学疗法或激素疗法组合向患有癌症的受试者施用抑制PLA2-GIB辅因子的化合物。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法，其包括与放射疗法、超声疗法或纳米颗粒疗法组合向患有癌症的受试者施用抑制PLA2-GIB辅因子的化合物。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法，其包括与检查点抑制剂、免疫疗法或抗癌疫苗组合向患有癌症的受试者施用抑制PLA2-GIB辅因子的化合物。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法，其包括与PLA2-GIB的抑制剂组合向患有癌症的受试者施用抑制PLA2-GIB辅因子的化合物。PLA2-GIB抑制剂可为其拮抗剂或针对所述PLA2-GIB的疫苗。

在“组合”疗法中，活性剂可同时或顺序一起或交替使用。各活性剂可根据特定时间表使用。在其他情况下，所有活性剂可一起配制和/或诸如以灌注方式施用。

在另一个实施方案中，化合物在手术(肿瘤切除或去除)之前、期间或之后施用。

如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指试图改变所治疗的受试者的天然过程的临床干预，且可进行以达到预防性或治愈性目的。所需治疗作用包括但不限于预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理性后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态和缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用以推迟疾病或病症的发展或减慢疾病或病症的进展。

施用本发明化合物或组合物的持续时间、剂量和频率可根据受试者和疾病进行调整。治疗可单独或与其他活性成分组合同时或分开或顺序使用。

典型方案包含经一天或若干天、长达一年和包括一周与约六个月之间的时段单次或重复施用有效量的辅因子或调节剂。应理解，体内施用的本发明的药物化合物或组合物的剂量将取决于接受者(受试者)的年龄、健康、性别和体重、并行治疗的种类(若存在)、治疗的频率和所需药物作用的性质。本文提供的有效量范围并不旨在限制且表示优选剂量范围。然而，最优选剂量将针对个体受试者定制，如通过相关领域的技术人员所理解且确定的(参见例如Berkowet等人编,The Merck Manual,第16版,Merck and Co.,Rahway,N.J.,1992；Goodmanetna.编,Goodman and Cilman’s The pharmacological Basis ofTherapeutics,第10版,Pergamon Press,Inc.,Elmsford,N.Y.,(2001))。

本发明可用于任何哺乳动物，尤其任何人类。

本发明的其他方面和优势将公开于以下实验章节中。

实施例

材料和方法

重组蛋白和肽-人类PLA2-GIB在大肠杆菌(Gerard Lambeau所赠，纯度>98％)中或在CHO-S(纯度>98％)中产生。HIV-1 gp41 MN重组蛋白是获自Antibodies onlines(gp41MN(565-771Delta642-725)，ABIN2129703，批次93-482，纯度>95％)，且PEP3肽NH2-PWNASWSNKSLDDIW-COOH和对照肽(CTL)NH2-PWNATWTQRTLDDIW-COOH订购自Covalab(纯度>98％)。HP Pg肽8(肽SEQ ID NO:8)NH2-SGEGGWSNGSLVDIM-COOH和混杂PEP3 NH2-WNWDSKILSDPAWNS-COOH肽订购自Covalab(纯度>98％)。来自人类血清的补体组分C1q是获自Sigma(C1740，纯度>95％)。HCV核心蛋白质自Prospec(HCV-011，纯度>95％)于具有0.002％SDS的PBS缓冲液中获得，且与PBS SDS 0.002％的类似稀释相比评估由HCV核心蛋白质所导致的作用的特异性。金黄色葡萄球菌蛋白质A获自Sigma(P6031)。

gC1qR KO Jurkat E6.1 T细胞的产生-缺乏C1QBP的Jurkat细胞发育的总体策略是基于经由同源重组使C1QBP基因双等位基因失活的靶向载体的设计。已使用与JurkatE6.1 T细胞系(ECACC 88042803)同基因的人类C1QBP同源区域。靶向载体通过Genewiz合成且克隆至pUC57-Amp载体中。通过引入新霉素抗性基因(NeoR)选择盒靶向人类C1QBP基因的第三外显子，由此导致C1QBP开放阅读框中断。NeoR盒使用BamHI/NotI限制位点克隆。靶向载体已通过用所选限制酶(APaL1、Drd1、Pvu1、Pvu2、BamH1/NotI、Not1/NcoI、NEB)进行DNA限制性消化切割和靶标区域测序来证实。将与C1QBP sgRNA(1828-Crispr_1A：CACC-GAAGTGACCGTGATTCTAAAA和1828-Crispr_1B：AAAC-TTTTAGAATCACGGTCACTTC)对应的DNA引物杂交且使用BbsI限制位点(NEB)克隆(Quick Ligase-New England Biolabs,NEB)至pX330质粒(Addgene,42230；Feng Zhang,MIT)中。

使Jurkat细胞(5×10⁶)重悬于100μL Opti-MEM中，且添加7μg CRISPR/Cas9质粒和2.5μg靶向载体。细胞用Nepa21电穿孔器进行电穿孔。在G418选择培养基中进行细胞选择之后，通过PCR基因分型预筛选Jurkat细胞克隆。将C1QBP基因敲除的独立型细胞克隆扩增且通过PCR基因分型和靶标区域测序证实。我们用于缺乏C1QBP基因的独立型Jurkat细胞克隆的验证流程由PCR基因分型组成。基因经编辑的Jurkat细胞的基因组DNA通过蛋白酶K处理和苯酚纯化分离。C1QBP基因双等位基因失活的各细胞克隆通过PCR基因分型和靶标区域测序证实。在50℃下使用Platinum HiFi Taq(Life technologies)用引物1828_RH5_F：TACTACAGCCCTTGTTCTT和1828_RH3_R：AGCACTTCCTGAAATGTT进行PCR扩增2分钟。引物设计于C1QBP人类基因座中和同源臂之外。在相同PCR反应中区分WT和突变体等位基因。野生型和突变体等位基因分别得到1146-bp和2362-bp扩增产物。此PCR基因分型方案允许鉴别敲除C1QBP基因的两种等位基因的纯合Jurkat细胞克隆。Jurkat细胞系中的基因破坏使用CRISPR/Cas9技术实现。获得三种缺乏C1QBP基因的独立型纯合Jurkat细胞克隆且通过PCR基因分型和靶标区域测序验证。

Jurkat E6.1 T细胞中gC1qR的免疫印迹检测-对WT和gC1qR KO Jurkat E6.1 T细胞裂解物中的gC1qR蛋白质表达的Western印迹分析。将细胞裂解于哺乳动物蛋白质萃取试剂(M-PER，11884111，Thermo Scientific)缓冲液中且用BCA蛋白质测定试剂盒定量澄清上清液(23227，Pierce，Thermo Scientific)的蛋白质的量。对于WT和gC1qR KO Jurkat E6.1T细胞(40μg)装载等量的总蛋白质，且经Mini-PROTEAN TGX免染色凝胶8-16％(4568104,BIORAD)通过SDS-PAGE分级，进一步电转移，且在室温下通过免疫印迹使用于PBS-Tween0.05％BSA 5％中的针对gC1qR(1:50的60.11Santa Cruz，1:1000的74.5.2Abcam)或β-肌蛋白(1:2000的AC-74，Sigma)的特异性抗体探测2小时，和使用于PBS PBS-Tween 0.05％BSA5％中的山羊抗小鼠-IgG-HRP(1:20000，31430，Invitrogen)探测1小时。使用ECL免疫印迹检测系统(NEL103001EA，PerkinElmer)检测结合的抗体。

gC1qR-肽结合测定法-在+4℃下将100μl用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)(15mM Na2CO3和35mM NaHCO3)稀释的100μg/ml的肽PEP3、混杂PEP3或CTL包被于Nunc Maxisorp平底微孔板(44-2404-21,Thermofisher Scientific)上。去除未结合蛋白质；孔用TBST(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl和0.05％Tween-20)洗涤2次，且未反应位点通过用300μl于TBST中的3％BSA温育(30分钟，室温)而阻断。在洗涤(用TBST，2次)之后，一式三份用0至3μg/孔范围内的不同量的His标签-gC1qR将微量滴定板结合肽温育(2小时，室温)。在洗涤(用TBST，5次)之后，每孔添加100μl于含3％BSA的TBST中的抗His标签-HRP抗体(1:1000；71840-3，Merck)且在室温下温育2小时。然后将微孔板的孔洗涤(用TBST，5次)且每孔添加100μl TMBELISA底物标准溶液(UP664781，Interchim)。用每孔100μl 0.16M的H2SO4溶液停止反应，且经酶标仪(Tecan Infinite M1000 Pro)测量450nm下的OD。

病毒血症患者和健康供体血浆的gp41免疫消减-在4℃下将1ml病毒血症患者血浆或健康供体血浆与100μg山羊抗gp41多克隆抗体(PA21719，Fisher)或对照山羊多克隆抗体(免疫前，AB108-C，R&D)于1.5ml Eppendorf管中在旋转器上一起温育过夜。然后在4℃下在旋转器上各样品添加200μl用PBS BSA 1％洗涤三次的蛋白G琼脂糖4快速流动珠(17-0618-01，GE healthcare)，持续3小时。为去除珠子，首先在4℃下在400xg下离心样品2分钟，收集上清液且然后在4℃下在16,100x g下离心15分钟。因为对照山羊多克隆抗体最初含有叠氮化钠，所以将其用PBS经10kDa Amicon洗涤5次，以在进行免疫消减之前去除叠氮化钠。

AT-2失活的HIV-1颗粒-为保留HIV颗粒的构象和功能完整性，用2,2-二硫二吡啶(AT-2；43791，Sigma)对HIV-1NDK(T向性)颗粒进行失活，且在PHA刺激的PBMC上如(Rossio等人,J Virol.1998)中所述制备。2,2-二硫二吡啶(aldrithiol-2；AT-2)共价修饰1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的核衣壳(NC)蛋白质中的必要锌指。用300μM AT-2对HIV-1颗粒进行失活两次，即在37℃下在水浴中持续1小时，之后在冰上持续2小时。

并行地，将PHA刺激的PBMC的上清液处理成HIV-1NDK感染的细胞上清液，以充当模拟对照(无HIV-1颗粒)。在感染性测定法中通过不可检测的TCID50证实HIV颗粒的失活。

通过抗HIV-1 gag p24 ELISA测定法(HIV-1Gag p24 Quantikine ELISA试剂盒，DHP240，R&D systems biotechne)测定HIV颗粒浓度。HIV-1颗粒以5000、500、50和5pg的p24/10e⁶个细胞使用。5000pg的p24/10e⁶个细胞(1754pg的p24/3.5×10e⁵个细胞)等效于每细胞1个颗粒(感染复数MOI是1)。

人类CD4 T淋巴细胞的纯化-静脉血液是经由EFS(Etablissement

duSang，Centre Necker-Cabanel，Paris)自健康志愿者获得。使用富含RosetteSep人类CD4+T细胞的混合液(干细胞，15062)自全血纯化CD4 T细胞。此混合液含有通过亲和色谱法使用蛋白A或蛋白G琼脂糖自小鼠腹水或杂交瘤培养上清液纯化的小鼠和大鼠单克隆抗体。这些抗体结合于双特异性四聚抗体复合物中，所述复合物是针对人类造血细胞上的细胞表面抗原(CD8、CD16、CD19、CD36、CD56、CD66b、TCRγ/δ)和红细胞上的血型糖蛋白A。rosetteSep抗体混合液使人类全血中的不期望的细胞与多种红细胞交联，形成免疫玫瑰(immunorosette)。由此增加不期望的细胞的密度，以使其在经浮力密度介质(诸如淋巴细胞分离介质(Eurobio，CMSMSL01-01))离心时连同红细胞一起沉淀。

在室温下在轻柔振荡(100rpm)下使全血与50μl/ml的富含RosetteSep人类CD4+T细胞的混合液一起温育20分钟，用等体积的PBS+2％胎牛血清(FBS)稀释且轻柔混合。稀释的样品在淋巴细胞分离介质的顶部在1200X g下离心20分钟。然后自血浆界面的密度介质收集富集的细胞，且用PBS+2％FBS洗涤两次。随后使细胞重悬于补充有5％FBS、50mM HEPES(pH 7.4)、谷氨酰胺、青霉素、链霉素和两性霉素B的RPMI 1640培养基(Lonza)(完全培养基)中，用Moxi Z小型自动化细胞计数器(ORFLO，MXZ000)计数。细胞悬浮液调节为7×10⁶个细胞/ml且在37℃下在5％CO2潮湿氛围中平衡至少2小时。

富集的CD4-T细胞群体经cytoflex(Beckman coulter)通过流式细胞术控制。回收的CD4 T细胞休眠通过低水平的IL-2Rα(CD25)控制。CD4 T细胞用抗人类CD3 eFluor780(eBioscience，克隆UCHT1，47-0038-42)、抗人类CD25-PE(Biolegend，克隆BC96，302605)和抗人类CD4-PerCP(BD，克隆SK3，345770)标记。富集的CD4-T细胞群体含有>95％的CD3+CD4+和小于8％的CD25+。

对CD4 T细胞进行PLA2-GIB生物测定法和标记特定蛋白质以用于光学显微法-在24孔聚苯乙烯板中，在37℃下，于调温的水中将平衡的纯化CD4T细胞装载(3.5×10⁵个细胞/50μl，于完全培养基中)于聚-L-赖氨酸包被(Sigma，P8920)的圆形盖玻片(14mm直径，Marienfeld)上，且与50μl含有肽、重组蛋白连同或不连同重组PLA2-GIB或含有病毒血症患者血浆(1或3％)或健康供体血浆的PBS BSA1％的悬浮液混合。细胞悬浮液用40μl于PBSBSA1％中的肽、重组蛋白或HIV-1NDK颗粒或模拟稀释液预处理15分钟，后续添加10μlPLA2-GIB(5nM，最终)持续30分钟，或直接用50μl肽或重组蛋白连同PLA2-GIB(5nM，最终)于PBS BSA 1％中的稀释液处理45分钟。将细胞用2nM重组经糖基化人类IL-7(AccrobioSystem)激活15分钟。去除细胞上清液且在37℃下通过添加500μl 4％多聚甲醛于PBS中的溶液(Fisher，PFA32％Electron Microscopy Science，15714)固定细胞15分钟，且然后于500μl冰冷90％甲醇/水溶液中透化20分钟。

然后用PBS加5％胎牛血清(FBS)将细胞再水化15分钟且然后进行标记。因此，在甲醇处理之后用PBS洗涤载片两次且在室温下用补充有5％FBS的PBS再水化15分钟。载片用于60μl PBS 5％FBS中的一抗(1/120)标记1小时，用PBS缓冲液洗涤15次，用PBS/FBS缓冲液洗涤5次，且然后用二抗(1/300)染色1小时。载片用PBS 5％FBS缓冲液洗涤5次，用PBS冲洗15次，且然后封装于新鲜Prolong Gold Antifade(ThermoFisher Scientific，P36930)封装剂中以用于共聚焦显微术。所用一抗由兔抗pSTAT5(pY694，9359，Cell Signalling)、小鼠抗CD4(BD Pharmingen，555344)组成，且二抗是驴抗小鼠IgG-AF488(Invitrogen，A21202)和驴抗兔IgG-AF555(Invitrogen，A31572)。

用抗gC1qR抗体60.11和74.5.2阻断gC1qR-平衡的纯化CD4 T细胞用抗gC1qR60.11(表位75-96，Santa Cruz，sc-23884)、74.5.2(表位204-218，Abcam，ab125132)(Ghebrehiwet B等人,Adv Exp Med Biol.2013)或对照IgG1(小鼠IgG1对照同种型，eBioscience/Affymetrix，16-4714)预温育30分钟，且在24孔聚苯乙烯板中，在37℃下，于调温的水中装载(3.5×10⁵个细胞/60μl，于完全培养基中)于聚-L-赖氨酸包被(Sigma，P8920)的圆形盖玻片(14mm直径，Marienfeld)上。细胞进一步用最终体积100μl的C1q(Sigma C1740，纯度>95％，10μg/ml)、PEP3肽(0.5μg/ml)在有或无5nM的PLA2-GIB下、或用病毒血症患者血浆(1％或3％)处理45分钟。然后用IL-7刺激细胞且如上文所述进行处理以通过共聚焦显微术分析pSTAT5 NT。

共聚焦显微术-经具有用于PFA固定的细胞的油浸平场复消色差63x/1.4NA物镜(Zeiss)的倒置激光扫描共聚焦显微术(LSM700，Zeiss)在衍射极限以上获取影像。获取影像且用ZEN软件(Zeiss)分析。

对[3H]花生四烯酸标记的CD4 T细胞或Jurkat E6.1 T细胞的PLA2-GIB酶促测定法-在37℃下，在5％CO2潮湿氛围中，于6孔板中，使2×10⁶个细胞/ml的纯化CD4 T细胞与1μCi/ml花生四烯酸[5,6,8,9,11,14,15-³H(N)](Perkin Elmer，NET298Z250UC)于补充有10％FBS、50mM HEPES(pH 7.4)、谷氨酰胺、青霉素、链霉素和两性霉素B的RPMI 1640培养基(Lonza)中以2ml/孔温育16小时。细胞用具有10％FBS的RPMI通过在室温下在580xg下离心10分钟而洗涤两次，且然后在-80℃下于90％FBS 10％DMSO中以10⁷个细胞/ml/小瓶冷冻。CD4 T细胞中[3H]花生四烯酸的百分比是(1减去无细胞的CD4 T细胞上清液中的[3H]花生四烯酸(cpm/ml)与上清液和细胞中的总[3H]花生四烯酸(cpm/ml)的比率。

在37℃下，在5％CO2潮湿氛围中，于6孔板中，使5×10⁵个细胞/ml的Jurkat E6.1T细胞(ECACC 88042803)或gC1qR KO Jurkat E6.1 T细胞与1μCi/ml的花生四烯酸[5,6,8,9,11,14,15-³H(N)](Perkin Elmer，NET298Z250UC)于补充有10％FBS、50mM HEPES(pH7.4)、谷氨酰胺、青霉素、链霉素和两性霉素B的RPMI 1640培养基(Lonza)中以2ml/孔温育17小时。细胞用具有10％FBS的RPMI通过在室温下在300xg下离心10分钟而洗涤两次，且然后在-80℃下于90％FBS 10％DMSO中以10⁷个细胞/ml/小瓶冷冻。CD4T细胞中[3H]花生四烯酸的百分比是(1减去无细胞的CD4 T细胞上清液中的[3H]花生四烯酸(cpm/ml)与上清液和细胞中的总[3H]花生四烯酸(cpm/ml)的比率。

为测试[3H]花生四烯酸标记的CD4 T淋巴细胞上的PLA2-GIB活性，细胞通过在室温下在580xg下离心10分钟而解冻于37℃下预热的10％FBS RPMI中，用2.5％FBS RPMI洗涤两次，且在37℃下，在5％CO2潮湿氛围中，于24孔聚苯乙烯板中以2×10⁵个CD4 T细胞/400μl/孔平衡1小时30分钟。然后将100μl于2.5％FBS RPMI中的重组蛋白(gp41 MN(565-771Delta642-725)，Antibodies online，ABIN2129703；HCV核心蛋白质，HCV-011,Prospec)或媒介物稀释液添加至各孔中持续2小时。将细胞和上清液收集于eppendorf管中且在室温下在580xg下离心10分钟。经计数器(tri-Carb 2800TR液体闪烁分析仪，Perkin Elmer)将300μl细胞上清液中所释放的[3H]花生四烯酸与16ml Ultima gold(Perkin Elmer，6013329)定量于低扩散小瓶(Perkin Elmer，6000477)中。

为测试[3H]花生四烯酸标记的Jurkat E6.1 T淋巴细胞上的PLA2-GIB活性，细胞通过在室温下在300xg下离心10分钟而解冻于37℃下预热的10％FBS RPMI中，用2.5％FBSRPMI洗涤两次，且在37℃下，在5％CO2潮湿氛围中，于24孔聚苯乙烯板中以5×10⁴或10⁵个Jurkat E6.1 T细胞/400μl/孔平衡1小时30分钟。然后将5.95μM的于2.5％FBS RPMI中的HCV核心溶液或媒介物稀释液与等体积的630nM或2μM的PLA2GIB的2.5％FBS RPMI溶液混合，且同时每孔添加100μl持续2小时。对于肽处理，如图所指示，细胞用50μl/孔的110μM或55μM于2.5％FBS RPMI中的肽溶液预处理2小时、4小时或21小时。然后添加50μl/孔的630nM或2μM的于2.5％FBS RPMI中的PLA2-GIB或单独培养基，持续2小时。将细胞和上清液收集于eppendorf管中且在室温下在580xg下离心10分钟。经计数器(tri-Carb 2800TR液体闪烁分析仪，Perkin Elmer)将300μl细胞上清液中所释放的[3H]花生四烯酸与16ml Ultima gold(Perkin Elmer，6013329)定量于低扩散小瓶(Perkin Elmer，6000477)中。

结果表示为PLA2GIB活性(用肽或HCV核心连同PLA2-GIB处理的细胞的上清液中[3H]花生四烯酸的释放减去仅有肽或缓冲液无PLA2-GIB下细胞的[3H]花生四烯酸的自发性释放，以cpm/ml计)或减去混杂PEP3下的活性的肽下的ΔPLA2-GIB活性(用肽处理的细胞的上清液中[3H]花生四烯酸的释放减去用混杂PEP3处理的细胞的[3H]花生四烯酸的释放，以cpm/ml计)。

结果和讨论

1.病毒血症患者血浆增加CD4 T细胞上的PLA2-GIB活性

我们先前已显示用75nM的单独PLA2-GIB处理CD4 T细胞显著降低由IL-7诱导的磷酸STAT5的核易位(pSTAT5 NT)，而用5nM PLA2-GIB处理不影响响应于IL-7的此核易位(缓冲液，图1A)。内源性PLA2-GIB消减的病毒血症血浆不影响响应于IL-7的磷酸SSTAT5易位。值得注意的是，添加5nM于1％内源性PLA2 GIB消减的病毒血症血浆中的PLA2-GIB产生40％的pSTAT5 NT抑制，而类似处理的健康供体血浆不起作用(n＝4个独立型供体，p<0.0001，图1A)。这些结果表明病毒血症血浆含有使CD4 T细胞对PLA2-GIB抑制敏感的辅因子。

为鉴别此病毒血症血浆辅因子的分子量，我们经截留30kDa和10kDa的过滤器对病毒血症血浆进行分级。如图1B所示，含有大于10kDa和小于30kDa的产物的内源性PLA2-GIB消减的病毒血症血浆的级分增加CD4 T细胞上的PLA2-GIB活性，但来自健康供体血浆的级分则不相同。含有大于30kDa的产物的内源性PLA2-GIB消减病毒血症血浆的级分和含有小于10kDa的产物的级分对PLA2-GIB活性不起作用。因此，病毒血症血浆患者含有分子量在10kDa与30kDa之间的辅因子，该辅因子使CD4 T细胞对在PLA2-GIB浓度单独不足以影响响应于IL-7的pSTAT5 NT的实验条件下PLA2-GIB的抑制敏感。

2.HIV-1失活病毒颗粒使CD4 T细胞对响应于IL-7的PLA2-GIB抑制活性敏感

为测试HIV-1病毒产物可在病毒血症血浆的辅因子活性中起作用的假定，我们首先研究HIV-1颗粒对健康供体CD4 T细胞中响应于IL-7的pSTAT5 NT的作用。我们使用先前用AT-2失活的T向性HIV-1NDK病毒的HIV-1颗粒测试不存在感染下病毒蛋白质对CD4 T细胞的作用。为测试辅因子活性，使CD4 T细胞暴露于呈单独形式或存在不抑制响应于IL-7的磷酸STAT5核易位的量的PLA2-GIB(5nM)形式的不同量的HIV颗粒(MOI是1、0.1、0.01和0.001)(图2)。在无PLA2-GIB下，响应于IL-7的pSTAT5NT大于92％，其与5nM的PLA2-GIB生物学类似，且如所预期在75nM和250nM的PLA2-GIB下，仅50％和10％。HIV-1颗粒单独并不影响响应于IL-7的pSTAT5 NT。值得注意的是，在存在5nM PLA2-GIB下，HIV-1颗粒产生pSTAT5 NT的剂量-反应抑制(在5pg/ml的p24(MOI＝0.001)下48％的pSTAT5 NT至在5000pg/ml的p24(MOI＝1)下仅8％的pSTAT5 NT，p<0.001，图2)，而具有5nM PLA2-GIB的对照(模拟)的类似稀释液对响应于IL-7的pSTAT5不起作用。这些结果表明一些病毒组分可起如病毒血症患者血浆中所观察到的使CD4 T细胞对PLA2-GIB活性敏感的辅因子的作用。

3.HIV-1 gp41蛋白质增加PLA2-GIB关于用IL-7刺激的CD4 T细胞中的pSTAT5NT的抑制活性

我们分析用不存在辅因子下不可抑制pSTAT5 NT的剂量(5nM)的PLA2-GIB连同或不连同重组gp41蛋白质一起预处理或在无PLA2-GIB下用单独gp41蛋白质(w/o GIB)预处理的细胞中响应于IL-7的pSTAT5 NT。如图3上所示，gp41蛋白质单独在0.5μg/ml的gp41下对响应于IL-7的pSTAT5NT具有微小抑制作用，仅抑制10％，且在0.25至0.05μg/ml的gp41下抑制小于8％(图3A和3B)。与之形成鲜明对比，在5nM的PLA2-GIB存在下，0.5μg/ml的gp41蛋白质产生大于60％的pSTAT5 NT抑制(图3B)，且在0.005μg/ml的gp41下剂量依赖性抑制至抑制18％(图3A)。

4.HIV-1 gp41蛋白质在病毒血症患者血浆对用IL-7刺激的CD4 T细胞中的pSTAT5NT的抑制活性中起关键作用

为证实gp41蛋白质可为病毒血症患者血浆中的PLA2-GIB的辅因子，我们用针对gp41的多克隆抗体(pAb抗gp41)或对照多克隆抗体(pAb ctrl)消减病毒血症患者血浆。健康供体血浆类似于阴性对照进行处理。如图4上所呈现，如所预期在75nM的PLA2-GIB下pSTAT5 NT的抑制是49％，且在250nM下是79％，且在无抗体的1％的病毒血症患者血浆下是39％且在无抗体的3％的病毒血症患者血浆下是54％。无抗体、有对照多克隆抗体或有抗gp41多克隆抗体的健康供体血浆对响应于IL-7的pSTAT5 NT无抑制作用，由此表明抗体对CD4 T细胞无毒性(图4)。用对照多克隆抗体处理病毒血症患者血浆不改变抑制活性，1％和3％的血浆下的抑制分别是43％和55％(图4)。值得注意的是，用抗gp41多克隆抗体进行免疫消减几乎消除病毒血症患者血浆的抑制活性，在1％和3％的免疫消减血浆下剩余抑制活性是6％和10％，(p<0.001，pAb抗gp41相对于pAb ctrl处理的血浆，图4)。总而言之，这些结果表明gp41是病毒血症患者血浆中的PLA2-GIB的辅因子。

5.gp41中的PEP3基序抑制用IL-7刺激的CD4 T细胞中的pSTAT5 NT

使CD4 T细胞暴露于含有潜在gC1qR结合元件的gp41的15个氨基酸肽域。肽含有SWSNKS基序。还使细胞暴露于对照(CTL)肽(图5A)连同(5nM GIB)或不连同(w/o)5nM的PLA2-GIB。尽管单独或有PLA2-GIB的CTL肽或单独PEP3对pSTAT5 NT不起作用，但用PEP3和5nM的PLA2-GIB处理产生pSTAT5 NT的PEP3剂量依赖性抑制，2.5μg/ml至0.025μg/ml的PEP3下的抑制分别是51％至18％(图5B)。如图5C所概述，单独用0.5μg/ml的PEP3处理仅产生5％的CD4 T细胞中的pSTAT5 NT抑制，而用0.5μg/ml PEP3连同5nM PLA2-GIB处理产生55％的抑制(p<0.05，n＝3个供体)。

6.PEP3对PLA2GIB具有辅因子作用

评价[3H]AA Jurkat E6.1 T细胞上PEP3对PLA2-GIB活性的作用。5×10⁴个JurkatE6.1细胞用PEP3或混杂PEP3预处理不同时段(长达21小时)。处理后2小时，将细胞与200nMPLA2-GIB一起温育。结果呈现于图11(3个实验的汇集)上。

如可见，相对于混杂PEP3，细胞用肽PEP3肽(11μM)的预处理4小时或更长显著增加对Jurkat E6.1 T细胞的膜的PLA2-GIB活性(p<0.001)。这些结果确定PEP3对PLA2GIB具有辅因子作用。

7.PEP3对PLA2-GIB的辅因子活性和病毒血症患者血浆的抑制活性取决于gC1qR

我们假设，gC1qR可在病毒血症患者血浆的抑制活性中起作用。为研究gC1qR在PLA2-GIB抑制pSTAT5 NT中的作用，我们测试gC1qR天然配体C1q对PLA2-GIB活性的作用。我们发现，单独C1q能够抑制40％pSTAT5 NT(p<0.001)。PLA2-GIB添加至C1q中使此抑制活性增加至抑制75-85％(p<0.01，图6A)，且两种不同抗gC1qR抗体显著抑制C1q以及辅因子对PLA2-GIB的作用，所述抗体恢复75％的反应(在C1q和5nM PLA2-GIB下60.11和75.4.2抗gC1qR抗体相对于IgG1ctrl，p<0.001，图6A)。值得注意的是，在PEP3和PLA2-GIB存在下抗gC1qR抗体74.5.2恢复54％的pSTAT5 NT(图6B，p<0.0001)且在用1％病毒血症患者血浆处理的细胞中恢复32％的pSTAT5 NT(图6C，p<0.0001)。相反，对照抗体(IgG1 ctrl)不抑制PLA2-GIB上的PEP3辅因子活性，也不抑制病毒血症患者血浆作用(图6B和6C)。

8.PEP3与gC1qR结合

如材料和方法中所述，PEP3与gC1qR的结合通过微孔板上的ELISA测定法进行测试。使用混杂肽或对照肽作为对照。

结果呈现于图12上。其显示PEP3与gC1qR结合，而混杂和对照肽基本上不与gC1qR结合。

9.gC1qR与PEP3辅因子对Jurkat T细胞膜的作用有关

测试[3H]AA Jurkat E6.1细胞上PEP3和gC1qR对PLA2-GIB活性的作用。5×10⁴个Jurkat E6.1 WT细胞gC1qR KO(1D5或2G9)用PEP3或混杂PEP3预处理21小时。处理后2小时，将细胞与PLA2-GIB一起温育。

结果呈现于图13(3个实验的汇集)上。相对于混杂PEP3，WT细胞而非gC1qR KO细胞用PEP3肽预处理21小时显著增加PLA2-GIB活性(p<0.01)。与gC1qR KO细胞相比，WT细胞上的PLA2-GIB活性显著更高。

这些结果进一步显示gC1qR与PEP3辅因子作用有关。

10.gp41蛋白质使CD4 T细胞膜对PLA2-GIB酶活性敏感

为研究PLA2-GIB对CD4 T细胞膜的作用，我们开发了CD4 T细胞用[3H]花生四烯酸标记的新的酶促测定法。当这些细胞暴露于PLA2-GIB时，CD4T细胞上的酶活性释放[3H]花生四烯酸。[3H]花生四烯酸的定量允许我们定量PLA2-GIB活性。

如我们上文所观察到gp41蛋白质可增加PLA2-GIB对pSTAT5 NT的抑制活性，我们假定gp41可增加PLA2-GIB对CD4 T细胞膜的酶活性。实际上，PLA2-GIB酶活性在gp41存在时且以gp41剂量依赖性方式高度且显著增加(p<0.01和p<0.001，图7)。单独Gp41处理对CD4 T细胞的[3H]花生四烯酸释放不起作用。关于CD4 T细胞的[3H]花生四烯酸释放，用0.5至5μg/ml的gp41处理使63nM的PLA2-GIB活性增加2.2至21倍，且使200nM的PLA2-GIB活性增加1.5至11.6倍，在5μg/ml的gp41下达到最大值。用5μg/ml gp41处理可使一些供体上的PLA2-GIB的活性增加大于70倍。

11.其他PLA2-GIB辅因子

我们表明gC1qR是PLA2-GIB辅因子的传感器，使我们研究其他gC1qR配体。

表2列举30种与gC1qR结合且因此可影响PLA2-GIB活性的不同分子。约一半这些分子是源自病原体：9种是病毒蛋白，4种是细菌组分，且一种是恶性疟原虫寄生物(表2)。一种分子LyP-1是人工gC1qR配体，且其他15种是内源性组分，五种来自血清且10种来自细胞。总而言之，这些结果表明PLA2-GIB活性可通过各种不同病原体组分和内源性因子调节，且此途径是通用致病机制。

12.HCV核心蛋白质使CD4 T细胞膜对PLA2-GIB酶活性敏感

我们分析重组HCV核心蛋白质存在下CD4 T细胞上的PLA2-GIB酶活性(图8)。HCV核心蛋白质含有gC1qR结合元件(参见表2)。我们的结果显示10和20μg/ml的单独HCV核心蛋白质略微诱导CD4 T细胞的[3H]花生四烯酸释放(图8A)。有趣的是，用PLA2-GIB和HCV核心蛋白质处理CD4 T细胞高度增加PLA2-GIB酶活性，且在10和20μg/ml的HCV核心蛋白质下63nM的PLA2-GIB使活性增加26倍和36倍，且200nM的PLA2-GIB使活性增加16倍和26倍(图8A)。如图8B所概述，单独用10μg/ml的HCV核心蛋白质处理略微且显著增加CD4 T细胞的[3H]花生四烯酸释放。此外，HCV核心蛋白质是极有效的PLA2-GIB辅因子，且63nM和200nM的PLA2-GIB分别使活性增加26倍和16倍(p<0.001，n＝3个供体)。这些结果显示HCV核心蛋白质可使CD4T细胞对PLA2-GIB抑制敏感，因此导致抑制具有丙型肝炎感染的患者的CD4 T细胞功能。

13.HCV核心蛋白质使Jurkat E6.1 T细胞膜对PLA2-GIB酶活性敏感

测试Jurkat E6.1细胞上HCV核心蛋白质对PLA2-GIB活性的作用。使HCV核心(595nM，等效于10μg/ml)与5×10e⁴个细胞一起温育。测量由PLA2-GIB所导致的[3H]AA的释放减去等效缓冲液中的活性。

结果呈现于图14上。其显示HCV核心蛋白质显著增加Jurkat E6.1 T细胞的膜上的PLA2-GIB活性，与CD4 T细胞膜上所观察到类似。

HCV核心蛋白质因此展现有效的辅因子作用。

14.金黄色葡萄球菌蛋白质A(SA蛋白质A)使CD4 T细胞对PLA2-GIB酶活性敏感

我们分析另一种gC1qR结合蛋白SA蛋白质A(表2)对CD4 T细胞上的PLA2-GIB酶活性的作用(图9)。如HCV核心蛋白质下所观察到，单独用10、25和50μg/ml的SA蛋白质A略微诱导CD4 T细胞的[3H]花生四烯酸释放(图9A，p<0.01)。值得注意的是，用PLA2-GIB和SA蛋白质A处理CD4 T细胞显著增加PLA2-GIB酶活性，10至50μg/ml的SA蛋白质A下200nM的PLA2-GIB使活性增加1.5倍至大于3倍(图9B，p<0.0001)。这些结果显示SA蛋白质A可使CD4 T细胞对PLA2-GIB抑制敏感，因此使得抑制具有金黄色葡萄球菌感染的患者的CD4 T细胞功能。这些结果也完成了对病毒蛋白质HCV核心的以上观察，且表明与gC1qR结合的细菌蛋白质可为PLA2-GIB辅因子。总而言之，HCV核心蛋白质和SA蛋白质A实验表明gC1qR激活/PLA2-GIB敏感可为病原体起作用的通用机制。

15.鉴别可充当PLA2-GIB辅因子的含有gC1qR结合域的蛋白质

我们筛选具有PEP3肽序列的蛋白质数据库以鉴别含有gC1qR结合元件的其他蛋白质。鉴别来自27种不同细菌物种和一种真菌(光滑假丝酵母)的42种蛋白质，一种来自菠萝，另一种来自秀丽隐杆线虫且最后一种来自人类(表1)。其中，我们鉴别可调节PLA2-GIB活性的来自9种人类病原体(8种细菌和1种真菌)的11种蛋白质，如表3中所概述。这些病原体已与癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病有关。举例而言，牙龈卟啉单胞菌感染与胰腺癌、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病相关，且光滑假丝酵母感染与HIV/AIDS患者、具有癌症、和化学疗法治疗和器官移植的患者中的皮肤念珠菌病相关。

16.HP牙龈卟啉单胞菌8(HP Pg)对PLA2-GIB具有辅因子作用

测量[3H]AA Jurkat E6.1细胞上肽HP Pg对PLA2-GIB活性的作用。10e⁵(左图)或5×10e⁴(右图)个Jurkat E6.1细胞用HP Pg、混杂PEP3或3S预处理21小时。处理后2小时，将细胞与200nM PLA2-GIB一起温育。

结果呈现于图15上。其显示相对于混杂PEP3，用HP Pg(SEQ ID NO:8)预处理显著增加PLA2-GIB活性。

这些结果表明HP Pg具有辅因子作用。

17.PDAC血浆对PLA2GIB具有辅因子作用

我们通过测量磷酸-STAT5核易位(pSTAT5 NT)测试来自PDAC患者的血浆调节CD4T细胞的IL-2反应的能力。

如图16中所示，我们观察到1％和3％稀释的PDAC血浆对CD4 T细胞IL-2反应的抑制作用。此结果表明，在癌症患者中，肿瘤微环境或血浆提供免疫调节，例如抑制。该研究结果指示，癌症含有使得T细胞对经PLA2-GIB的失活敏感的PLA2-GIB辅因子。

表2

表3

参考文献

Ghebrehiwet B,Jesty J,Vinayagasundaram R,Vinayagasundaram U,Ji Y,Valentino A,Tumma N,Hosszu KH,Peerschke EI.Targeting gC1qR domains fortherapy against infection and inflammation.Adv Exp Med Biol.2013；735:97-110.

Rossio JL,Esser MT,Suryanarayana K,Schneider DK,Bess JW Jr,VasquezGM,Wiltrout TA,Chertova E,Grimes MK,Sattentau Q,Arthur LO,Henderson LE,LifsonJD.Inactivation of human immunodeficiency virus type 1infectivity withpreservation of conformational and functional integrity of virion surfaceproteins.J Virol.1998Oct；72(10):7992-8001.

Platt EJ,Wehrly K,Kuhmann SE,Chesebro B,Kabat D.Effects of CCR5 andCD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates ofhuman immunodeficiency virus type 1.J Virol.1998Apr；72(4):2855-64.

Vieillard V,Strominger JL,DebréP.NK cytotoxicity against CD4+T cellsduring HIV-1infection:A gp41 peptide induces expression of an NKp44ligand.PNAS 2005Aug 2；102(31):10981-6.

Fausther-Bovendo H,Vieillard V,Sagan S,Bismuth G,DebréP.HIVgp41engages gC1qR on CD4+T cells to induce the expression of an NK ligandthrough the PIP3/H2O2 pathway.PLoS Pathog.2010Jul 1；6:e1000975.

Kittlesen DJ,Chianese-Bullock KA,Yao ZQ,Braciale TJ,HahnYS.Interaction between complement receptor gC1qR and hepatitis C virus coreprotein inhibits T-lymphocyte proliferation.J Clin Invest.2000Nov；106(10):1239-49.

Large MK,Kittlesen DJ,Hahn YS.Suppression of host immune response bythe core protein of hepatitis C virus:possible implications for hepatitis Cvirus persistence.J Immunol.1999Jan 15；162(2):931-8.

序列表

<110> 迪亚库雷特公司

<120> 治疗方法

<130> B2696

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB

<400> 1

Met Lys Leu Leu Val Leu Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ser Gly Ile Ser Pro Arg Ala Val Trp Gln Phe Arg Lys Met Ile Lys

20 25 30

Cys Val Ile Pro Gly Ser Asp Pro Phe Leu Glu Tyr Asn Asn Tyr Gly

35 40 45

Cys Tyr Cys Gly Leu Gly Gly Ser Gly Thr Pro Val Asp Glu Leu Asp

50 55 60

Lys Cys Cys Gln Thr His Asp Asn Cys Tyr Asp Gln Ala Lys Lys Leu

65 70 75 80

Asp Ser Cys Lys Phe Leu Leu Asp Asn Pro Tyr Thr His Thr Tyr Ser

85 90 95

Tyr Ser Cys Ser Gly Ser Ala Ile Thr Cys Ser Ser Lys Asn Lys Glu

100 105 110

Cys Glu Ala Phe Ile Cys Asn Cys Asp Arg Asn Ala Ala Ile Cys Phe

115 120 125

Ser Lys Ala Pro Tyr Asn Lys Ala His Lys Asn Leu Asp Thr Lys Lys

130 135 140

Tyr Cys Gln Ser

145

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> gC1qR

<400> 2

Met Leu Pro Leu Leu Arg Cys Val Pro Arg Val Leu Gly Ser Ser Val

1 5 10 15

Ala Gly Leu Arg Ala Ala Ala Pro Ala Ser Pro Phe Arg Gln Leu Leu

20 25 30

Gln Pro Ala Pro Arg Leu Cys Thr Arg Pro Phe Gly Leu Leu Ser Val

35 40 45

Arg Ala Gly Ser Glu Arg Arg Pro Gly Leu Leu Arg Pro Arg Gly Pro

50 55 60

Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ser Leu His Thr Asp Gly Asp Lys

65 70 75 80

Ala Phe Val Asp Phe Leu Ser Asp Glu Ile Lys Glu Glu Arg Lys Ile

85 90 95

Gln Lys His Lys Thr Leu Pro Lys Met Ser Gly Gly Trp Glu Leu Glu

100 105 110

Leu Asn Gly Thr Glu Ala Lys Leu Val Arg Lys Val Ala Gly Glu Lys

115 120 125

Ile Thr Val Thr Phe Asn Ile Asn Asn Ser Ile Pro Pro Thr Phe Asp

130 135 140

Gly Glu Glu Glu Pro Ser Gln Gly Gln Lys Val Glu Glu Gln Glu Pro

145 150 155 160

Glu Leu Thr Ser Thr Pro Asn Phe Val Val Glu Val Ile Lys Asn Asp

165 170 175

Asp Gly Lys Lys Ala Leu Val Leu Asp Cys His Tyr Pro Glu Asp Glu

180 185 190

Val Gly Gln Glu Asp Glu Ala Glu Ser Asp Ile Phe Ser Ile Arg Glu

195 200 205

Val Ser Phe Gln Ser Thr Gly Glu Ser Glu Trp Lys Asp Thr Asn Tyr

210 215 220

Thr Leu Asn Thr Asp Ser Leu Asp Trp Ala Leu Tyr Asp His Leu Met

225 230 235 240

Asp Phe Leu Ala Asp Arg Gly Val Asp Asn Thr Phe Ala Asp Glu Leu

245 250 255

Val Glu Leu Ser Thr Ala Leu Glu His Gln Glu Tyr Ile Thr Phe Leu

260 265 270

Glu Asp Leu Lys Ser Phe Val Lys Ser Gln

275 280

<210> 3

<211> 344

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 3

Ala Ala Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser

1 5 10 15

Thr Met Gly Ala Ala Ser Val Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Leu Leu

20 25 30

Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu

35 40 45

Ser Gln Gln His Met Leu Arg Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu

50 55 60

Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu

65 70 75 80

Leu Gly Phe Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Thr Val

85 90 95

Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Asp Asp Ile Trp Asn

100 105 110

Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Glu Arg Glu Ile Asp Asn Tyr Thr Ser

115 120 125

Leu Ile Tyr Ser Leu Leu Glu Lys Ser Gln Thr Gln Gln Glu Lys Asn

130 135 140

Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp

145 150 155 160

Phe Asp Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile Phe Ile Met Ile

165 170 175

Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser Ile

180 185 190

Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Leu Gln Thr Arg

195 200 205

Pro Pro Val Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu

210 215 220

Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Thr Ser Gly Arg Leu Val His Gly Phe

225 230 235 240

Leu Ala Ile Ile Trp Val Asp Leu Arg Ser Leu Phe Leu Leu Ser Tyr

245 250 255

His His Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Ala Ala Arg Ile Val Glu Leu

260 265 270

Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Val Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu Leu

275 280 285

Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Ser Ser Ala Val Ser Leu Leu Asn

290 295 300

Ala Ala Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val

305 310 315 320

Leu Gln Arg Ala Gly Arg Ala Ile Leu His Ile Pro Thr Arg Ile Arg

325 330 335

Gln Gly Leu Glu Arg Ala Leu Leu

340

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 4

Ala Trp Asn Ala Ile Trp Ile Asn Arg Lys Tyr Glu Gln Ile Asp

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 5

Gly Ile Ala Glu Ser Trp Pro Asn Ser Leu Asp Asp Ser Cys Ala

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 6

Gly Ile Ala Glu Ser Trp Pro Asn Ser Leu Asp Asp Ser Cys Ala

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 7

Ser Phe Leu Lys Ser Trp Phe Asn Asn Ser Leu Val Asp Ile Gly

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 8

Ser Gly Glu Gly Gly Trp Ser Asn Gly Ser Leu Val Asp Ile Met

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 9

Tyr Glu Leu Asp Ala Ala Ser Asn Asn Ser Val Asp Asp Ile Arg

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 10

Ala Ala Leu Gly Lys Thr Leu Val Lys Ser Leu Asp Asp Ile Pro

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 11

Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asp Lys Phe Tyr Glu Asn Ser Leu

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 12

Ala Ile His Ala Ser Trp Ser Asn Thr Ser Tyr Glu Val Ile Asp

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 13

Pro Trp Asn Ala Gly Trp Ser Asn Ala Arg Phe Asp Glu Leu Cys

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 14

Pro Trp Asn Ala Ile Trp Ser Ala Lys Asn Thr Thr Val Asp Ser

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 15

Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Ala Ala Gly Val Gly Ala His Ala

1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 16

Trp Phe Asn Ala Ser Trp Lys Asp Lys Ser Tyr Ser Thr Val Trp

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 17

Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Val Arg His Ile Ser Glu Leu Glu

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 18

Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Tyr Val Leu Asp Ser Ala Trp Ser

1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 19

Pro Trp Asn Gly Ser Trp Ser Asn Asp Ala Trp Gly Pro Gly Thr

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 20

Pro Trp Asn Ala Gly Trp Ser Asn Ala Arg Phe Asp Glu Leu Cys

1 5 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 21

Pro Trp Asn Ala Gly Trp Ser Leu Lys Ser Ser Gly Lys Ser Ala

1 5 10 15

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 22

Pro Trp Asn Ala Trp Trp Ser Asn Arg Ser Met Ile Ala Asp Val

1 5 10 15

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 23

Ala Trp Asn Glu Ser Trp Ser Asn Lys Ser Phe His Asn Gly Ala

1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 24

Glu Phe Asn Ala Asn Trp Ser Asn Lys Phe Tyr Leu Tyr Asn Gln

1 5 10 15

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 25

Arg Trp Asn Thr Ser Trp Ser Asn Trp Ala Arg Thr Glu Arg Ser

1 5 10 15

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 26

Asn Trp Asn Thr Ser Trp Ser Asn Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ser

1 5 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 27

Ser Ile Asn Ala Ala Trp Ser Asn Gln Ser Tyr Gly Phe Ser Arg

1 5 10 15

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 28

Asn Asn Asn Ala Gln Trp Ser Asn Lys Glu Tyr Asp Lys Ile Val

1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 29

His Thr Cys Ala Ser Trp Cys Asn Lys Ser Leu Ser Asp Ile Val

1 5 10 15

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 30

Lys Asp Ile Thr Ser Trp Val Asn Lys Ala Leu Asp Ala Ile Ala

1 5 10 15

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 31

Gly Ala Leu Ser Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu His Cys Cys Glu

1 5 10 15

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 32

Glu Lys Val Ala Asn Trp Ser Ile Lys Ser Leu Gly Leu Thr Val

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 33

Lys Phe Ile Glu Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Trp Leu Gly Glu

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 34

Phe Leu Leu Tyr Ala Leu Ser Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile Trp

1 5 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 35

Pro Thr Ser Val Ser Trp Ser Asn Tyr Glu Gln Ile Leu Val Gly

1 5 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 36

Asp Glu Gln Lys Gln Trp Arg Asn Lys Ser Leu Glu Gln Leu Trp

1 5 10 15

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 37

Tyr Leu Gly Val Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Leu Tyr Ser Tyr

1 5 10 15

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 38

Met Ser Lys Phe Gly Leu Ser Asp Lys Ser Ile Glu Gln Ile His

1 5 10 15

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 39

Met Arg Tyr Thr Val Glu Ser Gly Lys Ser Leu Asp Asp Ile Trp

1 5 10 15

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 40

Phe Glu Leu Val Cys Ala Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Leu Ala

1 5 10 15

<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 41

Asp His Asp Lys Gly Leu Glu Thr Glu Ser Leu Glu Gln Ile Trp

1 5 10 15

<210> 42

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 42

Glu Pro Lys Asp Phe Arg Glu Ser Ala Thr Leu Asn Gln Ile Trp

1 5 10 15

<210> 43

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<220>

<221> misc_feature

<222> (180)..(180)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 43

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Ile

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly

20 25 30

Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala

35 40 45

Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro

50 55 60

Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly

65 70 75 80

Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp

85 90 95

Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro

100 105 110

Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys

115 120 125

Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Val Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu

130 135 140

Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Ala Leu Glu Asp

145 150 155 160

Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile

165 170 175

Ser Leu Trp Xaa Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala

180 185 190

<210> 44

<211> 516

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PLA2-GIB辅因子

<400> 44

Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro

20 25 30

Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr

35 40 45

Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe

50 55 60

Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly

65 70 75 80

Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln

85 90 95

Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu

100 105 110

Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser

115 120 125

Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys

130 135 140

Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys

145 150 155 160

Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn

165 170 175

Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser

180 185 190

Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln

195 200 205

Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe

210 215 220

Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly

225 230 235 240

Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu

245 250 255

Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn

260 265 270

Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu

275 280 285

Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys

290 295 300

Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu

305 310 315 320

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys

325 330 335

Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys

340 345 350

Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys

355 360 365

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys

370 375 380

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys

385 390 395 400

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys

405 410 415

Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn

420 425 430

Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp

435 440 445

Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val

450 455 460

Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val

485 490 495

Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg

500 505 510

Arg Arg Glu Leu

515

<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PEP3肽

<400> 45

Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Asp Asp Ile Trp

1 5 10 15

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照肽

<400> 46

Pro Trp Asn Ala Thr Trp Thr Gln Arg Thr Leu Asp Asp Ile Trp

1 5 10 15

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

caccgaagtg accgtgattc taaaa 25

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

aaacttttag aatcacggtc acttc 25

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

tactacagcc cttgttctt 19

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

agcacttcct gaaatgtt 18

Claims (31)

1.用于治疗哺乳动物受试者中癌症的化合物，其中所述化合物是PLA2-GIB辅因子的抑制剂。

2.根据权利要求1使用的化合物，其中所述癌症是实体癌。

3.根据权利要求2使用的化合物，其中所述癌症选自胰腺癌、黑素瘤、肺癌、食管癌或咽癌、视网膜母细胞瘤、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌、十二指肠癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、脑癌或结肠直肠癌。

4.根据权利要求3使用的化合物，其中所述癌症是胰腺癌。

5.根据权利要求4使用的化合物，其中所述癌症选自胰腺腺癌、神经内分泌肿瘤、导管内乳头状粘液性新生物、粘液性囊性新生物和严重的囊性新生物。

6.根据权利要求1至5中任一项使用的化合物，用于预防癌症或降低癌症发生率。

7.根据权利要求1至5中任一项使用的化合物，用于降低癌症进展率。

8.根据权利要求1至5中任一项使用的化合物，用于减少或预防或治疗癌症转移。

9.根据权利要求1至5中任一项使用的化合物，用于杀伤癌细胞。

10.根据权利要求1至5中任一项使用的化合物，用于治疗癌症的危险因素，特别是口-胃-肠道炎症或感染，如胰腺炎。

11.根据权利要求1至10中任一项使用的化合物，其中所述PLA2-GIB辅因子是gClqR的配体。

12.根据权利要求1至10中任一项使用的化合物，其中所述PLA2-GIB辅因子是选自表1或2的蛋白质的蛋白质或此类蛋白质的gC1qR结合元件。

13.根据权利要求1至12中任一项使用的化合物，其中所述PLA2-GIB辅因子是病原体的组分或营养物，优选来自病原体的蛋白质或肽。

14.根据权利要求1至13中任一项使用的化合物，其中所述PLA2-GIB辅因子是病毒或细菌或真菌或寄生物蛋白质或肽。

15.根据权利要求1至14中任一项使用的化合物，其中所述抑制剂抑制所述辅因子与gC1qR的结合。

16.根据权利要求1至14中任一项使用的化合物，其中所述抑制剂抑制所述辅因子的表达。

17.根据权利要求1至14中任一项使用的化合物，其中所述抑制剂是与gC1qR或辅因子结合并且抑制gC1qR的功能的化合物。

18.根据权利要求1至17中任一项使用的化合物，其中所述抑制剂是抗体或抗体的变体或片段。

19.根据权利要求18使用的化合物，其中所述抑制剂是抗体或其变体或片段，其结合gC1qR或选自表1或表2的蛋白质并且优选抑制所述蛋白质与gC1qR的结合。

20.根据权利要求1至18中任一项使用的化合物，其中所述抑制剂是肽或脂肽。

21.根据权利要求20使用的化合物，其中所述抑制剂是结合gC1qR并抑制选自表1或2的蛋白质与gC1qR结合的肽。

22.根据权利要求1至18中任一项使用的化合物，其中所述抑制剂是核酸。

23.根据权利要求1至18中任一项使用的化合物，其中所述抑制剂是碳水化合物。

24.根据权利要求1至16中任一项使用的化合物，其中所述抑制剂是所述PLA2-GIB辅因子的免疫原，其可以诱导针对所述辅因子的抗体。

25.根据权利要求1至24中任一项使用的化合物，其中所述辅助因子调节剂与另一种药物或治疗组合施用。

26.根据权利要求23使用的化合物，其中所述化合物与化学疗法或激素疗法组合施用。

27.根据权利要求23使用的化合物，其中所述化合物与放射疗法、超声疗法或纳米粒子疗法组合施用。

28.根据权利要求23使用的化合物，其中所述化合物与检查点抑制剂、免疫疗法或抗癌疫苗组合施用。

29.根据权利要求23使用的化合物，其中所述化合物与PLA2-GIB的抑制剂组合施用。

30.根据权利要求29使用的化合物，其中所述PLA2-GIB的抑制剂是PLA2-GIB的拮抗剂。

31.根据权利要求1至23中任一项使用的化合物，其中在手术之前、期间或之后施用所述化合物。

Images