TW202000227A

TW202000227A - 治療方法

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Publication number: TW202000227A
Application number: TW108106934A
Authority: TW
Inventors: 茱莉安波絲莉克特; 菲利浦鮑麗緹; 賈克斯泰斯
Original assignee: 法商迪亞庫雷特公司
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2020-01-01
Also published as: CA3091996A1; WO2019166412A1; EP3758750A1; JP2021514994A; WO2019166413A1; EP3758733A1; CN112512570A; CN112533624A; EP3530282A1; CA3092004A1; US20200397855A1; US20200399392A1; WO2019166412A9; JP2021514990A

Abstract

本發明係關於使用PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔因子之調節劑治療或預防哺乳動物、尤其人類個體之疾病之新穎治療方法。

Description

治療方法

本發明係關於治療或預防哺乳動物、尤其人類個體之疾病之新穎治療方法。本發明提供根據抑制各種病原體在哺乳動物中起作用之新穎機制的治療方法。本發明可單獨或與其他治療組合用於預防性或治癒性方法中以對抗由諸如病毒或細菌之各種病原體所導之疾病。

發明人已證明sPLA2-GIB與HIV感染之患者中CD4 T細胞不活化有關(參見WO2015/097140)。因此，發明人提議且證明sPLA2-GIB調節劑對治療哺乳動物之疾病，例如與免疫缺乏有關之病症有效。

繼續進行其研究，申請人現已發現sPLA2-GIB之效應可由病變個體中存在之輔因子介導及/或放大，且此類輔因子經由gC1q受體在T細胞表面起作用。詳言之，本發明人現已展示病原體產生或活化結合至gC1qR之輔因子，從而使CD4 T細胞對經極低劑量之sPLA2-GIB不活化敏感。在感染此類病原體之患者中，CD4 T細胞變得對經生理量之sPLA2-GIB不活化敏感，而在非感染個體中，CD4 T細胞仍保持對經此類生理濃度之sPLA2-GIB不活化有抗性。本發明人已鑑別來自包括病毒或細菌(諸如HIV、HCV或金黃色葡萄球菌(S. aureus))之各種病原體之此類結合gC1qR之輔因子。申請人亦證實該等輔因子可使CD4 T細胞對經sPLA2-GIB不活化敏感，且活體內阻斷此類輔因子可恢復或維持CD4 T細胞對經sPLA2-GIB不活化有抗性。申請人因此鑑別一種新穎的通用機制，許多病原體藉由該機制，亦即藉由誘導CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化敏感而在哺乳動物中誘發疾病或病理性病狀。此類出人意料的研究結果使得申請人提供一種新穎的治療方法，該方法係基於此類輔因子之調節，諸如其阻斷或抑制，由此阻止、避免或至少降低許多病原體之病原性效應。

本發明之一目標為提供治療哺乳動物個體之方法，其包含向個體投與PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔因子之調節劑。

本發明之另一目的係關於調節哺乳動物個體之免疫反應之方法，其包含向個體投與PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔助因子之調節劑。

本發明之另一目的為PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔因子之調節劑，其係用於治療哺乳動物個體。

本發明亦係關於PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔助因子之調節劑，其係用於調節哺乳動物個體之免疫反應。

PLA2-GIB輔因子可為病原體之組分或營養物，較佳係來自病原體或藉由病原體活化之蛋白質或肽。在一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係病毒或細菌或真菌或寄生蟲蛋白質或肽。

PLA2-GIB輔因子之調節劑可為PLA2-GIB輔因子之抑制劑、或PLA2-GIB輔因子之免疫原、或PLA2-GIB輔因子之活化劑、促效劑或模擬抗原決定基。視藥劑或調節劑之類型而定，本發明可用以例如治療具有需要免疫抑制或免疫刺激療法之病狀的個體。

本發明亦係關於用於治療由病原體所導之病症的組合療法或治療方案，其包含至少兩種選自以下之活性劑的組合：(i)具有抗病原體活性之藥物、(ii)PLA2-GIB輔因子之調節劑及(iii)PLA2-GIB之調節劑，該藥物及調節劑係用於組合、各別或連續投與。

本發明亦係關於PLA2-GIB輔因子或其促效劑或模擬抗原決定基之用途，其係用於製造藉由增加PLA2-GIB對T細胞之作用誘導有需要個體之免疫抑制之藥物。

本發明亦係關於PLA2-GIB輔因子之調節劑，其係用於通常藉由調節PLA2-GIB對T細胞之作用來調節有需要個體之免疫反應。

本發明亦係關於PLA2-GIB輔因子之抑制劑之用途，其係用於製造刺激有需要個體之免疫反應之藥物。

在另一態樣中，本發明係關於一種選擇免疫刺激分子之方法，其包含測試候選分子是否可抑制gC1qR介導之CD4 T細胞敏感化。

本發明可用於任何哺乳動物，尤其人類個體中。其適合於治療其中刺激或恢復CD4 T細胞有益之病症，諸如由感染性病原體或不合需要的細胞增生所導之疾病（例如癌症）。

本發明通常係關於用於治療有需要個體之哺乳動物之新穎治療性組合物及方法，其包含施用調節PLA2-GIB輔因子之治療。治療可包含投與輔因子本身；或輔因子之活化劑、促效劑或模擬抗原決定基；或輔因子之抑制劑或免疫原。此類治療較佳以直接或間接調節PLA2-GIB對CD4 T細胞之作用的方式執行(且較佳以直接或間接調節PLA2-GIB對CD4 T細胞之作用的量施用治療)，通常以可維持或恢復個體中CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化有抗性或致使個體中CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化敏感的方式執行。

定義如本文所用，術語「PLA2-GIB」(或「PLA2-G1B」)表示基團IB胰臟磷脂酶A2。PLA2-GIB已得以鑑別且自各種哺乳動物物種選殖出。人類PLA2-GIB蛋白質揭示於例如Lambeau及Gelb (2008)中。序列可以Genbank號NP_000919獲得。

以下展示例示性人類PLA2-GIB之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)。

SEQ ID NO: 1之胺基酸1至15 (加下劃線)係信號序列，且SEQ ID NO: 1之胺基酸16至22 (呈粗體)係前肽序列。

在本發明之上下文內，術語「PLA2-GIB」較佳表示人類PLA2-GIB。

人類PLA2-GIB蛋白質可以兩種不同形式存在：前形式(前-sPLA2-GIB)，其藉由前肽之蛋白水解裂解活化，產生成熟分泌形式(sPLA2-GIB)。術語PLA2-GIB包括任何形式之蛋白質，諸如前形式及/或成熟形式。通常，成熟分泌形式包含SEQ ID NO: 1或其任何天然變異體之胺基酸殘基23-148之序列。

蛋白質之天然變異體包括例如由多形現象或拼接產生之變異體。天然變異體亦可包括包含SEQ ID NO: 1之序列，或SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基23-148之序列及一個或若干個(通常1、2或3個)胺基酸殘基之一或多個胺基酸取代、添加及/或缺失的任何蛋白質。變異體包括與SEQ ID NO: 1具有例如至少90%胺基酸序列一致性的天然產生之變異體。特定變異體與SEQ ID NO: 1相比含有一個或若干個(通常1、2或3個)胺基酸殘基之不超過10個胺基酸取代、添加及/或缺失。典型天然產生之變異體保留PLA2-GIB之生物活性。就此而言，在一些實施例中，PLA2-GIB具有至少一種選自以下之活性：誘導來自健康個體之CD4 T細胞中之膜微結構域(MMD)形成，或使健康個體之CD4 T細胞難以進行介白素信號傳導，諸如難以進行IL-2信號傳導或難以進行IL-7信號傳導或難以進行IL-4信號傳導。在一些實施例中，使健康個體之CD4 T細胞難以進行介白素-7信號傳導包含該等細胞中之STAT5A及/或B磷酸化降低至少約10%、至少約20%、至少約30%或至少約40%。在一些實施例中，使健康個體之CD4 T細胞難以進介白素-7信號傳導包含磷酸基-STAT5A及/或磷酸基-STAT5B之核易位速率降低至少約20%、至少約30%、至少約40%或至少約50%。

術語「序列一致性」在應用於核酸或蛋白質序列時係指使用標準化演算法對比對之至少兩個序列之間的核苷酸或胺基酸殘基匹配之定量化(通常百分比)，該標準化演算法係諸如史密斯-沃特曼比對(Smith-Waterman alignment) (Smith及Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-197)：CLUSTALW (Thompson等人 (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680)或BLAST2 (Altschul等人 (1997) Nucleic Acids Res 25:3389-3402)。BLAST2可以標準化及可再現方式用以在序列中之一者中插入間隙以使比對達最佳且在其之間獲得更有意義的比較。

關於CD4 T細胞之術語「不活化」指示此類細胞失去其至少一部分有助於發生有效免疫反應之能力。不活化可為部分或完全、瞬時或永久的。不活化較佳表示CD4 T細胞之功能，尤其pSTAT5核易位及/或CD4 T細胞免疫刺激活性降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。通常，非活性CD4 T細胞並無有效pSTAT5核易位。在一特定實施例中，非活性CD4 T細胞為無反應性CD4 T細胞。

術語CD4 T細胞對經sPLA2-GIB不活化「有抗性」(或「不敏感」)指示在本發明之上下文內，CD4 T細胞在活體外在5nM sPLA2-GIB存在下培育時基本上不為不活化的。有抗性指示例如CD4 T細胞在活體外在5nM sPLA2-GIB及介白素-7存在下培育時保留pSTAT5之活性核易位。CD4 T細胞對sPLA2-GIB有抗性(或不敏感)亦可指示在活體外與5nM PLA2-GIB一起培育之CD4 T細胞仍保持免疫功能，例如並不變得無反應性。

輔因子作用 本發明人已發現許多病原體藉由使CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化敏感而起作用。咸信此類機制涉及(誘導)使病原體之分子結合至CD4 T細胞表面之gC1qR，致使CD4 T細胞對經生理濃度之PLA2-GIB不活化敏感。詳言之，分析藉由PLA2-GIB使CD4 T細胞不活化之機制，本發明人發現gC1qR之促效劑使CD4 T細胞對低劑量之PLA2-GIB敏感。因而，在此類輔因子及生理量之PLA2-GIB存在下，CD4 T細胞變為非活性的(例如無反應性)，而在僅生理量之PLA2-GIB存在下其保持活性。本發明人證實gC1qR之天然配體gC1q展現此類輔因子作用，且抗gC1q抗體可阻斷此類輔因子作用。本發明人亦出人意料地發現，包括病毒及細胞之許多病原體實際上含有或產生或活化使得CD4 T細胞對經sPLA2-GIB不活化敏感之此類輔因子。詳言之，本發明人已展示(i) HCV核心蛋白質可結合gC1qR，且致使CD4 T細胞對經sPLA2-GIB不活化敏感，(ii)葡萄球菌蛋白質A可結合gC1qR且致使CD4 T細胞對經sPLA2-GIB不活化敏感，(iii) HIV gp41可結合gC1qR且致使CD4 T細胞對經sPLA2-GIB不活化敏感，及(iv)來自癌症患者之血漿致使CD4 T細胞對經sPLA2-GIB不活化敏感。

申請人因此鑑別出一種新穎的通用機制，許多病原體藉由該機制，亦即藉由產生或活化誘導CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化敏感之輔因子而在哺乳動物中誘發疾病或病理性病狀或(至少暫時性)免疫缺陷。本發明人尤其發現癌症中之PLA2GIB輔因子，表明此類機制亦與癌症之發生及顯現有關。此類出人意料的研究結果使得申請人根據該機制之調節(例如阻斷或抑制或刺激)提供新穎的治療方法，由此阻止、避免或至少降低許多病原體之病原性作用，或誘導免疫抑制。

因此本發明之目的為提供用於治療哺乳動物個體之方法及組合物，其包含向個體投與PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔因子之調節劑。

本發明之另一目的為提供用於調節哺乳動物個體之免疫反應之方法及組合物，其包含向個體投與PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔助因子之調節劑。

本發明之另一目的係關於PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔助因子之調節劑，其係用於調節哺乳動物個體之免疫反應。

本發明之另一目的係關於一種PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔助因子之調節劑，其係用於治療有需要個體，尤其患有需要免疫抑制或免疫刺激療法之疾病或病狀之個體。

本發明之另一目的為提供用於恢復/維持哺乳動物中CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化有抗性之方法及組合物。

本發明亦係關於PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔因子之調節劑之用途，其係用於製造用以治療有需要個體，尤其患有需要免疫抑制或免疫刺激療法之病狀之個體的藥物，更尤其用於調節有需要個體之免疫反應。

PLA2 - GIB 輔因子 本發明人已出人意料地發現，許多不同類型的病原體充當(或產生或活化) PLA2-GIB之輔因子，該PLA2-GIB之輔因子與PLA2-GIB組合致使CD4 T細胞不活化。詳言之，如圖8所示，HCV核心蛋白質致使CD4 T細胞對經低濃度之sPLA2-GIB不活化敏感。類似地，如圖9所示，葡萄球菌蛋白質A致使CD4 T細胞對經低濃度之sPLA2-GIB不活化敏感，且如圖3至7所示，HIV gp41致使CD4 T細胞對經低濃度之sPLA2-GIB不活化敏感。圖15展示來自牙齦卟啉單胞菌之肽具有PLA2GIB輔因子作用，且圖16進一步表明來自癌症患者之血漿具有PLA2GIB輔因子作用。本發明人已進一步發現此等輔因子分子係gC1qR之配體，且抑制其與gC1qR結合亦抑制輔因子作用(圖6B及6C)。

本發明人因此鑑別藉由病原體及/或在病原性病狀中產生之可結合gC1qR且充當sPLA2-GIB之輔因子的各種分子。

在本發明之上下文內，術語PLA2-GIB之「輔因子」因此表示增強或放大或介導PLA2-GIB之作用，尤其PLA2-GIB對CD4 T細胞之作用的任何分子或藥劑。較佳輔因子係可使CD4 T細胞對經低濃度之PLA2-GIB不活化敏感之分子。

在本發明之一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係gC1qR之配體。本發明人確實已表明，CD4 T細胞表面之gC1qR之配體充當PLA2-GIB之輔因子，從而使細胞對經PLA2-GIB不活化更敏感。更特定言之，PLA2-GIB輔因子係gC1qR之促效劑，例如可經由gC1qR誘導信號傳導，更特定言之可誘導gC1qR介導之胞外分泌。

在此態樣中，本發明人已鑑別可充當PLA2-GIB之輔因子之各種蛋白質，如表1至3中所列舉。在本發明之一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係選自表1或2之蛋白質的蛋白質或此類蛋白質之gC1qR結合元素。更特定言之，輔因子可為包含SEQ ID NO: 2-44中之任一者或選自ID NO: 45-71之蛋白質，更佳選自SEQ ID NO: 3、43、44及ID 45-61中之任一者，甚至更佳選自SEQ ID NO: 3、43、44及ID 45-55中之任一者或其任何片段或模擬抗原決定基的任何蛋白質。

關於此類輔因子之術語「片段」較佳表示含有此類蛋白質之gC1qR結合元素之片段及/或保留結合gC1qR能力之片段。較佳片段含有至少5個，通常5與100個之間的連續胺基酸殘基。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係病原體之組分或營養物，較佳來自病原體之蛋白質或肽。在一更特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係病毒或細菌或真菌或寄生蟲蛋白質或肽。此類輔因子之較佳實例列舉於表2及3中。

在一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係HCV核心蛋白質或其片段或模擬抗原決定基。在一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 43組成之蛋白質或肽或其模擬抗原決定基或片段。 SEQ ID NO: 43 GenBank: ARQ19013.1

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係葡萄球菌蛋白質A或其片段或模擬抗原決定基。在一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 44組成之蛋白質或肽或其模擬抗原決定基或片段。 SEQ ID NO :44 NCBI參考序列：YP_498670.1

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係HIV gp41或rev，或其片段或模擬抗原決定基。在一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 3或ID NO: 51組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與HIV感染有關。 SEQ ID NO: 3 GenBank參考號AAC31817.1

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 45組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與EBV感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 46組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與腺病毒感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 47組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與漢坦病毒(Hantaan virus)感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 48組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與HSV感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 49或50組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與風疹病毒(Rubella virus)感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 52組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與單核球增多性李斯特菌(L. monocytogenes)感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 53組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 54組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 55組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)感染有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 7或8組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與牙齦卟啉單胞菌有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 14組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與奇異變形桿菌(P. mirabilis)有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 18組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與韋氏鉤端螺旋體菌株(L. weilii str)有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 28組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與甘油利用泰瑞孢子菌(T. glycolicus)有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 29或30組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與鬆脆桿菌(B. fragilis)有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 33組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與光滑假絲酵母(C. glabrata)有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 38組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與伴放線凝聚桿菌(A. actinomycetemcomitans)有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 41組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與索氏卟啉單胞菌(P. somerae)有關。

在另一特定實施例中，PLA2-GIB輔因子係包含或由SEQ ID NO: 42組成之蛋白質或肽或其片段或模擬抗原決定基。此類輔因子尤其與嗜沫凝集桿菌(A. aphrophilus)有關。

輔因子之其他說明性實例係癌症患者血漿中之分子或藥劑，或其變異體或衍生物，其可對PLA2GIB發揮輔因子作用。

調節輔因子作用之治療 本發明提出藉由調節此類輔因子作用治療患病個體及/或恢復/增強個體中之CD4 T細胞活性。本發明因此提供使用PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔因子之調節劑治療患病個體及/或恢復/增強個體之CD4 T細胞活性之方法及組合物。

術語PLA2-GIB輔因子之「調節劑」在本發明之上下文內表示可直接或間接調節PLA2-GIB輔因子之表現或活性的任何分子。調節劑因此可為PLA2-GIB輔因子之抑制劑；或PLA2-GIB輔因子之免疫原(其誘導抗輔因子抗體)；或PLA2-GIB輔因子之活化劑、促效劑或模擬抗原決定基。

輔因子抑制劑 術語輔因子之「抑制劑」表示引起(直接或間接)抑制輔因子之表現或功能(例如輔因子與gC1qR之結合或輔因子使CD4 T細胞對 PLA2-GIB敏感之能力)的任何分子或治療。抑制輔因子較佳表示輔因子之表現或功能降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多，以及完全阻斷或抑制該表現或功能。視情況而定，抑制可為瞬時、持續或永久性的。

在特定實施例中，輔因子之抑制劑係gC1qR抑制劑。實際上，輔因子結合作為目標受體之gC1qR。使用gC1qR抑制劑阻斷或降低或阻止輔因子與gC1qR之結合可影響輔因子作用。術語「gC1qR抑制劑」表示引起(直接或間接)抑制gC1qR之功能(例如gC1qR介導之胞外分泌)的任何分子或治療。

gC1qR表示細胞、尤其CD4 T細胞之表面之補體C1q的受體，尤其該受體之人類形式。gC1qR亦稱為C1q結合蛋白(C1QBP)、ASF/SF2相關蛋白p32 (SF2P32)；糖蛋白gC1qBP；玻尿酸結合蛋白1 (HABP1)；粒線體基質蛋白p32；gC1q-R蛋白；p33；C1qBP及GC1QBP。受體之胺基酸序列揭示於此項技術中。人類gC1qR之例示性胺基酸序列如下再現(SEQ ID NO: 2)：

術語gC1qR表示以上SEQ ID NO: 2之任何受體(寄存編號UniProtKB/Swiss-Prot：Q07021.1)，以及其加工形式及變異體。變異體包括與SEQ ID NO: 2具有例如至少90%胺基酸序列一致性之天然產生之變異體。

在結合輔因子時，gC1qR觸發使得細胞內囊泡胞外分泌之信號傳導路徑。不受理論束縛，咸信此等囊泡與細胞質膜之融合可改變脂質組合物且增加CD4 T細胞膜上之sPLA2-GIB活性，使得抑制phosphoSTAT5信號傳導(參見圖10)。詳言之，此等囊泡與漿膜之融合可改變脂質組合物且引起CD4 T細胞膜上之sPLA2-GIB活性。因而，膜流動性增加且細胞介素受體聚集於異常膜域中，使得細胞介素信號傳導顯著降低且CD4 T細胞無反應。

術語gC1qR抑制劑因此包括任何分子，結合至gC1qR或gC1qR之搭配物且抑制gC1qR之功能，諸如gC1qR介導之胞外分泌。

在另一實施例中，輔因子抑制劑係直接抑制輔因子活性，例如結合輔因子及/或抑制輔因子與其受體之結合的分子。

輔因子抑制劑之較佳實例包括例如抗體及其變異體、合成的特定配體、肽、小藥物或抑制性核酸。

抗體在第一實施例中，輔因子抑制劑係基本上具有相同抗原特異性之抗體或抗體變體/片段，或編碼此類抗體或變型/片段之核酸。抗體可結合輔因子、或gC1qR、或gC1qR之搭配物、或其gC1qR結合元素，且較佳抑制同源抗原(例如gC1qR或輔因子)之功能。

抗體可為合成的、單株的或多株的，且可藉由本身在此項技術中熟知之技術製得。

術語「抗體」意謂包括多株抗體、單株抗體、其片段(諸如F(ab')2及Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、單域抗體片段(VHH或奈米抗體)、二價抗體片段(雙功能抗體))以及任何以重組方式及以合成方式產生之結合搭配物、人類抗體或人類化抗體。

較佳地，若抗體以大於或等於約10⁷ M-1之Ka的結合至同源抗原，則其定義為特異性結合。抗體之親和力可容易使用習知技術測定，例如藉由Scatchard等人, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)所述之彼等技術。

多株抗體可容易由多種來源(例如馬、奶牛、驢、山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠、倉鼠或大鼠)使用此項技術中已熟知之程序產生。一般而言，通常經由非經腸注射向宿主動物投與視情況適當結合之純化之免疫原。免疫原之免疫原性可經由使用佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑而增強。在追加免疫之後，收集小血清樣品且測試對抗原多肽之反應性。適用於此類測定之各種分析之實例包括Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow及Lane (編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988中所述之彼等分析；以及程序，諸如對流免疫電泳(CIEP)、放射免疫分析、放射免疫沈澱、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、點漬墨法分析及夾心分析。參見美國專利第4,376,110號及第4,486,530號。

單株抗體可容易使用熟知程序製備。參見例如美國專利第RE 32,011號、第4,902,614號、第4,543,439號及第4,411,993號；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam及Bechtol (編), 1980中所述之程序。舉例而言，諸如小鼠之宿主動物可用經分離及純化之免疫原視情況在佐劑存在下腹膜內注射至少一次，且較佳以約3週時間間隔至少兩次。小鼠血清接著藉由習知點漬墨法技術或抗體捕捉(ABC)分析以確定何動物最佳融合。大致兩至三週後，給與小鼠靜脈內蛋白質或肽之追加免疫劑。隨後將小鼠處死且遵循已建立之方案使脾臟細胞與諸如Ag8.653 (ATCC)之市售骨髓瘤細胞融合。簡言之，骨髓瘤細胞用介質洗滌若干次，且以約三個脾臟細胞與一個骨髓瘤細胞之比率與小鼠脾臟細胞融合。融合劑可為此項技術中所用之任何適合的藥劑，例如聚乙二醇(PEG)。將融合物接種於含有使得融合之細胞選擇性生長的介質之盤中。接著可使融合之細胞生長大致八天。收集來自所得融合瘤之上清液，且添加至首先塗佈有山羊抗小鼠Ig之盤中。在洗滌之後，將標記物添加至各孔，之後進行培育。隨後可偵測陽性孔。陽性純系可在大量培養物中生長且隨後經蛋白A管柱(Pharmacia)純化上清液。單株抗體亦可使用替代技術產生，諸如藉由Alting-Mees等人, 「Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas」, Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)所述之彼等技術，其以引用的方式併入本文中。類似地，結合搭配物可使用重組DNA技術構築以併入編碼特異性結合抗體之基因之可變區。此類技術描述於Larrick等人, Biotechnology, 7:394 (1989)中。

本發明亦涵蓋可藉由習知技術產生之抗體之抗原結合片段。此類片段之實例包括(但不限於) Fab及F(ab')2片段。亦提供藉由遺傳工程改造技術產生之抗體片段及衍生物，

本發明之單株抗體亦包括嵌合抗體，例如鼠類單株抗體之人類化形式。此類人類化抗體可藉由已知技術製備，且在向人類投與抗體時提供降低免疫原性之優點。在一個實施例中，人類化單株抗體包含鼠類抗體之可變區(或僅其抗原結合位點)及源自人類抗體之恆定區。或者，人類化抗體片段可包含鼠類單株抗體之抗原結合位點及源自人類抗體之可變區片段(不具有抗原結合位點)。用於產生嵌合及經進一步工程改造之單株抗體之程序包括Riechmann等人(Nature 332:323, 1988)、Liu等人(PNAS 84:3439, 1987)、Larrick等人(Bio/Technology 7:934, 1989)及Winter及Harris (TIPS 14:139, May, 1993)中所描述之彼等程序。以轉殖基因方法產生抗體之程序可見於GB 2,272,440、美國專利第5,569,825號及第5,545,806號。可使用可用標準重組DNA技術製造之包含人類與非人類部分之藉由遺傳工程改造方法產生之抗體(諸如嵌合及人類化單株抗體)。此類嵌合及人類化單株抗體可藉由遺傳工程改造使用此項技術中已知之標準DNA技術，例如使用以下中所述之方法產生：Robinson等人之國際公開案第WO 87/02671號；Akira等人, European Patent Application 0184187；Taniguchi, M., 歐洲專利申請案0171496；Morrison等人之歐洲專利申請案0173494；Neuberger等人之PCT國際公開案第WO 86/01533號；Cabilly等人美國專利案第4,816,567號；Cabilly等人之歐洲專利申請案0125023；Better等人, Science 240:1041 1043, 1988；Liu等人, PNAS 84:3439 3443, 1987；Liu等人, J. Immunol. 139:3521 3526, 1987；Sun等人 PNAS 84:214 218, 1987；Nishimura等人, Canc. Res. 47:999 1005, 1987；Wood等人, Nature 314:446 449, 1985；及Shaw等人, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553 1559, 1988)；Morrison, S. L., Science 229:1202 1207, 1985；Oi等人, BioTechniques 4:214, 1986；Winter之美國專利案第5,225,539號；Jones等人, Nature 321:552 525, 1986；Verhoeyan等人, Science 239:1534, 1988；及Beidler等人, J. Immunol. 141:4053 4060, 1988。

與合成及半合成抗體結合，此類術語意欲涵蓋(但不限於)抗體片段、同型轉換抗體、人類化抗體(例如小鼠-人類、人類-小鼠)、混合物、具有複數個特異性之抗體及全合成抗體樣分子。

人類單株抗體亦可藉由使用由源自個體淋巴球之mRNA製備之免疫球蛋白輕鏈及重鏈cDNA構築諸如Fab噬菌體呈現文庫或scFv噬菌體呈現文庫之組合免疫球蛋白文庫來製備。參見例如McCafferty等人之PCT公開案WO 92/01047；Marks等人 (1991) J. Mol. Biol. 222:581 597；及Griffths等人 (1993) EMBO J 12:725 734。另外，抗體可變區之組合文庫可藉由使已知人類抗體突變產生。舉例而言，已知結合gC1qR之人類抗體之可變區可藉由例如使用無規改變之突變誘發之寡核苷酸突變，以產生突變之可變區之文庫，其接著可經篩選以結合至gC1qR。誘導免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈之CDR區內之隨機突變誘發之方法、使隨機分組之重鏈及輕鏈交叉以成對之方法及篩選方法可見於例如Barbas等人之PCT公開案WO 96/07754；Barbas等人 (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4457 4461中。

本發明之抗體可針對gC1qR、gC1qR配體或C1qR搭配物，且致使抑制藉由gC1qR介導之信號傳導。對於製備本發明之抗體，可使用包含gC1qR、gC1qR配體或gC1qR搭配物或其片段、變型或融合分子之免疫原。

gC1qR 之抗體本發明之特定抗體結合gC1qR抗原決定基，及/或已藉由用選自成熟gC1qR蛋白質或包含至少8個其連續胺基酸殘基之gC1qR之片段的包含gC1qR抗原決定基之多肽免疫接種產生。較佳本發明抗gC1qR抗體結合gC1qR內之配體結合位點之抗原決定基，由此干擾配體之結合。在一特定實施例中，抗體結合包含於SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基76至282之間的抗原決定基，其含有gC1qR配體結合位點。結合至gC1qR之C1q可涉及gC1qR上之至少三種不同基元，亦即：胺基酸殘基75-96、190-202及144-162 (參考SEQ ID NO: 2)。結合至gC1qR之HCV核心蛋白質可涉及gC1qR上之至少兩種不同基元，亦即：胺基酸殘基144-148及196-202 (參考SEQ ID NO: 2)。結合至gC1qR之HIV gp41可涉及gC1qR上之至少胺基酸殘基174-180 (參考SEQ ID NO: 2)。

因此較佳使用結合含有至少一個胺基酸殘基之抗原決定基的抗體(或其變異體)，該至少一個胺基酸殘基含於該等抗原決定基中之一者中或接近該等抗原決定基中之一者。此類抗體之實例包括抗體60.11，其結合至gC1qR之殘基75-96；以及抗體74.5.2，其結合至具有殘基204至218之抗原決定基。

較佳gC1qR抑制劑因此係對抗gC1qR、更佳對抗定位於蛋白質之胺基酸殘基76-282 (參考SEQ ID NO: 2)內之gC1qR之抗原決定基，甚至更佳含有選自胺基酸75-96、144-162、174-180及190-210之胺基酸殘基之抗原決定基的單株抗體。較佳抗體係中和(或拮抗劑)抗體，亦即其防止或抑制或減小天然配體與受體之結合及/或經由受體之信號傳導。

PLA2 - GIB 輔因子之抗體 本發明之其他特定抑制劑係結合PLA2-GIB輔因子之抗體，及/或已藉由用PLA2-GIB輔因子或其片段免疫接種產生，且較佳至少部分抑制此類輔因子之活性，較佳此類輔因子與gC1qR之結合。

本發明之特定抗體係多株抗體或單株抗體或其變異體，其結合選自表1及2中所列舉之蛋白質的蛋白質，且至少部分抑制該蛋白質與gC1qR之結合。本發明之較佳抗體係多株抗體或單株抗體或其變異體，其結合選自表2及3中所列舉之蛋白質的蛋白質，且至少部分抑制該蛋白質與gC1qR之結合，甚至更尤其結合選自表2中所列舉之蛋白質的蛋白質，且至少部分抑制該蛋白質與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，C1qR抑制劑係抗體或其變異體，其結合選自SEQ ID NO: 2-44及ID NO: 45-71，更佳選自SEQ ID NO: 2、3、43、44及選自ID NO: 45-61，甚至更佳選自SEQ ID NO: 3、8、43、44及ID NO: 45-55之蛋白質，且至少部分抑制該蛋白質與gC1qR之結合。

本發明之特定抗體或變異體結合C1qR配體內之抗原決定基，該抗原決定基含於該配體之gC1qR結合元素或域中(或與其重疊)，通常包含至少1個與該配體與gC1qR之結合有關之該配體之胺基酸殘基。

在一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 7或8之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與牙齦卟啉單胞菌有關之病症，諸如胰臟癌、慢性牙周病、類風濕性多發性關節炎或阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在另一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 14之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與奇異變形桿菌有關之病症，諸如HIV患者中之泌尿道感染或骨髓炎。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在另一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 18之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與韋氏鉤端螺旋體菌株有關之病症，諸如鉤端螺旋體病。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 28之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與甘油利用泰瑞孢子菌有關之病症，諸如創傷感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 29或30之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與鬆脆桿菌有關之病症，諸如腹膜感染、菌血症、皮下膿腫或燒傷。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 33之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與光滑假絲酵母有關之病症，諸如HIV/AIDS、癌症及器官移植中之皮膚念珠菌病。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 38之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與伴放線凝聚桿菌有關之病症，諸如侵襲性牙周炎、細菌性陰道炎、心內膜炎、放線菌病或類風濕性關節炎。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 41之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與索氏卟啉單胞菌有關之病症，諸如慢性皮膚、軟組織及骨骼感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合包含SEQ ID NO: 42之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療與嗜沫凝集桿菌有關之病症，諸如心內膜炎、大腦膿腫、椎骨骨髓炎及菌血症。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由SEQ ID NO: 3或ID45組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療HIV感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由SEQ ID NO: 43組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療HCV感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 51組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療EBV感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 46組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療腺病毒感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 47組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療HTNV感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 48組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療HSV感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 49或50組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療風疹病毒感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由SEQ ID NO: 44組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療金黃色葡萄球菌感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 52組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療單核球增多性李斯特菌感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 53組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療肺炎鏈球菌感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 54組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療蠟狀芽孢桿菌感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

在一特定實施例中，抑制劑係結合含有或由ID NO: 55組成之蛋白質或肽的抗體或其變異體。此類抑制劑尤其適用於治療惡性瘧原蟲感染。較佳地，此類抗體抑制該蛋白質與目標受體或細胞，尤其與gC1qR之結合。

抑制性核酸 在一替代實施例中，輔因子抑制劑係抑制性核酸。較佳抑制性核酸包括經設計以結合輔因子或gC1qR或gC1qR之搭配物且抑制其功能之適體。

其他核酸係編碼如上文所定義抗體之核酸。

肽在一替代實施例中，輔因子抑制劑係抑制輔因子之功能的肽。肽通常係選擇性結合輔因子、gC1qR或gC1qR之搭配物的分子。

肽較佳含有4至30個胺基酸殘基，且其序列可與gC1qR之域或輔因子之域一致(誘餌肽)，或其序列可含有與gC1qR之域之序列或輔因子之域相比的變化(肽拮抗劑)。

本發明之較佳肽含有SEQ ID NO: 2 (gC1qR)或選自SEQ ID NO: 3-71中之任一者的輔因子之4至30個連續胺基酸殘基，且可含有至少1處修飾。

修飾可由胺基酸取代組成。此類取代之實例包括(但不限於)經諸如丙胺酸之更為中性的殘基置換帶電或反應性胺基酸殘基，或相反。修飾或者(或另外)可由諸如將化學基團添加至肽之一個(或兩個)末端、或其側鏈、或肽鍵中之化學修飾組成。就此而言，本發明之肽可包含肽、非肽及/或修飾之肽鍵。在一特定實施例中，肽包含至少一個選自以下之肽模擬鍵烷基：嵌入亞甲基(-CH₂ -)或磷酸鹽(-PO₂ -)基團、二級胺(-NH-)或氧(-O-)、α-氮雜肽、α-烷基肽、N-烷基肽、膦醯胺基、縮肽、羥基亞甲基、羥基伸乙基、二羥基伸乙基、羥乙基胺、逆反式肽、亞甲基氧基、酮亞甲基(cetomethylene)、酯、亞膦酸酯、次膦酸基(phosphinics)或膦醯胺。此外，肽可包含例如藉由醯化及/或醯胺化及/或酯化得到之經保護N-端及/或C-端官能基。

此類肽之實例包括例如具有SEQ ID NO: 2 (gC1qR)之胺基酸殘基144-162之肽及具有SEQ ID NO: 2 (gC1qR)之胺基酸殘基204-218之肽。

本發明之此類肽之其他實例包括包含SEQ ID NO: 7、8、14、18、28-30、33、38、41或42中之任一者之序列及一個胺基酸取代，更佳至少一個選自W、I或K之胺基酸經丙胺酸置換的肽。

本發明之此類肽之其他實例包括包含SEQ ID NO: 7、8、14、18、28-30、33、38、41或42中之任一者之序列及一個中心胺基酸缺失的肽。

本發明之肽之其他實例包括包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列及以下修飾中之至少一者的肽：E3A、W6A、S10A、I14A (為了清晰起見，E3A意謂位置3中之胺基酸E經胺基酸A置換)。

本發明之肽之其他實例包括包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列及以下修飾中之至少一者的肽：S1A、K4A、W6A、S10A、I14A (為了清晰起見，S1A意謂位置1中之胺基酸S經胺基酸A置換)。

本發明之肽可藉由諸如化學、生物學及/或遺傳合成之本身在此項技術中已知之技術產生。

呈分離形式之此等肽中之各者表示本發明之特定目的。如本文所用，術語「分離之」係指自其天然環境之組分移除、分離或分隔，且至少60%不含、較佳75%不含且最佳90%不含其天然相關之其他組分的分子(例如核酸或胺基酸)。「分離之」多肽(或蛋白質)係例如自其自然環境之組分分隔之多肽，且較佳如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)遷移所測定純化至大於90%或95%之純度。「分離之」核酸係指自其天然環境組分分隔及/或組裝於不同構築體(例如載體、表現卡匣、重組宿主等)中之核酸分子。

小藥物 其他抑制劑係小藥物抑制劑，諸如係選擇性結合gC1qR或輔因子之烴化合物。

小藥物較佳可藉由一種方法獲得，該方法包含：(i)使測試化合物與表現gC1qR之細胞接觸，(ii)選擇結合gC1qR之測試化合物，及(iii)選擇抑制gC1qR活性之(ii)之化合物。此類方法表示本發明之特定目的。

gC1qR 可溶性受體 在一替代實施例中，輔因子抑制劑係gC1qR之可溶形式。

細胞生長抑制或細胞毒性劑 在另一實施例中，調節劑係對抗PLA2-GIB輔因子或對抗表現PLA2-GIB輔因子之原核或真核細胞或病毒的細胞生長抑制或細胞毒性劑。

在輔因子係細菌或細菌之一部分或藉由細菌產生之情況下，抑制劑可為對抗該細菌之抗生素。藉由殺死細菌，避免產生輔因子。抗生素可為任何廣譜抗生素，或具有針對目標細菌之特定光譜之抗生素。抗生素之實例包括(但不限於)阿莫西林(amoxicillin)、克拉黴素(clarithromycin)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢力新環丙沙星(cephalexin ciprofloxacin)、克林達黴素(clindamycin)、多西環素(doxycycline)、甲硝噠唑(metronidazole)、特比萘芬(terbinafine)、左氧氟沙星(levofloxacin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、四環素(tetracycline)、青黴素(penicillin)及阿奇黴素(azithromycin)。

在輔因子係真核細胞或真核細胞之一部分或藉由真核細胞產生之情況下，抑制劑可為對抗該細胞之細胞毒性劑。藉由殺死細胞，避免產生輔因子。

在輔因子係真菌或真菌之一部分或藉由一種產生之情況下，抑制劑可為抗真菌劑。藉由殺死真菌，避免產生輔因子。抗真菌劑之實例包括(但不限於)克黴唑(clotrimazole)、布替萘芬(butenafine)、布康唑(butoconazole)、環吡酮(ciclopirox)、氯碘羥喹(clioquinol)、氯碘羥喹(clioquinol)、克黴唑、益康唑(econazole)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黃黴素(griseofulvin)、鹵苯炔醚(haloprogin)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)、萘替芬(naftifine)、耐絲菌素(nystatin)、奧昔康唑(oxiconazole)、硫康唑(sulconazole)、特比萘芬(terbinafine)、特康唑(terconazole)、噻康唑(tioconazole)及托萘酯(tolnaftate)。

在輔因子係病毒或病毒之一部分或藉由病毒產生之情況下，抑制劑可為對抗該病毒之細胞毒性劑或抗病毒劑。藉由殺死病毒，避免產生輔因子。抗病毒劑之實例包括(但不限於)齊多夫定(zidovudine)、地達諾新(didanosine)、紮西他濱(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韋(abacavir)、田諾弗(tenofovir)、奈韋拉平(nevirapine)、地拉韋定(delavirdine)、依法韋侖(efavirenz)、沙奎那韋(saquinavir)、利托那韋(ritonavir)、茚地那韋(indinavir)、奈非那韋(nelfinavir)、沙奎那韋(saquinavir)、安普那韋(amprenavir)及洛匹那韋(lopinavir)。

在另一實施例中，輔因子之調節劑係微生物群落之調節劑。微生物群落之組成/多樣性之調節可用以降低或調節或增加輔因子之產生。

免疫原 在一替代(或累積)實施例中，個體中輔因子之抑制藉由使用輔因子之免疫原(例如個體以其接種疫苗或免疫)而獲得。因而，個體產生抑制輔因子之抗體(或細胞)。詳言之，投與輔因子免疫原(例如輔因子之任何免疫原性部分)可在治療之個體中產生抗體。此等抗體與免疫療法或疫苗預防一般將抑制輔因子作用。

本發明之目的因此在於一種個體接種疫苗之方法，其包含向個體投與PLA2-GIB輔因子之免疫原。

本發明之另一目的係關於一種PLA2-GIB輔因子之免疫原，其係用以有需要之個體接種疫苗。

在一特定實施例中，用於接種疫苗之PLA2-GIB輔因子抗原之免疫原係個體中誘導對抗輔因子之免疫反應之不活化免疫原性分子。不活化可例如藉由以化學或物理方式改變輔因子、或藉由蛋白質突變或截斷、或兩者獲得；且免疫原性可由於不活化及/或藉由使蛋白質進一步結合至適合的載體或半抗原(諸如KLH、HSA、聚離胺酸、病毒性類毒素或其類似物)，及/或藉由聚合反應或其類似方式獲得。免疫原因此可以化學或物理方式修飾，例如以改良其免疫原性。

在一較佳實施例中，本發明之PLA2-GIB輔因子之免疫原包含整個輔因子。

在一替代實施例中，PLA2-GIB輔因子之免疫原包含有包含至少6個連續胺基酸殘基且含有其免疫原性抗原決定基之輔因子之片段。在一較佳實施例中，免疫原包含至少6至20個胺基酸殘基。本發明之較佳免疫原包含或由蛋白質之4至30個選自SEQ ID NO: 2-44及ID NO: 45-71中之任一者的連續胺基酸殘基(或天然變異體之對應序列)組成。

免疫原可呈各種形式，諸如呈游離形式、聚合、以化學或物理方式修飾及/或與載體分子偶合(亦即連接)。與載體偶合可增加免疫原之免疫原性且(進一步)抑制生物活性。就此而言，載體分子可為習知用於免疫學中之任何載體分子或蛋白質，諸如KLH (匙孔螺血氰蛋白(Keyhole limpet hemocyanin))、卵白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、病毒性或細菌性類毒素(諸如破傷風類毒素、白喉類毒素B型霍亂毒素、其突變體(諸如白喉毒素CRM 197))、外膜小泡蛋白質、聚離胺酸分子或病毒樣粒子(VLP)。在一較佳實施例中，載體係KLH或CRM197或VLP。

免疫原與載體之偶合可藉由共價化學使用連接化學基團或反應物(諸如戊二醛、生物素等)執行。較佳地，使結合物或免疫原經受用甲醛處理以使輔因子完全不活化。

免疫原之免疫原性可藉由各種方法測試，諸如藉由移植人類免疫細胞之非人類動物之免疫接種，之後證實抗體之存在，或藉由夾心ELISA使用人類或人類化抗體測試。生物活性之缺乏可藉由本申請案中所描述之活性測試中之任一者證實。

在一特定實施例中，本發明係關於一種不活化且免疫原性PLA2-GIB輔因子。

在另一特定實施例中，本發明係關於一種與載體分子，較佳與KLH結合之PLA2-GIB輔因子蛋白質或其片段。

在另一態樣中，本發明係關於一種疫苗，其包含PLA2-GIB輔因子之免疫原、適合賦形劑及視情況選用之適合佐劑。

本發明之另一目的係關於一種用於誘導中和有需要個體之PLA2-GIB輔因子之活性的抗體之產生的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如上文所定義之免疫原或疫苗。

投與本發明之免疫原或疫苗可藉由任何適合途徑，諸如藉由注射，較佳肌肉內、皮下、經皮、靜脈內或動脈內注射；藉由經鼻、經口、經黏膜或直腸投藥。

活化劑、促效劑及模擬抗原決定基 在本發明之上下文內，術語輔因子「促效劑」涵蓋具有輔因子活性，諸如使CD4 T細胞對PLA2-GIB敏感之能力的任何物質。輔因子之促效劑可包括gC1qR之促效劑。促效劑之實施例係輔因子本身。

在本發明之上下文內，術語輔因子之「活化劑」表示介導或上調輔因子表現或活性之任何物質，諸如(但不限於)肽、多肽、重組蛋白、結合物、天然或人造配體、降解產物、同源物、核酸、DNA、RNA、適體等或其組合。

模擬抗原決定基包括可使輔因子之活性再現之任何合成分子。

輔因子之活化劑亦可為微生物群落之調節劑。微生物群落之組成/多樣性之調節可用以增加輔因子之產生。

就此而言，本發明亦提供一種分析微生物群落之方法，其包含偵測或量測該微生物群落中PLA2GIB輔因子之存在、不存在或活性。該方法可用以監測微生物群落，或測定治療功效或疾病之進展。

在一特定實施例中，本發明係關於抑制個體之免疫反應之方法，其包含向個體投與PLA2-GIB輔因子之促效劑或活化劑或模擬抗原決定基，諸如輔因子本身，或編碼輔因子之核酸。

治療之組合物及方法 本發明亦係關於一種組合物，其包含如上文所定義之輔因子或調節劑及較佳醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。

「醫藥組合物」係指本發明化合物(活性成分)及用於將生物活性化合物遞送至有需要之個體的此項技術中通常可接受之介質之調配物。此類載劑因此包括所有醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、介質或負載物。習知醫藥實踐可用於向個體提供例如呈單位劑型之適合的調配物或組合物。

根據本發明之化合物或組合物可以軟膏、凝膠、糊劑、液體溶液、懸浮液、錠劑、明膠膠囊、膠囊、栓劑、散劑、鼻滴劑或氣溶膠形式，較佳以可注射溶液或懸浮液形式調配。對於注射劑，化合物通常以液體懸浮液形式封裝，其可經由例如注射器或灌注來注射。在此態樣中，通常將化合物溶解於與醫藥用途相容且熟習此項技術者已知之生理食鹽水、生理學、等張或緩衝的溶液中。因此，組合物可含有一或多種藥劑或選自分散劑、增溶劑、穩定劑、防腐劑等之賦形劑。可用於液體及/或可注射調配物中之藥劑或賦形劑尤其係甲基纖維素、羥甲基纖維素、羧甲基纖維素、聚山梨醇酯80、甘露糖醇、明膠、乳糖、植物油、阿拉伯膠等。載劑亦可選自例如甲基-β-環糊精、丙烯酸之聚合物(諸如卡波莫(carbopol))、聚乙二醇及聚丙二醇之混合物、單乙醇胺及羥甲基纖維素。

組合物通常包含有效量之本發明化合物，例如有效直接或間接調節PLA2-GIB對CD4 T細胞之作用的量。抑制劑通常以有效維持/恢復CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化有抗性之量使用。一般而言，根據本發明之組合物包含約1 µg至1000 mg之輔因子或調節劑，諸如0.001-0.01、0.01-0.1、0.05-100、0.05-10、0.05-5、0.05-1、0.1-100、0.1-1.0、0.1-5、1.0-10、5-10、10-20、20-50及50-100 mg，例如0.05與100 mg之間、較佳0.05與5 mg之間，例如0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4或5 mg。劑量可藉由熟習此項技術者視藥劑及疾病而調節。

本發明之組合物可進一步包含一或多種用於各別、同時或連續使用之額外活性化合物。額外活性化合物之實例包括(但不限於)化學治療藥物、抗生素、抗寄生蟲藥劑、抗真菌劑或抗病毒劑。

在一特定實施例中，抑制劑與化學療法或激素療法組合使用。

在另一特定實施例中，抑制劑與放射線療法、超音波療法或奈米粒子療法組合使用。

在另一特定實施例中，抑制劑與檢查點抑制劑、免疫療法或抗癌疫苗組合使用。

在另一特定實施例中，抑制劑與PLA2-GIB之調節劑組合使用。

PLA2-GIB調節劑之實例揭示於例如WO2015/097140、WO2017/037041或WO2017/060405中，其以引用的方式併入本文中。在一特定實施例中，PLA2-GIB調節劑係對抗PLA2-GIB之抗體，尤其對抗PLA2-GIB之單株抗體，或其衍生物或片段，諸如scFv、奈米抗體、Fab、雙特異性抗體等。抗體或衍生物或片段可為人類或人類化的。

在一特定實施例中，本發明之方法或組合物使用(i)PLA2GIB輔因子之抑制劑及(ii)對抗PLA2GIB之抗體(或其衍生物或片段)之組合。在另一特定實施例中，PLA2GIB輔因子之抑制劑係對抗輔因子之抗體、或抗生素、或抗真菌劑、或抗病毒劑。

在另一特定實施例中，本發明之方法或組合物使用(i)PLA2GIB輔因子之抑制劑及(ii)PLA2GIB之基於吲哚之抑制劑((諸如3-(2-胺基-1,2-二側氧基乙基)-2-乙基-1-(苯基甲基)-1H-吲哚-4-基)氧基)乙酸乙酸其醫藥學上可接受之鹽、水合物或前體藥物，諸如其鈉鹽(伐瑞拉迪(Varespladib)))之組合。在另一特定實施例中，PLA2GIB輔因子之抑制劑係對抗輔因子之抗體、或抗生素、或抗真菌劑、或抗病毒劑。

在另一特定實施例中，本發明之方法或組合物使用(i)PLA2GIB輔因子之抑制劑及(ii)PLA2GIB之五肽抑制劑(諸如選自FLSYK、FLSYR及(2NapA)LS(2NapA)R將環肽)之組合。在另一特定實施例中，PLA2GIB輔因子之抑制劑係對抗輔因子之抗體、或抗生素、或抗真菌劑、或抗病毒劑。

本發明亦係關於一種用於製備醫藥組合物之方法，該方法包含混合如先前所述之輔因子或調節劑及醫藥學上可接受之稀釋劑或賦形劑，及將組合物調配於任何適合形式或容器(注射器、安瓿、燒瓶、瓶子、囊等)。

本發明亦係關於一種套組，其包含(i)包含如先前所述之輔因子或調節劑之組合物，(ii)至少一個容器，及視情況選用之(iii)使用套組之書面說明書。

本發明之化合物及組合物可用以治療多種疾病，諸如感染性疾病及與不適當(例如有缺陷或不當的)免疫反應，尤其與不適當CD4 T細胞活性相關之疾病，以及免疫性增加可改善個體病狀之任何疾病。此等疾病在本申請案中有時稱為「免疫病症」。此疾病包括免疫缺陷情形(例如由病毒感染、病原性感染、癌症等所致)、自體免疫疾病、移植物、糖尿病、發炎性疾病、癌症、過敏、哮喘、牛皮癬、風疹、濕疹及其類似疾病。

在一特定實施例中，本發明係針對刺激有需要個體之免疫反應之方法，其包含向該個體投與輔因子抑制劑或免疫原。

在另一特定實施例中，本發明係針對治療有需要個體之免疫缺陷或相關病症之方法，其包含向該個體投與較佳有效維持/恢復CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化有抗性之量的輔因子抑制劑或免疫原。

免疫缺乏症及相關病症指示特徵為個體中之免疫功能或反應降低及/或藉由其所致之任何病狀或病理學。免疫缺乏症可由例如病毒感染(例如，HIV、B型肝炎、C型肝炎等)、細菌感染、癌症或其他病理性病狀所致。術語「免疫缺陷相關病症」因此表示由免疫缺陷所致或與免疫缺陷有關之任何疾病。本發明尤其適用於治療與CD4-T細胞相關之免疫缺乏症，及相關疾病。

本發明尤其係關於治療個體之癌症之方法，其包含向個體投與抑制PLA2-GIB輔因子之化合物。本發明人已展示PLA2-GIB輔因子存在於癌症患者之血漿中，該等輔因子連同PLA2-GIB一起誘導免疫細胞不活化。

在一特定實施例中，本發明係關於治療有需要個體之癌症或贅瘤形成之方法，其包含向個體投與抑制PLA2-GIB輔因子之化合物。

本發明亦係關於一種抑制PLA2-GIB輔因子之化合物，其係用於治療有需要個體之癌症或贅瘤形成。

在一特定實施例中，本發明之方法係用於預防有需要個體，諸如具有贅瘤形成或癌症風險之個體之癌症或降低癌症發生率。就此而言，本發明可用於治療癌症之風險因素，由此避免或降低癌症之出現風險/出現率。此類風險因素包括(但不限於)口腔、胃及/或腸炎症及感染，諸如胰臟炎。

本發明亦係關於抑制PLA2-GIB輔因子之化合物，其係用於預防有需要個體之癌症或降低癌症發生率。

在另一特定實施例中，本發明之方法係用於降低患有癌症之個體之癌症進展速率。

在另一特定實施例中，本發明係關於抑制PLA2-GIB輔因子之化合物，其係用於降低患有癌症之個體之癌症進展速率。

在另一特定實施例中，本發明之方法係用於減輕或預防或治療患有癌症之個體之癌轉移或用於殺死癌細胞。

在另一特定實施例中，本發明係關於一種抑制PLA2-GIB輔因子之化合物，其係用於減輕或預防或治療患有癌症之個體之癌轉移或用於殺死患有癌症之個體之癌細胞。

本發明可用於治療任何癌症。

在一特定實施例中，癌症為實體癌症。

在一特定實施例中，該方法用於治療患有癌症且表現PLA2-GIB輔因子之個體。在一較佳實施例中，該方法用於治療個體之癌症，其中該個體中存在PLA2-GIB輔因子或表現PLA2-GIB輔因子之原核或真核細胞或病毒。

在另一特定實施例中，該方法用於治療患有癌症之個體，其中癌症微環境或血液中存在PLA2-GIB或PLA2-GIB輔因子。

本發明亦尤其適用於治療患有PLA2GIB相關之CD4 T細胞缺乏症之個體之癌症或贅瘤形成。

本發明可用以治療任何發展分期之癌症。就此而言，大多數實體癌症經由四個分期發展： . I期. 此分期通常係尚未深入地生長至鄰近組織中之小癌症或腫瘤。其亦尚未擴散至淋巴結或身體之其他部分。其通常稱為早期癌症。 . II期及III期. 一般而言，此等2個分期指示已更深入地生長至鄰近組織中之較大癌症或腫瘤。其亦可已擴散至淋巴結中但尚未擴散至身體之其他部分。 . IV期. 此分期意謂癌症已擴散至身體之其他器官或部分。其亦可稱為晚期或轉移性癌症。

一些癌症亦具有0期。0期癌症仍位於開始之位置，且尚未擴散至鄰近組織。此分期之癌症通常藉由用手術移除整個腫瘤高度可治癒。

本發明可用於治療0、I、II、III或IV期之腫瘤或癌症。

本發明可用以預防或減輕或治療0、I、II或III期癌症之癌轉移。

本發明可用以降低0、I、II、III或IV期癌症之進展速率。

本發明尤其可用於治療選自以下之實體癌：胰臟癌、黑素瘤、肺癌、食道癌或咽癌、視網膜母細胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌、腎癌、胃癌、十二指腸癌、子宮癌、頸椎癌、甲狀腺癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、腦癌或結腸直腸癌。

在一特定實施例中，本發明之方法係用於治療胰臟癌。胰臟癌根據胰腺之何部分受影響而進行分類：產生消化物質之部分引起外分泌癌症，產生胰島素及其他激素引起內分泌癌症。儘管存在若干不同類型之胰臟癌，但95%之病例係由外分泌癌症胰管腺癌(PDAC)所致。

在由癌症致死亡之主要原因中PDAC排名第四。研究人員預計，2030年PDAC將變為美國癌症相關死亡之第二最主要原因，發生率在30年內已增加一倍以上且目前每年增加5%。5年之相對存活率係大約5%且手術操作係治療PDAC之最有效的選項。診斷方法之可利用性有限且作為僅有的治癒選項之手術的存活可能性僅係診斷患者之10%增加了此疾病之可怕程度。疾病之不良預後可藉由不存在用於篩選及早期偵測之有效生物標記以及侵襲性特性及對目前可用化學療法之耐受性闡述。

本發明展示PLA2-GIB抑制可用以治療胰臟癌。本發明表示預防胰臟癌進展及癌轉移之新穎策略。本發明可用於任何類型/分期之胰臟癌，諸如胰管腺癌、神經內分泌腫瘤、導管內乳頭狀黏液性贅瘤、黏液性囊性腫瘤及嚴重囊性腫瘤。本發明尤其適合於治療任何分期之胰管腺癌。

本發明亦尤其適合於治療結腸直腸癌、肺癌以及快速生長癌症。結腸直腸癌係所有性別之最常見癌症中之一者。在所有分期，5年存活率係約55%。(Bossard N, 2007)。實際上，在法國、日本、美國、德國、意大利、西班牙及英國，在2010診斷出大於180 000例新穎直腸癌病例。將結腸直腸癌分類為四個分期：I期，其係最早期的且主要藉由手術處理，II及III期，其患者經歷組合放射線化學療法(RCT)，及IV期，其係極晚期且發生轉移的分期。當患者診斷患有局部晚期(II或III期)結腸直腸癌時，患者通常在手術切除之前用RCT治療。本發明適合於治療I、II、III及IV期結腸直腸癌。本發明尤其適合於治療II、III或IV期之結腸直腸癌。

本發明亦適用於治療誘發胃腸及代謝病變之癌症。

對於用於本發明，PLA2-GIB輔因子抑制劑可藉由任何適合途徑投與。較佳地，藉由注射，諸如全身或非經腸注射或灌注(例如肌肉內、靜脈內、動脈內、皮下、瘤內等)投與。投與通常係重複或連續投與。在一特定實施例中，在治療期間量測腫瘤或體液中PLA2-GIB或PLA2-GIB輔因子之含量以指導治療方案。

PLA2-GIB輔因子抑制劑可單獨或與其他癌症治療組合使用。

在一特定實施例中，本發明係關於一種治療個體之癌症之方法，其包含向患有癌症之個體投與抑制PLA2-GIB輔因子之化合物與化學療法或激素療法組合。

在另一特定實施例中，本發明係關於一種治療個體之癌症之方法，其包含向患有癌症之個體投與抑制PLA2-GIB輔因子之化合物與放射線療法、超音波療法或奈米粒子療法組合。

在另一特定實施例中，本發明係關於一種治療個體之癌症之方法，其包含向患有癌症之個體投與抑制PLA2-GIB輔因子之化合物與檢查點抑制劑、免疫療法或抗癌疫苗組合。

在另一特定實施例中，本發明係關於一種治療個體之癌症之方法，其包含向患有癌症之個體投與抑制PLA2-GIB輔因子之化合物與PLA2-GIB之抑制劑組合。PLA2-GIB抑制劑可為其拮抗劑或對抗該PLA2-GIB之疫苗。

在「組合」療法中，活性劑可同時或依序一起或交替使用。各活性劑可根據特定時程使用。在其他情況下，所有活性劑可一起調配及/或諸如以灌注方式投與。

在另一實施例中，化合物在手術(腫瘤切除或移除)之前、期間或之後投與。

如本文所用，「治療(treatment)」或「治療(treat)」係指試圖改變所治療之個體之天然過程的臨床介入，且可執行以達到預防性或治癒性目的。所需治療效應包括(但不限於)預防疾病出現或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防癌轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之組合物及方法用以延緩疾病或病症之顯現或減慢疾病或病症之進展。

投與本發明化合物或組合物之持續時間、劑量及頻率可根據個體及疾病調適。治療可單獨或與其他活性成分組合同時或各別或依序使用。

根據本發明之化合物或組合物可以各種方式或途徑投與，諸如(但不限於)藉由全身注射、肌肉內、靜脈內、腹膜內、皮膚、皮下、真皮、經皮、鞘內、眼部(例如，角膜)或經直腸路徑，或藉由在炎症部位局部投與，且較佳藉由肌肉內或靜脈內注射。

典型方案包含經一天或若干天、長達一年及包括一週與約六個月之間的時段單次或重複投與有效量之輔因子或調節劑。應瞭解，活體內投與之本發明之醫藥化合物或組合物之劑量將視接受者(個體)之年齡、健康狀況、性別及體重、同時進行的治療之種類(若存在)、治療之頻率及所需醫藥效應之性質而定。本文提供之有效量範圍並不意欲限制且表示較佳劑量範圍。然而，最佳劑量將適合於個別個體，如藉由熟習相關技術者所瞭解且確定(參見例如Berkowet等人編, The Merck Manual, 第16版, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992；Goodmanetna.編, Goodman and Cilman's The pharmacological Basis of Therapeutics, 第10版, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (2001))。

病毒性疾病 本發明可用以治療哺乳動物之病毒疾病或病毒感染。

可用本文所提供之方法治療之病毒之實例包括(但不限於)包膜病毒，諸如以下病毒家族之成員：反轉錄病毒屬(例如HIV (諸如HIV1及HIV2)、MLV、SIV、FIV、人類T細胞白血病病毒1及2、XMRV及科爾帝病毒(Coltivirus) (諸如CTFV或班納病毒(Banna virus)))；披膜病毒科(Togaviridae) (例如α病毒(諸如羅斯河病毒(Ross River virus)、辛得比斯病毒(Sindbis virus)、勝利基森林病毒(Semliki Forest Virus)、奧-奈氏病毒(O'nyong'nyong virus)、屈公病毒(Chikungunya virus)、東部馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、西部馬腦炎病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus))或風疹病毒)；黃病毒科(Flaviridae) (例如登革病毒(dengue virus)、腦炎病毒(諸如西尼羅河病毒(West Nile virus)或日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus))、黃熱病病毒(yellow fever virus))；冠狀病毒科(Coronaviridae) (例如冠狀病毒，諸如SARS病毒或環曲病毒(Toroviruses))；彈狀病毒科(Rhabdoviridae) (例如水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、狂犬病病毒(rabies virus))；副黏病毒科(Paramyxoviridae) (例如副流感病毒(parainfluenza virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、仙台病毒(sendai virus)及偏肺病毒(metopneumovirus))；正黏病毒科(Orthomyxoviridae) (例如流感病毒)；布尼亞病毒科(Bunyaviridae) (例如漢坦病毒、崩芽病毒(bunya virus) (諸如拉克羅斯病毒(La Crosse virus))、白蛉熱病毒(phlebovirus)及奈諾病毒(Nairo virus))；肝DNA病毒科(Hepadnaviridae) (B型肝炎病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae) (單純疱疹病毒(HSV) 1及HSV-2、水痘帶狀皰狀病毒(varicella zoster virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、HHV-8、HHV-6、HHV-7及假性狂犬病病毒(pseudorabies virus))；絲狀病毒科(Filoviridae) (絲狀病毒，包括埃博拉病毒)Ebola virus)及馬堡病毒(Marburg virus))及痘病毒科(Poxyiridae) (痘瘡病毒(variola virus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、痘病毒(pox virus) (諸如天花(small pox)、猴(monkey pox)及傳染性軟疣病毒(Molluscum contagiosum virus))、亞塔痘病毒(yatabox virus) (諸如特納河痘(Tanapox)及亞巴痘(Yabapox)))。非包膜病毒亦可用本文所提供之方法治療，諸如以下家族之成員：杯狀病毒科(Calciviridae) (諸如引起胃腸炎之菌株)；沙粒病毒科(Arenaviridae) (出血熱病毒(hemorrhagic fever virus)，諸如LCMV、拉沙熱病(Lassa)、胡寧(Junin)、馬丘波(Machupo)及瓜納里托(Guanarito)病毒)；呼腸孤病毒科(Reoviridae) (例如呼腸孤病毒(reovirus)、環狀病毒(orbivirus)及輪狀病毒(rotavirus))；雙股核醣酸病毒科(Birnaviridae)；細小病毒科(Parvoviridae) (細小病毒(parvovirus)，諸如人類博卡病毒腺相關病毒(Human bocavirus adeno-associated virus))；乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae) (諸如乳突狀瘤病毒(papillomavirus))；乳多空病毒科(Papovaviridae) (乳頭瘤病毒(papilloma virus)、多瘤病毒(polyoma virus)；腺病毒科(Adenoviridae) (腺病毒)；小RNA病毒科(Picornaviridae) (腸病毒(enterovirus)、腸道病毒(enteric virus)、脊髓灰白質炎病毒(Poliovirus)、柯沙奇病毒(coxsackievirus)、肝病毒(hepatovirus)、心病毒(cardiovirus)、安普病毒(aptovirus)、埃可病毒(echoviruses)、A型肝炎病毒、口蹄病病毒(Foot and mouth disease virus)及鼻病毒(rhinovirus))及虹彩病毒科(Iridoviridae) (諸如非洲豬發熱病毒(African swine fever virus))。可使用本文所提供之方法治療之其他病毒包括未分類的病毒(例如海綿狀腦病(Spongiform encephalopathies)之病原體、δ肝炎之藥劑(視為B型肝炎病毒之缺陷輔助物)、非A型、非B型肝炎(例如C型肝炎)之藥劑；嵌環病毒(calcivirus) (諸如諾羅病毒(Norovirus)、諾沃克(Norwalk)及相關病毒)；戊型肝炎病毒(Hepevirus) (諸如E型肝炎、JC及BK型肝炎病毒)及星狀病毒(astrovirus))。

在一特定實施例中，本發明係關於治療個體之HIV感染之方法，其藉由向個體投與輔因子抑制劑視情況與sPLA2-GIB抑制劑組合實現。在一些實施例中，個體係早期HIV患者且該等方法致使患者係HIV控制者之概率增加。在一些實施例中，個體係在抗反轉錄病毒治療之後具有低免疫重建及/或具有重度特發性CD4 T淋巴球減少症(ICL)之患者。本發明亦係關於一種用於增加HIV感染之個體中CD4-T細胞活性之方法，其藉由抑制個體中之sPLA2-GIB及輔因子，較佳藉由向個體投與sPLA2-GIB抑制劑及輔因子抑制劑來實現。

對於治療HIV感染，較佳輔因子抑制劑選自(i)結合gC1qR或SEQ ID NO: 3之多肽之抗體或其變異體或核酸，及(ii)包含SEQ ID NO: 3之片段之肽。

在另一特定實施例中，本發明係關於治療個體之HCV感染之方法，其藉由向個體投與輔因子抑制劑視情況與sPLA2-GIB抑制劑組合來實現。

對於治療HCV感染，較佳抑制劑選自(i)結合gC1qR或SEQ ID NO :43之多肽的抗體或其變異體核酸核酸及(ii)包含SEQ ID NO: 43之片段的肽。

細菌 / 真菌疾病 可用本文所提供之方法治療之感染性細菌之實例包括(但不限於)任何類型之革蘭氏陽性細菌(諸如鏈球菌(Streptococcus )、葡萄球菌(Staphylococcus )、棒狀桿菌(Corynebacterium )、李斯特菌(Listeria )、芽孢桿菌(Bacillus )及梭菌屬(Clostridium ) 或革蘭氏陰性細菌(諸如卟啉單胞菌(Porphyromonas )、沙門氏菌(Salmonella )、志賀桿菌(Shigella )、腸內菌(Enterobacteriaceae )、假單胞菌(Pseudomonas )、莫拉菌屬(Moraxella )、螺旋桿菌(Helicobacter )、寡養單胞菌(Stenotrophomonas )、乙酸細菌、α- 變形菌(alpha - proteobacteria )、大腸桿菌(Escherichia coli )、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae )、奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseria meningitidis )、黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis )、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae )、肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae ) 、嗜肺性退伍軍人桿菌( Legionella pneumophila )、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis )、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae )及黏質沙雷氏菌(Serratia marcescen s)。例示性感染性細菌包括(但不限於)：牙齦卟啉單胞菌、索氏卟啉單胞菌(Porphyromonas somerae )、甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus )、伴放線凝聚桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans )、嗜沫凝集桿菌(Aggregatibacter aphrophilus )、鬆脆桿菌(Bacteroides fragilis )、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pyloris )、伯氏疏螺旋體(Borelia burgdorferi )、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophilia )、分枝桿菌屬(Mycobacteria sps) (諸如結核分枝桿菌(M . tuberculosis )、鳥分枝桿菌(M . avium )、胞內分枝桿菌(M . intracellulare )、堪薩斯分枝桿菌(M . kansaii )、戈登分枝桿菌(M . gordonae ))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae )、奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseria meningitidis )、單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes )、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes ) (A群鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae ) (B群鏈球菌)、鏈球菌 (草綠色群)、糞球鏈球菌(Streptococcus faecalis )、牛鏈球菌(Streptococcus bovis )、鏈球菌(厭氧屬)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )、病原性曲狀桿菌屬(pathogenicCampylobacter sp.)、腸球菌屬(Enterococcus sp.)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )、炭疽芽孢桿菌( Bacillus anthracis )、白喉棒狀桿菌(corynebacterium diphtheriae )、棒狀桿菌屬(corynebacterium sp . )、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae )、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringers )、破傷風梭菌(Clostridium tetani )、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes )、肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae )、多殺巴斯德氏菌(Pasturella multocida )、擬桿菌屬(Bacteroides sp . )、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum )、念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis )、梅毒密螺旋體(Treponema pallidium )、細弱密螺旋體(Treponema pertenue )、鉤端螺旋體(Leptospira ) 及以色列放線菌(Actinomyces israelli )。

可用本文所提供之方法治療之感染性真菌之實例包括(但不限於)新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum )、粗球孢子菌(Coccidioides immitis )、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis )、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis )、白色念珠菌(Candida albicans )及光滑假絲酵母(Candida glabrata )。

在一特定實施例中，本發明係關於治療個體之葡萄球菌感染、尤其金黃色葡萄球菌感染之方法，其藉由向個體投與輔因子抑制劑或免疫原視情況與sPLA2-GIB抑制劑組合來實現。

對於治療個體之葡萄球菌感染、尤其金黃色葡萄球菌感染，較佳抑制劑選自(i)結合gC1qR或SEQ ID NO: 44之多肽的抗體或其變異體或核酸，及(ii)包含SEQ ID NO: 44之片段的肽。

在一特定實施例中，本發明係關於治療個體之李斯特菌感染、尤其單核球增多性李斯特菌感染之方法，其藉由向個體投與gC1qR抑制劑視情況與sPLA2-GIB抑制劑組合來實現。

對於治療個體之李斯特菌感染、尤其單核球增多性李斯特菌感染，較佳gC1qR抑制劑選自(i)結合gC1qR或ID NO: 52之多肽的抗體或其變異體或核酸及(ii)包含ID NO: 52之片段的肽。

在一特定實施例中，本發明係關於治療個體之鏈球菌感染、尤其肺炎鏈球菌感染之方法，其藉由向個體投與輔因子抑制劑視情況與sPLA2-GIB抑制劑組合來實現。

對於治療個體之鏈球菌感染、尤其肺炎鏈球菌感染，較佳抑制劑選自(i)結合gC1qR或ID NO: 53之多肽的抗體或其變異體或核酸，及(ii)包含ID NO: 53之片段的肽。

在一特定實施例中，本發明係關於治療個體之芽孢桿菌感染、尤其蠟狀芽孢桿菌感染之方法，其藉由向個體投與gC1qR抑制劑視情況與sPLA2-GIB抑制劑組合來實現。

對於治療個體之芽孢桿菌感染、尤其蠟狀芽孢桿菌感染，較佳gC1qR抑制劑選自(i)結合gC1qR或ID NO: 54之多肽的抗體或其變異體或核酸，及(ii)包含ID NO: 54之片段的肽。

寄生蟲疾病 可用本文所提供之方法治療之感染性寄生蟲之實例包括(但不限於)惡性瘧原蟲及剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii )。

在一特定實施例中，本發明係關於治療個體之惡性瘧原蟲感染之方法，其藉由向個體投與輔因子抑制劑視情況與sPLA2-GIB抑制劑組合來實現。

對於治療個體之惡性瘧原蟲感染，較佳抑制劑選自(i)結合gC1qR或ID NO: 55之多肽的抗體或其變異體或核酸，及(ii)包含ID NO: 55之片段的肽。

其他病症 本發明可用以改良任何有需要哺乳動物之免疫系統。其適合於校正不合需要的作用，諸如藥物、毒素、污染物、殺有害生物劑等之醫源作用。

本發明可用於任何哺乳動物，尤其任何人類。

本發明之其他態樣及優勢將揭示於以下實驗章節中。

實例 材料及方法 重組蛋白及肽 - 人類PLA2-GIB在大腸桿菌(Gerard Lambeau所贈，純度＞ 98%)中或在CHO-S (純度＞ 98%)中產生。HIV-1 gp41 MN重組蛋白係獲自Antibodies onlines (gp41 MN (565-771Delta642-725)，ABIN2129703，批次93-482，純度＞95%)，且PEP3肽NH2-PWNASWSNKSLDDIW-COOH及對照肽(CTL) NH2-PWNATWTQRTLDDIW-COOH係定購自Covalab(純度＞98%)。HP Pg肽8 (肽SEQ ID NO: 8) NH2-SGEGGWSNGSLVDIM-COOH及亂序PEP3 NH2-WNWDSKILSDPAWNS-COOH肽Covalab (純度＞98%)。來自人類血清之補體組分C1q係獲自Sigma (C1740，純度＞ 95%)。HCV核心蛋白質自Prospec (HCV-011，純度＞ 95%)於具有0.002% SDS之PBS緩衝劑中獲得，且與PBS SDS 0.002%之類似稀釋相比評估由HCV核心蛋白質所致之作用特異性。金黃色葡萄球菌蛋白質A係獲自Sigma (P6031)。

gC1qR KO Jurkat E6 . 1 T 細胞 之產生 - 缺乏C1QBP之Jurkat細胞發育之總體策略係根據經由同源重組使C1QBP基因雙等位基因不活化之靶向載體之設計。已使用與Jurkat E6.1 T細胞株(ECACC 88042803)同基因之人類C1QBP同源區域。靶向載體藉由Genewiz合成且選殖至pUC57-Amp載體中。藉由引入新黴素抗性基因(NeoR)選擇卡匣靶向人類C1QBP基因之第三外顯子，由此致使C1QBP開放閱讀框架中斷。NeoR卡匣使用BamHI/NotI限制位點選殖。靶向載體已藉由用所選限制酶(APaL1、Drd1、Pvu1、Pvu2、BamH1/NotI、Not1/NcoI、NEB)進行DNA限制性消化切割及標靶區定序來證實。將與C1QBP sgRNA (1828-Crispr_1A：CACC-GAAGTGACCGTGATTCTAAAA及1828-Crispr_1B：AAAC-TTTTAGAATCACGGTCACTTC)對應之DNA引子雜交且使用BbsI限制位點(NEB)選殖(Quick Ligase - New England Biolabs, NEB)至pX330質體(Addgene, 42230；Feng Zhang, MIT)中。

使Jurkat細胞(5×10⁶ )再懸浮於100 μL Opti-MEM中，且添加7 μg CRISPR/Cas9質體及2.5 μg靶向載體。細胞用Nepa21電穿孔器電穿孔。在G418選擇培養基中進行細胞選擇之後，藉由PCR基因分型預篩選Jurkat細胞純系。將C1QBP基因剔除之獨立型細胞純系擴增且藉由PCR基因分型及標靶區域定序證實。吾人之缺乏C1QBP基因之獨立型Jurkat細胞純系之驗證途徑由PCR基因分型組成。基因組DNA之基因經編輯的Jurkat細胞藉由蛋白酶K處理及苯酚純化分離。C1QBP基因雙等位基因不活化之各細胞純系藉由PCR基因分型及標靶區域定序證實。在50℃下使用Platinum HiFi Taq (Life technologies)用引子1828_RH5_F：TACTACAGCCCTTGTTCTT及1828_RH3_R：AGCACTTCCTGAAATGTT執行PCR擴增2分鐘。引子設計於C1QBP人類基因座中及同源臂之外。在相同PCR反應中區分WT及突變型等位基因。野生型及突變型等位基因分別得到1146-bp及2362-bp擴增產物。此PCR基因分型方案使得鑑別剔除C1QBP基因之兩種等位基因的同種接合子Jurkat細胞純系。Jurkat細胞株中之基因破壞使用CRISPR/Cas9技術實現。獲得三種缺乏C1QBP基因之獨立型同種接合子Jurkat細胞純系且藉由PCR基因分型及標靶區域定序驗證。

Jurkat E6 . 1 T 細胞中 gC1qR 之免疫墨點偵測 - 對WT及gC1qR KO Jurkat E6.1 T細胞溶胞物中之gC1qR蛋白質表現之西方墨點分析。將細胞溶解於哺乳動物蛋白質萃取試劑(M-PER，11884111，Thermo Scientific)緩衝劑中且用BCA蛋白質分析套組定量澄清上清液(23227，Pierce，Thermo Scientific)之蛋白質量。對於WT及gC1qR KO Jurkat E6.1 T細胞(40 µg)裝載等量總蛋白質，且經Mini-PROTEAN TGX免染色凝膠8-16% (4568104, BIORAD)藉由SDS-PAGE分離，進一步電轉移，且在室溫下藉由免疫墨點使用於PBS-Tween 0.05% BSA 5%中之對抗gC1qR (1:50之60.11 Santa Cruz，1:1000之74.5.2 Abcam)或β-肌蛋白(1:2000之AC-74，Sigma)之特異性抗體探測2小時，及使用於PBS PBS-Tween 0.05% BSA 5%中之山羊抗小鼠-IgG-HRP (1:20000，31430，Invitrogen)探測1小時。使用ECL免疫墨點偵測系統(NEL103001EA，PerkinElmer)偵測結合之抗體。

gC1qR - 肽結合分析 - 在+4℃下將100 µl用碳酸鹽緩衝劑(pH 9.6) (15 mM Na2CO3及35 mM NaHCO3)稀釋之100 µg/ml之肽PEP3、亂序PEP3或CTL塗佈於Nunc Maxisorp平底微定量盤式(44-2404-21, Thermofisher Scientific)上。移除未結合蛋白質；孔用TBST (20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl及0.05% Tween-20)洗滌2次，且未反應位點藉由用300 µl於TBST中之3% BSA培育(30分鐘，室溫)而阻斷。在洗滌(用TBST，2次)之後，一式三份用0至3 µg/孔範圍內之不同量之His標籤-gC1qR將結合肽將微量滴定盤培育(2小時，室溫)。在洗滌(用TBST，5次)之後，每孔添加100 µl於含3% BSA之TBST中之抗His標籤-HRP抗體(1:1000；71840-3，Merck)且在室溫下培育2小時。接著將微量培養盤孔洗滌(用TBST，5次)且每孔添加100 µl TMB ELISA受質標準溶液(UP664781，Interchim)。用每孔100 µl 0.16 M之H2SO4溶液停止反應，且經微定量盤讀取器(Tecan Infinite M1000 Pro)量測450 nm下之OD。

病毒血症患者及健康供者血漿之 gp41 免疫耗竭 - 在4℃下將1 ml病毒血症患者血漿或健康供者血漿與100 µg山羊抗gp41多株抗體（PA21719，Fisher)或對照山羊多株抗體(免疫前，AB108-C，R&D)於1.5 ml埃彭道夫管(Eppendorf tube)中在旋轉器上一起培育隔夜。接著在4℃下在旋轉器上各樣品添加200 µl用PBS BSA 1%洗滌三次之蛋白G瓊脂糖4快速流動珠粒(17-0618-01，GE healthcare)，持續3小時。為移除珠粒，首選在4℃下在400 xg 下離心樣品2分鐘，收集上清液且接著在4℃下在16,100 x g下離心15分鐘。因為對照山羊多株抗體最初含有疊氮化鈉，所以將其用PBS經10kDa超過濾器洗滌5次，以在進行免疫耗竭之前移除疊氮化鈉。

AT - 2 不活化 HIV - 1 粒子 - 為保留HIV粒子之構形及功能完整性，用2,2-二硫二吡啶(AT-2；43791，Sigma)對HIV-1 NDK (T向性)粒子進行不活化，且在PHA刺激之PBMC上如(Rossio等人, J Virol. 1998)中所述製備。2,2-二硫二吡啶(aldrithiol-2；AT-2)共價修飾1型人類免疫缺乏病毒(HIV-1)之核蛋白衣(NC)蛋白質中之必要鋅指。用300 µM AT-2對HIV-1粒子進行不活化兩次，亦即在37℃下在水浴中持續1小時，之後在冰上持續2小時。

並行地，將PHA刺激之PBMC之上清液處理成HIV-1 NDK感染之細胞上清液，以充當模擬對照(無HIV-1粒子)。在感染性分析中藉由不可偵測TCID50證實HIV粒子之不活化。

藉由抗HIV-1 gag p24 ELISA分析(HIV-1 Gag p24 Quantikine ELISA套組，DHP240，R&D systems biotechne)測定HIV粒子濃度。HIV-1粒子以5000、500、50及5 pg之p24/10e⁶ 個細胞使用。5000 pg之p24/10e⁶ 個細胞(1754 pg之p24/3.5×10e⁵ 個細胞)等效於每細胞1個粒子(感染倍率MOI係1)。

人類 CD4 T 淋巴球 之純化 - 靜脈血液係經由EFS (Etablissement Français du Sang，Centre Necker-Cabanel，Paris)自健康志願者獲得。使用富含RosetteSep人類CD4+ T細胞之混合液(幹細胞，15062)自全血純化CD4 T細胞。此混合液含有藉由親和力層析法使用蛋白質A或蛋白G瓊脂糖自小鼠腹水或融合瘤培養上清液純化之小鼠及大鼠單株抗體。此等抗體結合於雙特異性四聚抗體複合物中，該等複合物係針對人類造血細胞上之細胞表面抗原(CD8、CD16、CD19、CD36、CD56、CD66b、TCRγ/δ)及紅血球上之血型糖蛋白A。rosetteSep抗體混合液使人類全血中之不合需要之細胞與多種紅血球交聯，形成免疫玫瑰花節(immunorosette)。由此增加不合需要之細胞之密度，以使其在經浮力密度介質(諸如淋巴球分離介質(Eurobio，CMSMSL01-01))離心時連同紅血球一起丸化。

在室溫下在輕緩振盪(100 rpm)下使全血與50µl/ml之富含RosetteSep人類CD4+ T細胞之混合液一起培育20分鐘，用等體積之PBS+2%胎牛血清(FBS)稀釋且逐漸混合。稀釋之樣品在淋巴球分離介質之頂部在1200 X g下離心20分鐘。接著自血漿界面之密度介質收集富集之細胞，且用PBS+2% FBS洗滌兩次。隨後使細胞再懸浮於補充有5% FBS、50 mM HEPES (pH 7.4)、麩醯胺酸、青黴素、鏈黴素及兩性黴素B之RPMI 1640介質(Lonza)(完全培養基)中，用Moxi Z小型自動化細胞計數器(ORFLO，MXZ000)計數。細胞懸浮液調節為7×10⁶ 個細胞/毫升且在37℃下在5% CO2潮濕氛圍中平衡至少2小時。

富集之CD4-T細胞群體經cytoflex (Beckman coulter)藉由流式細胞測量術控制。回收之CD4 T細胞休眠藉由低含量之IL-2Rα (CD25)控制。CD4 T細胞用抗人類CD3 eFluor780(eBioscience，純系UCHT1，47-0038-42)、抗人類CD25-PE (Biolegend，純系BC96，302605)及抗人類CD4-PerCP (BD，純系SK3，345770)標記。富集之CD4-T細胞群體含有＞ 95%之CD3+CD4+及小於8%之CD25+。

對 CD4 T 細胞進行 PLA2 - GIB 生物測定及標記特異性蛋白以用於光學顯微法 - 在24孔聚苯乙烯盤中，在37℃下，於調溫之水中將平衡之純化CD4 T細胞裝載(3.5×10⁵ 個細胞/50µl，於完全培養基中)於聚-L-離胺酸塗佈(Sigma，P8920)之圓形蓋片(14mm直徑，Marienfeld)上，且與50 µl含有肽、重組蛋白連同或不連同重組PLA2-GIB或含有病毒血症患者血漿(1或3%)或健康供者血漿之PBS BSA1%之懸浮液混合。細胞懸浮液用40 µl於PBS BSA1%中之肽、重組蛋白或HIV-1 NDK粒子或模擬稀釋液預處理15分鐘，後續添加10 µl PLA2-GIB (5 nM，最終)持續30分鐘，或直接用50 µl肽或重組蛋白連同PLA2-GIB(5nM，最終)於PBS BSA 1%中之稀釋液處理45分鐘。將細胞用2 nM重組經糖基化人類IL-7 (Accrobio System)活化15分鐘。移除細胞上清液且在37℃下藉由添加500 µl 4%多聚甲醛於PBS中之溶液固定細胞(Fisher，PFA 32% Electron Microscopy Science，15714)15分鐘，且接著於500 µl冰冷90%甲醇/水溶液中滲透20 min。

接著用PBS加5%胎牛血清(FBS)將細胞復水15分鐘且接著進行標記。因此，在甲醇處理之後用PBS洗滌載片兩次且在室溫下用補充有5% FBS之PBS復水15分鐘。載片用於60 µl PBS 5% FBS中之初級抗體(1/120)標記1小時，用PBS緩衝劑洗滌15次，用PBS/FBS緩衝劑洗滌5次，且接著用二級抗體(1/300)染色1小時。載片用PBS 5% FBS緩衝劑洗滌5次，用PBS沖洗15次，且接著封埋於新鮮Prolong Gold Antifade (ThermoFisher Scientific，P36930)封埋劑中以用於共焦顯微鏡。所用初級抗體由兔抗pSTAT5 (pY694，9359，Cell Signalling)、小鼠抗CD4 (BD Pharmingen，555344)組成，且二級抗體係驢抗小鼠IgG-AF488 (Invitrogen，A21202)及驢抗兔IgG-AF555 (Invitrogen，A31572)。

用抗 gC1qR 抗體 60 . 11 及 74 . 5 . 2 阻斷 gC1qR - 平衡之純化CD4 T細胞用抗gC1qR 60.11 (抗原決定基75-96，Santa Cruz，sc-23884)、74.5.2 (抗原決定基204-218，Abcam，ab125132) (Ghebrehiwet B 等人, Adv Exp Med Biol. 2013)或對照IgG1 (小鼠IgG1對照同型，eBioscience/Affymetrix，16-4714)預培育30分鐘，且在24孔聚苯乙烯盤中，在37℃下，於調溫之水中裝載(3.5×10⁵ 個細胞/60 µl，於完全培養基中)於聚-L-離胺酸塗佈(Sigma，P8920)之圓形蓋片(14mm直徑，Marienfeld)上。細胞進一步用最終體積100 µl之C1q (Sigma C1740，純度＞ 95%，10 µg/ml)、PEP3肽(0.5 µg/ml)在有或無5 nM之PLA2-GIB下、或用病毒血症患者血漿(1%或3%)處理45分鐘。接著用IL-7刺激細胞且如上文所述進行處理以藉由共焦顯微鏡分析pSTAT5 NT。

共焦顯微鏡 - 經具有用於PFA固定之細胞的油浸平場複消色差63x/1.4 NA物鏡(Zeiss)之反向雷射掃描共焦顯微鏡(LSM700，Zeiss)在繞射極限以上獲取影像。獲取影像且用ZEN軟體(Zeiss)分析。

對 [ 3H ] 花生四烯酸標記之 CD4 T 細胞或 Jurkat E6 . 1 T 細胞之 PLA2 - GIB 酶促分析 - 在37℃下，在5% CO2潮濕氛圍中，於6孔盤中，使2×10⁶ 個細胞/毫升之純化CD4 T細胞與1 µCi/ml花生四烯酸[5,6,8,9,11,14,15-³ H(N)] (Perkin Elmer，NET298Z250UC)於補充有10% FBS、50 mM HEPES (pH 7.4)、麩醯胺酸、青黴素、鏈黴素及兩性黴素B之RPMI 1640介質(Lonza)中以2 ml/孔培育16小時。細胞用具有10% FBS之RPMI藉由在室溫下在580 xg下離心10分鐘而洗滌兩次，且接著在-80℃下於90% FBS 10% DMSO中以10⁷ 個細胞/毫升/小瓶冷凍。CD4 T細胞中[3H]花生四烯酸之百分比係(1減去無細胞之CD4 T細胞上清液中之[3H]花生四烯酸(cpm/ml)與上清液及細胞中之總[3H]花生四烯酸(cpm/ml)之比率。

在37℃下，在5% CO2潮濕氛圍中，於6孔盤中，使5×10⁵ 個細胞/毫升之Jurkat E6.1 T細胞(ECACC 88042803)或gC1qR KO Jurkat E6.1 T細胞與1 µCi/ml之花生四烯酸[5,6,8,9,11,14,15-³ H(N)] (Perkin Elmer，NET298Z250UC)於補充有10% FBS、50 mM HEPES (pH 7.4)、麩醯胺酸、青黴素、鏈黴素及兩性黴素B之RPMI 1640介質(Lonza)中以2 ml/孔培育17小時。細胞用具有10% FBS之RPMI藉由在室溫下在300 xg下離心10分鐘而洗滌兩次，且接著在-80℃下於90% FBS 10% DMSO中以10⁷ 個細胞/毫升/小瓶冷凍。CD4 T細胞中[3H]花生四烯酸之百分比係(1減去無細胞之CD4 T細胞上清液中之[3H]花生四烯酸(cpm/ml)與上清液及細胞中之總[3H]花生四烯酸(cpm/ml)之比率。

為測試[3H]花生四烯酸標記之CD4 T淋巴球上之PLA2-GIB活性，細胞藉由在室溫下在580 xg下離心10分鐘而解凍於37℃下預熱之10% FBS RPMI中，用2.5% FBS RPMI洗滌兩次，且在37℃下，在5% CO2潮濕氛圍中，於24孔聚苯乙烯盤中以2×10⁵ 個CD4 T細胞/400微升/孔平衡1小時30分鐘。接著將100 µl於2.5% FBS RPMI中之重組蛋白(gp41 MN (565-771Delta642-725)，Antibodies online，ABIN2129703；HCV核心蛋白質，HCV-011, Prospec)或媒劑稀釋液添加至各孔中持續2小時。將細胞及上清液收集於埃彭道夫管(eppendorf tube)中且在室溫下在580 xg下離心10分鐘。經計數器(tri-Carb 2800 TR液體閃爍分析儀，Perkin Elmer)將300 µl細胞上清液中所釋放之[3H]花生四烯酸與16 ml Ultima gold (Perkin Elmer，6013329)定量於低擴散小瓶(Perkin Elmer，6000477)中。

為測試[3H]花生四烯酸標記之Jurkat E6.1 T淋巴球上之PLA2-GIB活性，細胞藉由在室溫下在300 xg下離心10分鐘而解凍於37℃下預熱之10% FBS RPMI中，用2.5% FBS RPMI洗滌兩次，且在37℃下，在5% CO2潮濕氛圍中，於24孔聚苯乙烯盤中以5×10⁴ 或10⁵ 個Jurkat E6.1 T細胞/400微升/孔平衡1小時30分鐘。接著將5.95 μM之於2.5% FBS RPMI中之HCV核心溶液或媒劑稀釋液與等體積之630 nM或2 μM之PLA2-GIB之2.5% FBS RPMI溶液混合，且同時每孔添加100 μl持續2小時。對於肽處理，如圖所指示，細胞用50微升/孔之110 μM或55 μM於2.5% FBS RPMI中之肽溶液預處理2小時、4小時或21小時。接著添加50微升/孔之630 nM或2 μM之於2.5% FBS RPMI中之PLA2-GIB或單獨介質，持續2小時。將細胞及上清液收集於埃彭道夫管中且在室溫下在580 xg下離心10分鐘。經計數器(tri-Carb 2800 TR液體閃爍分析儀，Perkin Elmer)將300 µl細胞上清液中所釋放之[3H]花生四烯酸與16 ml Ultima gold (Perkin Elmer，6013329)定量於低擴散小瓶(Perkin Elmer，6000477)中。

結果表示為PLA2-GIB活性(用肽或HCV核心連同PLA2-GIB處理之細胞之上清液中[3H]花生四烯酸之釋放減去僅有肽或緩衝劑無PLA2-GIB下細胞之[3H]花生四烯酸之自發性釋放，以cpm/ml計)或減去亂序PEP3下之活性的肽下之ΔPLA2-GIB活性 (用肽處理之細胞之上清液中[3H]花生四烯酸之釋放減去用雜亂PEP3處理之細胞之[3H]花生四烯酸之釋放，以cpm/ml計)。

結果及論述

1 . 病毒血症患者血漿增加 CD4 T 細胞上之 PLA2 - GIB 活性吾人先前已展示用75 nM之單獨PLA2-GIB處理CD4 T細胞顯著降低由IL-7誘導之phosphoSTAT5之核易位(pSTAT5 NT)，而用5 nM PLA2-GIB處理不影響響應於IL-7之此核易位(緩衝劑，圖1A)。內源性PLA2-GIB耗竭之病毒血症血漿不影響響應於IL-7之phosphosSTAT5易位。值得注意的是，添加5nM於1%內源性PLA2 GIB耗竭之病毒血症血漿中之PLA2-GIB產生40%之pSTAT5 NT抑制，而類似處理之健康供者血漿不起作用(n=4個獨立型供者，p ＜0.0001，圖1A)。此等結果表明病毒血症血漿含有使CD4 T細胞對PLA2-GIB抑制敏感之輔因子。

為鑑別此病毒血症血漿輔因子之分子量，吾人經截留30kDa及10kDa之過濾器分離病毒血症血漿。如圖1B所示，含有大於10kDa及小於30kDa之產物的內源性PLA2-GIB耗竭之病毒血症血漿之部分增加CD4 T細胞上之PLA2-GIB活性，但來自健康供者血漿之部分則不相同。含有大於30kDa之產物之內源性PLA2-GIB耗竭病毒血症血漿之部分及含有小於10kDa之產物之部分對PLA2-GIB活性不起作用。因此，病毒血症血漿患者含有分子量在10kDa與30kDa之間的輔因子，該輔因子使CD4 T細胞對在PLA2-GIB濃度單獨不足以影響響應於IL-7之pSTAT5 NT之實驗條件下PLA2-GIB之抑制敏感。

2. HIV - 1 不活化病毒粒子使 CD4 T 細胞 對響應於 IL - 7 之 PLA2 - GIB 抑制活性敏感 為測試HIV-1病毒產物可在病毒血症血漿之輔因子活性中起作用之假定，吾人首先研究HIV-1粒子對健康供者CD4 T細胞中響應於IL-7之pSTAT5 NT之作用。吾人使用先前用AT-2不活化之T向性HIV-1 NDK病毒之HIV-1粒子測試不存在感染下病毒蛋白質對CD4 T細胞之作用。為測試輔因子活性，使CD4 T細胞暴露於呈單獨形式或存在不抑制響應於IL-7之phosphoSTAT5核易位之量的PLA2-GIB (5 nM)形式之不同量之HIV粒子(MOI係1、0.1、0.01及0.001)(圖2)。在無PLA2-GIB下，響應於IL-7之pSTAT5 NT大於92%，其與5 nM之PLA2-GIB生物學類似，且如所預期在75 nM及250 nM之PLA2-GIB下，僅50%及10%。HIV-1粒子單獨並不影響響應於IL-7之pSTAT5 NT。值得注意的是，在存在5 nM PLA2-GIB下，HIV-1粒子產生pSTAT5 NT之劑量-反應抑制(在5 pg/ml之p24 (MOI=0.001)下 48%之pSTAT5 NT至在5000 pg/ml之p24 (MOI =1)下僅8%之pSTAT5 NT，p ＜0.001，圖2)，而具有5nM PLA2-GIB之對照(模擬)之類似稀釋液對響應於IL-7之pSTAT5不起作用。此等結果表明一些病毒組分可起如病毒血症患者血漿中所觀察到之使CD4 T細胞對PLA2-GIB活性敏感之輔因子之作用。

3. HIV - 1 gp41 蛋白質增加 PLA2 - GIB 關於用 IL - 7 刺激之 CD4 T 細胞中之 pSTAT5 NT 之抑制活性 吾人分析用不存在輔因子下不可抑制pSTAT5 NT之劑量(5 nM)的PLA2-GIB連同或不連同重組gp41蛋白質一起預處理或在無PLA2-GIB下用單獨gp41蛋白質(w/o GIB)預處理之細胞中響應於IL-7之pSTAT5 NT。如圖3上所示，gp41蛋白質單獨在0.5 µg/ml之gp41下對響應於IL-7之pSTAT5 NT具有微小抑制作用，僅抑制10%，且在0.25至0.05 µg/ml之gp41下抑制小於8% (圖3A及3B)。與之形成鮮明對比，在5 nM之PLA2-GIB存在下，0.5 µg/ml之gp41蛋白質產生大於60%之pSTAT5 NT抑制(圖3B)，且在0.005 µg/ml之gp41下劑量依賴性抑制達至抑制18%(圖3A)。

4. HIV - 1 gp41 蛋白質 在 病毒血症患者血漿對 用 IL - 7 刺激之 CD4 T 細胞中之 pSTAT5 NT 之抑制活性 中起關鍵作用 為證實gp41蛋白質可為病毒血症患者血漿中之PLA2-GIB之輔因子，吾人用對抗gp41之多株抗體(pAb抗gp41)或對照多株抗體(pAb ctrl)耗竭病毒血症患者血漿。健康供者血漿類似於陰性對照進行處理。如圖4上所呈現，如所預期在75 nM之PLA2-GIB下pSTAT5 NT之抑制係49%，且在250 nM下係79%，且在無抗體之1%之病毒血症患者血漿下係39%且在無抗體之3%之病毒血症患者血漿下係54%。無抗體、有對照多株抗體或有抗gp41多株抗體之健康供者血漿對響應於IL-7之pSTAT5 NT無抑制作用，由此表明抗體對CD4 T細胞無毒性(圖4)。用對照多株抗體處理病毒血症患者血漿不改變抑制活性，1%及3%之血漿下之抑制分別係43%及55%(圖4)。值得注意的是，用抗gp41多株抗體進行免疫耗竭幾乎消除病毒血症患者血漿之抑制活性，在1%及3%之免疫耗竭血漿下剩餘抑制活性係6%及10%，(p＜0.001，pAb抗gp41相對於pAb ctrl處理之血漿，圖4)。總而言之，此等結果表明gp41係病毒血症患者血漿中之PLA2-GIB之輔因子。

5. gp41 中之 PEP3 基元抑制用 IL - 7 刺激之 CD4 T 細胞中之 pSTAT5 NT 使CD4 T細胞暴露於含有潛在gC1qR結合元素之gp41之15個胺基酸肽域。肽含有SWSNKS基元。亦使細胞暴露於對照(CTL)肽(圖5A)連同(5nM GIB)或不連同(w/o) 5nM之PLA2-GIB。儘管單獨或有PLA2-GIB之CTL肽或單獨PEP3對pSTAT5 NT不起作用，但用PEP3及5nM之PLA2-GIB處理產生pSTAT5 NT之PEP3劑量依賴性抑制，2.5 µg/ml至0.025 µg/ml之PEP3下之抑制分別係51%至18% (圖5B)。如圖5C所概述，單獨用0.5 µg/ml之PEP3處理僅產生5%之CD4 T細胞中之pSTAT5 NT抑制，而用0.5 µg/ml PEP3連同5 nM PLA2-GIB處理產生55%之抑制(p ＜0.05，n=3個供者)。

6. PEP3 對 PLA2 - GIB 具有輔因子作用 評定[3H] AA Jurkat E6.1 T細胞上PEP3對PLA2-GIB活性之作用。5×10⁴ 個Jurkat E6.1細胞用PEP3或亂序PEP3預處理持續不同時段(長達21小時)。處理後2小時，將細胞與200 nM PLA2-GIB一起培育。結果呈現於圖11 (3個實驗之彙集)上。

如可見，相對於亂序PEP3，細胞用肽PEP3肽(11µM)之預處理4小時或更長顯著增加對Jurkat E6.1 T細胞之膜的PLA2-GIB活性(p＜0.001)。此等結果確定PEP3對PLA2-GIB具有輔因子作用。

7. PEP3 對 PLA2 - GIB 之輔因子活性及病毒血症患者血漿之抑制活性視 gC1qR 而定吾人假設，gC1qR可在病毒血症患者血漿之抑制活性中起作用。為研究gC1qR在PLA2-GIB抑制pSTAT5 NT中之作用，吾人測試gC1qR天然配體C1q對PLA2-GIB活性之作用。吾人發現，單獨C1q能夠抑制40% pSTAT5 NT (p ＜ 0.001)。PLA2-GIB添加至C1q中使此抑制活性增加至抑制75-85% (p ＜ 0.01，圖6A)，且兩種不同抗gC1qR抗體顯著抑制C1q以及輔因子對PLA2-GIB之作用，該等抗體恢復75%之反應(在C1q及5 nM PLA2-GIB下60.11及75.4.2抗gC1qR抗體相對於IgG1ctrl，p ＜ 0.001，圖6A)。值得注意的是，在PEP3及PLA2-GIB存在下抗gC1qR抗體74.5.2恢復54%之pSTAT5 NT(圖6B，p ＜0.0001)且在用1%病毒血症患者血漿處理之細胞中恢復32%之pSTAT5 NT (圖6C，p ＜0.0001)。相反，對照抗體(IgG1 ctrl)不抑制PLA2-GIB上之PEP3輔因子活性，亦不抑制病毒血症患者血漿作用(圖6B及6C)。

8. PEP3 與 gC1qR 結合如材料及方法中所述，PEP3與gC1qR之結合藉由微量培養盤上之ELISA分析進行測試。使用亂序肽或對照肽作為對照。

結果呈現於圖12上。其展示PEP3與gC1qR結合，而亂序及對照肽基本上不與gC1qR結合。

9. gC1qR 與 PEP3 輔因子對 Jurkat T 細胞 膜之作用有關 測試[3H] AA Jurkat E6.1細胞上PEP3及gC1qR對PLA2-GIB活性之作用。5×10⁴ 個Jurkat E6.1 WT細胞gC1qR KO (2G9)用PEP3或亂序PEP3預處理21小時。處理後2小時，將細胞與PLA2-GIB一起培育。

結果呈現於圖13 (3個實驗之彙集)上。相對於亂序PEP3，WT細胞而非gC1qR KO細胞用PEP3肽預處理21小時顯著增加PLA2-GIB活性 (p ＜ 0.01)。與gC1qR KO細胞相比，WT細胞上之PLA2-GIB活性顯著更高。

此等結果進一步展示gC1qR與PEP3輔因子作用有關。

10. gp41 蛋白質使 CD4 T 細胞膜對 PLA2 - GIB 酶活性敏感 為研究PLA2-GIB對CD4 T細胞膜之作用，吾人研發CD4 T細胞用[3H]花生四烯酸標記之新穎酶促分析。當此等細胞暴露於PLA2-GIB時，CD4 T細胞上之酶活性釋放[3H]花生四烯酸。[3H]花生四烯酸之定量使得吾等定量PLA2-GIB活性。

如吾人上文所觀察到gp41蛋白質可增加PLA2-GIB對pSTAT5 NT之抑制活性，吾人假定gp41可增加PLA2-GIB對CD4 T細胞膜之酶活性。實際上，PLA2-GIB酶活性在gp41存在時且以gp41劑量依賴性方式高度且顯著增加(p ＜ 0.01及p ＜ 0.001，圖7)。單獨Gp41處理對CD4 T細胞之[3H]花生四烯酸釋放不起作用。關於CD4 T細胞之[3H]花生四烯酸釋放，用0.5至5 µg/ml之gp41處理使63 nM之PLA2-GIB活性增加2.2至21倍，且使200 nM之PLA2-GIB活性增加1.5至11.6倍，在5 µg/ml之gp41下達到最大值。用5 µg/ml gp41處理可使一些供者上之PLA2-GIB之活性增加大於70倍。

11. 其他 PLA2 - GIB 輔因子 吾人表明gC1qR係PLA2-GIB輔因子之感測子，使吾等研究其他gC1qR配體。

表2列舉30種與gC1qR結合且因此可影響PLA2-GIB活性之不同分子。約一半此等分子係源自病原體：9種係病毒蛋白，4種係細菌組分，且一種係惡性瘧原蟲寄生蟲(表2)。一種分子LyP-1係人造gC1qR配體，且其他15種係內源性組分，五種來自血清且10種來自細胞。總而言之，此等結果表明PLA2-GIB活性可藉由各種不同病原體組分及內源性因子調節，且此路徑係通用致病機制。

12. HCV 核心蛋白質使 CD4 T 細胞膜對 PLA2 - GIB 酶活性敏感 吾人分析重組HCV核心蛋白質存在下CD4 T細胞上之PLA2-GIB酶活性(圖8)。HCV核心蛋白質含有gC1qR結合元素(參見表2)。吾人之結果展示10及20 µg/ml之單獨HCV核心蛋白質略誘導CD4 T細胞之[3H]二十碳四烯酸釋放(圖8A)。有趣的是，用PLA2-GIB及HCV核心蛋白質處理CD4 T細胞高度增加PLA2-GIB酶活性，且在10及20 µg/ml之HCV核心蛋白質下63nM之PLA2-GIB使活性增加26倍及36倍，且200nM之PLA2-GIB使活性增加16倍及26倍(圖8A)。如圖8B所概述，單獨用10 µg/ml之HCV核心蛋白質處理略微且顯著增加CD4 T細胞之[3H]二十碳四烯酸釋放。此外，HCV核心蛋白質係極有效的PLA2-GIB輔因子，且63nM及200nM之PLA2-GIB分別使活性增加26倍及16倍(p＜0.001，n=3個供者)。此等結果展示HCV核心蛋白質可使CD4 T細胞對PLA2-GIB抑制敏感，因此導致抑制具有C型肝炎感染之患者的CD4 T細胞功能。

13. HCV 核心蛋白質使 Jurkat E6 . 1 T 細胞膜對 PLA2 - GIB 酶活性敏感 測試Jurkat E6.1細胞上HCV核心蛋白質對PLA2-GIB活性之作用。使HCV核心(595 nM，等效於10µg/ml)與5×10e⁴ 個細胞一起培育。量測由PLA2-GIB所致之[3H] AA之釋放減去等效緩衝劑中之活性。

結果呈現於圖14上。其展示HCV核心蛋白質顯著增加Jurkat E6.1 T細胞之膜上之PLA2-GIB活性，與CD4 T細胞膜上所觀察到類似。

HCV核心蛋白質因此展現有效的輔因子作用。

14. 金黃色葡萄球菌蛋白質 A ( SA 蛋白質 A ) 使 CD4 T 細胞對 PLA2 - GIB 酶活性敏感 吾人分析另一gC1qR結合蛋白SA蛋白質A (表2)對CD4 T細胞上之PLA2-GIB酶活性之作用(圖9)。如HCV核心蛋白質下所觀察到，單獨用10、25及50 µg/ml之SA蛋白質A略微誘導CD4 T細胞之[3H]二十碳四烯酸釋放(圖9A，p＜0.01)。值得注意的是，用PLA2-GIB及SA蛋白質A處理CD4 T細胞顯著增加PLA2-GIB酶活性，10至50 µg/ml之SA蛋白質A下200 nM之PLA2-GIB使活性增加1.5倍至大於3倍(圖9B，p＜0.0001)。此等結果展示SA蛋白質A可使CD4 T細胞對PLA2-GIB抑制敏感，因此使得抑制具有金黃色葡萄球菌感染之患者的CD4 T細胞功能。此等結果亦由病毒蛋白質HCV核心完成以上觀察，且表明與gC1qR結合之細菌蛋白質可為PLA2-GIB輔因子。總而言之，HCV核心蛋白質及SA蛋白質A實驗表明gC1qR活化/PLA2-GIB敏感可為病原體起作用之通用機制。

15. 鑑別可充當 PLA2 - GIB 輔因子之含有 gC1qR 結合域之蛋白質 吾人篩選具有PEP3肽序列之蛋白質資料庫以鑑別含有gC1qR結合元素之其他蛋白質。鑑別來自27種不同細菌物種及一種真菌(光滑假絲酵母)之42種蛋白質，一種來自菠蘿，另一種來自秀麗隱桿線蟲且最後一種來自人類(表1)。其中，吾人鑑別可調節PLA2-GIB活性之來自9種人類病原體(8種細菌及1種真菌)之11種蛋白質，如表3中所概述。此等病原體已與癌症、自體免疫性疾病及神經退化性疾病有關。舉例而言，牙齦卟啉單胞菌感染與胰臟癌、類風濕性關節炎、阿茲海默氏病相關，且光滑假絲酵母感染與HIV/AIDS患者、具有癌症、及化學療法治療及器官移植之患者中之皮膚念珠菌病相關。

16. HP 牙齦卟啉單胞菌 8 ( HP Pg ) 對 PLA2 - GIB 具有輔因子作用 量測[3H] AA Jurkat E6.1細胞上肽HP Pg對PLA2-GIB活性之作用。10e⁵ (左側圖)或5×10e⁴ (右側圖)個Jurkat E6.1細胞用HP Pg、亂序PEP3或PEP3預處理21小時。處理後2小時，將細胞與200 nM PLA2-GIB一起培育。

結果呈現於圖15上。其展示相對於亂序PEP3，用HP Pg (SEQ ID NO: 8)預處理顯著增加PLA2-GIB活性。

此等結果表明HP Pg具有輔因子作用。

17. PDAC 血漿對 PLA2GIB 具有輔因子作用 吾人藉由量測磷酸基-STAT5核易位(pSTAT5 NT)測試來自PDAC患者之血漿調節CD4 T細胞之IL-2反應之能力。

如圖16中所示，吾人觀察到1%及3%稀釋之PDAC血漿對CD4 T細胞IL-2反應之抑制作用。此結果表明，在癌症患者中，腫瘤微環境或血漿提供免疫調節，例如抑制。此研究結果指示，癌症含有使得T細胞對經PLA2-GIB不活化敏感之PLA2-GIB輔因子。表 1

表2

表3

參考文獻 Ghebrehiwet B, Jesty J, Vinayagasundaram R, Vinayagasundaram U, Ji Y, Valentino A, Tumma N, Hosszu KH, Peerschke EI. Targeting gC1qR domains for therapy against infection and inflammation. Adv Exp Med Biol. 2013;735:97-110. Rossio JL, Esser MT, Suryanarayana K, Schneider DK, Bess JW Jr, Vasquez GM, Wiltrout TA, Chertova E, Grimes MK, Sattentau Q, Arthur LO, Henderson LE, Lifson JD. Inactivation of human immunodeficiency virus type 1 infectivity with preservation of conformational and functional integrity of virion surface proteins. J Virol. 1998 Oct;72(10):7992-8001. Platt EJ, Wehrly K, Kuhmann SE, Chesebro B, Kabat D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 1998 Apr;72(4):2855-64. Vieillard V, Strominger JL, Debré P. NK cytotoxicity against CD4+ T cells during HIV-1 infection: A gp41 peptide induces expression of an NKp44 ligand. PNAS 2005 Aug 2;102(31):10981-6. Fausther-Bovendo H, Vieillard V, Sagan S, Bismuth G, Debré P. HIV gp41 engages gC1qR on CD4+ T cells to induce the expression of an NK ligand through the PIP3/H2O2 pathway. PLoS Pathog. 2010 Jul 1;6:e1000975. Kittlesen DJ, Chianese-Bullock KA, Yao ZQ, Braciale TJ, Hahn YS. Interaction between complement receptor gC1qR and hepatitis C virus core protein inhibits T-lymphocyte proliferation. J Clin Invest. 2000 Nov;106(10):1239-49. Large MK, Kittlesen DJ, Hahn YS. Suppression of host immune response by the core protein of hepatitis C virus: possible implications for hepatitis C virus persistence. J Immunol. 1999 Jan 15;162(2):931-8.

圖 1. 病毒血症血漿含有導致CD4 T細胞對PLA2-GIB活性敏感的輔因子。A - 使自4個健康供者純化之CD4 T細胞持續30分鐘暴露於含5 nM或75 nM PLA2-GIB (GIB)或不含PLA2-GIB(w/o GIB)之PBS BSA1%緩衝劑(緩衝劑)、先前用抗PLA2-GIB抗體進行耗竭以移除CD4 T細胞上之內源性PLA2-GIB活性之1%之健康供者血漿(pHD)或病毒血症患者血漿(pVP)中。接著用IL-7處理細胞15分鐘且藉由共焦顯微鏡評估pSTAT5之核易位(pSTAT5 NT)。結果呈現經緩衝劑中響應於IL-7之pSTAT5 NT標準化的pSTAT5 NT之百分比。使用不成對t測試將病毒血症患者血漿對5nM PLA2-GIB之作用的統計分析與健康供者血漿相比。B - 使純化之CD4 T細胞暴露於先前用抗PLA2-GIB抗體進行耗竭之1%之健康供者血漿(pHD)或病毒血症患者血漿(pVP)，且分離成分子量為大於及小於30kDa及大於及小於10kDa或在30kDa與10kDa之間的各別部分。圖 2. AT-2不活化之HIV-1粒子致使CD4 T細胞對PLA2-GIB活性敏感。用PBS BSA1%緩衝劑、HIV-1 AT-2不活化粒子或模擬對照之類似稀釋液將純化之CD4 T細胞預處理15分鐘。HIV-1粒子以5000、500、50及5 pg之p24/10e⁶ 個細胞使用，其分別表示1、0.1、0.01及0.001之感染倍率(MOI)。接著將細胞用含5 nM、75 nM或250 nM PLA2-GIB之PBS BSA1%處理30分鐘或不處理作為PLA2-GIB抑制條件之對照，或用5 nM具有HIV-1粒子或模擬之PLA2-GIB處理或不處理。接著用IL-7處理細胞15分鐘且藉由共焦顯微鏡評估pSTAT5之核易位(pSTAT5 NT)。結果為在大於3個獨立區域上計算之響應於IL-7之pSTAT5 NT之百分比及SEM變化。在具有GIB相對於無PLA2-GIB之IL-7處理之條件之間，**p ＜0.01及***p ＜0.001。在具有逐漸增加量之HIV-1粒子及5nM之PLA2-GIB之條件之間，#p ＜0.05、###p ＜0.001。使用不成對t測試及魏爾希氏校正(Welch's correction)執行統計分析。圖 3. 重組gp41蛋白質致使CD4 T細胞對PLA2-GIB關於響應於IL-7之pSTAT5 NT的抑制活性敏感。A - 重組gp41蛋白質對PLA2-GIB關於響應於IL-7之pSTAT5 NT之活性的劑量作用。來自健康供者之純化CD4 T細胞用若干量之gp41或緩衝劑(PBS BSA1%)預處理15分鐘，在有5 nM PLA2-GIB (GIB)或無PLA2-GIB (w/o GIB)下培育30分鐘且用IL-7刺激15分鐘。藉由共焦顯微鏡分析pSTAT5 NT。B. 關於用0.5 µg/ml之gp41處理15分鐘，用5 nM之PLA2-GIB處理30分鐘(GIB)或不用PLA2-GIB處理(w/o GIB)且用IL-7刺激15分鐘之CD4 T細胞之3個獨立健康供者之實驗的概述。A及B，結果呈現經緩衝劑中響應於IL-7之pSTAT5 NT標準化的pSTAT5 NT抑制百分比。用不成對t測試對gp41及5 nM PLA2-GIB相對於無PLA2-GIB下單獨gp41之抑制差進行統計分析，**意謂p ＜0.01。圖 4. 用抗gp41抗體對病毒血症患者血漿進行免疫耗竭會消除PLA2-GIB對CD4 T細胞中之pSTAT5 NT之抑制活性(亦即恢復CD4 T細胞對經PLA2-GIB不活化之抗性)。來自3個獨立健康供者之純化CD4 T細胞在3個獨立實驗中持續30分鐘用單獨PLA2-GIB(作為對PLA2-GIB敏感之陽性對照)、先前用抗gp41多株抗體(pAb抗gp41)、對照多株抗體(pAb ctrl)進行耗竭或無抗體處理(僅)之健康供者(HD)血漿或病毒血症患者(VP)血漿處理，且用IL-7刺激15分鐘。結果呈現pSTAT5 NT抑制百分比，對於PLA2-GIB，該百分比經緩衝劑中響應於IL-7之pSTAT5 NT標準化，或對於病毒血症患者血漿處理之樣品，該百分比經健康供者血漿之相同百分比標準化。在pAb ctrl相對於pAb抗gp41處理之病毒血症血漿的pSTAT5 NT抑制差之不成對t測試下，***意謂p ＜0.001。圖 5. PEP3肽誘導對PLA2-GIB關於用IL-7刺激之CD4 T細胞中之pSTAT5 NT之抑制活性敏感。A - 所研究之PEP3及對照(CTL)肽之胺基酸序列。B - PEP3及CTL肽對關於響應於IL-7之pSTAT5 NT抑制百分比之PLA2-GIB活性的劑量作用。來自健康供者之純化CD4 T細胞用若干量之PEP3或CTL肽或緩衝劑(PBS BSA1%)預處理15分鐘，在有5 nM PLA2-GIB (5 nM G1B)或無(w/o G1B)下培育30分鐘且用IL-7刺激15分鐘。藉由共焦顯微鏡分析pSTAT5 NT。C - 關於用0.5 µg/ml之PEP3在有5 nM之PLA2-GIB (G1B 5nM)或無(w/o G1B)下處理45分鐘且用IL-7刺激15分鐘之CD4 T細胞之3個獨立健康供者之實驗的概述。B及C，結果呈現經緩衝劑中響應於IL-7之pSTAT5 NT標準化的pSTAT5 NT抑制百分比。用不成對t測試對PEP3及5 nM PLA2-GIB相對於無PLA2-GIB下單獨PEP3之抑制差進行統計分析，*意謂p ＜0.05。圖 6. gC1qR在C1q及PEP3對PLA2-GIB之輔因子活性中起關鍵作用，且與病毒血症患者血漿抑制活性有關。A - C1q對PLA2-GIB具有輔因子活性，且抗gC1qR之60.11以及74.5.2抗體阻斷CD4 T細胞上之C1q PLA2-GIB輔因子活性。純化之CD4 T細胞在60.11、74.5.2或小鼠對照IgG1 (IgG1 ctrl)下或在無抗體(w/o)下預培育，用10 µg/ml之C1q在無(w/o)或有5 nM PLA2-GIB(G1B 5 nM)下處理，且分析響應於IL-7之pSTAT5 NT。B - 抗gC1qR 74.5.2抗體，而非60.11抗體阻斷CD4 T細胞上之PEP3肽PLA2-GIB輔因子活性。細胞如A中一般用0.5 µg/ml PEP3在無(w/o)或有5 nM PLA2-GIB (G1B 5 nM)下處理。C - 抗gC1qR 74.5.2抗體，而非60.11抗體，降低用IL-7刺激之CD4 T細胞中之pSTAT5 NT之抑制。細胞如A中一般用抗gC1qR或對照抗體預處理，用1%或3%病毒血症患者(pVP)或健康供者(pHD)血漿處理45分鐘且分析響應於IL-7之pSTAT5 NT。在一個代表性實驗中，A、B及C中之結果呈現為pSTAT5 NT抑制百分比±SEM，其在A中經在IgG1 ctrl及5nM G1B與C1q下，或在B中經在PEP3下及在C中經在IgG1 ctrl與1%或3%之病毒血症患者血漿下之抑制百分比標準化。統計分析係至少三個獨立區域上不同條件下不成對t測試及魏爾希氏校正之結果。在各實驗條件下，在A及B中，在有PLA2-GIB相對於無PLA2-GIB下，或在C中，在有各百分比之病毒血症患者血漿相對於有相同百分比之健康供者血漿下，#p ＜0.05、##p ＜0.01及###p ＜0.001。在各實驗條件中，相對於用對照IgG1抗體處理之細胞，*p ＜0.05、**p ＜0.01及***p ＜0.001。圖 7. gp41增加CD4 T細胞膜上之PLA2-GIB酶活性。使用[3H]花生四烯酸標記之純化之CD4 T細胞暴露於若干濃度之單獨重組gp41或連同63nM、200nM之PLA2-GIB、或暴露於PLA2-GIB但無gp41 (僅介質)。結果呈現為各gp41濃度一式三份由於藉由PLA2-GIB之[3H]花生四烯酸之釋放所致之刺激減去單獨介質中之活性之平均值cpm/ml ± SEM，且表示具有類似結果之4個獨立實驗中之一個實驗。統計分析係不成對t測試，在有gp41及PLA2-GIB相對於單獨PLA2-GIB之實驗條件之間，*p＜0.05、**p＜0.01及***p＜0.001。圖 8. HCV核心蛋白質增加CD4 T細胞膜上之PLA2-GIB酶活性。A - HCV核心蛋白質對[3H]花生四烯酸釋放及PLA2-GIB酶活性之劑量作用。使用[3H]花生四烯酸標記之純化之CD4 T細胞暴露於若干濃度之單獨HCV核心蛋白質(僅HCV核心)或連同63 nM、200 nM之PLA2-GIB、或暴露於PLA2-GIB而無HCV核心(僅緩衝劑)。結果呈現為一個實驗之各蛋白質濃度一式兩份由於藉由PLA2-GIB之[3H]花生四烯酸之釋放所致之刺激減去單獨有緩衝劑之介質中之活性之平均值cpm/ml。B - HCV核心蛋白質增加PLA2-GIB活性。使用[3H]花生四烯酸標記之純化之CD4 T細胞暴露於10 µg/ml之單獨HCV核心蛋白質(0 nM)或連同63 nM、200 nM之PLA2-GIB、或暴露於PLA2-GIB但無HCV核心(緩衝劑，等效於10µg/ml)。結果呈現為三個獨立實驗在一式三份由於藉由PLA2-GIB之[3H]花生四烯酸之釋放所致之刺激減去單獨有緩衝劑(等效於10µg/ml之HCV核心蛋白質)之介質中之活性下的平均值cpm/ml ± SEM。統計分析係不成對t測試，分別在具有單獨HCV核心蛋白質或連通PLA2-GIB相對於單獨介質或於緩衝劑中之PLA2-GIB之實驗條件之間，***p＜0.001。圖 9. 金黃色葡萄球菌蛋白質A (SA蛋白質A)增加CD4 T細胞膜上之PLA2-GIB酶活性。使用[3H]花生四烯酸標記之純化之CD4 T細胞暴露於若干濃度之單獨SA蛋白質A (w/o G1B)或連同63nM、200nM之PLA2-GIB、或暴露於PLA2-GIB但無SA 蛋白質A。A - SA蛋白質A增加基礎及PLA2-GIB誘導之[3H]花生四烯酸釋放。結果呈現為3個獨立實驗在一式三份由於藉由單獨SA蛋白質A或連同PLA2-GIB之[3H]花生四烯酸釋放所致之刺激下之平均值cpm/ml±SEM。統計分析係不成對t測試，在具有單獨SA蛋白質A相對於單獨介質之實驗條件之間，##p＜0.01及###p＜0.001，且在具有SA 蛋白質A連通PLA2-GIB相對於單獨PLA2-GIB之實驗條件之間，*p＜0.05、**p＜0.01及***p＜0.001。B - SA蛋白質A增加CD4 T細胞上之PLA2-GIB活性。結果呈現為由3個獨立實驗在一式三份用SA蛋白質A及PLA2-GIB之刺激減去用單獨SA蛋白質A或單獨介質之刺激下所獲得之PLA2-GIB活性所致之平均值cpm/ml±SEM。在具有SA蛋白質A連同PLA2-GIB相對於單獨PLA2-GIB之實驗條件之間，*p＜0.05、**p＜0.01及***p＜0.001。圖 10. 對CD4 T細胞膜上之PLA2-GIB活性之gp41及其他輔因子作用的簡化模型。使諸如HIV-1粒子、gp41、PEP3、C1q、HCV核心或SA蛋白質A之PLA2-GIB輔因子與gC1qR結合，觸發細胞內囊泡之胞外分泌。使此等囊泡與漿膜融合改變脂質組合物，且引起CD4 T細胞膜上之PLA2-GIB活性。由於PLA2-GIB活性，膜流動性增加且細胞介素受體聚集於異常膜域中，從而使得細胞介素信號傳導顯著降低且使得CD4 T細胞無反應。圖 11. PEP3對PLA2GIB具有輔因子作用。圖 12. PEP3結合gC1qR。圖 13. gC1qR與PEP3輔因子作用有關。圖 14. HCV核心蛋白質使Jurkat E6.1 T細胞膜對PLA2-GIB酶活性敏感圖 15. 牙齦卟啉單胞菌對PLA2-GIB具有輔因子作用。圖 16. 來自胰臟癌患者之血漿對PLA2GIB具有輔因子作用。表 1. 含有可充當PLA2-GIB輔因子之潛在gC1qR結合元素之蛋白質。表 2. 可充當PLA2-GIB輔因子之gC1qR配體之清單。表 3. 含有潛在gC1qR結合元素之來自人類病原體之蛋白質。此表源自表1且列舉可充當PLA2-GIB輔因子之來自人類病原體之蛋白質及肽及相關疾病。

Claims

一種PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔因子之調節劑，其係用於治療哺乳動物個體。
一種PLA2-GIB輔因子或PLA2-GIB輔因子之調節劑，其係用於調節哺乳動物個體之免疫反應。
如請求項1或2使用之輔因子或調節劑，其中該PLA2-GIB輔因子係gC1qR之配體。
如請求項1或2使用之輔因子或調節劑，其中該PLA2-GIB輔因子係選自表1或2之蛋白質之蛋白質，或此類蛋白質之gC1qR結合元素。
如請求項1至4中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該PLA2-GIB輔因子係病原體之組分或營養物、較佳來自病原體之蛋白質或肽。
如請求項5使用之輔因子或調節劑，其中該PLA2-GIB輔因子係病毒或細菌或真菌或寄生蟲蛋白質或肽。
如請求項6使用之輔因子或調節劑，其中該PLA2-GIB輔因子係HCV核心蛋白質或葡萄球菌蛋白質A或其片段或模擬抗原決定基。
如請求項1至7中任一項使用之輔因子或調節劑，其中PLA2-GIB輔因子之該調節劑係該PLA2-GIB輔因子之抑制劑。
如請求項8使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑抑制該輔因子與gC1qR之結合。
如請求項8使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑抑制該輔因子之表現。
如請求項9使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑係與gC1qR或該輔因子結合且抑制gC1qR之功能的化合物。
如請求項11使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑抑制gC1qR介導之胞外分泌。
如請求項8至12中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑係抗體或抗體之變異體或片段。
如請求項13使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑係抗體或其變異體或片段，其結合gC1qR或選自表1或2之蛋白質且較佳抑制該蛋白質與gC1qR之結合。
如請求項8至12中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑係肽或脂肽。
如請求項15使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑係結合gC1qR且抑制選自表1或2之蛋白質與gC1qR之結合的肽。
如請求項8至12中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑係核酸。
如請求項8至12中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該抑制劑係碳水化合物。
如請求項1至7任一項使用之輔因子或調節劑，其中PLA2-GIB輔因子之該調節劑係該PLA2-GIB輔因子之免疫原，其可誘導產生該輔因子之抗體。
如請求項8至19中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該個體患有由病原體、較佳感染性病原體所致之疾病。
如請求項20使用之輔因子或調節劑，其中該感染性病原體係病毒或細菌或真菌或寄生蟲。
如請求項8至19中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該個體患有由免疫抑制所致或與免疫抑制有關或誘導免疫抑制之疾病。
如請求項8至22中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該輔因子調節劑與另一藥物或治療組合投與。
如請求項1使用之輔因子或調節劑，其係用於治療個體之由病原性細菌所致之疾病，該方法包含向該個體投與PLA2-GIB輔因子之抑制劑。
如請求項1使用之輔因子或調節劑，其係用於治療個體之由病毒所致之疾病，該方法包含向該個體投與PLA2-GIB輔因子之抑制劑。
如請求項25使用之輔因子或調節劑，其係用於治療個體之由肝炎病毒或HIV所致之疾病，該方法包含向該個體投與PLA2-GIB輔因子之抑制劑。
如請求項1或2使用之輔因子或調節劑，其中該PLA2-GIB輔因子之該調節劑係該PLA2-GIB輔因子之活化劑或促效劑或模擬抗原決定基。
如請求項1至27中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該個體患有需要免疫抑制或免疫刺激療法之病狀。
一種PLA2-GIB輔因子或其促效劑或模擬抗原決定基，其係用以藉由增加PLA2-GIB對T細胞之作用來誘導有需要個體之免疫抑制。
如前述請求項中任一項使用之輔因子或調節劑，其中該個體係哺乳動物、較佳人類。
一種用於治療由病原體所致之病症的組合療法或治療方案，其包含至少兩種選自以下之活性劑之組合：(i)具有抗病原體活性之藥物、(ii)PLA2-GIB輔因子之調節劑及(iii)PLA2-GIB之調節劑，該藥物及調節劑係用於組合、各別或連續投與。