JP2017532332A

JP2017532332A - 炎症性疾患の治療に使用するための乳酸トランスポーターの阻害剤

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Publication number: JP2017532332A
Application number: JP2017519617A
Authority: JP
Inventors: マウロ、クラウディオ; ハース、ロバート; マレリ−バーグ、フェデリカ
Original assignee: クイーンメアリーユニバーシティオブロンドン
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2035-10-20
Also published as: CA2962798A1; CA2962798C; EP3209328B1; JP6767647B2; WO2016063037A1; US20190106697A1; US20170355987A1; GB201418626D0; EP3209328A1; US20210087561A1

Abstract

本発明は、乳酸トランスポーターの阻害剤を用いる関節リウマチなどの炎症性疾患の治療のための方法および組成物を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、慢性炎症性疾患の治療における乳酸トランスポーターの特異的阻害剤の使用に関する。本発明は、そのような疾患の治療方法にも関する。

慢性炎症は、関節リウマチ、変形性関節症および癌などの多種多様な疾患に関連する状態である。関節リウマチ（RA）は、最も一般的な炎症性疾患の1つであり、人口の約0.5〜1％に発症する慢性疼痛の主要原因である。この疾患は関節の慢性炎症を特徴とし、滑膜炎や軟骨および骨の侵食と関連する。

RAには多くの治療方法があるが、ほとんど全てが望ましくない副作用を有している。例えば、現在RAの主要な治療法である非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）および疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）は、消化器不調から肝臓および腎臓損傷に亘る著しい副作用を有している。

従って、上記の欠点や問題と関連していない慢性炎症性疾患を治療するための改善された方法が必要とされている。

最近の研究は、多細胞生物における代謝と免疫との相互接続および免疫応答の効果的な確立および回復のためのそれらの機能的協調に光を当てている。この微妙なシグナル伝達ネットワークの不均衡は、非回復性の炎症、ひいては慢性炎症性疾患の発症を引き起こすことがある

T細胞は、細胞溶解活性および免疫応答を調節する炎症促進性と抗炎症性サイトカインの産生の両方を介して炎症プロセスにおいて主要な役割を果たす。T細胞レセプター（TCR）による抗原認識の際に、ナイーブT細胞における下流シグナル伝達現象がエフェクターT細胞への活性化、増殖および分化をもたらす。増殖中の高分子（例、アミノ酸、ヌクレオチドおよび脂肪酸）の適切な供給を維持するために、T細胞は、TCRおよび共刺激分子CD28によって生じるシグナル伝達現象によって駆動される酸化的リン酸化から好気性解糖へ代謝切り替えをする。代謝機構はまた、Tリンパ球が異なる微小環境（例、血液、リンパ組織および末梢組織）の間を連続的に再循環して、次々にT細胞代謝を調節するので、T細胞遊走現象に直接影響を及ぼすようである。これらの「環境」において、それらは異なった栄養素利用能および酸素（O2）分圧に曝されていて、免疫応答を効果的に媒介するためにそれらの代謝経路を適応させなければならない。T細胞の輸送能に関する代謝の直接的影響は、しかしながら、まだ研究する必要がある（非特許文献１）。

CXCL10などの炎症促進性ケモカインは炎症性刺激に応答して産生され、炎症部位にエフェクターT細胞を引き付けて、エフェクター機能を果たす。炎症部位は、しかしながら、エフェクターT細胞の挙動に影響を及ぼし、免疫応答の結果に影響する可能性のある炎症性浸潤物の細胞成分および損傷組織自体によって放出された因子で豊富な「過酷な」微小環境にある。

乳酸塩は、細胞代謝の「廃棄」副産物であると長い間考えられており、炎症部位に蓄積している。最近の知見は、乳酸塩を細胞シグナル伝達における活性代謝物として認定したが、炎症中の免疫細胞に対するその効果はほとんど研究されていない。

Mauro C, Marelli‐Berg FM (2012) Front Immunol 3: 173

本発明者らは、驚くべきことに、細胞外乳酸ナトリウムおよび乳酸がCD4+およびCD8+T細胞の運動性をそれぞれ阻害し、T細胞運動性のこの選択的制御が、それぞれCD4+サブセットおよびCD8+サブセットによって選択的に発現するサブタイプ特異的トランスポーター（Slc5a12およびSlc16a1）を介してもたらされることを見い出した。これは、これらの２つのサブセットを区別するこれまで未知の特徴である。本発明者らは、これらの乳酸トランスポーターの阻害が炎症組織からのT細胞の放出を促進することを示した。

従って、第１の態様において、本発明は、Slc5a12および/またはSlc16a1の阻害剤の治療有効量を患者に投与することを含む、患者における炎症性疾患を治療する方法を提供する。Slc5a12は溶質キャリアファミリー5（ナトリウム/グルコース共輸送体）、メンバー12とも呼ばれる。Slc16a1は溶質キャリアファミリー16（モノカルボキシレートトランスポーター）、メンバー1とも呼ばれる。

本明細書で用いられる炎症性疾患とは、関節リウマチ、変形性関節症、癌、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬などの疾患をいう。

炎症性微小環境の重要な特徴は、解糖系の副産物である乳酸塩の蓄積である。pHに依存して、乳酸塩は低pH環境中でプロトン化された酸性形態（乳酸）として、または塩基性pHでナトリウム塩（乳酸ナトリウム）として存在する。生理学的条件（pH7.2）では、乳酸塩の殆んどが脱プロトン化され、負に帯電した生物学的に活性な形態で乳酸塩アニオンとして存在している。

モノカルボン酸トランスポーター（MCT）は、細胞膜を通って乳酸塩、ピルビン酸塩、ロイシン、バリンおよびイソロイシンに由来する分岐鎖オキソ酸、およびケトン体のアセト酢酸エステル、β-ヒドロキシ酪酸エステルおよび酢酸エステルなどのモノカルボン酸分子の輸送に関与するプロトン結合膜貫通タンパク質である。Fischerらは、乳酸取り込みを促進するモノカルボン酸トランスポーターSlc16a1（Mct1としても知られる）のヒトCD8+細胞傷害性リンパ球による発現を記載している。Slc5a12は、これまでに記載された唯一の乳酸ナトリウムトランスポーターである。

本明細書で用いる用語「阻害」は、阻害剤が存在しない場合に乳酸トランスポーターによって示される生物学的活性の検出可能な減少および/または消失をいう。

阻害剤は、抗体、アプタマー、イントラマー、RNAi（二本鎖RNA）および抗Slc16a1および/またはSlc5a12アンチセンス分子からなる群から選択される。好ましくは、阻害剤は抗体である。抗体阻害剤は、ブロッキング抗体として記載してもよい。

用語「抗体」は、インタクトな抗体、抗体の断片、例えばFab、F（ab'）2断片、およびそれらの定常領域および/または可変領域のいずれかで変異したインタクトな抗体および断片（例、キメラ抗体、部分的にヒト化された抗体、または完全にヒト化された抗体を産生する変異、ならびに所望の形質、例えば、増強されたIL-13結合および/または減少したFcR結合、を有する抗体を産生する変異）を含む。抗体は、ポリクローナルであっても、またはモノクローナルであってもよい。

本発明の実施態様において、阻害剤は特異的阻害剤である。本明細書において、用語「特異的阻害剤」とは、特定のモノカルボキシレート輸送体を主に阻害する任意の分子をいう。Slc16a1の特異的阻害剤は、主にSlc16a1を阻害する。Slc5a12の特異的阻害剤は、主にSlc5a12を阻害する。

従って、本発明はまた、患者にSlc16a1またはSlc5a12の特異的阻害剤の治療有効量を投与することを含む、患者の炎症性疾患を治療する方法を提供する。

他の実施態様において、Slc16a1の特異的阻害剤は、Slc5a12の特異的阻害剤と組み合わせて投与してもよい。一の実施態様において、Slc5a12の特異的阻害剤は抗体であり、Slc16a1の特異的阻害剤は別の抗体である。

本発明のさらなる実施態様においては、阻害剤は二重特異性分子である。二重特異性分子とは、一般に、２つ以上の異なる結合特異性を有する分子をいう。本明細書において、用語「結合特異性」とは、抗体の抗原への結合、レセプターのリガンドへの結合、および酵素の基質への結合などの、一つの分子の他の分子に対する選択的親和性をいう。特定の実体に結合する全ての分子は、その実体に対して結合特異性を有するとみなされる。従って、特定の抗原に結合する全ての抗体はその抗原に対して結合特異性を有し、特異的細胞レセプターに結合する全てのリガンドはそのレセプターに対して結合特異性を有する。

二重特異性ポリペプチドを作製する方法は、当該分野で公知である。二重特異性抗体工学への初期のアプローチには、２つの異なる抗体または抗体フラグメントおよびクアドローマの化学的架橋が含まれていた。クアドローマは、２つの異なる抗原結合アームを有するモノクローナル抗体に似ている。それらは、それぞれ異なるモノクローナル抗体を産生する２つの異なるハイブリドーマ細胞を融合することによって生成される。所望の二重特異性を有する抗体は、重鎖および軽鎖のランダムな対合によって作製される。

TriomAbsは、異なる抗原エピトープに結合する各アームと、NK細胞や樹状細胞などのFcR発現細胞に結合するFcドメインとを有する二重特異性三機能性抗体である。これらは、不活性ヘテロ原子を生成することなく各特異性の重鎖と軽鎖の正しい会合を可能にする２つの特異的ハイブリドーマ細胞株の融合によって調製されたクアドローマ細胞株によって産生される。

抗原結合部分は、scFv断片に基づくものであってもよい。古典的な抗体分子では、Fv断片の２つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされる。しかし、それらは、組換え法を用いて、VLおよびVH領域が対になって一価分子を形成する一本鎖Fv（scFv）として知られる単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって結合することができる。

scFvフラグメントは、多くのアプローチを用いて二重特異性にすることができる。sScFv分子は、得られるscFvが安定な単量体または多量体を確実に形成するようにサイズが変化するリンカーを用いて、VH-VLまたはVL-VH配向で操作することができる。リンカーのサイズが例えば３〜１２残基のように十分に小さい場合、scFvは機能性モノマーに折り畳まれない。その代わりに、別のscFvと会合して二価二量体を形成する。リンカーのサイズがさらに減少すると、三量体および四量体が形成できる。

二重特異性抗体は、２つの抗体AおよびBのVHおよびVLドメインが融合して、ペプチドリンカーによって一緒に連結された２つの鎖VHA-VLBおよびVHB-VLAを作製する二量体scFvである。両方の抗体AおよびBの抗原結合部位が再形成され、分子にその二重特異性を与えている。単鎖二重特異性抗体（sc-二重特異性抗体）は、VHA-VLBおよびVHB-VLAフラグメントを連結する追加のリンカーを有している。タンデムscFvは、単一のタンパク質鎖上の可動性ペプチドリンカーによって連結された２つのsc-二重特異性抗体から成っている。別の二重特異性scFv形式である二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）は、可動性リンカーを介して結合した２つのscFvフラグメントからなり、一つのフラグメントは表面抗原に対して向けられ、他方はT細胞上のCD3に対して向けられている。ミニ抗体は、ロイシンジッパーを用いた修飾された二量体形成ドメインを介して２つのscFvフラグメントの会合によって生成される。

scFv-Fc抗体は、ヒトIgG1ヒンジとFc領域（CH2およびCH3ドメイン）を持ったIgG様抗体である。各scFvアームは、分子を二重特異性にする異なる特異性を有することができる。scFv-Fcヘテロ二量体を生成する1つの方法は、Knobs-into-Holes技術を採用することによる。ノブはCH3ドメイン間の界面の小さなアミノ側鎖をより大きなものに置き換えることによって形成されるが、ホールは大きな側鎖をより小さなものに置き換えることによって構築される。二重特異性分子はscFvであってもよい。二重特異性分子は、二重特異性抗体、特に二重特異性ヒト抗体であってもよい。

さらなる実施態様において、二重特異性分子は、モノカルボキシレートトランスポーターに対する1つの結合特異性と組織特異的抗原に対する他の結合特異性を有する。二重特異性分子のモノカルボキシレートトランスポーターへの結合は、モノカルボキシレートトランスポーターの阻害をもたらす。モノカルボキシレートトランスポーターは、Slc5a12でもSlc16a1であってもよい。組織特異的抗原は滑膜に特異的な抗原であってもよい。関節炎患者の滑膜微小血管系を特異的に標的とするポリペプチドの例は、WO2012/042270に記載されている。

Slc5a12およびSlc16a1に対する抗体は、抗体またはその断片の対応するCDR領域によって認識され得るエピトープを形成するタンパク質のどの免疫原性配列に対しても産生され得る。アミノ酸配列は、長さが5〜75アミノ酸、例えば、長さが5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70または75アミノ酸であってもよい。Slc5a12のアミノ酸配列は、ヒトSlc5a12（受託番号NP_848593.2Gl：157671931、2015年3月15日現在）であってもよい。Slc16a1のアミノ酸配列は、ヒトSlc16a1（受託番号XP_011547028.1 Gl：768055870、2015年3月12日現在）であってもよい。

抗Slc5a12抗体は、ヒトSlc5a12のC末端領域からのアミノ酸583-613を含む領域に特異的である（データベース受託番号NP_848593.2Gl：157671931、2015年3月15日現在）。抗Slc16a1抗体は、ヒトSlc16A1からのアミノ酸202-263を含む領域に特異的である（データベース受託番号。 XP_01 1547028.1 G1 68055870、2015年3月12日現在）。

Slc16a1の他の阻害剤としては、これらに限定されないが、フロレチン、α-シアノ-4-ヒドロキシシンナメート（CHC）およびAR-C155858（6-[(3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル)メチル]-5-[[(4S)-4-ヒドロキシ-2-イソオキサゾリジニル]カルボニル]-3-メチル-1-(2-メチルプロピル)チエノ[2,3-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン）が挙げられる。

本明細書において、被験体とは、ヒトを含む動物、例えば哺乳動物をいう。動物には、マウス、ラット、ニワトリなどの家禽、ウシ、ヤギ、シカ、ヒツジ、ウマなどの反芻動物、ならびにブタ、ネコ、イヌなどの他の動物、およびヒト、チンパンジー、ゴリラおよびサルなどの霊長類が含まれる。好ましくは、被験体はヒトである。

本発明に記載の方法に従って治療される疾患は、炎症に関連する疾患である。例としては、これらに限定されないが、関節リウマチ、変形性関節症、癌、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬が挙げられる。好ましい実施態様において、炎症性疾患は関節リウマチまたは癌である。より好ましい実施態様において、炎症性疾患は関節リウマチである。

本発明者らは、ヒトにおいて、関節リウマチ（RA）を有する患者の滑液は、非炎症性タイプの関節炎、例えば変形性関節症（OA）と比較して、乳酸塩レベルの上昇を示すことを示した。従って、さらなる実施態様において、本明細書で提供される方法は、これらに限定されないが、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症および癌などの炎症部位での乳酸塩レベルの上昇と関連する疾患を治療するために使用できる。一つの実施態様では、疾患は関節リウマチである。

第２の態様において、本発明は、Slc5a12および/またはSlc16a1の阻害剤を含む医薬組成物を提供する。一つの実施態様において、医薬組成物は、Slc5a12およびSlc16a1の阻害剤の組み合わせを含んでいる。

他の実施態様において、医薬組成物は、Slc5a12の特異的阻害剤を、任意にSlc16a1の特異的阻害剤と一緒に含む。さらなる実施態様において、医薬組成物は、Slc16a1の特異的阻害剤と組み合わせてSlc5a12の特異的阻害剤を含む。

本発明の医薬組成物は、炎症性疾患の治療に適している。例としては、これらに限定されないが、関節リウマチ、変形性関節症、癌、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬が挙げられる。一つの実施態様において、炎症性疾患は関節リウマチまたは癌である。他の実施態様において、炎症性疾患は関節リウマチである。

本発明による医薬組成物は、即座に使用できる形態で提供してもよい。または、組成物は、投与前にいくらかの調製を必要とする形態で提供されてもよい。

本発明の医薬組成物は、何らかの適当なルートにより、例えば経口（バッカルまたは舌下を含む）、局所（バッカル、舌下または経皮を含む）、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内または皮内を含む）ルートにより投与に適応させてもよい。

非経口投与に適合した医薬組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を対象とするレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性無菌注射溶液;および懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。

注射用溶液に使用される賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。組成物は単位用量または多用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供してもよく、そして凍結乾燥された（凍結乾燥）状態で保存してもよく、使用直前に持ち運んだ無菌液、例えば注射用水を添加するだけでよい。即時注射溶液および懸濁液は、無菌粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。

医薬組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着臭剤、塩（本発明の物質はそれ自体が薬学的に許容される塩の形態で提供される）、緩衝剤、コーティング剤または抗酸化剤を含有してもよい。それらはまた、本発明の物質に加えて、治療的に活性な薬剤を含有してもよい。

治療有効量は、炎症を減少させるのに十分な用量である。送達および投与のための用量は、動物疾患モデルを用いて、または任意にヒト臨床試験において経験的に決定された現在の既存のプロトコールに基づくことができる。初期の試験投与量は、例えば、マウスについて、本明細書に記載の動物試験に基づくことができる。

投与量は、治療が予防的であるか治療的であるか、治療が指向する疾患のタイプ、発症、進行、重症度、頻度、持続時間または確率、所望の臨床的エンドポイント、以前または同時の治療、全体的な健康、年齢、性別、人種または被験体の免疫学的適格性および当業者に認識される他の要因に依存して、変わる。投与量、数、頻度または持続時間は、治療または療法の何らかの副作用効果、合併症または他の危険因子および被験者の状態によって示されるように、比例して増加または減少させる。当業者は、治療的または予防的利益を提供するのに十分な量を提供するのに必要な投薬量およびタイミングに影響する要因を理解するであろう。

第３の態様において、本発明は炎症性疾患の治療におけるSlc5a12またはSlc16a1の阻害剤の使用を提供する。炎症性疾患は、関節リウマチ、変形性関節症、癌、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬のいずれか1つである。好ましい実施態様において、炎症性疾患は関節リウマチまたは癌である。より好ましい実施態様において、炎症性疾患は関節リウマチである。他の実施態様において、本発明は炎症性疾患の治療におけるSlc16a1の阻害剤と組み合わせたSlc5a12の阻害剤の使用を提供する。さらなる実施態様において、Slc5a12の阻害剤はSlc5a12の特異的阻害剤であり、Slc16a1の阻害剤はSlc16a1の特異的阻害剤である。本発明による使用には、炎症性疾患の治療に使用するための医薬品の製造におけるSlc5a12またはSlc16a1の阻害剤の使用が含まれる。

第４の態様において、本発明は、本発明の特異的阻害剤および/または医薬組成物を含む部品のキットを提供する。本発明の一つの実施態様において、キットは炎症に関連する疾患の治療に使用するためのものである。好ましい実施態様において、キットは関節リウマチの治療に使用するためのものである。

キットは、本発明の阻害剤を凍結乾燥した粉末として含有する密閉容器と、溶媒を含有する第２の容器とを含んでいてもよい。ペプチドは凍結乾燥されていてもよい。固体または液体部分に、さらなる成分を含めてもよい。従って、キットはペプチドを含む第１の容器と等張の生理食塩水を含む第２の容器、またはペプチドとマンニトールを含有する第１の容器と無菌の水を含有する第２の容器から成ってもよい。投与に先立って、注射用溶液を得るために、溶媒を固体成分を含有する容器に添加する。

本発明の第２とそれに続く態様の好ましい特徴は、第１の態様の場合と同様である。

本発明を以下の実施例および図面を参照して更に説明するが。これらは参考のためだけに含めるのであって、本発明を限定するものと解釈してはならない。

乳酸塩はT細胞の運動性を阻害する。（A）変形性関節炎（OA）または関節リウマチ（RA）患者の滑液における乳酸塩測定。（B-C）キネティック（左パネル）および４時間ポイント（右パネル）として示した乳酸（10mM）または乳酸ナトリウム（10mM）の存在下でのCXCL10（300ng/ml）への活性化CD4⁺（B）およびCD8⁺（C）T細胞のin vitro走化性。（D）キネティック（左パネル）および４時間ポイント（右パネル）として示した乳酸ナトリウムの濃度増大下でのCXCL10（300ng/ml）への活性化CD4⁺T細胞のin vitro走化性。（E）乳酸ナトリウム（10mM）またはHCl（pH4.5）単独、または図に示したように次第にpHを下げるためにHClの濃度増大と組み合わせた乳酸ナトリウムの存在下でのCXCL10（300ng/ml）への活性化CD8⁺T細胞のin vitro走化性（4時間ポイント）。（A）OA、n = 4およびRA、n = 8。（B右パネル）n = 4。（C-D右パネル、E）n = 3。（B-D左パネル）データは、３つの独立した実験の代表である。値は、平均± SDを示す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。乳酸塩はCCL5刺激時のT細胞遊走を阻害し、細胞生存率に影響しない。（A）キネティック（左パネル）および４時間ポイントとして示した乳酸（10mM）または乳酸ナトリウム（10mM）の存在下でのCCL5（50ng/ml）への活性化CD4⁺T細胞のin vitro走化性。（B）乳酸（10mM）または乳酸ナトリウム（10mM）の存在下におけるCXCL10で処理した生存CD4⁺T細胞の総細胞数。（A左パネル）データは、3つの独立した実験の代表である。（A右パネル、B）n = 3。値は平均±SDを示す。***P <0.001。乳酸ナトリウムおよび乳酸は、それぞれ特異的細胞膜トランスポーターを介して、CD4⁺およびCD8⁺T細胞サブセットに作用する。（A）活性化CD4⁺およびCD8⁺T細胞サブセットにおけるウエスタンブロットによって評価したトランスポーターSlc16a1およびSlc5a12の全タンパク質レベル。（B-D）乳酸（10mM）のみの存在下、またはCHC (425μM)、フロレチン(25μM)または抗Slc16a1抗体(2.5μg/ml)との組み合わせ(B)、または図（C）に示したようなAR-C155858の濃度増加におけるCXCL10（300ng/ml）への活性化CD8⁺ T細胞のin vitro走化性（4時間時点）、および乳酸ナトリウム（10mM）のみの存在下、または抗Slc5a12抗体(2.5μg/ml)または2種の特異的sh-RNA（D）との組み合わせにおけるCXCL10（300ng/ml）への活性化CD4⁺ T細胞のin vitro走化性（4時間時点）。アイソタイプ対照抗体は、抗体特異性を制御するために含め（B、D）、非特異的sh-RNAは遺伝子ノックダウン特異性を制御するために含めた（D）。（B-D）n = 3。値は平均±SDを示す。*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。乳酸トランスポーターの遮断によるT細胞の移動の阻害は、サブタイプ特異的である。（A）Slc5a12特異的プライマーおよびsh-RNAを発現する活性化CD4⁺ T細胞由来のRNAを用いたウエスタンブロットおよびqRT-PCRを示す。（B、C）乳酸（10mM）のみの存在下または抗Slc5a12抗体（2.5μg/ml）またはアイソタイプ対照抗体（B左パネル）およびSlc5a12の２つの特異的sh-RNAまたは非特異的sh-RNA（B右パネル）との組み合わせにおけるCXCL10への活性化CD8⁺T細胞のin vitro走化性（4時間時点）、および乳酸ナトリウムのみの存在下またはCHC(425μM)またはフロレチン(25μM)（C左パネル）および抗Slc16a1（2.5μg / ml）またはアイソタイプ対照抗体、またはAR-C155858（8nM）（C右パネル）との組み合わせにおけるCXCL10への活性化CD4⁺ T細胞のin vitro走化性（4時間時点）。（A）データは３つの独立した実験の代表である。（B-C）n = 3。値は平均±SDを示す。*P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001。 CD4⁺T細胞の遊走には基本的およびケモカイン誘導の好気性解糖が必要である。（A）CXCL10（1000ng/ml）単独または乳酸ナトリウム（10mM）との組み合わせで処理した、または未処理のままの活性化CD4⁺ T細胞におけるHk1、アルドラーゼA、PkM1/2、エノラーゼ1およびβ-アクチンに対する抗体を用いたウエスタンブロット。ウェスタンブロットの濃度測定の定量化は、平均±SD、n = 3を示す（生物学的複製で二度繰り返して行う）。*P <0.05; ***P <0.001。（B）qRT-PCRによって評価したCXCL10（1000ng/ml）での処理後６時間の活性化CD4⁺ T細胞におけるHk1、PkM2およびグルコーストランスポーター（Glut1、Glut2、Glut3、Glut4）の相対的mRNA発現レベル。ナイーブCD4⁺ T細胞のmRNAレベルを1に設定した。（C）乳酸ナトリウム（10mM）またはPBSで処理した活性化CD4⁺ T細胞におけるmpH/分として表される解糖活性のECARトレース。縦軸は、それぞれ乳酸ナトリウムまたはPBSの添加時間を表す。（D）2-DG（1mM）、乳酸ナトリウム（10mM）または乳酸（10mM）で前処理し、次いで蛍光プローブ6-NBDGまたは2-NBDGでインキュベートした活性化CD4⁺ T細胞におけるグルコース取り込みおよびフラックスの測定。（E）CXCL10（1000ng/ml）および乳酸ナトリウム（10mM）で処理した活性化CD4⁺ T細胞における解糖活性のECARトレース。縦軸は、CXCL10、乳酸ナトリウムおよびPBSの添加時間を表す。（F）ラパマイシン（200nM）、2-DG（1mM）またはメトホルミン（2mM）で前処理した活性化CD4⁺ T細胞のCXCL10（300ng/ml）へのインビトロ走化性（4時間時点）。（G）ラパマイシン（200nM）、2-DG（1mM）またはメトホルミン（2mM）で前処理し、続いて、CXCL10（120ng/マウス）をi.p. 注射した同系レシピエントC57BL/6マウスの腹膜潅流液中でDDAO細胞蛍光色素で標識した、i.v. 注射した活性化CD4⁺ T細胞の相対的濃縮。（H）ラパマイシン（200nM）、2-DG（1mM）またはメトホルミン（2mM）の存在下での活性化CD4⁺ T細胞の自発的経内皮遊走（６時間時点）。（B-C、E）データは３つの独立した実験の代表である。（D、F、H）n = 3。（G）n = 4。値は平均±SDを示す。*P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001。ナイーブおよび活性化されたCD4⁺およびCD8⁺ T細胞における解糖および走化性。（A）CXCL10（1000ng/ml）で処理した、または未処理の活性化CD8⁺ T細胞におけるHk1、アルドラーゼA、PkM1/2、エノラーゼ1およびβ-アクチンに対する抗体でのウエスタンブロット。ウェスタンブロットの濃度測定の定量化は、平均±SD、n = 3を示す（生物学的複製で二度繰り返して行う）。（B）qRT-PCRによって評価したCXCL10（1000ng/ml）での処置後６時間の活性化CD8⁺ T細胞におけるHk1、PkM2およびグルコース輸送体（Glut1、Glut2、Glut3およびGlut4）の相対的なmRNA発現レベル。ナイーブT細胞のmRNAレベルを1に設定した。（C）2-DG、乳酸ナトリウムまたは乳酸で前処理し、次で蛍光プローブ6-NBDGまたは2-NBDGでインキュベートした活性化CD8⁺ T細胞におけるグルコース取り込みおよびフラックスの測定。（D）2-DG（1mM）、ラパマイシン（200nM）、メトホルミン（2mM）またはエトモキシール（100μM）で処理した活性化CD4⁺ T細胞におけるmpH/分で表した解糖活性のECARトレース。（E）図5Gに示した腹膜潅流液中の相対的濃縮に対応する、レシピエントマウスの腹膜潅流液および脾臓から収集したDDAO標識ドナーCD4⁺ T細胞の代表的なFACSドットプロット。（F）ラパマイシン（200nM）、2-DG（1mM）またはメトホルミン（2mM）で前処置したナイーブT細胞のケモカインCCL19/21（各ケモカイン200ng/ml）へのインビトロ走化性（４時間時点）。（B、D）データは、3つの（B）と2つの（D）の独立した実験の代表である。（C、F）n = 3。値は平均±SDを示す。*P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001。代謝薬物は、CD4⁺/CD8⁺ T細胞比およびCD25発現に影響を及ぼさない。フローサイトメトリーによって評価したラパマイシン（200nM）、2-DG（1mM）またはメトホルミン（2mM）で処理した活性化T細胞上のCD4、CD8およびCD25の細胞表面発現を示す代表的なFACSドットプロットおよびヒストグラム。代謝薬物は、T細胞表面分子の表現型およびFSC/SSCプロファイルに影響を及ぼさない。フローサイトメトリーによって評価したラパマイシン（200nM）、2-DG（1mM）またはメトホルミン（2mM）で処理した活性化T細胞上のFSC/SSCプロファイルおよびCXCR3、CCR7、CD62LおよびLFA-1の細胞表面発現を示す代表的なFACSドットプロットおよびヒストグラム。 ThO、Th1、Th2およびTh17細胞サブセットのサイトカイン発現プロファイル。qRT-PCRによって評価したサイトカインIFN-γ、Tnf-β、IL-4、IL-5、IL-13およびIL-17の相対的なmRNA発現レベル。未処理ThO細胞により発現された各サイトカインのmRNAレベルを1に設定した。データは、3つの独立した実験の代表である。と乳酸塩は、エフェクターT細胞機能を調節する。（A）乳酸ナトリウム（10mM）で処理、または未処理のCD4⁺サブセットThO、Th1、Th2およびTh17においてqRT-PCRで評価したサイトカインIFN-γ、Tnf-β、IL-4、IL-5、IL-13およびIL-17および転写因子Rorcの相対的mRNA発現レベル。未処理ThO細胞により発現された各サイトカインのmRNAレベルを1に設定した。（B）乳酸ナトリウム（10mM）で処理、または未処理の活性化CD4⁺ T細胞におけるIL-17AおよびIFN-γの細胞内染色。（C）乳酸ナトリウム単独または抗Slc5a12抗体との組み合わせで処理した活性化CD4⁺ T細胞におけるIL-17およびRorcの相対的mRNA発現レベル。未処理T細胞のmRNAレベルを1に設定した。（D）キネティック（左パネル）および６時間時点（右パネル）で示したCD8⁺細胞傷害性T細胞および乳酸（10mM）または乳酸ナトリウム（10mM）の存在下での同種内皮細胞の細胞生存。（A、C、D左パネル）データは、３つの独立した実験の代表である。（B、D右パネル）n = 3。（A-D）値は平均±SDを示す。*P <0.05; **P <0.01。とヒトのRAにおける高Slc5a12発現。（A）Croia C et al. Ann Rheum Dis 2013に示されるように、T0（浸潤性T細胞の不在）からT3（異所性ろ胞にオーガナイズされる多数の浸潤性T細胞）までの半定量的スコアを用いて定量化した連続的な高度のT細胞浸潤を示すCD3染色したRA滑膜組織の代表的画像。（B）RA患者の関節から単離された滑液におけるSlc16a1およびSlc5a12の相対的なmRNA発現レベル。サンプルは、Aに記載したT細胞スコアに基づいてグループ化する。値は平均±SD、（TO）n = 6、および（T2-3）n = 7を示す。*P <0.05。（C）RA患者の滑膜組織におけるSlc5a12およびCD4またはCD8に対する二重蛍光免疫染色。Slc5a12（緑色）は、高度のCD4⁺（赤色）T細胞浸潤の存在下でRA滑膜内で高度に発現している。緑色および赤色チャネルの混合（黄色）は、Slc5a12がCD8⁺浸潤性T細胞ではなく、CD4⁺によって選択的に発現されていることを示している。％ダブルポジティブ細胞の定量化は、条件あたり少なくとも６つの画像において陽性細胞（各マーカーについてシングルおよびダブルポジティブ）を計数する際に提供される。縦列は、CD4⁺またはSlc5a12⁺細胞内のダブルポジティブCD4⁺ Slc5a12⁺集団の％およびCD8⁺またはSlc5a12⁺細胞内のダブルポジティブCD8⁺ Slc5a12⁺集団の％を表す。スケールバー：50μm。（D）乳酸（10mM）または乳酸ナトリウム（10mM）の存在下でのCXCL10（300ng/ml）への活性化ヒトCD4⁺およびCD8⁺ T細胞のin vitro走化性（4時間時点）。（E）乳酸ナトリウム（10mM）で処理または未処理の活性化ヒトCD4⁺ T細胞におけるIL-17Aの細胞内染色。（D）n = 3。（E）n = 4。値は平均±SDを示す。*P <0.05。乳酸トランスポーターの阻害は、ザイモサン誘発性腹膜炎における炎症部位からのT細胞の放出を促進する。（A）ザイモサン処理マウスの腹膜における乳酸塩濃度。（B）ザイモサン（1mg/マウス）をi.p.注射して腹膜炎を誘発し、５日後にフロレチン（50μM）、抗Slc5a12抗体（5μg/ml）またはアイソタイプコントロール抗体でi.p. 処理したC57BL/6マウスの腹膜潅流液中のCD4⁺ T細胞およびCD8⁺ T細胞のそれぞれの数。（C）ザイモサン（1mg/マウス）をi.p.注射し、次いでフロレチン（50μM）、抗Slc5a12特異的抗体（5μg/ml）またはアイソタイプコントロール抗体でi.p. 処理したC57BL/6マウスの、それぞれ腹膜潅流液（左パネル）または脾臓（右パネル）におけるCFSE標識活性化CD4⁺ T細胞の数。（A-C）n = 3以上。値は平均±SDを示す。*P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001。インビボ腹膜炎モデルのFACSドットプロット。（A、B）図12Bに示した腹膜潅流液中のCD4⁺およびCD8⁺ T細胞に対応する、ザイモサンをi.p.注射して腹膜炎を誘発し、５日後にSlc5a12特異的抗体（5μg/ml）、フロレチン（50μM）またはアイソタイプコントロール抗体で処理したC57BL/6マウスの活性化CD4⁺（A）およびCD8⁺（B）T細胞の代表的な腹膜潅流FACSドットプロット。（C）図12Cに示した分析の典型である、養子移入されたCFSE標識活性化CD4⁺ T細胞の腹膜潅流FACSドットプロット。抗Slc5a12は、マウスモデルにおける関節炎を抑制する。Charles River Laboratoriesから購入したDBA/1マウスにCFA（Sigma-Aldrich）中の20μgのヒトG6PI合成ペプチド（hG6PI325-339; ThermoFisher Scientific）をs.c. 投与して免疫化した。示された量のペプチドをCFAと1：1の比（v / v）で混合し、超音波処理により乳化させた。関節炎の誘発のためにエマルジョン100μlを尾の付け根にs.c. 投与した。（A）7日目（疾患の発症時点）および誘導後11日目（グラフ中の矢印で示した）に、マウスを未処置のまま、または0.1 mg/mlの抗体;インフリキシマブ（Remicade、Janssen Biologics）、抗TNF（BD bioscience、TN3-19.12）、抗Slc5a12（abeam）、lso-TNF（BD bioscience）およびlso-Slc5a12（abeam）；の20マイクロリットルを後ろ足の足裏の下（sub-plantar）に処置した。抗体の用量は各処置群について同じであった。臨床スコアを視覚的に評価することにより、疾患の発症を毎日モニターした。スコア0は関節炎の臨床的徴候がないことを示す；それぞれ指、足および足首のスコア1は腫れと赤みを示す。各足の最大スコアは7である。マウスの免疫状態に目隠しされた熟練の観察者がスコアリングを行った。（B）Slc5a12アイソタイプコントロール抗体と比較して（即ち、腫脹、発赤）、抗Slc5a12処置の効果を示すG6PIで免疫化後21日目の足の代表的画像。（C）PBSまたは抗Slc5a12を用いて後ろ足の足裏の下に処理したマウスから単離した膝および足首のSlc5a12、Slc16a1およびIL-17の相対的なmRNA発現レベル。（A-C）値は平均±SD、n = 6を示す。*P <0.05。抗Slc5a12は関節炎のマウスモデルにおいて免疫浸潤物を減少させる。（A、B）PBSおよびアイソタイプコントロール抗体と比較して、抗Slc5a12処置群において免疫浸潤物が劇的に減少していることを示す図１４に示した実験群から採取した足首と足切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色。免疫浸潤に対する効果は抗TNF処置群に匹敵する。 Slc5a12。ヒトSlc5a12のアミノ酸配列（受託番号NP_848593.2Gl：157671931、2015年3月15日現在）。 Slc16a1。ヒトSlc16a1のアミノ酸配列（受託番号XP_011547028.1 GI：768055870、2015年3月12日現在）。

乳酸塩は、活性化T細胞の運動性を阻害する
T細胞運動性が乳酸塩によって影響を受けるかどうかを評価するために、試験を行った。それにより抗CD3および抗CD28抗体およびインターロイキン2（IL-2）で5日間活性化されたT細胞によるケモキネシスが、10mMの乳酸または乳酸ナトリウムの存在下で炎症促進性ケモカインCXCL10により誘発され、本発明者らによりRA患者の滑液中の乳酸濃度が測定され（図1A）、多くの炎症部位に見出された。CD4⁺ T細胞ケモキネシスは乳酸ナトリウムによって阻害されたが、一方CD8⁺ T細胞のそれは乳酸によって阻害されたが、その逆はなかった（図1B、C）。

T細胞遊走がいくつかのケモカインによって活性化され、異なる応答をもたらすため、本発明者らはCCL5（別の炎症性ケモカイン）誘発ケモキネシスに対する乳酸の効果も試験した。CD4⁺ T細胞のCCL5誘発遊走は、乳酸ナトリウムリッチの環境では減少したが、乳酸リッチの環境では減少せず（図2A）、図1BおよびCに示した実験で予想されるよりもケモカイン誘発シグナル伝達および下流の効果において乳酸塩の作用がより広いことを示唆している。乳酸ナトリウム処理時のCD4⁺ T細胞の遊走は、約10mMの乳酸ナトリウムのEC50で乳酸ナトリウム濃度の増加とともに減少した（図1D）。これらの乳酸ナトリウムおよび乳酸濃度は、細胞生存率に影響を与えなかった（図2B）。

酸性化“自体”は細胞運動に影響を及ぼすので、CD8⁺ T細胞遊走のpH依存性の低下を排除するために、本発明者らは、乳酸の存在下で重炭酸塩またはHEPESを用いて培地を緩衝して中性pHにした後に同様のケモキネシスアッセイを行った。これらの条件下では、CD8⁺ T細胞のケモキネシスはまだ損なわれていた（図1E）。逆に、培地に乳酸無しで重炭酸塩またはHEPESを添加するか、または培地のみをHClで酸性化すると、CD8⁺ T細胞の遊走に影響を与えなかった（図1E）。この効果は、その遊走が乳酸リッチの培地では影響を受けなかったので（図1B）、CD4⁺ T細胞には適用しなかった。

異なるT細胞サブセットに対する乳酸塩作用の効果は、別個のトランスポーターによって媒介される
本発明者らは次に、それぞれ乳酸ナトリウムまたは乳酸に対するCD4+およびCD8+T細胞の異なる、かつ相互に排他的な応答性の分子的基礎を調べた。Fischerらは、乳酸取り込みを促進するモノカルボキシレートトランスポーターSlc16a1（Mct1としても知られる）のヒト細胞傷害性リンパ球による発現を記載している。Slc5a12はこれまでに記載されている唯一の乳酸ナトリウムトランスポーターである。本発明者らは、マウスCD8+およびCD4+T細胞が、それぞれSlc16a1およびSlc5a12を選択的に発現することを見出した（図3A）が、各T細胞サブセットについての各トランスポーターの特異的な機能的役割を示唆している。本発明者らは、続いて、異なって発現した乳酸トランスポーターがT細胞ケモキネシス阻害において機能的であることを確認しようとした。

選択的阻害剤フロレチン、α-シアノ-4-ヒドロキシシンナメート（CHC）およびAR-C155858での、または特異的抗体でのCD8+T細胞のSlc16a1の遮断は、乳酸に暴露されたCD8+T細胞のケモキネシスを回復させた（図3B、C）。逆に、レンチウイルス送達された特異的sh-RNAまたは特異的抗体でのCD4+T細胞上のSlc5a12の選択的阻害後に、乳酸ナトリウムリッチ培地中のCD4+T細胞のケモキネシスが回復した（図3Dおよび4A）。期待通り、Slc5a12を標的とする抗Slc5a12抗体またはsh-RNAはCD8+T細胞遊走に影響を及ぼさず（図4B）、Slc16a1阻害剤フロレチン、CHCおよびAR-C155858または抗Slc16a1抗体もCD4+T細胞の遊走に影響を及ぼさなかった（図4C）。

乳酸ナトリウムは、CD4+T細胞における基本的およびケモカイン誘導の好気性解糖を制限する
乳酸トランスポーター特異性（図3A）およびトランスポーター阻害時の乳酸に対するT細胞非感受性（図3B〜Dおよび4B、C）は、乳酸塩の効果は、おそらく細胞代謝機構を妨害し、特にケモカイン受容体誘発の下流で関与して解糖経路を妨害する細胞内シグナル伝達によって媒介されることを示唆している。本発明者らは、抗CD3および抗CD28抗体およびインターロイキン-2（IL-2）で３日間活性化したCD4+およびCD8+T細胞における解糖の誘導に対するCXCL10処置の効果を調べることから始めた。本発明者らは、ヘキソキナーゼ1（Hk1）およびピルビン酸キナーゼ（Pk）M2が、タンパク質レベルでCXCL10とのCXCR3の会合直後およびmRNAレベルで６時間後にCD4+T細胞において増加したことを見出したが、CXCR3誘発の解糖経路下流の調節の複数レベルの存在を示唆していて、翻訳後および転写の両方である（図5A、B）。さらに、CXCL10へのCD4+T細胞の曝露は、酵素エノラーゼ1およびアルドラーゼAのタンパク質発現の増加（図5A）およびグルコーストランスポーターの遺伝子発現の増加（図5B）をもたらした。注目すべきことに、乳酸ナトリウムは、解糖酵素のCXCL10誘導の増加を阻害した（図5A）。対照的に、CD8+T細胞は、CXCL10への曝露に際して解糖系遺伝子/タンパク質の発現に大きな変化を起こさなかった（図6A、B）。解糖は、CXCR3誘発時にCD4+T細胞において選択的に活性化されるので、本発明者らは次いで、Seahorse分析装置を使用してリアルタイムでCD4+T細胞の細胞培養液における細胞外酸性化速度（ECAR）を測定することにより、基本条件下でのCD4+T細胞の解糖エネルギー代謝について乳酸ナトリウムの効果を試験した。

本発明者らは、乳酸ナトリウムが、CD4+T細胞のECARを未処理のコントロールにおける平均14mpH/分から5mpH/分未満のレベルに減少させたことを見出し（図5C）、解糖フラックスの減少を示した。これらのデータを支持するために、本発明者らは、乳酸ナトリウムまたは乳酸の存在下または非存在下でCD4+またはCD8+T細胞を処理し、蛍光プローブ2-NBDGおよび6-NBDGを用いて解糖によるグルコース取り込みおよびフラックスを測定した。2-NBDGは解糖経路に入り、ヘキソキナーゼによってリン酸化され、急速に非蛍光生成物に分解される。対照的に、6-NBDGはヘキソキナーゼによってリン酸化されず、その蛍光形態で細胞質に蓄積する。本発明者らは、乳酸ではなく乳酸ナトリウムが、CD8+T細胞ではなくCD4+T細胞において解糖によるグルコース取り込みおよびフラックスを選択的にブロックし、逆もまた同様であることを示す（図5Dおよび6C）。本発明者らは次に、乳酸ナトリウムがCXCL10によるCXCR3結合の際にも解糖を減少させることができるかどうかを調べた。CD4+T細胞をCXCL10に曝露すると、いくつかの時点でECAR値が上昇し、これらの条件下で解糖のフラックスが増加することが示された（図5E）。CXCL10刺激細胞に乳酸ナトリウムを添加すると、ECARの劇的な低下に反映されるように解糖が停止する（図5E）。

基本的およびケモカイン誘導の好気性解糖がインビトロおよびインビボの両方でCD4+T細胞遊走に必要である
解糖の減少および乳酸ナトリウム曝露時の遊走に対する阻害効果−解糖の直接および間接の阻害剤である乳酸塩−は、解糖がCD4+T細胞遊走に必要であることを示唆している。この仮説を試験するために、本発明者らは活性化CD4+T細胞を解糖の阻害剤または活性化剤で処理し、CXCL10に対するそれらのケモキネシス応答を評価した。グルコースアナログ、2-デオキシグルコース（2-DG）、またはmTOR阻害剤、ラパマイシン（図6D）による解糖の直接的または間接的阻害は、インビトロおよび腹膜へのT細胞動員の確立したインビボモデルにおいてケモキネシスの低下を引き起こした（Jarmin et al 2008 J Clin Invest 1 18：1154-1164）（図5F、Gおよび6E）。逆に、電子伝達鎖複合体I阻害剤、メトホルミン（図6D）を用いた解糖の活性化は、インビトロおよびインビボの両方でCXCL10に対するケモキネシスを増加させた（図5F、Gおよび6E）。解糖測定の特殊性を説明すると、脂肪酸酸化の阻害剤であるエトモキシールは、解糖に対してわずかな効果を有するのみであった（図6D）。

解糖を妨害する代謝薬は、自発的ケモキネシスアッセイ（即ち、いかなる炎症促進性ケモカイン刺激とも無関係）においてT細胞運動性に同様の効果を有し、T細胞遊走の定常状態制御におけるこの経路の役割を暗示している（図5H）。重要なことに、使用した濃度での種々の代謝薬への曝露は、T細胞表面分子の形質に影響しなかった（図7および8）。T細胞の活性化および機能における好気性解糖の重要性は以前に示されているが、T細胞遊走に対するその潜在的な影響は未だに未解明である；したがって、本発明者らはホメオスタシスのために主として酸化的代謝に依存するナイーブT細胞の遊走への解糖の影響を評価した。

活性化T細胞で観察されたのと同様に、2-DGおよびラパマイシンを介した解糖の阻害は、ナイーブTリンパ球の運動性の低下をもたらし（図6F）、解糖経路を介したT細胞遊走の一般的制御を示唆している。しかしながら、活性化T細胞とは対照的に、メトホルミンへの暴露はナイーブT細胞遊走を減少させ（図6F）、ナイーブT細胞と活性化T細胞との間の異なる代謝チェックポイントの存在を示した。全体的に、代謝薬は使用された濃度および実験条件においてTリンパ球のT細胞生存に影響を及ぼさなかった（データは示さない）。

乳酸塩はエフェクターT細胞機能を調節する
乳酸ナトリウムがCD4+T細胞エフェクター機能に影響を与えるかどうかを調べるため、本発明者らは、適切なサイトカイン「環境」中のTh1、Th2およびTh17サブセットに対するCD4+T細胞の分極を誘導した。分化型Thサブセットによるサイトカイン発現の期待したパターンは、mRNAレベルで確認された（図9）。本発明者らは、次いで同じ分極条件下で異なるThサブセットによるサイトカインの放出に対する乳酸ナトリウムの存在の効果を試験した。遺伝子発現解析は、乳酸ナトリウムでの処理が全てのThサブセットにおいてIL-17の有意な増加を引き起こしたことを示した（図10A）。

これらのデータを支持して、Th17細胞のシグネチャー転写因子であるRorcの遺伝子発現も、T細胞を乳酸ナトリウムに曝露すると全てのThサブセットにおいて有意に増加した（図10A）。Th1およびTh2シグネチャーサイトカインの遺伝子発現は、乳酸ナトリウム処理で修飾されないか、または減少さえした（即ち、Th1サブセットにおけるIL-4、IL-5およびIL-13；図10A）。細胞内染色実験は、未処理の細胞と比較して、乳酸ナトリウムに曝露されたCD4+T細胞におけるIL-17タンパク質の発現の増加を確認した（図10B）。注目すべきことに、抗体抗Slc5a12とのプレインキュベーションは、乳酸ナトリウムによって誘導されたIL-17およびRorc遺伝子の発現増加を遮断した（図10C）。

CD8+サブセットから分化する細胞傷害性T細胞（CTL）は、標的細胞の死滅を促進するパーフォリン/グランザイム複合体からなる細胞溶解性顆粒を発現および放出する。これらの機能が乳酸塩によって影響されたかどうかを試験するために、本発明者らは、同種の内皮細胞を用いた細胞傷害性アッセイを行った。遊走アッセイで得られた結果（図1C）と同様に、乳酸ナトリウムではなく乳酸がCTLの細胞溶解活性を阻害した（図10D）。

乳酸トランスポーターの阻害は、炎症組織からのT細胞の放出を促進する
本発明者らは、ヒトにおいて、関節炎の非炎症型（例、変形性関節症[OA]、図1A）と比較して、RA（関節炎の炎症型）の滑液が乳酸塩レベルの上昇を示すことを示した。リウマチの滑膜環境は、捕捉、IL-17分泌および抗原応答性の喪失を含めて、T細胞における乳酸塩誘発性変化のすべてのパラダイムである。それ故、本発明者らはRAに罹患している１６人の患者の滑膜組織内のSlc5a12およびSlc16a1の発現および細胞局在を調べた（表1、人口統計データ）。

RA患者は、Croiaら（2013）Ann Rheum Dis 72：1559-1568に以前に記載されているように半定量的スコア（図11A）を用いてCD3+浸潤T細胞の量について層別化した。次に、遺伝子発現解析を行い、試験したサンプルのT細胞スコアとの相関関係においてSlc5a12 mRNA発現が有意に増加することが見出された（図11B、右）。有意ではないが、Slc16a1発現の増加傾向がCD8+T細胞においても観察された（図11B、左）。Slc5a12がCD4+では発現するが、CD8+T-細胞では発現しないというインビトロデータを確認するために（図3A）、本発明者らはSlc5a12およびCD4またはCD8の二重免疫蛍光検査を行った。図10Cに示したように、RA滑膜組織内で、Slc5a12はCD8+T細胞ではなくCD4+T細胞によって豊富かつ選択的に発現されている。RA滑膜におけるCD4+T細胞によるSlc5a12トランスポーターの発現の増強は、このトランスポーターが、本発明者らが以前に記載した、RAにおけるT細胞浸潤物の重要な特徴と相関する遊走性と機能性の変化を媒介する可能性を開く。

これらの結果により、本発明者らは、乳酸塩がインビボで炎症部位へのT細胞の保持を促進するかどうか、および乳酸トランスポーターの阻害剤が炎症部位からのT細胞の放出に有利に働くかどうかを調べようとした。本発明者らは、ザイモサン注射の5日後にT細胞を炎症部位に補充する、ザイモサン誘発腹膜炎の確立したマウスモデルを使用した（Montero-Melendezら、2011 Am J Pathol 179：259-269）。C57BL/6マウスを0日目にザイモサン（1mg/マウス）を腹腔内に注射したか、または未処置のままにした。5日目に、フロレチン、抗Slc5a12抗体またはアイソタイプコントロール抗体を腹腔内に注射した。24時間後、マウスを屠殺し、腹膜潅流液を採取した。腹膜における乳酸濃度およびCD4+およびCD8+T細胞は、レシピエント動物の腹膜において有意に増加した（図12A、B）。抗Slc5a12抗体の腹腔内注射は、アイソタイプコントロール抗体と比較して、腹膜におけるCD4+T細胞の有意な減少を引き起こしたが、CD8+T細胞には影響を及ぼさなかった（図12Bおよび13A、B）。対照的に、フロレチンは、腹膜におけるCD8+T細胞の有意な減少を促進したが、CD4+T細胞には何ら効果を示さなかった（図12Bおよび13A、B）。

腹腔へのT細胞局在の減少が、少なくとも部分的には、この部位からのそれらの放出の増加に起因することを立証するために、本発明者らは、CFSE標識CD4+T細胞に抗Slc5a12抗体、フロレチンまたはアイソタイプコントロール抗体を、5日前にザイモサン（1mg/マウス）を投与したマウスの腹腔内に同時注入して、乳酸塩が豊富な環境を作り出す養子移植実験を行った（図12A）。CFSE標識CD4+T細胞の腹腔内注射24時間後にマウスを屠殺し、腹膜潅流液および脾臓を採取した。フロレチンまたはアイソタイプコントロール抗体ではなく、抗Slc5a12抗体の腹腔内投与が、腹膜における養子移入したT細胞の選択的減少および脾臓におけるその蓄積を引き起こした（図12Cおよび13C）。

抗Slc5a12はマウスモデルにおいて関節炎を抑制する
最後に、本発明者らは、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（G6PI）誘導関節炎の確立したマウスモデルを利用して（Schubert et al 2004 J Immunol 172：4503-4509）、乳酸ナトリウムトランスポーターSlc5a12のブロッキングがRA治療のための革新的な作用機序を示すという原理を証明した。具体的には、市販されている特異的ポリクローナル抗体でのSlc5a12の阻害が、G6PI誘導マウスモデルにおける臨床スコアおよび足腫脹（図14A、B）を改善することを示した。注目すべきことに、抗Slc5a12抗体の効果は、標準的な抗TNF療法に十分匹敵する（図14A）。

材料および方法
特に言及しない限り、全ての化学物質および試薬はSigma-Aldrich＆Co（UK）から購入した。
T細胞単離、インビトロ活性化およびサブセット濃縮：T細胞をC57BL/6マウスリンパ節から単離し、プレート結合抗CD3および抗CD28抗体（BioLegend）、およびIL-2（PeproTech）で3〜5日間活性化した。CD4+およびCD8+サブセットは、実験的設定に従って活性化の前または後のいずれかに製造者の指示書（Easysep、Invitrogen）に従って市販のCD4+およびCD8+T細胞単離キットで濃縮した。ケモキネシスアッセイ：ケモキネシスアッセイは5μmのトランスウェルインレーで行った。いくつかの実験では、T細胞はCalbiochemから購入した多数の薬物：ラパマイシン（200nM）、2-DG（1mM）、メトホルミン（2mM）で一晩前処理した。たいていの実験では、アッセイの1時間前に、細胞は乳酸（10mM）または乳酸ナトリウム（10mM）と、単独またはフロレチン（25μM）、CHC（425μM）と組み合わせてインキュベートし、AR-C155858、Slc5a12特異的抗体（2.5μg/ml）またはSlc16a1特異的抗体（2.5μg/ml）の濃度を増加させた。3×10 5個のリンパ球を上部トランスウェルチャンバーに播種した；ケモカインを下部チャンバーに加えた：CXCL10（300ng/ml）、CCL5（50ng/ml）、CCL19/21（各ケモカインの200ng/ml）。遊走したT細胞を播種の２、４および６時間後に血球計数器で計数し、遊走した細胞の％を計算した。

RNA単離および逆転写：市販のキット（Qiagen）またはTrizol（Life）を製造者の指示に従って使用して10⁶細胞または10mgのRA滑膜組織からRNAを単離し、吸収測定を用いて品質および量について評価した。cDNAへの逆転写は、製造者の指示（Applied Biosystems）に従って行った。

qRT-PCR：遺伝子発現分析は、製造者の指示に従って、CFX connect light cycler（Biorad）中でSYBR Green Supermix（Biorad）を用いて行った。遺伝子の相対発現はΔΔct法を用いて計算し、参照コントロール（RplpO）に対して標準化した。qRT-PCRのためのプライマーは、可能であればプライマー対ごとに少なくとも1つのエキソン結合部位を用いて、オンラインツール（Primer 3Plus）の助けを借りて設計した。用いたプライマーの完全なリストは、下記の表２で利用できる。遺伝子受託番号はGenBankに従って示す。

ウエスタンブロット：タンパク質溶解液はRIPA緩衝液中の活性化T細胞から調製した。タンパク質はSDS-PAGEで分離し、ナイロンメンブラン（GE Healthcare）に移した。メンブランは5％ミルク/TBST中で室温で２時間ブロックし、一次抗体（1：1000）およびその後HRP結合二次抗体（Amersham Bioscience）（1：5000）と４℃で一晩インキュベートした。ヘキソキナーゼ1、ピルビン酸キナーゼM1/2、アルドラーゼA、エノラーゼ1およびβ-アクチンに対する抗体はCell Signalingから購入した；Slc16a1およびSlc5a12に対する抗体はAbeamから購入した。

レンチウイルス調製：Slc5a12を標的とするsh-RNAプラスミドクローンを含有する細菌グリセロールストックはSigmaから購入し、Luria Bertani培地中で育てた。プラスミドはPlasmid Maxiキット（Qiagen）を用いて単離した。HEK293T細胞は10×10cmの細胞培養皿で70％コンフルエンスになるまで増殖させ、リン酸カルシウム法を用いてプラスミドを導入した。上清をトランスフェクションの４８時間および７２時間後に採取して、超遠心分離機で100倍に濃縮した。一定分量を-80℃で保存した。

レンチウイルス形質導入およびsh-RNA媒介遺伝子発現抑制：C57BL/6ネズミリンパ節から一次CD4+T細胞を単離し、プレート結合した抗CD3および抗CD28、およびIL-2で３日間活性化した。３日目に、培地を交換し、細胞をポリブレン（8μg/ml）の存在下で25μlウイルス/10⁶細胞と共にインキュベートした。ウイルスは２４時間後に除去した；T細胞はPBSで2回洗浄し、完全RPMI培地で２４時間インキュベートした。

乳酸塩、解糖、グルコース取り込み/フラックスおよび細胞死の測定：乳酸塩濃度は、ラクテートアッセイキット（Biovision）を用いて、製造者の指示に従って、滑液または腹膜潅流液で測定した。解糖代謝はSeahorse XF24 Extracellular Flux Analyzerで測定した。簡潔には、T細胞を10％FCSを補充した高グルコースRPMI-1640中で増殖させた。実験の1時間前に、5×10⁵個のT細胞をXF Assay Modified DMEM中の２４穴マイクロプレートに播種して、CXCL10、乳酸ナトリウム、代謝薬物またはPBSを測定中に注入した。グルコース取り込み/フラックスは、2-DG、乳酸ナトリウムまたは乳酸で前処理し、次いで蛍光プローブ2-NBDGまたは6-NBDG（Life）でインキュベートしたT細胞で測定した。乳酸塩または代謝薬物処理したときのT細胞生存率はトリパンブルー色素排除アッセイによって評価した。

CTL分化および活性アッセイ：単離されたCD8+T細胞（balb/c）をCD3-枯渇およびマイトマイシン-C根絶同種異系脾細胞（C57BL/ 6）とともにインキュベートした。分化したCTLをFicollおよびCD3濃縮キットで濃縮し、10mMの乳酸または乳酸ナトリウムの存在下または非存在下で内皮細胞（C57BL/6）と共培養した。アッセイ開始後２、４、６および１８時間にトリパンブルー色素排除アッセイを用いて死細胞を計数した。

Thサブセット分化：T細胞をマウスリンパ節から単離し、CD3+、続いてCD4+サブセットについて濃縮した。10⁶細胞を蒔いて/ウェル、Th0、Th1、Th2およびTh17表現型に分化させた。条件は、Th0（10ng/ml IL-2）；Th1（10ng/ml IL-2; 3.4ng/ml IL-12; 2μg/ml抗IL-4）; Th2（10ng/ml IL-2; 10ng/ml IL-4; 2μg/ml 抗IFN-γ）; Th17（10ng/ml IL-6; 2μg/ml抗IL-4; 2μg/ml抗IFN-γ、5ng/ml TGF-β）であった。全ての抗体およびサイトカインはPeproTechから購入した。

細胞内タンパク質染色：分化したT細胞を透過化/固定化バッファー（ebioscience）中で４℃で一晩インキュベートした。サンプルを透過性緩衝液（ebioscience）で洗浄し、４℃で３０分間、蛍光性複合一次抗体（1：200、ebiosciences）を用いてサイトカインIFN-γおよびIL-17について染色して、LSR Fortessa（BD Biosciences）およびFlowJo version 7.6.5 softwareを用いてフローサイトメトリーで評価した。

ヒトRA滑膜組織の収集および免疫組織学/免疫蛍光検査：Humby et al (2009) PLoS Med 6: e1に以前に記載されているように、全人工関節置換または超音波ガイド滑膜生検を受けた合計16人のRA患者からインフォームドコンセント（LREC 07 / Q0605 / 29）後にRA滑膜組織を収集した。RA患者の人口統計的および臨床的特徴の概要を表１に報告する。

全T細胞スコアリングのために、パラフィン切片をCD3について染色し、Croia et al（2013）Ann Rheum Dis 72：1559-1568に以前記載されているように半定量的スコアを適用した。Slc5a12の単一および二重（CD4またはCD8と）免疫蛍光のために、抗原回収（S2367、Dako）および非特異的結合のブロック後、スライドを一次抗体と共に4℃で一晩（CD4およびCD8, 1：50, Dako）またはRTで1時間（Slc5a12, 1：50、Novus Biologicals）、続いて蛍光色素結合二次抗体（Invitrogen、Eugene、Oregon、USA）とインキュベートした。全ての切片をツァイス蛍光顕微鏡を用いて視覚化した。CD4+またはSlc5a12+細胞内の二重陽性CD4+ Slc5a12+集団の％およびCD8+またはSlc5a12+細胞内の二重陽性CD8+Slc5a12+集団の％を計算することによって定量化を行った。

インビボ腹膜動員モデル：全てのインビボ実験は、英国内務省規則（PPL 70/7443）の下で実施された。活性化T細胞（5×10⁶/マウス）をラパマイシン（200nM）、2-デオキシグルコース（1mM）またはメトホルミン（2mM）で一晩前処理し、次いで蛍光細胞色素DDAO（Invitrogen）で標識して、3時間前にCXCL10（120ng/マウス）の腹腔内注射を受けた同系雌のC57BL/6マウスに静脈内注射した。注射の２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓と腹膜潅流液を採取した。T細胞は表面マーカー（CD4およびCD8、ebiosciences）を染色し、FACSにより分析した。細胞をまずCD4にゲート（gate）し、続いてDDAO陽性について分析した。この方法は、図3GおよびS3Eにおいて使用した。

インビボでのザイモサン誘発性腹膜炎：C57BL/6マウスは0日目にザイモサン（1マウスあたり1mg）を腹腔内に注射したか、または未処置のままにした。5日目に、フロレチン（50μM）、抗Slc5a12抗体（5μg/ml）または抗ウサギIgGアイソタイプコントロール抗体（5μg/ml; Invitrogen）を腹腔内に注入した。24時間後、マウスを屠殺し、腹膜潅流液を採取した。T細胞は表面マーカー（CD4およびCD8; ebiosciences）を染色し、FACSにより分析した。この方法は図6BおよびS6A-Bに用いた。あるいは、C57BL/6マウスは、0日目にザイモサン（1マウスあたり1mg）を腹腔内に注射した。5日目に、蛍光細胞色素CFSE（3.3μM; Invitrogen）で標識した活性化CD4+T細胞（5×10⁶/マウス）を抗Slc5a12抗体（5μg/ml）、フロレチン（50μM）またはアイソタイプコントロール抗体（5μg/ml）を腹腔内に同時注入した。24時間後、マウスを屠殺し、腹膜潅流液および脾臓を採取した。T細胞は表面マーカー（CD4およびCD8; ebiosciences）を染色し、FACSにより分析した。細胞をまずCD4にゲートし、続いてCFSE陽性について分析した。この方法を図6Cおよび13Cに用いた。

FACS：単離されたT細胞は表面マーカー；CD3、CD4、CD8、CD25、CXCR3、CCR7、CD62LおよびLFA-1を蛍光性複合一次抗体（1：200、ebiosciences）を用いて4℃で30分間染色し、LSR Fortessa（BD Biosciences）およびFlowJo version 7.6.5 softwareを用いてフローサイトメトリーで評価した。

G6PI誘発性関節炎のモデル：Charles River Laboratoriesから購入したDBA/1マウスをCFA（Sigma-Aldrich、Taufkirchen、Germany）中の20μgのヒトG6PI合成ペプチド（hG6PI325-339）（ThermoFisher Scientific）を用いてs.c.で免疫化した。指示量のペプチドをCFAと1：1の比（v / v）で混合し、超音波処理によって乳化させた。関節炎の誘発のために、100μlのエマルションを尾の付け根にs.c.で投与した。誘発後7日目および11日目に、マウスは未処置のままにしたか、または後足に足裏の下から2μgの抗体；インフリキシマブ（Remicade、Janssen Biologics）、抗TNF（BD bioscience）、抗Slc5a12（Abeam）、Iso-TNF（BD biosciences）およびlso-Slc5a12（Abeam）で処置した。

臨床スコアを視覚的に評価することにより、疾患の発症を毎日モニターした。スコア0は、関節炎の臨床的徴候がないことを示す。それぞれの指（全部で5）に対するスコア1で、足と足首が腫れと発赤を示す。各足の最大スコアは7である。マウスの免疫状態を目隠しされた熟練観察者がスコアリングを行った。1処置群につきn = 5。

統計解析：データは平均±s.e.mで表す。両側スチューデントt検定を用いて、パラメータデータ分布を持つ2群を比較した。多重比較分析のために、1-、2-または3-way ANOVAを使用した。全ての場合において、5％未満のp値が有意であると判断された。

Claims

Slc5a12阻害剤の治療有効量を患者に投与することを含む、患者における炎症性疾患を治療する方法。
Slc16a1阻害剤の治療有効量を患者に投与することを含む、患者における炎症性疾患を治療する方法。
治療有効量のSlc5a12阻害剤を治療有効量のSlc16a1阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む、患者における炎症性疾患を治療する方法。
阻害剤がSlc5a12またはSlc16a1の特異的阻害剤である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
該阻害剤が抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
該抗体が二重特異性抗体である、請求項５に記載の方法。
炎症性疾患が炎症部位での乳酸塩レベルの上昇と関連している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、癌、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
Slc5a12またはSlc16a1の阻害剤を含有する、医薬組成物。
Slc5a12の阻害剤およびSlc16a1の阻害剤を含有する、医薬組成物。
Slc5a12の阻害剤がSlc5a12の特異的阻害剤であり、Slc16a1の阻害剤がSlc16a1の特異的阻害剤である、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
炎症性疾患の治療に使用するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
疾患が関節リウマチ、変形性関節症、癌、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬から成る群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
炎症性疾患の治療に用いるためのSlc5a12の特異的阻害剤。
炎症性疾患の治療に用いるためのSlc16a1の特異的阻害剤。
炎症性疾患の治療に使用するためのSlc16a1の特異的阻害剤と組み合わせたSlc5a12の特異的阻害剤。
炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、癌、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬から成る群から選択される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用のための特異的阻害剤。
Slc5a12および/またはSlc16a1の特異的阻害剤または請求項９〜１１のいずれか１項の医薬組成物を含むキット。
炎症性疾患の治療に使用するための、請求項１８に記載のキット。
該疾患が関節リウマチ、変形性関節症、癌、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬から成る群から選択される、請求項１９に記載のキット。