KR20120123748A - 플로레틴을 포함하는 글루타치온 ｓ―전이효소 유도 및 사이토크롬 ｐ450 효소 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플로레틴의 글루타치온 S-전이효소 유도 효과 및 사이토크롬 P450 효소 억제 효과와 이러한 효과들로 인한 아플라톡신 B1 해독 및 아플라톡신 B1으로 인한 발암 예방 효과에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 본 발명 조성물의 유효성분인 플로레틴으로 인해 사이토크롬 P450 효소의 활성이 저해되고, 글루타치온 S-전이효소의 발현 및 활성이 유도되어 효과적으로 아플라톡신 B1 중독을 해독할 수 있고 이 아플라톡신 B1으로 인한 발암을 예방할 수 있다.

Description

플로레틴을 포함하는 글루타치온 Ｓ―전이효소 유도 및 사이토크롬 Ｐ450 효소 억제용 조성물{Composition comprising phloretin for inducing glutathione S-transferase and inhibiting cytochrome P450 enzyme}

본 발명은 플로레틴을 포함하는 글루타치온 S-전이효소 유도 및 사이토크롬 P450 효소 억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 플로레틴의 글루타치온 S-전이효소 유도 효과 및 사이토크롬 P450 효소 억제 효과와 이러한 효과들로 인한 아플라톡신 B1 해독 및 아플라톡신 B1으로 인한 발암 예방 효과에 관한 것이다.

아플라톡신 B1(aflatoxin B1, AFB1)은 곰팡이인 아스퍼질러스 플라부스에 의해 생산되는 유력한 발암 인자로, 이 곰팡이는 땅콩이나 옥수수 등을 오염시키며, 이러한 오염은 식물이 성장할 때 또는 수확한 이후에 발생한다(Wild and Hall, 2000).

AFB1은 사이토크롬 P-450 효소(cytochrome P450 enzymes, CYPs)에 의해 AFB1-8,9-에폭사이드(AFB1-8,9-epoxide, AFBO)로 활성화된 이후, 특히 DNA와 같은 세포의 고분자물질과 작용하여 발암 효과를 발휘한다(Swenson et al., 1997; Essigmann et al.,1982). 이 사이토크롬 P-450 효소 중 CYP1A2와 CYP3A4가 AFB1의 활성화를 위해 필요한 첫 번째 효소라고 널리 알려져 있으며(Aoyama et al.,1990; Crespi et al.,1991), 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferase, GST)에 의한 AFBO의 글루타치온(GSH) 결합이 주요 해독 경로라고 할 수 있다(Neal and Green, 1983). 따라서 GST 활성이 높아지면 AFBO-글루타치온 결합을 효과적으로 유도하여, AFB1의 해독을 기대할 수 있다. 그러므로 AFB1의 독성 및 발암성을 화학적인 방법을 사용하여 방지하기 위해서는, 발암인자로의 활성화를 위해 필요한 CYP 효소를 저해(Guengerich and Shimada, 1991)시키거나 GST와 같은 2상 해독 효소를 유도(Kensler et al.,1986)시키는 방법을 사용할 수 있다.

몇몇 식물성 화학물질은 물질대사효소의 활성을 조절하는 것으로 알려진다(Wood et al.,1986). 이러한 화학물질의 효과는 물질대사효소의 유도, 활성화, 저해를 포함한다. 이전에 포도쥬스의 섭취로 쥐 간의 CYP3A 활성이 감소되어 AFB1으로 인해 유도되는 쥐 간의 DNA 손상을 방지할 수 있는 것으로 조사된 바 있다(Miyata et al.,2004). 또한, 위스타 쥐에 플라본(flavone)을 경구투여 하였을 경우 GST 활성이 증가되었고(Nijhoff et al.,1995), 제니스틴 또는 다이드진 식이요법은 쥐 신장에서 GST 활성을 높이는 것으로 조사되었다(Appelt and Reicks, 1999). 쿠에르세틴은 아릴 수소 리셉터(AhR)-의존적 CYP1A1 유도를 통해 CYP1A1 효소 활성을 증가시키는 것으로 나타났으며(Ciolino et al.,1999), 플라본, 쿠마린, 안쓰라퀴논은 쥐의 간에서 CYP 효소에 의해 AFB1이 AFBO로 형질전환되는 것을 저해하는데 상당한 영향을 미치는 것으로 조사되었다(Lee et al.,2001).

플로레틴(2',4',6'-Trihydroxy-3-phydroxyphenylpropiophenone)은 플라보노이드의 찰콘 클래스에 속하고, 사과, 딸기, 배에서 글루코사이드 플로리드진(phloretin 2'-0-glucose)으로 존재한다. 이것은 많은 플라보노이드와 같이 항산화 특성을 나타낸다. 플로레틴은 인간 백혈병 세포 성장을 저해하고 흑색종의 자멸을 유도하는 것으로 나타났다(Devi and Das, 1993; Kobori et al.,1997). 또한 생체실험을 통해 방광암 및 쥐 유방 선암종 세포의 성장을 저해하는 것으로 조사되었다(Nelson and Falk, 1993). 플로레틴은 배양 상태 및 종양을 지니고 있는 SCID 쥐를 통해 확인한 바, 간암 세포에서 자멸을 유도하여 항종양 활성을 나타내는 것으로 조사되었다. 이러한 발견으로 간암의 치료에 적용할 수 있을 것으로 예상된다(Wu et al.,2009). 또한, 인간 간암 세포의 치료에 있어서, 파크리탁셀(paclitaxel)과 플로레틴을 결합한 것의 항종양 활성을 평가하기 위해, 시험관실험 및 생체실험 상의 연구가 진행되었다(Yang et al.,2009). 여러 연구들을 통해 플로레틴이 항산화 성질 및 항종양 활성을 나타내는 것으로 조사되었다(Rezk et al.,2002; Yang et al.,2009). 한편 플로레틴이 발암인자로부터의 방지 효과를 나타내거나 GST 활성 상에서 특히, GST 이소자임의 발현 상에서의 효과에 관련된 분자 메커니즘에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자들은 AFB1의 대사 과정에 있어서 플로레틴의 효과 및 메커니즘을 조사하였고, 플로레틴이 CYP1A2 및 CYP3A4의 억제를 통해 AFB1의 대사적 활성화 능력을 감소시킬 뿐만 아니라, AFBO를 불활성화시키는 GST 활성을 증가시켜 AFB1에 대한 화학적인 보호 효과를 나타낸다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 아플라톡신 B1으로 인한 포유동물의 중독 증상을 해독하거나 이로 인한 발암을 예방할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 이용한 아플라톡신 B1의 해독 및 발암 예방 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 정의되는 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 글루타치온 S-전이효소 유도용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1로 정의되는 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 사이토크롬 P450 효소 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1로 정의되는 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 아플라톡신 B1 해독 및 아플라톡신 B1으로 인한 발암 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 해독 및 아플라톡신 B1으로 인한 발암 예방 방법을 제공한다.

본 발명에서 아플라톡신 B1 해독 및 아플라톡신 B1으로 인한 발암 예방 효과를 나타내는 유효성분은 플로레틴(phloretin)이다.

플로레틴(2',4',6'-Trihydroxy-3-phydroxyphenylpropiophenone)은 플라보노이드의 찰콘 클래스에 속하고, 사과, 딸기, 배에서 글루코사이드 플로리드진(phloretin 2'-0-glucose)으로 존재한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 반응성 AFBO의 작용을 뚜렷하게 감소시킨다. 이러한 효과는 플로레틴이 사이토크롬 P450 효소(cytochrome P450 enzymes, CYPs)인 CYP1A2 및 CYP3A4 활성을 저해하고, 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferase, GST)의 발현 및 활성을 유도하기 때문인 것으로 나타났다.

도 2A에 나타난 것과 같이, 플로레틴의 처리로 AFBO 형성이 투여량에 의존적으로 감소하였으며, AFB1 발암성을 증가시키는 CYP1A2 및 CYP3A4 활성 모두에 저해 효과를 나타냈다(도 2B 및 2C 참조). CYP1A2와 CYP3A4가 AFB1의 활성화를 위해 필요한 효소이기 때문에, 이들의 활성을 저해한다는 것은 AFB1의 발암성을 방지할 수 있다는 것을 의미한다.

AFB1의 독성을 감소시키기 위한 또 다른 결정요소는 GST에 의해 촉매되는 GSH와 AFBO의 결합이다(Hayes et al.,1998; Kensler, 1997). 마우스(mouse)의 경우, AFB1의 독성 및 발암성 효과에 높은 저항력을 갖고 있고, 높은 레벨의 GST 활성을 나타낸다(Degen and Neumann, 1981). AFBO의 결합을 위한 마우스 간 세포질의 특정 활성은 렛(rat)의 간 세포질에 비해 약 50배에 달하는 것으로 나타났다(Monroe and Eaton, 1987). 또한 마우스의 GST A3, GST P1, GST M1은 간과 신장에서 높은 레벨로 발현된다(Mitchell et al.,1997). 따라서 본 발명자들은 AFBO와 GSH 사이의 결합 단계를 위한 양성대조군으로 마우스의 세포질을 사용하였다. 또한 결합 단계가 AFB1 독소의 감소를 위한 주요 결정요소이고, GST 활성의 증가가 AFB1의 해독에서 중요한 보호 메커니즘이 된다고 생각했기 때문에, 플로레틴이 GST 이소자임의 발현을 유도하는지 조사하기 위하여 AML 12 세포를 사용하여 조사하였다. 플로레틴을 처리한 AML 12 세포로부터 수득한 세포 용해질을 사용하여 CDNB 분석을 수행한 결과, 플로레틴이 CDNB에 대한 GST 활성을 투여량에 의존적으로 증가시키는 것으로 나타났다(도 3A 참조). 20μM 플로레틴을 처리한 후 GST 활성이 미처리 대조군의 4배 이상 증가하였지만, 이 증가된 활성은 마우스의 세포질에서 관찰된 것에 비교하면 아주 낮은 정도였다. 반면, AFBO에 대한 GST 활성은 플로레틴 처리 후 효과적으로 증가하였으며, 이 활성은 20μM 플로레틴 처리 후 미처리 대조군의 23배에 달했다. 마우스 세포질의 GST 활성과 비교하여 20μM 플로레틴 처리된 세포 용해질의 총 활성은 약 77%에 달했다. 이러한 결과는 플로레틴이 GST 활성 특히, AFBO에 대한 GST 활성에 좋은 유도제가 된다는 것을 나타낸다.

또한, 20μM 플로레틴을 18시간 처리하면 도 4A에 나타난 것과 같이, GST P1, GST T1, GST M1, GST A3, GST A4의 발현이 유도되었다. 그리고 GST 이소자임에 대한 siRNA를 도입시킨 다음 이들 유도된 효소들이 AFB1 해독 능력이 있는지 조사하기 위하여 AFBO와 GSH 사이의 결합을 분석한 결과, GST T1, GST P1, GST M1은 AFB1 해독을 위한 GSH와 AFBO의 결합 상에서 GST A3, GST A4에 비해 높은 효과를 갖고 있는 것으로 나타났다(도 5 참조). 이것은 GST 활성의 유도가 감소된 발병률 및 종양의 다양성과 연관되고, GST 이소자임이 화학적 발암의 감수성을 충분히 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서 플로레틴은 효과적인 화학보호제가 될 수 있다.

전사인자인 Nrf2는 기본적인 루신 지퍼 NF-E2 페밀리(leucine zipper NF-E2 family) 중 하나로, 2상 해독 효소의 ARE-매개 발현에서 필수적인 역할을 한다. ARE-루시퍼레이즈의 발현은 플로레틴에 의해 유도되었고, 4㎍의 Nrf2-DN(Nrf2-dominant negative)으로 완전히 차단되었다(도 6 참조). 이 결과는 플로레틴이 효과적인 ARE-매개 유도물질이며, Nrf2가 ARE에 유도 신호를 전달하는 것에 관련된 중요 전사인자라는 것을 나타낸다. Nrf2에서 유전적인 결함은 최종적으로 GST 이소자임의 발현을 감소시키고, 발암 물질 처리에 따른 악성 종양의 형성 빈도를 증가시킨다. 본 발명자들은 플로레틴에 의해 유도되는 GST 이소자임의 발현이 Nrf2와 연관되는 반면, 플로레틴으로 유도된 GST 발현의 절반 이상이 4㎍의 Nrf2-DN 상에서 여전히 발현된다는 것을 증명하였다.

또한, 도 6C에 나타난 것과 같이, Nrf2-DN은 AFBO-GSH 결합체의 형성을 투여량에 의존적으로 감소시켰지만, 감소 정도는 양성 대조군의 30% 미만이었다. 따라서 AML 12 세포에서 ARE는 플로레틴에 의해 유도된 GST 이소자임의 발현에서 주요 결정요소는 아니라는 것으로 나타났다. Jowsey 등은 Nrf2 전사인자의 결손이 mGSTA3 mRNA의 발현 감소와 연관된다는 것을 조사하였다. Nrf2-결손 간(liver)에서 mGSTA3의 발현은 야생형 조직의 레벨에 비해 45%가 감소되었다. Usamin 등은 Keap1 및 Nrf2의 야생형과 우성음성 형태의 과발현이 GST P1의 유도 상에서 작은 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다. 이것은 프로테이좀(proteasome) 저해물질에 의해 유도된 GST P1 발현에서, JNK/c-Jun 경로와 같은 선택적인 신호전달 메커니즘이 연관된다는 것을 의미한다. 미세소체효소(microsomal enzyme) 유도물질이 AhR, 조직적인 안드로스탄 수용체(constitutive androstane receptor), 프레그넌 X 수용체(pregnane X receptor), 페록시좀 증식체-활성 수용체 α(peroxisome proliferator-activated receptor α), Nrf2와 같은 전사인자를 통해 생체형질전환효소(1상 및 2상) 및 운반체의 발현을 증가시킨다는 것이 조사되었다. 모든 다섯 가지의 전사인자는 GST 유도 역할을 하는 것으로 나타났다. 플로레틴에 의해 유도된 GST 이소자임 유전자의 발현은 아마도 ARE 및 다른 경로와 연관될 것이다.

본 발명에 따르면, AFBO에 대한 플로레틴의 보호 효과가 AFB1의 대사에 연관된 CYP1A2 및 CYP3A4 활성의 저해와 관련될 수 있다. 또한, AFBO의 해독과 밀접하게 관련있는 것으로 보이는 GST 활성의 유도 효과 역시 플로레틴의 화학적 보호효과의 다른 주요 결정요소인 것으로 판단된다.

플로레틴은 AML 12 세포에서 GST A3, GST A4, GST P1, GST T1, GST M1의 발현을 유도할 수 있으며, AFB1의 해독에 있어서, GST M1, GST T1, GST P1은 AFBO와 GSH의 결합 상에서 중요한 역할을 한다. 따라서 이러한 플로레틴은 효과적인 ARE 활성 유도물질일 것이며, 이로 인한 GST 이소자임 유전자 발현은 Nrf2/ARE 경로를 통하여 부분적으로 조절된다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학적 제제로의 제형화 기준에 의거하여 제형화 할 수 있다.

약제학적 제제로의 제형화 기준에 허용이 가능한 부형제, 예를 들어 미결정셀룰로오즈, 콜로이드성 이산화규소, 옥수수전분 및 붕해제, 예를 들어 옥수수전분, 크로스포비돈, 전젤라틴화전분 및 활택제, 예를 들어 글리세릴베헤네이트 및 제피제, 예를 들어 오파드라이 등과 함께 제형화 할 수 있다. 그리고 제형화 된 제제는 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 물, 링거액 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 복강을 통한 유효 성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직한 투여 형태는 전신 투여인 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 또는 경피 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 0.1㎎ 내지 25mg을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 본 발명 조성물의 유효성분인 플로레틴으로 인해 사이토크롬 P450 효소의 활성이 저해되고, 글루타치온 S-전이효소의 발현 및 활성이 유도되어 효과적으로 아플라톡신 B1 중독을 해독할 수 있고 이 아플라톡신 B1으로 인한 발암을 예방할 수 있다.

도 1은 본 발명 조성물의 유효성분인 플로레틴의 화학구조이다.
도 2는 플로레틴의 처리 농도에 따른 AFBO 형성(A), EROD 활성(B) 및 니페디핀 산화 활성(C)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 플로레틴의 처리 농도에 따른 CDNB에 대한 GST 활성(A) 및 AFBO-GSH 결합체의 생성 정도(B)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 플로레틴의 처리 농도(A) 또는 처리 시간(B)에 따른 각 GST 유전자의 발현 정도를 나타낸 RT-PCR 전기영동 사진이다.
도 5는 플로레틴 및 각 GST에 대한 siRNA를 처리하였을 때 AFBO-GSH 결합체의 생정 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 플로레틴 및 Nrf2-DN의 처리 농도에 따른 ARE-루시퍼레이즈 활성(A), 각 GST의 발현 양상(B) 및 AFBO-GSH 결합체의 생성 정도를 나타낸 그래프 또는 RT-PCR 전기영동 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실험예 1.

1-1. 실험 재료

본 실험예에서 사용한 AFB1, 6-인산 포도당(glucose-6-phosphate), NADP(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), GSH, 6-인산 포도당 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 플로레틴(phloretin)은 Sigma Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 역상 HPLC(Reverse-phase high-performance liquid chromatography)용 용매(solvent)는 Merck Co.(Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 인간 간 마이크로솜 풀(Human Liver microsomes pool)은 BD Gentest TM에서 구입하였고, GST 이소자임에 대한 siRNA(small interfering RNA)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.

여기에서 언급하지 않은 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.

1-2. 세포 배양 방법

알파 마우스 간 12(alpha mouse liver 12, AML 12) 세포로는 인간 TGF 알파 유전자를 마우스(CD1 스트레인, 라인 MT42)에 도입하고, 이 마우스의 간세포를 수득하여 사용하였다. 세포 배양에는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's Nutrient Mixture F-12배지를, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 5㎍/㎖ 인슐린(insulin), 5ng/㎖ 셀레니움(selenium), 40ng/㎖ 덱사메타손(dexamethasone)이 추가된 2.5mM L-글루타민(L-glutamine), 1.2g/ℓ 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 15mM HEPES 및 0.5mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate)과 1:1로 하여 제조한 배지를 이용하였고, 가습배양기에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

1-3. AFB1 대사 측정 방법

AFB1 대사의 측정은 이전에 알려진 방법을 사용하여 이루어졌다(Kim et al. 1997). 혼합물은 2mM GSH가 포함된 50mM 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer)(pH 7.5), 0.6㎎ 마우스 간 시토졸(mouse liver cytosol), 50μM AFB1, 5mM 6-인산포도당(glucose 6-phosphate, G6p), 1.0mM NADP, and 1.0 IU 6-인산포도당 탈수소효소(glucose 6-phosphate dehydrogenase, G6pdh)로 구성된다. 첫째로, NADPH-생성 시스템(NADP, G6p, G6pdh 포함)을 37℃에서 10분간 반응시킨 다음, 모든 성분을 혼합하여 37℃에서 90분간 반응시켰다. 반응은 40㎕의 포름산(formic acid)을 첨가하여 정지시켰다. 반응정지 후 혼합물을 -80℃에서 밤새도록 보관하였다. 반응물을 13,000rpm으로 10분간 원심분리하고, HPLC 분석을 위해 상층액을 수득하였다. AFBO-GSH의 글루타치온(glutathione) 결합형을 기존의 변형된 방법(Raney et al. 1992)에 따라 UV 검출기를 사용하여 HPLC로 정량하였다. 상층액을 용매 B(acetonitrile : methanol : H₂O = 4.5 : 4.5 : 1, v/v/v)가 10% 포함된 용매 A(20mM ammonium acetate, pH5.4)의 이동상과 함께 옥타데실시릴(octadecylsilyl, C18) 컬럼에 주입하였다. 용출은 30% B - 70% A의 농도구배, 0.8㎖/min의 유속으로 20분간 이루어졌다. 투입량은 20㎕로 하였다. 용출액은 UV 흡광도(λ=362㎚)로 모니터링하였다.

1-4. 니페디핀 산화 및 EROD 분석

인간 간 마이크로솜에 각각 다른 농도로 플로레틴을 처리한 다음 곧바로 CYP1A2 및 CYP3A4 활성을 측정하였다. 에톡시레소루핀 O-디실레이즈(ethoxyresorufin O-deethylase, EROD) 활성을 CYP1A2 활성을 위한 선택적 탐침으로 사용하였다. 이 분석은 2μM의 기질농도를 사용하여 수행하였고, 반응비율을 반응시간 및 단백질 농도를 고려하여 선형조건에서 결정하였다. 주로 CYP3A4로 촉진되고, 피리딘(pyridine) 산화 생성물로 니페디핀이 산화되는 반응을 20μM 농도의 니페디핀을 인간 간 마이크로솜에 처리하여 측정하였다. 피리딘은 Guengerich 등의 방법에 따라 HPLC로 측정하였다.

1-5. 역전사 중합 연쇄 반응 분석(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis, RT-PCR)

RT-PCR은 기존의 방법에 따라 수행하였다. GST T1, GST M1, GST P1, GST A2, GST A3, GST A4, β-엑틴(actin)의 PCR 조건은 다음과 같다: 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 45초 35회. 프라이머는 다음과 같다: 마우스 GST A3 유전자(forward: 5′- GGTAGAGATCGACGGGATGA - 3′ 및 reverse: 5′- GGAGTTCAACCAGGGCAATA - 3′), 마우스 GST A4 유전자(forward: 5′ - GAAGACCCTAGTAGTTGGTGCATC - 3′ 및 reverse: 5′ - AAGGAGTAAATACAGTCGTTGGGAC - 3′), 마우스 GST M1 유전자(forward: 5′- GCTCATCATGCTCTGTTACAAC - 3′ 및 reverse: 5′ - TGTAGCAAGGGCCTACTTGT - 3′), 마우스 GST T1 유전자(forward: 5′ - TCACTGGATCATGGTCAGCACTCT - 3′ 및 reverse: 5′- ATGGTGCTGGAGCTCTATCTGGAT - 3′), 마우스 GST P1 유전자(forward: 5′ - GCAAATATGTCACCCTCATCTACACC - 3′ 및 5′ - GCAGGGTCTCAAAAGGCTTCA - 3′), β-엑틴 유전자(forward: 5′ - ATGGAATCCTGTGGCATCCATG - 3′ 및 reverse: 5′ - TAGAAGCACTTGCGGTGCACGAT - 3′). 증폭된 산물은 1.2% 아가로오스(agarose) 겔 전기영동 후 에티디움 브로마이드로 염색하고 자외선 상에서 촬영하여 분석하였다.

1-6. 일시적인 트랜스펙션

트랙스펙션 하루 전에, 약 70 ~ 80% 집합도(confluency)로 60㎜ 배양접시에서 1×10⁶ 세포의 밀도가 되도록 세포를 전배양하였다. 프라이머는 다음과 같다: GST A3 siRNA(5′ - GGAUCUGGAGAUAAUGAUUCUCUAU - 3′), GST A4 siRNA(5′ - AUACAAGUUGUACUUGGCAGCGAGG - 3′), GST M1 siRNA(5′ - UAACAGAGCAUGAUGAGCUGCAUGC - 3′), GST T1 siRNA(5′ - AAGAUAGCCACACUCUCACACAGGG - 3′), GST P1 siRNA(5′ - AUCAGCAGCAGGUCCAGCAAGUUGU - 3′). 대조 siRNA의 사용방법은 제조사의 방법에 따랐다(Santa Cruz Biotechnology). siRNA(40nmol/㎖)와 리포펙티민(lipofectimine)을 사용하거나, Nrf2(Nrf2-DN)와 항산화 반응요소(ARE) 서열의 플라스미드-함유 우성-음성 돌연변이주를 사용하여 Opti-MEM?I reduced serum medium에서 제조사의 방법에 따라 세포를 일시적으로 트랜스펙션 시켰다. 이후 세포를 신선한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium /Ham's Nutrient Mixture F-12로 재생시켰다. 하룻밤 트랜스펙션 후, 세포를 20μM 플로레틴으로 18시간 처리하였고, AFBO의 형태로 결합된 GSH를 HPLC로 분석하였다. 루시퍼레이즈를 분석하기 위하여, 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 두 번 세척하였고, 용해된 추출물을 루시퍼레이즈 분석용 시약 100㎕와 상온에서 혼합한 다음, 혼합물을 발광정도를 측정하기 위해 광도계에 위치시켰다.

1-7. CDNB를 위한 GST 활성의 측정

CDNB(1, 4-dichloro-2-nitrobenzene)을 위해 기존의 방법에 따라 세포질 GST 활성을 결정하였다. 농도별로 플로레틴에 노출시킨 다음, AML 12 세포를 수득하고 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 이후 세포를 100㎕ 멸균수에서 소니케이션하고, 13,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 단백질의 농도를 로우리 단백질 분석 키트(lowry protein assay kit)를 이용하여 결정하였다. CDNB를 위한 GST의 활성을 1mM CDNB, 1mM GSH, 60㎍ 세포 용해질 및 멸균수가 함유된 0.1M 인산칼륨 완충액(pH6.5)에서 측정하였다. 반응은 총 1㎖의 부피로 25℃에서 수행하였다. GST-촉매 형태인 CDNB-GSH는 울트로스펙 3000 UV-분광광도계(ultrospec 3000 UV-visible spectrophotometer)로 340nm에서 검출되는 디니트로페닐 티오에테르(dinitrophenyl thioether)를 생성하였다. 각 샘플의 동량의 단백질이 포함되어 있는 부피를 효소 활성 시험에 사용하였다.

1-8. 통계적 분석

그룹간의 데이터 차이를 일방향 분산 분석 방법(one-way analysis of variance)으로 분석하였고, 모든 값은 평균ㅁ표준편차로 표현하였다. 그룹간의 차이는 P < 0.05에서 의의있는 것을 채택하였다.

1-9. 결과

(가) 플로레틴에 의한 AFB1 활성의 저해

플로레틴이 인간 간 마이크로솜 부근의 AFB1 활성화를 조절할 수 있는지 결정하기 위하여, 활성화된 매개체인 AFBO의 형성을 검출하기 위한 HPLC 분석을 시도하였다. 도 2A에 나타나 있듯이, 플로레틴은 투여량에 의존적으로 AFBO의 형성을 저해하였다. 25uM 및 50uM의 플로레틴을 사용하였을 경우, AFBO의 형성이 대조군에 비해 각각 41% 및 28% 감소하였다. CYP1A2 및 CYP3A4는 인간 간 마이크로솜에서 AFBO의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에 우리는 플로레틴이 CYP1A2 및 CYP3A4 활성에 대한 저해효과를 통해 AFBO의 형성을 감소시키는지를 조사하였다. EROD 활성은 CYP1A2 활성을 위해 측정하였고, 니페디핀(nifedipine) 산화 활성은 CYP3A4 활성을 위해 측정하였다. 도 2B 및 C에 나타난 것과 같이, 플로레틴은 농도에 의존적으로 EROD 활성 및 니페디핀 산화 활성을 현격하게 저해시켰다. 특히, 50uM 플로레틴은 EROD 활성을 대조군에 비해 67% 저해하였고, 니페디핀 산화 활성을 86% 저해하였다. 이러한 결과는 플로레틴이 주로 CYP1A2 및 CYP3A4 활성을 저해시켜 AFB1 활성화를 감소시킨 다는 것을 암시하는 것이다.

(나) 플로레틴의 의한 GST 활성의 유도

대부분 포유동물의 GST 이소자임은, GST 활성을 감지하는데 일반적으로 사용되는 CDNB에 친화력을 나타낸다. 플로레틴이 GST 활성을 유도하는지 결정하기 위하여, 우리는 다양한 농도의 플로레틴으로 18시간 전처리한 AML 12 세포로부터 수득한 세포 용해질을 대상으로 CDNB 분석을 수행하였다. 플로레틴은 투여량에 의존적으로 CDNB에 대한 GST 활성을 증가시켰다(도 3A). 20μM 플로레틴에 의해 유도된 GST 활성은 미처리 대조군 용해질의 4배로 나타났고, 반면 용해질에서 유도된 GST 활성의 양은 GST 활성을 위한 양성 대조군으로 사용된 쥐 세포질의 7% 미만이었다. AFBO-GSH 결합체를 AFBO에 대한 GST 활성을 감지하기 위해 측정하였다. 도 3B에 나타난 것과 같이, AFBO에 대한 GST 활성은 플로레틴을 처리한 이후 뚜렷하게 증가하였고, 20μM 플로레틴을 처리한 이후 대조군의 레벨에 23배 이상에 달했다. 이러한 결과는 플로레틴이 투여량에 의존적으로 특히, AFBO에 대한 GST 활성을 유도할 수 있다는 것을 의미한다.

플로레틴에 의해 GST 활성이 유도되는 것이 GST 이소자임에도 영향을 미치는지 확인하기 위하여, AML 12 세포에서 각 GST 이소자임 유전자의 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 도 4A에 나타난 것과 같이, 플로레틴은 GST A3, GST A4, GST P1, GST M1, GST T1을 포함하는 GST 이소자임의 발현을 투여량에 의존적으로 증가시켰고, 처리 이후 18시간에 최대 발현을 나타내었다(도 4B). 이들 유도된 GST 이소자임이 AFBO의 해독에 관여하는 정도를 조사하기위해, 세포에 GST siRNA를 도입시킨 후 AFBO-GSH 결합체의 형성을 조사하였다. 도 5에 나타난 것과 같이, GST siRNA의 도입에 따라 AFBO-GSH 결합체 형성에 변화가 나타났지만, 대조군 siRNA의 도입에 대해서는 어떠한 변화도 나타나지 않았다. AFBO-GSH 결합체의 형성은 GST A3 siRNA, GST A4 siRNA, GST M1 siRNA, GST P1 siRNA, GST T1 siRNA의 도입 이후 각각 14%, 10%, 24%, 26%, 22% 감소하였다. 이들 결과를 종합해 보면, 플로레틴이 GST의 활성 및 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있다. GST P1 및 GST T1은 AFBO 해독에 더욱 효과적인 것으로 보인다.

(다) GST 이소자임 유전자의 발현과 GST 활성 상에서 Nrf2-DN의 효과

AML 12 세포에 ARE-루시퍼레이즈(luciferase)가 존재하거나 존재하지 않는 형태로 Nrf2-DN이 포함된 플라스미드를 다양한 농도로 도입하였다. ARE-루시퍼레이즈는 플로레틴이 ARE를 통해 GST 발현을 유도하는지 평가하기 위하여 사용하였다. 도 6A에 나타난 것과 같이, 20μM 플로레틴은 ARE-루시퍼레이즈 활성을 3.5배 증가시켰고, Nrf2-DN은 투여량에 의존적으로 이 활성을 감소시켰다. Nrf2-DN 4㎍의 경우, 대조군 보다 활성이 더 낮게 나타났다. 또한 우리는 이 Nrf2-DN이, 유도된 GST 이소자임 유전자의 발현에 영향을 미치는지 확인하였다(도 6B). Nrf2-DN(4㎍)의 도입 이후, GST 이소자임의 발현이 부분적으로 감소하였다. 이러한 결과는 Nrf2/ARE가 플로레틴-유도 GST 발현을 의미하는 것만은 아니라는 것을 나타낸다. 이러한 발견을 확실히 하기 위해, AFBO에 대한 GST 활성에 있어서 Nrf2-DN의 영향을 조사하였다(도 6C). AML 12 세포 용해질에서 Nrf2-DN은 투여량에 의존적으로 AFBO-GSH 결합체의 형성을 감소시켰다. 하지만, 빈 백터(pcDNA3)가 도입된 세포에 비해 29%만이 감소하였다. 따라서 플로레틴-유도 GST 발현은 Nrf2/ARE 경로에 의해 부분적으로 조절되는 것으로 보였다.

Claims (4)

1. 하기 화학식 1로 정의되는 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 글루타치온 S-전이효소 유도용 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 상기 화학식 1로 정의되는 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 사이토크롬 P450 효소 억제용 조성물.
3. 상기 화학식 1로 정의되는 플로레틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 아플라톡신 B1 해독 및 아플라톡신 B1으로 인한 발암 예방용 약제학적 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 해독 및 아플라톡신 B1으로 인한 발암 예방 방법.

Images