CN112525845A - 同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和vb12浓度的双波长紫外分光光度法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12浓度的双波长紫外分光光度法：(1)配制VB12标准溶液，在232nm和361nm波长下测定吸光度，得线性方程yVB12‑232和yVB12‑361；(2)配制肌酐标准溶液，在232nm波长下测定吸光度，得线性方程y肌酐‑232；(3)测定模拟液吸光度A361混，作为A361‑VB12代入yVB12‑361计算xVB12，根据xVB12利用yVB12‑232计算出VB12在232nm波长下的吸光度值A232‑VB12；测得A232混，计算模拟液中肌酐A232‑肌酐＝A232混‑A232‑VB12，利用y肌酐‑232计算出肌酐浓度x肌酐。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和 VB12浓度的双波长紫外分光光度法。
背景技术
在体外循环测试透析器性能的过程中，通常采用配置一定浓度的毒素模拟液代替血液进行体外循环测试，计算其清除率，作为透析器对毒素清除能力的指标。模拟液是含有尿素、肌酐、磷酸盐和维生素B12的混合水溶液，为了计算透析器的清除率，需要测试透析前后模拟液中的物质浓度。目前，模拟液中的物质是分开检测的，肌酐单独采用生化仪酶联免疫法检测，在这样分开检测的情况下，步骤繁琐，需要的仪器昂贵、试剂多费用大，检测时间长。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12 浓度的双波长紫外分光光度法。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12浓度的双波长紫外分光光度法，包括如下步骤：
(1)绘制VB12标准曲线：配制VB12标准溶液，利用紫外分光光度计分别在232nm和361nm波长下测定吸光度，分别得到VB12分别在232nm和361nm处的线性方程yVB12-232和yVB12-361；
(2)绘制肌酐标准曲线：配制肌酐标准溶液，利用紫外分光光度计在232nm波长下测定吸光度，得到肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232；
(3)测定待测模拟液在361nm的吸光度A361混，以A361混作为VB12在361nm处的吸光度值A361-VB12代入VB12在361nm处的线性方程yVB12-361从而计算出模拟液中VB12的浓度xVB12，根据得到的VB12的浓度xVB12利用VB12在232nm处的线性方程yVB12-232计算出VB12 在232nm波长下的吸光度值A232-VB12；测得待测模拟液在232nm吸光度值A232混，计算模拟液中肌酐在232nm波长下的吸光度值A232-肌酐＝A232混-A232-VB12，然后利用肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232计算出模拟液中肌酐的浓度x肌酐。
所述待测模拟液中VB12浓度为2.50μmol/L—40.00μmol/L，肌酐浓度为 15.62μmol/L—250.00μmol/L。
在上述技术方案中，
VB12在361nm处的线性方程yVB12-361＝b1*xVB12+c1，其中，xVB12为VB12的浓度，yVB12-361即为VB12在361nm处的吸光度值A361-VB12；
VB12在232nm处的线性方程yVB12-232＝b2*xVB12+c2，其中，xVB12为VB12的浓度，yVB12-232即为VB12在232nm处的吸光度值A232-VB12；
肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232＝b3*x肌酐+c3，其中，x肌酐为肌酐的浓度，y肌酐-232即为肌酐在232nm处的吸光度值A232-肌酐。
所述步骤(3)的具体计算步骤为：
通过紫外分光光度计测得A361混，A361-VB12＝A361混，通过公式yVB12-361＝A361-VB12＝b1*xVB12+c1计算得到xVB12，将xVB12代入公式A232-VB12＝yVB12-232＝b2*xVB12+c2计算得到A232-VB12；
通过紫外分光光度计测得A232混，通过公式A232-肌酐＝A232混-A232-VB12计算得A232-肌酐，将A232-肌酐代入公式y肌酐-232＝b3*x肌酐+c3，其中，y肌酐-232＝A232-肌酐，计算得到x肌酐。
作为优选地，
所述b1＝0.02597，c1＝-0.00837，VB12在361nm处的线性方程 yVB12-361＝0.02597xVB12-0.00837，其中，xVB12为VB12的浓度，yVB12-361即为VB12在361nm处的吸光度值A361-VB12；
所述b2＝0.03262，c2＝-0.00682，VB12在232nm处的线性方程 yVB12-232＝0.03262xVB12-0.00682；
所述b3＝0.00658，c3＝0.00376，肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232＝0.00658x肌酐+0.00376，其中，x肌酐为肌酐的浓度，y肌酐-232即为肌酐在232nm处的吸光度值A232-肌酐。
本发明的有益效果是：创新性地采用双波长法同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和 VB12浓度的方法，通过了方法学验证，证实本发明方法是科学有效的，采用此方法能节约设备投入，采用常用的紫外分光光度计即可，不需额外的试剂，检测时间短，检测精度和准确度高。
附图说明
图1是测试溶液用紫外分光光度计测得的重叠光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
试剂来源如下：
| 序号 | 试剂名称 | 批号 | 生产厂家 |
| 1 | 肌酐 | DB15BA0013 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 2 | 维生素B12 | 20181218 | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 3 | 尿素 | EA29BA0005 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 4 | 磷酸二氢钾 | 20190101 | 重庆川东化工(集团)有限公司 |
| 5 | 氢氧化钠 | 20161001 | 重庆川东化工(集团)有限公司 |
实验仪器：紫外-可见光分光光度计：岛津UV-1900。
实施例1
一、溶液制备
肌酐储备液：精确称取0.1131g肌酐，纯水稀释定容至100mL。
10％NaOH溶液：称取5g氢氧化钠，用45g纯水溶解。
磷酸盐储备液：精确称取0.6805g磷酸二氢钾，用50mL纯水溶解，加入1.6mL10％NaOH 溶液稀释定容至100mL。
尿素储备液：精确称取2.1021g尿素，纯水稀释定容至100mL。
维生素储备液：精确称取0.0542g维生素B12，纯水稀释定容至100mL，避光储存备用。
肌酐标准液(肌酐浓度1000.00μmol/L)：取10mL肌酐储备液，稀释定容至100mL。
维生素标准液：取10mLVB12储备液，稀释定容至100mL，避光储存备用。
尿素标准液：取10mL尿素储备液，稀释定容至100mL。
磷酸盐标准液：取10mL磷酸盐储备液，稀释定容至100mL。
混合标准液：各取10mL肌酐、维生素B12、尿素和磷酸盐储备液，混合稀释定容至100mL。
二、专属性测试
(1)测试方法：
①稀释肌酐标准液、维生素B12标准液、尿素标准液、磷酸盐标准液和混合标准液至原浓度1/4，在190nm～800nm波长范围内，以纯水扫描基线，扫描5种溶液的光谱。
②稀释肌酐标准液、维生素B12标准液、尿素标准液、磷酸盐标准液和混合标准液至原浓度1/4，以纯水调零，分别测试5种溶液在232nm和361nm波长下吸光度的值。
③配制5组溶液，5组溶液的编号依次为1组、2组、3组、4组、5组，每组溶液中含有3种溶液：溶液1、溶液2、溶液3，溶液1中含有VB12，溶液2中含有肌酐，溶液3中含有VB12和肌酐。每种溶液中物质浓度如表1所示，分别测试其在232nm波长下的吸光度。
表1
(2)测试结果：
①重叠光谱图如图1所示。
②在232nm和361nm波长下吸光度的值,具体数据见表2。
表2
③溶液在232nm波长下的吸光度值，具体数据见表3。
表3
结果显示在232nm波长下，肌酐和维生素B12都有吸收，且混合液在该波长下的吸收等于肌酐和维生素B12吸收之和；而维生素B12在232nm波长下的吸光度值在浓度 2.50μmol/L—40.00μmol/L范围成线性，且在361nm波长下只有维生素B12有吸收，混合液中的尿素和磷酸盐在232nm和361nm波长下均不影响肌酐和维生素B12的吸收，那么可以通过在361nm波长下测得维生素B12浓度，计算出维生素B12在232nm波长下的吸光度，用混合液在232nm的吸光度减去维生素B12在232nm波长下的吸光度，即为肌酐在232nm下的吸光度。
三、线性范围
(1)肌酐曲线
测试方法：吸取肌酐样液(肌酐浓度1000μmol/L)，分别稀释成15.62μmol/L，31.25μmol/L， 62.50μmol/L，125.00μmol/L，250.00μmol/L，5个浓度系列的溶液，在232nm波长下测定其吸光度值。
测试结果如下表，具体数据见表4。
表4
结果显示肌酐在232nm波长下的吸光度值在浓度15.62μmol/L—250.00μmol/L范围内线性良好。
(2)VB12曲线
测试方法：吸取维生素B12标准液(维生素B12浓度40.00μmol/L)，分别配制成2.50μmol/L，5.00μmol/L，10.00μmol/L，20.00μmol/L，40.00μmol/L，5个浓度系列的溶液，以纯水调零，在232nm和361nm波长下测定其吸光度值。
测试结果如表5所示：
表5
结果显示维生素B12在232nm和361nm波长下的吸光度值在浓度 2.50μmol/L—40.00μmol/L范围内线性良好。
四、精密度测试
(1)重复性
测试方法：由同一分析人员取肌酐标准液和维生素B12标准液，配制维生素B12浓度为 10.00μmol/L、肌酐浓度分别为31.25μmol/L、62.50μmol/L和125.00μmol/L的三种混合溶液，以纯水调零，测试其在232nm和361nm波长下吸光度的值并用本发明方法计算其肌酐浓度。
测试结果如表6所示：
表6
结果显示同一分析人员测定所得结果的精密度RSD最高为1.00％，小于2％，符合要求。
(2)中间精密度
测试方法：分别由两名分析人员用肌酐标准液和维生素B12标准液配制维生素B12浓度为10.00μmol/L、肌酐浓度为62.50μmol/L的混合溶液各3份，使用相同仪器，以纯水调零，测试其在232nm和361nm波长下的吸光度的值并计算其肌酐浓度。
测试结果如表7所示：
表7
结果显示两名分析人员测定所得结果的中间精密度RSD为1.57％，小于2.00％，符合要求。
五、准确度
测试方法：以回收率表示，用肌酐标准液和维生素B12标准液配制3份维生素B12浓度为5.00μmol/L、肌酐浓度为125.00μmol/L的混合溶液，再配制肌酐浓度分别为100.00μmol/L、 125.00μmol/L和150.00μmol/L各一份分别与前混合溶液等体积混合。
测试结果如表8所示：
表8
结果显示添加肌酐浓度80％、100％和120％的样品，回收率在95.96％—103.70％之间，满足回收率要求95.00％—105.00％之间。
综合前面所有实验，通过验证，混合液在232nm波长下的吸光度值为肌酐和维生素B12 之和，维生素B12在232nm的吸光度值与浓度成正比，肌酐在232nm的吸光度值也与浓度成正比，且混合液在361nm波长下只有维生素B12有吸收。因此可通过在361nm波长下测得维生素B12浓度，计算出维生素B12在232nm波长下的吸光度，用模拟液在232nm的吸光度减去VB12在232nm波长下的吸光度，得到肌酐在232nm下的吸光度，便可计算出模拟液中肌酐浓度。该方法在肌酐浓度为15.62μmol/L—250.00μmol/L范围内线性良好，相关系数 R2大于0.999，测得混合液肌酐浓度的精密度RSD小于2.00％，回收率为在95.00％—105.00％范围内。说明该测试方法适用于透析器清除率模拟液中肌酐含量的测试，结果准确可靠。
实施例2
同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12浓度的双波长紫外分光光度法，按照如下步骤操作：
(1)按照实施例1中的方法绘制VB12标准曲线：配制VB12标准溶液，利用紫外分光光度计分别在232nm和361nm波长下测定吸光度，得到VB12分别在232nm和361nm处的线性方程yVB12-232和yVB12-361；yVB12-232＝0.03262xVB12-0.00682，yVB12-361＝0.02597xVB12-0.00837。
(2)按照实施例1中的方法绘制肌酐标准曲线：配制肌酐标准溶液，利用紫外分光光度计在 232nm波长下测定吸光度，得到肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232＝0.00658x肌酐+0.00376；
(3)利用紫外分光光度计测定待测模拟液在361nm的吸光度A361混，以A361混作为VB12在 361nm处的吸光度值A361-VB12代入VB12在361nm处的线性方程yVB12-361从而计算出模拟液中VB12的浓度xVB12，根据得到的VB12的浓度xVB12利用VB12在232nm处的线性方程yVB12-232计算出VB12在232nm波长下的吸光度值A232-VB12；利用紫外分光光度计测得待测模拟液在232nm吸光度值A232混，计算模拟液中肌酐在232nm波长下的吸光度值A232-肌酐＝A232混 -A232-VB12，然后利用肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232计算出模拟液中肌酐的浓度x肌酐。
具体计算步骤为：
通过紫外分光光度计测得A361混，A361-VB12＝A361混，
通过公式yVB12-361＝A361-VB12＝A361混＝0.02597xVB12-0.00837计算得到xVB12，将xVB12代入公式A232-VB12＝yVB12-361＝0.02597xVB12-0.00837计算得到A232-VB12；
通过紫外分光光度计测得A232混，通过公式A232-肌酐＝A232混-A232-VB12计算得A232-肌酐，将A232-肌酐代入公式y肌酐-232＝0.00658x肌酐+0.00376，其中，y肌酐-232＝A232-肌酐，计算得到x肌酐， x肌酐即为模拟液中肌酐的浓度。
Claims (5)
1.一种同时测试透析器清除率模拟液中肌酐和VB12浓度的双波长紫外分光光度法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)绘制VB12标准曲线：配制VB12标准溶液，利用紫外分光光度计分别在232nm和361nm波长下测定吸光度，分别得到VB12分别在232nm和361nm处的线性方程yVB12-232和yVB12-361；
(2)绘制肌酐标准曲线：配制肌酐标准溶液，利用紫外分光光度计在232nm波长下测定吸光度，得到肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232；
(3)测定待测模拟液在361nm的吸光度
以
作为VB12在361nm处的吸光度值A361-VB12代入VB12在361nm处的线性方程yVB12-361从而计算出模拟液中VB12的浓度xVB12，根据得到的VB12的浓度xVB12利用VB12在232nm处的线性方程yVB12-232计算出VB12在232nm波长下的吸光度值A232-VB12；测得待测模拟液在232nm吸光度值
计算模拟液中肌酐在232nm波长下的吸光度值
然后利用肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232计算出模拟液中肌酐的浓度x肌酐。
2.如权利要求1所述的双波长紫外分光光度法，其特征在于：所述待测模拟液中VB12浓度为2.50μmol/L—40.00μmol/L，肌酐浓度为15.62μmol/L—250.00μmol/L。
3.如权利要求1或2所述的双波长紫外分光光度法，其特征在于：
VB12在361nm处的线性方程yVB12-361＝b1*xVB12+c1，其中，xVB12为VB12的浓度，yVB12-361即为VB12在361nm处的吸光度值A361-VB12；
VB12在232nm处的线性方程yVB12-232＝b2*xVB12+c2，其中，xVB12为VB12的浓度，yVB12-232即为VB12在232nm处的吸光度值A232-VB12；
肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232＝b3*x肌酐+c3，其中，x肌酐为肌酐的浓度，y肌酐-232即为肌酐在232nm处的吸光度值
4.如权利要求3所述的双波长紫外分光光度法，其特征在于：所述步骤(3)的具体计算步骤为：
通过紫外分光光度计测得
通过公式yVB12-361＝A361-VB12＝b1*xVB12+c1计算得到xVB12，将xVB12代入公式A232-VB12＝yVB12-232＝b2*xVB12+c2计算得到A232-VB12；
通过紫外分光光度计测得
通过公式
计算得
将
代入公式y肌酐-232＝b3*x肌酐+c3，其中，
计算得到x肌酐。
5.如权利要求3或4所述的双波长紫外分光光度法，其特征在于：
所述b1＝0.02597，c1＝-0.00837，VB12在361nm处的线性方程yVB12-361＝0.02597xVB12-0.00837，其中，xVB12为VB12的浓度，yVB12-361即为VB12在361nm处的吸光度值A361-VB12；
所述b2＝0.03262，c2＝-0.00682，VB12在232nm处的线性方程yVB12-232＝0.03262xVB12-0.00682；
所述b3＝0.00658，c3＝0.00376，肌酐在232nm处的线性方程y肌酐-232＝0.00658x肌酐+0.00376，其中，x肌酐为肌酐的浓度，y肌酐-232即为肌酐在232nm处的吸光度值
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