CN112522399A

CN112522399A - 一种piRNA NU9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂

Info

Publication number: CN112522399A
Application number: CN202010201346.3A
Authority: CN
Inventors: 何大维; 王璋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-03-19

Abstract

本发明公开了一种未知的新piRNA NU9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂。未知piRNA NU9作为检测靶点在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。检测ND5表达量的试剂在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。本发明通过研究发现piRNA NU9在肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤的肿瘤组织与正常组织中的表达差异显著，可以做为区分胚胎性恶性肿瘤与正常组织的潜在标志物。

Description

一种piRNA NU9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种piRNA NU9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂，具体是piRNA NU9(TCTCGTGATGAAAACTCTGTCCAGT)作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂。

背景技术

肿瘤干细胞(CSC)理论认为，CSCs是肿瘤复发转移及抵抗放化疗的根本原因。了解肿瘤干细胞的起源以及发生过程则有助于我们更好的判断肿瘤的预后以及更精准的进行靶向治疗。课题组前期用Piwil2重编程正常FB细胞建立了稳定表达Piwil2-GFP标记的肿瘤干细胞(Piwil2-iCSC)，并经过了细胞生物行为学测试以及肿瘤干细胞标志物检测证实重编程成功，可以作为理想的体外CSCs细胞模型。

piRNA是一段长度为23-31nt的sncRNA，特征是在5’端常见单磷酸的尿嘧啶核糖核酸，而在3′末端有甲基化修饰^[8]。其作用机制主要是结合PIWI蛋白(Piwil2/Piwil4)，通过乒乓效应抑制转座子的功能起到稳定基因的作用，此外piRNA还可通过DNA甲基化与组蛋白修饰参与基因调节。通过Piwil2重编程成纤维细胞形成体外CSCs模型，我们推测Piwil2基因过表达所致的相关piRNA的表达量及功能发生的变化可能是在肿瘤发生过程中具有的重要作用，其差异表达的piRNA可能对肿瘤组织的发生以及对肿瘤的诊治及预后判断有重要价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种piRNA NU9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂。

本发明的另一目的是提供一种ND5作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

ND5作为检测靶点在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。

检测ND5表达量的试剂在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。

一种ND5作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂，其特征在于包含检测ND5表达量的试剂。

有益效果：

本发明通过研究发现未知piRNA NU9在肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤的肿瘤组织与正常组织中的表达差异显著，可以做为区分胚胎性恶性肿瘤与正常组织的潜在标志物，检测上述piRNA的试剂可用于制备儿童肾母细胞瘤神经母细胞瘤，肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂。

附图说明

图1表达差异显著的piRNA的预测靶基因的GO分析。

图2差异piRNA的预测靶基因的蛋白互作分析(a：蛋白互作网络；b：蛋白互作综合评分；c：蛋白互作点数)。

图3 piRNA NU9,NU13,ND5,ND7,ND9及其靶基因NOP56,RPS8，MTRNR2L1在肾母细胞瘤组织中的表达情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

NU9序列:TCTCGTGATGAAAACTCTGTCCAGT(SEQ ID NO.1)

NU13序列:TGGAGGTGATGAACTGTCTGAGCCTGACCTT(SEQ ID NO.2)

ND5序列:ATGTTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGC(SEQ ID NO.3)

ND7序列:ATGTTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGCC(SEQ ID NO.4)

ND9序列:TTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGCC(SEQ ID NO.5)

1标本与材料

1.1主要试剂及仪器CO2孵箱(美国Thermo公司)、恒温水浴箱(上海医疗器械厂)细胞培皿(美国Hyclone公司)、移液器(德国Eppendorf公司)、超速离心机(美国Thermo公司)荧光显微镜(日本Nikon公司)、胎牛血清(美国Hyclone公司)、F-12培养基(美国Gibico公司)、嘌呤霉素(美国Sigma公司)、Trizol(美国Thermo公司)、miRNA逆转录第一链试剂盒(中国天根TIANGEN公司)、miRNA荧光定量PCR试剂盒(中国天根TIANGEN公司)、mRNA逆转录第一链试剂盒(日本Takara公司)、mRNA荧光定量PCR试剂盒(德国Qiagen公司)

1.2细胞课题组前期将携带Piwil2-GFP标记的慢病毒以及空载目的基因的GFP标记的慢病毒分别转染原代培养的小儿包皮成纤维细胞(FB)，经细胞行为学及体外细胞染色体核型分析证实成功构建Piwil2诱导的肿瘤干细胞，并长期储存于液氮中。

1.3临床标本收集重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科2015年6月至2019年6月入院肾母细胞瘤患者的手术标本，均为首次行肿瘤切除术并经病理科2位医师证实为肾母细胞瘤组织。标本来自34例儿童，男15例，女19例，平均年龄29.9(4.0～104.0·)个月，依照美国国家肾母细胞瘤研究组(NWTS-5)标准，组织分化良好型(FH)27例，分化不良型(uFH)7例，分期Ⅰ期7例，Ⅱ期9例，Ⅲ期11例，Ⅳ期1例，Ⅴ期6例。每位患者皆取其肿瘤组织作为肿瘤组，并取其癌旁组织距离肿瘤≥3cm正常肾脏组织作为对照组织，Ⅴ期双侧肿瘤则取肿瘤同侧的正常肾脏组织。

2实验方法

2.1细胞培养将Piwil2-FB、GFP-FB细胞从-80℃冰箱中取出，快速在37℃水浴箱中复温，将细胞悬液移至10mlEP管中，加入2mlF12培养基后离心清洗后分别培养于10％胎牛血清的F12培养基(10cm的培养皿)，在37℃、5％CO2培养箱中培养，细胞每隔48小时进行换液，待细胞生长至80％融合度以上时使用trizol消化进行总RNA提取。

2.2总RNA提取、逆转录及qPCR trizol法提取细胞及组织的总RNA，将10cm培养皿中细胞用1ml trizol消化10min后吸入1.5ml去酶EP管中(组织加100μg/ml trizol后电动匀浆器充分匀浆1-2分钟)，加入200μl氯仿震荡混匀后室温放置15分钟，4℃12000g离心15分钟，吸取上清加入500μl异丙醇混匀室温静置10分钟后4℃12000g离心10分钟，弃上清，加入1ml 75％乙醇温和震荡，4℃8000g离心5分钟弃上清，真空干燥5-10分钟后加入50μlDEPC水溶解。进行NanoDrop ND-1000分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳进行质量检验，满足标准A260/A280在1.8～2.0之间且电泳可见28s、18s两条亮带。使用miRNA逆转录试剂盒(天根TIANGEN)以及mRNA逆转录试剂盒(Takara)将总RNA逆转录为cDNA。qPCR引物设计来自上海生工(表1)，qPCR实验步骤参见miRNA荧光定量试剂盒(天根TIANGEN)和mRNA荧光定量试剂盒(Qiagen)。

表1

2.3二代测序及靶基因预测送检2组样本(Piwil2-FB、GFP-FB)于上海惠研生物进行二代测序。通过illumina Hiseq2000测序平台的单端50bp测序模式对模式物种人类的样本进行高通量测序，Piwil2-FB(Piwil2通过慢病毒转染FB而成的肿瘤干细胞)作为实验组、GFP-FB(空载GFP标记慢病毒转染的FB)作为对照组。原始数据经过引物与adaptor序列去除并经过对测序片段3’端的质量检验，同时选择质量可靠长度范围24-30nt的片段用于预测piRNA。piRNA的预测采用k-mer统计方法建立数学模型用以识别区分具有piRNA特征和非piRNA序列特征的序列，经过机器训练学习算法建立piRNA序列特征分类器，并以此用于预测piRNA。差异基因的筛选标准为P≤0.05且|logFC|≥1，并通过Miranda算法对这些差异基因进行靶基因预测，并且对这些靶基因进行功能分析。

3统计学分析

采用SPSS及Graphpad进行统计分析和作图，非正态分布的数据描述采用中位数(四分位数区间)表示，通过wilcoxcon检验比较配对样本中目标基因的表达差异，Mann-whitney检验比较目标基因在不同年龄、性别、分期和分型的肿瘤组织中的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

4结果

4.1 Piwll2-iCSC中piRNA表达谱及差异piRNA：从Piwll2-iCSC中筛选出的显著差异piRNA个数为230条，对比The piRNA database数据库，其中180条已发现且报道过的基因(46条在人类基因中有过报道，134条在非人生物中有过报道)，50条未有报道的新piRNA(上调未知用NU表示，下调未知用ND表示)。其中106条表达量在肿瘤干细胞中显著上调(其中22条未知)，124条表达量显著下调(其中28条未知)。

4.2 piRNA靶基因预测及富集分析：通过miRanda算法对230个差异表达基因进行靶基因预测，共61个piRNA预测出靶基因，预测出的靶基因共43条。对这43个靶基因进行GO分析(P≤0.05)，发现其参与的生物学过程主要为调节细胞钙离子浓度，分子功能主要为参与ATP酶的活动及多聚A尾RNA结合(图2)。通过String数据库对其进行蛋白互作网络分析(互作分数≥0.15)，其中肌球蛋白IXA有8个相互作用蛋白，成蛋白2有7个互作蛋白，蛋白酪氨酸磷酸酶D型受体(PTPRD)有6个互作蛋白，NOP56核糖核蛋白(NOP56)有4个互作蛋白，40S核糖体蛋白S8(RPS8)有3个互作蛋白，相互作用综合分数最高的组合是NOP56和RPS8(0.994)。靶基因MT-RNR2样蛋白1(MTRNR2L1)虽然没有在蛋白互作网络中，但是在差异表达量前十的下调未知piRNA中有3个piRNA靶向它(图3)。

4.3极差piRNA及其靶基因在34例肾母细胞瘤患者组织中的表达：选择piRNA NU13(未知的上调差异piRNA第13位)及其靶向基因NOP56，piRNA NU9(未知的上调差异piRNA第9位)及其靶向基因RPS8，piRNA ND5、ND7、ND9(未知的上调差异piRNA第5、第7、第9位)及其靶向基因MTRNR2L1在34例肾母细胞瘤患者组织中进行qPCR检测。结果显示，在肿瘤组织中，NU13表达量显著下调(P<0.01)，其靶向基因NOP56表达无显著差异(P＝0.58)；NU9表达量显著下调(P<0.01)，其靶向基因RPS8的表达无显著差异(P＝0.29)；而ND5、ND7、ND9及其靶基因MTRNR2L1的表达量均显著下调(P<0.01)(图3)。其中NOP56与RPS8在肿瘤组织的表达量与年龄性别有关，其余基因与肾母细胞瘤NWTS分期、年龄以及性别并无相关性(P＞0.05)(表2，3)。

表2 piRNA NU9,NU13,ND5，ND7，ND9在34例肾母细胞瘤患者组织中的表达情况与临床病理参数的关系

表3靶基因MTRNR2L1,NOP56,RPS8在34例肾母细胞瘤患者组织中的表达情况与临床病理参数的关系

可见piRNA NU9,NU13，ND5，ND7，ND9在肾母细胞瘤组织与正常组织间的表达差异巨大，因此以上piRNA可以作为胚胎性恶性肿瘤的诊断新靶点。

序列表

<110> 何大维

<120> 2020102013463

<140> 一种piRNA NU9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂

<141> 2020-03-20

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

tctcgtgatg aaaactctgt ccagt 25

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

tggaggtgat gaactgtctg agcctgacct t 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 3

atgttggatc aggacatccc aatggtgcag c 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 4

atgttggatc aggacatccc aatggtgcag cc 32

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 5

ttggatcagg acatcccaat ggtgcagcc 29

Claims

1.piRNA NU9作为检测靶点在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。

2.检测ND5表达量的试剂在制备儿童肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤或髓母细胞瘤诊断试剂中的应用。

3.一种ND5作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂，其特征在于包含检测piRNANU9表达量的试剂。