CN112501172A

CN112501172A - 一种根结线虫病相关miRNA及其调控基因、蛋白和应用

Info

Publication number: CN112501172A
Application number: CN202011459114.4A
Authority: CN
Inventors: 周冬梅; 魏利辉; 王纯婷
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: WO2022121127A1; CN112501172B

Abstract

本发明提供了一种根结线虫病相关miRNA及其调控基因、蛋白和应用，miRNA为miRcn1，miRcn1调控的基因包括CRF9；蛋白由本发明提供的根结线虫病相关miRNA调控基因编码；应用包括抗根结线虫病；本发明通过实验证实miRNA miRcn1及其靶基因CRF9在防治根结线虫上具有重要的作用。过表达miRNA miRcn1以及沉默靶基因CRF9可提高植物对根结线虫的抗性。

Description

一种根结线虫病相关miRNA及其调控基因、蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种根结线虫病相关miRNA及其调控基因、蛋白和应用。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)为世界范围内危害最为严重的植物寄生线虫之一，每年约造成数百亿美元的经济损失。其中，南方根结线虫的寄主范围广泛，可以危害几百种植物，番茄等作物受到其侵染后造成巨大的经济损失。目前针对该病害的防治方法包括化学杀线剂，作物轮作以及抗性品种选育，但这些措施都有严重的局限性。化学杀线剂更是对人、畜会产生一定的不安全影响，并且易对环境造成污染。因此，寻求新的防治根结线虫病的措施越来越紧迫。

为了抵御病原物的侵染，植物进化出了多种复杂的防卫机制，包括结构防御、化学防御、过敏反应和系统获得性抗性等。大量研究表明，在寄主植物响应病原物侵染产生PTI的过程中，microRNA(miRNA)扮演着重要作用。不仅如此，miRNA 还参与了寄主应对非生物胁迫的过程。Navarro等第一次在拟南芥中发现了一个 miRNA(miR393)在植物抗病过程中发挥重要作用，miR393作用于生长素受体 TIR1，AFB2以及AFB3的mRNA负调控生长素信号进而增强拟南芥对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性。灰葡萄孢菌侵染拟南芥，miR394下调表达，过表达miR94，其靶标基因Lcr下调表达，而Lcr缺失突变植株更加感病，因此miR394通过调控Lcr的表达来负调控拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性。

随着研究的不断深入，植物miRNA在寄主与线虫侵染互作过程中的功能也有所报道。为了抵抗甜菜孢囊线虫的侵染，拟南芥中不同的miRNA均下调表达，包括miR161,miR164,miR167a,miR172c,miR396c,miR396a,b和miR398a。拟南芥中，miR827在受甜菜孢囊线虫侵染形成的合胞体内大量表达，而其靶标基因NLA下调表达，miR827过表达植株更加感病，而miR827失活后植株更加抗病，同样的，过表达NLA增加植株对线虫的抗性，表明合胞体中线虫激活miR827的表达从而抑制免疫反应，促进感染和引起疾病。为了鉴定参与茉莉酸(JA)介导的番茄抗根结线虫的miRNA，Zhao等构建了野生型(WT)和JA突变体(spr2)两个miRNA文库，共有263个已知miRNA和441个新的miRNA的表达具有显著性差异，进一步研究表明，miR319a在受线虫侵染的或受JA处理的植物组织中均下调表达，其靶标基因TPC4上调表达，miR319a过表达后，JA含量降低且更加感病，因此，miR319a参与了番茄抗根结线虫的防御反应。拟南芥中，过表达miR858 降低拟南芥对孢囊线虫的敏感性，低表达量的miR858增强植株对线虫的敏感性，相应的，过表达其靶标基因MYB83的转基因植株则更加感病。

细胞分裂素反应因子(cytokinin response factor，CRFs)属于 APETALA2/ERF超家族中乙烯响应因子(ERF)亚家族的B-5亚群(亚群VI)，在植物与病原物互作过程中起着重要的作用。在拟南芥中，过表达CRF2和CRF5可以提高拟南芥对丁香假单胞菌的抗性(Rashotte et al.,2006；Cutcliffe et al., 2011；Kwon,2016)。在番茄中，共鉴定出11个CRF基因，其中，CRF9的表达受细胞分裂素的调控。目前，尚未有研究表明CRFs与根结线虫抗病相关。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种根结线虫病相关miRNA及其调控基因、蛋白和应用。

本发明首次发现CRF9参与了番茄与根结线虫互作，并且受miRNA miRcn1的调控。本发明的研究成果进一步验证了miRNA在线虫与寄主植物互作过程中重要调控作用，且提供了一种通过提高植物自身抗性有效防治根结线虫病害的技术方案。该技术手段可减少化学农药的施用，降低农业投入，缓解环境污染，实现线虫病害高效、安全的可持续控制。可以为线虫病害的防治提供新的理论基础。

本发明的第一个方面，提供了一种根结线虫病相关miRNA，所述miRNA包括 miRcn1及其调控的基因。

所述miRcn1选自以下组：

a)SEQ ID NO.1所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.1所示的碱基序列的互补序列；

c)与SEQ ID NO.1至少70％同源性、且具有相同功能的核苷酸序列。

SEQ ID NO.1：taacttcgtctagctcgccttc

本发明的第二个方面，提供了一种根结线虫病相关miRNA调控基因，所述基因包括CRF9。

优选的，所述CRF9选自以下组：

a)SEQ ID NO.10所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.10所示的碱基序列的互补序列；

c)与SEQ ID NO.10至少70％同源性、且具有相同功能的核苷酸序列。

SEQ ID NO.10：

atggatggttgcattagttcagtgaggaaagttcgcatagtttatgatgatcctgatgctacgga ctctgagagcgatgatgatcagaatgctgctcgtttcgataaaaatgtgaacagaatcaagcgtg ttgttaaggaaattgttattcctgttgtttcatgggagaatgattttaaaaaatgttctaaactt gataacattaggattaaagattccaagaagattcatgaaaataagaaggtgcagctaaaatcgac cgcgttgcctaaaggagttaggatgaggaaatgggggaaatatgcagctgagatcagagatccct cgcaggggaaaagaatatggttagggacttttgagactgtggaggcggcttcacaagcatacgag gcaaagagggctgaatttgataggattatttcattggggaagggtaagaatttgagccctggtcc tgctgagtgttctatggcgtgtacgtctcatcctacaaatgggaaaaatcgtgtgtactcacacc cttccccgtcttcggtgctagatgtccccacatcatcagctgctgccccggttgagtccaatgaa aatctaacgagagatatggctcgaatgccagattcaggttctgaagattttagcttgagttttga ggaccaaatgcttcatgaatttatcaaacaaagacagggcatttcagaattgatcgaacatcctt tgatagaacaaggctcgatcagcaatagcgttatggagatgactgaagtgaatatcaggaagaaa acgaaagccagacaaccaacgatagcaagttgtaaaatattgacaaagggaactgaggactacag taatgacaagtccattttcagtgtattaaacgagcctacaatcatgtctcctattcatacagagc tgcttcacttgaacatcgaggaaacagcagttacggggaatagcttgaaacttctaggctttgat gacaatgctttatttgataaagatatatcacaattatttgatccatatgcagatgctatatgcttggacaacacttttcaatgctgtgatggttggaatgagtgtgtttattgcaaaattttcaaagatg aagtcgacctagatgaagttgacttaagatggttagatgcagttttggtataa

本发明的第三个方面，提供了一种根结线虫病相关蛋白，所述蛋白由本发明所述的根结线虫病相关miRNA调控基因编码。

优选的，所述miRcn1调控的基因包括CRF9。

优选的，所述CRF9选自以下组：

a)SEQ ID NO.10所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.10所示的碱基序列的互补序列；

本发明的第四个方面，提供了一种工程菌，所述工程菌含有本发明所述的根结线虫病相关miRNA和miRNA调控基因。

优选的，包括转入本发明所述的根结线虫病相关miRNA和miRNA调控基因的根癌农杆菌GV3101。

优选的，所述根结线虫病相关miRNA，包括miRcn1。

优选的，所述miRNA调控基因包括CRF9。

优选的，所述miRcn1选自以下组：

a)SEQ ID NO.1所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.1所示的碱基序列的互补序列；

优选的，所述CRF9选自以下组：

a)SEQ ID NO.10所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.10所示的碱基序列的互补序列；

本发明的第五个方面，提供了一种植物表达载体，包括本发明所述的根结线虫病相关miRNA、miRNA调控基因、35S启动子、NOS终止子和pEarlygate 202 载体。

优选的，所述根结线虫病相关miRNA，包括miRcn1。

优选的，所述miRNA调控基因包括CRF9。

优选的，所述miRcn1选自以下组：

a)SEQ ID NO.1所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.1所示的碱基序列的互补序列；

优选的，所述CRF9选自以下组：

a)SEQ ID NO.10所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.10所示的碱基序列的互补序列；

本发明的第六个方面，提供了本发明所述的根结线虫病相关miRNA、本发明所述的miRNA调控基因、本发明所述的根结线虫病相关蛋白、本发明所述的工程菌和本发明所述的表达载体在防治根结线虫病中的应用。

优选的，所述应用包括，在植物中高表达miRcn1用于抗根结线虫病。

优选的，所述应用包括，在植物中敲除和/或沉默CRF9基因用于抗根结线虫病。

优选的，所述根结线虫病包括双子叶植物根结线虫病；进一步优选的，所述根结线虫病包括番茄植物根线虫病。

本发明的第七个方面，提供了一种生产转基因植物的方法，包括以下步骤：

S1、将本发明的根结线虫病相关miRNA转化入植物愈伤组织，或将本发明的根结线虫病相关miRNA调控基因从植物愈伤组织敲除和/或沉默，或用本发明的工程菌感染植物愈伤组织；

S2、从步骤S1获取的植物愈伤组织再生得到转基因植物。

优选的，步骤S1中敲除和/或沉默基因的方法包括：

S11、利用VIGS，CRISPR/Cas9，基因重组的方法，获得的基因CRF9敲除和 /或沉默重组载体；

S12、将步骤S11获得的CRF9敲除和/或沉默重组载体转化入宿主细胞。

优选的，所述植物包括双子叶植物。

优选的，所述双子叶植物包括番茄。

本发明相对于现有技术具有如下优点：本发明通过实验证实miRNA miRcn1 及其靶基因CRF9在防治根结线虫上具有重要的作用。过表达miRNA miRcn1以及沉默靶基因CRF9可提高植物对根结线虫的抗性。与现有技术相比，本发明的技术方案可通过提高植物自身抗性有效防治根结线虫病害。该技术手段可减少化学农药的施用，降低农业投入，缓解环境污染，实现线虫病害高效、安全的可持续控制。

附图说明

图1为本发明一实施例4中的miRcn1+SlCRF9、pEarleyGate202+SLCRF9和 miR319+SlCRF9三组的荧光图；

图2为本发明一实施例4中的miRcn1+SlCRF9、pEarleyGate202+SlCRF9和 miR319+SlCRF9三组的表达量图；

图3为本发明一实施例4中的miRcn1+SlCRF9、pEarleyGate202+SlCRF9和 miR319+SlCRF9三组的Westernblot电泳图；

图4为本发明一实施例7中的经根结线虫感染后的miRNA miRcn1转基因植株中miRNA miRcn1表达量检测结果；

图5为本发明一实施例7中的经根结线虫感染后的miRNA miRcn1转基因植株中CRF9表达量检测结果；

图6为本发明一实施例7中的经根结线虫感染后的miRNA miRcn1转基因植株根系图，其中，WT为对照组植株；

图7为本发明一实施例7中的经根结线虫感染后的miRNA miRcn1转基因植株根结数量统计；

图8为本发明一实施例7中的经根结线虫感染后的CRF9转基因植株中CRF9 表达量检测结果；

图9为本发明一实施例7中的经根结线虫感染后的CRF9转基因植株根系图；

图10为本发明一实施例7中的经根结线虫感染后的CRF9转基因植株根结数量统计图；

图11为本发明一实施例8中的对照组、TRV2载体沉默植株、TRV2载体和 CRF9沉默植株三组植株根系图；

图12为本发明一实施例8中的对照组、TRV2载体沉默植株、TRV2载体和 CRF9沉默植株三组植株根结数量统计图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1miRNA miRcn1基因的PCR扩增和pEarleyGate202+miRcn1重组载体的构建

1.1设计引物

采用miRcn1的成熟序列SEQ ID NO.1(taacttcgtctagctcgccttc)，以及 RPS300质粒，利用软件WMD3(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp. cgi)设计引物，共生成4条引物序列，序列分别命名为I miRcn1-s、II miRcn1-a 和III miRcn1*s、IV miRcn1*a，依次编号为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.5。

SEQ ID NO.2(I miRcn1-s)：

gataacttcgtctagctcgccttctctctcttttgtattcc

SEQ ID NO.3(II miRcn1-a)：

gagaaggcgagctagacgaagttatcaaagagaatcaatga

SEQ ID NO.4(III miRcn1*s)：

gagacggcgagctagtcgaagttatcacaggtcgtgatatg

SEQ ID NO.5(IV miRcn1*a)：

gataacttcgactagctcgccgtctctacatatatattcct

其中，下划线部分为miRcn1的成熟序列获取互补配对序列。

1.2 miRNA miRcn1基因的PCR扩增

选取位于pRS300多克隆位点之外的2条序列SEQ ID NO.6(CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC)和SEQ ID NO.7(GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG)，采用高保真酶Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase(诺维赞)进行如下4组PCR 扩增。

PCR扩增1：以pRS300为模板，SEQ ID NO.6和IV miRcn1*a为模板进行扩增，得到的扩增产物命名为a片段。

PCR扩增2：以pRS300为模板，II miRcn1-a和III miRcn1*s为模板进行扩增，得到的扩增产物命名为b片段。

PCR扩增3：以pRS300为模板，SEQ ID NO.7和I miRcn1-s为模板进行扩增，得到的扩增产物命名为c片段。

PCR扩增4：以PCR扩增1-3扩增得到的a、b、c片段为模板，SEQ ID NO.6 和SEQ IDNO.7为模板，扩增包含miRcn1的人工片段SEQ ID NO.14。

SEQ ID NO.14：

1.3 pEarleyGate202+miRcn1重组载体的构建

将步骤1.2扩增得到的miRcn1片段SEQ ID NO.14用限制性内切酶EcoRI和 BamHI进行双酶切，胶回收酶切片段，利用T4酶连接到入门载体pENTRY上，连接产物热激转化到大肠杆菌DH5α中，将转化后的细胞涂布于含有Kan 50μg/ml 抗生素的LA平板上，PCR验证正确的单菌落于LB培养基中37℃过夜培养，提质粒测序。测序正确的pENTRY+miRcn1重组质粒利用Gateway^TM LR Clonase^TM II Enzyme mix(Thermo Fisher Scientific)将目的片段转移到表达载体 pEarleyGate202上。通过热激转化法将重组的pEarleyGate202+miRcn1转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，对转化后的单菌落进行PCR验证并提取质粒送测序，测序结果正确的单菌落过夜培养，与50％甘油溶液1:1(v/v)混匀于-80℃保存，即为pEarleyGate202+miRcn1重组载体。

实施例2 CRF9的PCR扩增和pEarleyGate202+CRF9重组载体的构建

以番茄(Solanum lycopersicum)Moneymaker基因组cDNA的序列SEQ ID NO.10为模板。以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9为引物，采用高保真酶Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase(诺维赞，南京，中国)扩增基因CRF9。扩增产物CRF9的序列编号为SEQ IDNO.10。

SEQ ID NO.8：5’-ccggaattcatggatggttgcattagttc-3’

SEQ ID NO.9：5’-cgcggatccttataccaaaactgcatcta-3’

SEQ ID NO.10：

将扩增产物CRF9片段采用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切。反应体系为：CRF9片段100ng，10μl 10×Buffer，限制性内切酶EcoRI和BamHI 各4μl，无菌水补足至100μl。移液枪将反应体系轻轻吹打混匀，反应液37℃孵育2-3h。胶回收酶切片段，利用T4酶连接到入门载体pENTRY上，10×T4 DNA连接酶缓冲液1.0μl，T4 DNA连接酶0.5μl，片段或载体的添加体积按照各自浓度计算，使片段的添加量在载体添加量的三倍左右，ddH₂O补足体积至10 μl，22℃水浴3-5h。

连接产物热激转化到大肠杆菌DH5α中，将装有热转感受态细胞的离心管放置在冰上融化，加入pENTRY+CRF9连接产物，移液枪轻轻吹打混匀，冰浴30min。冰浴后将离心管放入42℃的水浴锅，热激90s后迅速取出离心管置于冰上，冰浴150s。加入LB液体培养基800μl，摇床37℃，180rpm振荡培养1h。离心3min，弃上清液，吸取100μl LB液体培养基轻轻吹打混匀菌体沉淀。将悬浮的菌液均匀涂布于含有Kan 50μg/ml抗生素的LA平板上，挑取单菌落PCR 验证，37℃LB培养基中过夜培养，提质粒送测序。验证正确的pENTRY+CRF9重组质粒。

利用Gateway^TM LR Clonase^TM II Enzyme mix(Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆,美国)将pENTRY+CRF9重组质粒转移到表达载体pEarleyGate202上，反应体系为：pENTRY+CRF9 50-150ng，pEarleyGate202 150ng，TE buffer补足体积至8μl。将反应体系轻轻混匀，冰上静置2min，加入2μl LR Clonase^TM II Enzyme mix混匀，反应液置于25℃1h，加入1μl Proteinase K混匀， 37℃孵育10min，将反应液加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，热激转化，对转化后的单菌落进行PCR验证并提取质粒送测序，测序结果正确的单菌落过夜培养，与50％甘油溶液1:1(v/v)混匀于-80℃保存。即为pEarleyGate202+CRF9 重组载体。

实施例3重组根癌农杆菌GV3101+CRF9和重组根癌农杆菌GV3101+miRNA miRcn1

3.1、根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备

活化GV3101在LB[50mg/l利福平(Rif)]的固体培养基平板上，1-2d。挑取单菌落GV3101，接种于5ml LB(50mg/l Rif)的液体培养基中，28℃，200 rpm，过夜。取2ml培养物至50ml LB液体培养基中，28℃，200rpm，继续培养至OD600为0.5左右。将培养物于冰上放置，冰浴30min，4℃，5000rpm，离心 5min，弃上清。用l0 ml冷藏的0.l mol/l NaCl悬浮菌体；4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。用1ml冷藏的20mmo1/l CaCl2悬浮，分装成50uL/管(甘油终浓度为20％)，液氮速冻后，-80℃保存。

3.2、冻融法转化重组根癌农杆菌GV3101+CRF9和GV3101+miRNA miRcn1

取一管农杆菌GV3101感受态细胞冰浴融化。加入3μl实施例1和2的表达载体质粒，轻轻混合，冰浴30min，液氮中冻1min，然后再于37℃水浴5min。加入950μl无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h后10000rpm 离心1min以浓缩菌液，用100μl YEP回溶菌体。将回溶后的菌体涂于YEP[50 mg/l Rif+50mg/l(Kan)]的固体培养基上，28℃培养36-48h。菌液PCR 检测阳性克隆。挑取单菌落于5mL YEP(50mg/l Rif+50mg/l Kan)的液体培养基中，28℃，200rpm，黑暗培养16h，保存菌种并提取质粒。菌种即为根癌农杆菌GV3101+CRF9和GV3101+miRNA miRcn1。

实施例4验证miRNA miRcn1的靶基因为CRF9

将实施例3获得重组根癌农杆菌GV3101+CRF9和重组根癌农杆菌GV3101+ miRNAmiRcn1过夜活化，转接于含Km 50mg/l、Rif 25mg/l、10mM MES以及 20μM乙酰丁香酮的LB培养基过夜培养，离心收集菌体，沉淀重新悬浮于缓冲液(10mM MgCl2,10mM MES,200μM乙酰丁香酮)中，OD600约为0.8-1.0。将重组根癌农杆菌GV3101+CRF9和重组根癌农杆菌GV3101+miRNA miRcn1悬浮液按照1:1的比例混合共注射于生长6-8周的本氏烟烟草叶片，48h后，收集叶片，用于总蛋白的提取。

植物蛋白提取采用植物蛋白提取试剂盒(索莱宝)提取，具体方法为：取 100-200mg的植物组织放入液氮中过夜，在液氮环境中将植物组织碾碎；加入1ml 的裂解液，4℃裂解20min，期间每隔5min震荡1次；4℃，14000转离心30min；吸取上清至新的管中，获得植物总蛋白。

Western blotting检测：将提取的蛋白及收集的上清样品与buffer混匀， 98℃变性10min，加入聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，100V电泳90min。采用半干转法将待测蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜。将转膜完毕的PVDF膜浸泡于含5％脱脂奶粉的封闭液中水平振荡仪上孵育1h，1×TBST清洗3次，将封闭完的PVDF膜浸入一抗孵育液中，置于水平震荡仪上孵育2h，1×TBST清洗3 次，将一抗孵育后的PVDF膜浸入二抗孵育液中，置于水平震荡仪上孵育1h， 1×TBST清洗3次，利用ECL Western Blotting Substrate试剂盒配制发光显色液，将二抗孵育后的PVDF膜浸泡于化学发光显色液中，5min后取出放在成像仪中分析结果并拍照。结果如图1-3所示。图中，SlCRF9表示番茄中的CRF9 基因，miR319为对照miRNA,其靶标基因为PtoTCP20，与根结线虫病无相关。

图1可以看出，miRcn1+SlCRF9的荧光量明显低于pEarleyGate202+SlCRF9 和miR319+SlCRF9，可见，miRcn1抑制了CRF9的表达。

图2可以很直观的看出，miR319+SlCRF9的表达量与pEarleyGate202+SlCRF9 的表达量均较高，且明显高于miRcn1+SlCRF9的表达量。可见，miRcn1抑制了 CRF9的表达。

图3可以看出，pEarleyGate202+SlCRF9、miR319+SlCRF9和miRcn1+SlCRF9 的抗肌动蛋白(Anti-Actin)的电泳结果几乎相同，但是pEarleyGate202+SlCRF9、 miR319+SlCRF9的抗绿色荧光蛋白(Anti-GFP)电泳图具有明显的条带，而 miRcn1+SlCRF9的抗绿色荧光蛋白(Anti-GFP)电泳图无条带。可见，miRcn1 抑制了CRF9的表达。

上述结果均说明，miRcn1可以调控CRF9的表达。具体为，miRcn1可以下调 CRF9的表达。

实施例5番茄愈伤组织诱导和转化

5.1、在超净工作台上对番茄种子进行消毒。先用75％的酒精浸泡种子2min，无菌水冲洗3次，再用灭过菌的饱和磷酸钠浸泡20min，无菌水冲洗3次，然后用25％(V/V)的ClOROX漂白水浸泡10min，无菌水冲洗7次，并用无菌水浸泡8h。最后播种在1/2MS培养基上。放置在光照培养箱内等待发芽。

5.2、番茄播种后约6～8d，种子发芽并且子叶展平。切取子叶，在MS液体培养基[MS液体培养基+0.2mg/l 2，4-D+0.1mg/l激动素(KT)]中浸泡1 h。然后用灭过菌的滤纸吸干子叶上残留的培养基，并放置在A1固体培养基[MS 培养基+1mg/l吲哚乙酸(IAA)+1.75mg/l玉米素(ZT)]上，预培养1d。

5.3、将实施例3获得的重组根癌农杆菌GV3101+CRF9和重组根癌农杆菌 GV3101+miRNA miRcn1接种在YEB培养基+500μg/ml链霉素(Strep)+50μg/ml Rif+50μg/ml Kan的固体培养基中28℃培养2d。挑单菌落于5ml YEB培养基 +500μg/ml Strep+50μg/ml Rif+50μg/ml Kan的液体培养基中28℃，200rpm，黑暗培养1.5d。取500μl过夜培养菌液加入到50ml新鲜的YEB培养基+500 μg/ml Strep+50μg/ml Rif+50μg/ml Kan的液体培养基中，28℃，200rpm，黑暗培养直到OD600＝1.8～2.0，然后4000rpm室温离心10min，用YEB培养基重悬菌体，4000rpm室温离心8min，用40ml MS盐培养基重新悬浮菌体。

5.4、将预培养的子叶浸泡在MS盐培养基重悬的农杆菌菌液中15min，用灭过菌的滤纸吸干多余的菌液，放回原培养基共培养2d。共培养两天后，将子叶转到A2抗性培养基[MS培养基+1.0μg/ml IAA+1.75μg/ml ZT+75μg/ml Kan+200μg/ml特美汀(Tim)]上。26℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)培养。之后每三周换一次培养基，直至形成愈伤。

5.5、愈伤形成后，将其转移到A3培养基(MS培养基+1.0μg/ml IAA+1.75 μg/ml ZT+50μg/ml Kan+200μg/ml Tim)上诱导出芽成苗。待愈伤组织分化出生长点后，用小刀切取生长点，并将其转移到A4培养基(MS培养基+50μg/ml Kan+200μg/ml Tim)上进行生根筛选。鉴定并筛选阳性转化苗，即为CRF9转基因苗和miRNA miRcn1转基因苗，进而进行后续实验。

上述培养基的配方及配置方法具体如下：

YEB培养基(1l)

用1M NaOH调节pH至7.2；固体培养基每1l加15g琼脂。

MS培养基(1l)

用1M NaOH调节pH至5.9；固体培养基每1l加8g琼脂。

1/2MS培养基(1l)

用1M NaOH调节pH至5.9；固体培养基每1l加8g琼脂。

MS液培养基(100ml)

用1M NaOH调节pH至5.9。

MS盐培养基(100ml)

用1M NaOH调节pH至5.9。

A1培养基(100ml)

A2培养基(100ml)

A3培养基(100ml)

A4培养基(100ml)

实施例6番茄转基因植株鉴定

在实施例5获得GV3101+CRF9转基因苗和GV3101+miRNA miRcn1转基因苗，生长4周后，利用TRIzol reagent(Invitrogen)，根据使用方法提取总RNA。用1μg的RNA用于cDNA的合成。cDNA的合成采用PrimeScriptTM RT Reagent (Perfect Real Time)Kit(TaKaRa,大连,中国)试剂盒。反转录参照两步法 RT-PCR程序。以U6、β-tubulin和ubiquitin为对照，使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme,Nanjing,China)，GV3101+miRNA miRcn1转基因苗的引物序列为miRcn1-F和miRcn1-R，编号为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。 GV3101+CRF9转基因苗的引物序列为CRF9-F和CRF9-R，编号为SEQ ID NO.11和 SEQ ID NO.13。在荧光定量PCR仪LightCycler 96system(Lightcycler 96, Roche,Basel,Switzerland)上分析目标基因的表达情况，每个处理3个重复。含有目的片段的植株为CRF9转基因阳性苗和miRNA miRcn1转基因苗阳性苗，可用于后续实验。

miRcn1-F(SEQ ID NO.11)：5’-ctaacagaactcgccgtgaa-3’

miRcn1-R(SEQ ID NO.12)：5’-catggcgatgccttaaataa-3’，

CRF9-F(SEQ ID NO.11)：5’-ctaacagaactcgccgtgaa-3’

CRF9-R(SEQ ID NO.13)：5’-acgccatagaacactcagca-3’。

实施例7转基因植株的根结线虫温室盆栽实验

获取线虫：将线虫侵染8周以上的番茄根洗去泥沙后剪碎装瓶，加入10％次氯酸钠，振荡3min，随即倒入分离筛，次序分别为20、170、500目。利用大量的清水洗去次氯酸钠后，收集500目标准筛上的虫卵。收集到的虫卵，利用 35％蔗糖悬浮，收集上层虫卵，然后加入10％次氯酸钠溶液进行处理，振荡悬浮5min，离心收集虫卵，灭菌水洗3次除去次氯酸钠。室温无菌条件下孵化2-3天后，开始收集南方根结线虫二龄幼虫备用。

线虫感染转基因番茄苗：将实施例6筛选的CRF9转基因阳性苗和miRNA miRcn1转基因苗阳性苗发芽后移栽至装有细沙的盆砵中，置于25℃，16h光照、 8h黑暗条件下生长。待番茄苗生长至四周龄时，接种500头J2悬浮液。在J2 接种后三周，统计根结数，8周后统计卵块数。每个处理12株苗，重复3次。

卵块染色方法：称取100mg亮蓝粉末溶于100ml灭菌水中制备母液，用量筒量取10ml母液加入含有500ml自来水的大烧杯中并搅拌混匀，所得溶液即为工作液；将番茄根部用水洗净沙土，根部放入工作液中染色15min后，可统计卵块数目。

统计并分析转基因苗中miRNA miRcn1和CRF9表达量，以及植物的根结数量，结果如图4-10所示。

图4miRNA miRcn1转基因植株中miRNA miRcn1表达量检测结果，其中，WT 为对照组植株，L1-21、L2-15和L3-23为3组miRNA miRcn1转基因植株。从图 4可以看出，在miRNAmiRcn1转基因植株中miRNA miRcn1表达量均明显高于对照组。可见，筛选的miRNA miRcn1转基因植株为阳性株，其均可以高表达miRNA miRcn1。

图5为miRNA miRcn1转基因植株中CRF9表达量检测结果，其中，WT为对照组植株，L1-21、L2-15和L3-23为3组miRNA miRcn1转基因植株。从图5可以看出，在miRNA miRcn1转基因植株中CRF9表达量均明显低于对照组。进一步验证了，miRNA miRcn1可以下调CRF9表达。

图6为经根结线虫感染后的miRNA miRcn1转基因植株根部情况，其中，WT 为对照组植株，L1-21、L2-15和L3-23为3组miRNA miRcn1转基因植株。从图6可以看出，L1-21、L2-15和L3-23的根结数目显著少于对照组。可见，miRNA miRcn1可抑制根结线虫的侵染。

图7为经根结线虫感染后的miRNA miRcn1转基因植株根结数量统计图，其中，WT为对照组植株，L1-21、L2-15和L3-23为3组miRNA miRcn1转基因植株。从图7可以看出，L1-21、L2-15和L3-23的根结数少于对照组。可见，miRNA miRcn1可促抑制根结线虫的侵染。

图8为CRF9转基因植株中CRF9表达量检测结果，其中，WT为对照组植株， L1-2、L3-7和L4-26为3组CRF9转基因植株。从图8可以看出，CRF9转基因植株中CRF9表达量明显高于对照组，可见，筛选的CRF9转基因植株为阳性株，其均可以高表达CRF9。

图9为经根结线虫感染后的CRF9转基因植株根部情况，其中，WT为对照组植株，L1-2、L3-7和L4-26为3组CRF9转基因植株。从图9可以看出，L1-2、 L3-7和L64-26的根结数目显著高于对照组。可见，CRF9可促进根结线虫的侵染。

图10为经根结线虫感染后的CRF9转基因植株根结数量统计图，其中，WT 为对照组植株，L1-2、L3-7和L4-26为3组CRF9转基因植株。从图10可以看出，L1-2、L3-7和L4-26的根结明显多于对照组。可见，CRF9可促进根结线虫的侵染。

实施例8CRF9沉默植株的构建及抗线虫能力检测

8.1构建CRF9沉默植株

利用VIGS技术构建基因沉默植株，以番茄cDNA为模板，根据番茄CRF9的 CDS区设计引物，通过选取合适的酶切位点将片段连接到pTRV2载体上，将pTRV1、 pTRV2、pTRV2-PDS、pTRV2-CRF9分别转化农杆菌GV3101，将含以上质粒的农杆菌过夜活化，转接于含Km50mg/L、Rif 25mg/L、10mM MES以及20μM乙酰丁香酮的LB培养基过夜培养，离心收集菌体，沉淀重新悬浮于缓冲液(10mM MgCl2,10mM MES,200μM乙酰丁香酮)中，OD600约为0.8-1.0，将含目的片段的pTRV2的农杆菌悬浮液与含pTRV1的农杆菌悬浮液按照1:1的比例混合共注射番茄获得靶标基因沉默植株，3周后，叶片及根可进行下一步的实验。通过 qRT-PCR验证VIGS植株中靶标基因的沉默情况。

8.2、根结线虫感染CRF9沉默植株

按照实施例7的方法获得根结线虫二龄幼虫，在上述获得的沉默植株根围接种500头J2，接种4周后收集番茄根部组织，统计每株植物的根结数量及单位质量里的根结数量，观察沉默植株对根结线虫的抗性。结果如图11和12所示。

图11为对照组、TRV2空载体植株、和CRF9沉默植株三组植株根系图。从图11可以看出CRF9沉默植株根结数目较少，显著少于对照组和TRV2组。

图12为对照组、TRV2空载体植株、和CRF9沉默植株三组植株根结统计图。从图12可以看出，对照组和TRV2空载体植株的根结无差别，而CRF9沉默植株根结明显减少。可见，TRV2空载体沉默对根结线虫侵染几乎无影响，而CRF9沉默可抑制根结线虫的侵染。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种根结线虫病相关miRNA及其调控基因、蛋白和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taacttcgtc tagctcgcct tc 22

<210> 2

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gataacttcg tctagctcgc cttctctctc ttttgtattc c 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaaggcga gctagacgaa gttatcaaag agaatcaatg a 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagacggcga gctagtcgaa gttatcacag gtcgtgatat g 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gataacttcg actagctcgc cgtctctaca tatatattcc t 41

<210> 6

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgcaaggcg attaagttgg gtaac 25

<210> 7

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggataaca atttcacaca ggaaacag 28

<210> 8

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggaattca tggatggttg cattagttc 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcggatcct tataccaaaa ctgcatcta 29

<210> 10

<211> 1158

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggatggtt gcattagttc agtgaggaaa gttcgcatag tttatgatga tcctgatgct 60

acggactctg agagcgatga tgatcagaat gctgctcgtt tcgataaaaa tgtgaacaga 120

atcaagcgtg ttgttaagga aattgttatt cctgttgttt catgggagaa tgattttaaa 180

aaatgttcta aacttgataa cattaggatt aaagattcca agaagattca tgaaaataag 240

aaggtgcagc taaaatcgac cgcgttgcct aaaggagtta ggatgaggaa atgggggaaa 300

tatgcagctg agatcagaga tccctcgcag gggaaaagaa tatggttagg gacttttgag 360

actgtggagg cggcttcaca agcatacgag gcaaagaggg ctgaatttga taggattatt 420

tcattgggga agggtaagaa tttgagccct ggtcctgctg agtgttctat ggcgtgtacg 480

tctcatccta caaatgggaa aaatcgtgtg tactcacacc cttccccgtc ttcggtgcta 540

gatgtcccca catcatcagc tgctgccccg gttgagtcca atgaaaatct aacgagagat 600

atggctcgaa tgccagattc aggttctgaa gattttagct tgagttttga ggaccaaatg 660

cttcatgaat ttatcaaaca aagacagggc atttcagaat tgatcgaaca tcctttgata 720

gaacaaggct cgatcagcaa tagcgttatg gagatgactg aagtgaatat caggaagaaa 780

acgaaagcca gacaaccaac gatagcaagt tgtaaaatat tgacaaaggg aactgaggac 840

tacagtaatg acaagtccat tttcagtgta ttaaacgagc ctacaatcat gtctcctatt 900

catacagagc tgcttcactt gaacatcgag gaaacagcag ttacggggaa tagcttgaaa 960

cttctaggct ttgatgacaa tgctttattt gataaagata tatcacaatt atttgatcca 1020

tatgcagatg ctatatgctt ggacaacact tttcaatgct gtgatggttg gaatgagtgt 1080

gtttattgca aaattttcaa agatgaagtc gacctagatg aagttgactt aagatggtta 1140

gatgcagttt tggtataa 1158

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaacagaac tcgccgtgaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catggcgatg ccttaaataa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgccataga acactcagca 20

<210> 14

<211> 432

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaattcctgc agccccaaac acacgctcgg acgcatatta cacatgttca tacacttaat 60

actcgctgtt ttgaattgat gttttaggaa tatatatgta gagacggcga gctagtcgaa 120

gttatcacag gtcgtgatat gattcaatta gcttccgact cattcatcca aataccgagt 180

cgccaaaatt caaactagac tcgttaaatg aatgaatgat gcggtagaca aattggatca 240

ttgattctct ttgataactt cgtctagctc gccttctctc tcttttgtat tccaattttc 300

ttgattaatc tttcctgcac aaaaacatgc ttgatccact aagtgacata tatgctgcct 360

tcgtatatat agttctggta aaattaacat tttgggttta tctttattta aggcatcgcc 420

atggggggat cc 432

Claims

1.一种根结线虫病相关miRNA，其特征在于，所述miRNA包括miRcn1。

2.如权利要求1所述的一种根结线虫病相关miRNA，其特征在于，所述miRcn1选自以下组：

a)SEQ ID NO.1所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.1所示的碱基序列的互补序列；

3.一种根结线虫病相关miRNA调控基因，其特征在于，所述基因包括CRF9。

4.如权利要求3所述的一种根结线虫病相关miRNA调控基因，其特征在于，所述CRF9选自以下组：

a)SEQ ID NO.10所示的碱基序列；

b)SEQ ID NO.10所示的碱基序列的互补序列；

5.一种根结线虫病相关蛋白，其特征在于，所述蛋白由权利要求4所述的根结线虫病相关miRNA调控基因编码。

6.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌含有权利要求1或2所述的根结线虫病相关miRNA，和/或权利要求3或4所述的根结线虫病相关miRNA调控基因。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，包括转入权利要求1或2所述的根结线虫病相关miRNA，和/或权利要求3或4所述的根结线虫病相关miRNA调控基因的根癌农杆菌GV3101。

8.一种植物表达载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的根结线虫病相关miRNA，和/或权利要求3或4所述的根结线虫病相关miRNA调控基因、35S启动子、NOS终止子和pEarlygate 202载体。

9.权利要求1或2所述的根结线虫病相关miRNA、权利要求3或4所述的根结线虫病相关miRNA调控基因、权利要求5所述的根结线虫病相关蛋白、权利要求6或7所述的工程菌和权利要求8所述的表达载体在防治根结线虫病中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在植物中高表达权利要求1或2所述的根结线虫病相关miRNA用于抗根结线虫病。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在植物中敲除和/或沉默权利要求3或4所述的根结线虫病相关基因用于抗根结线虫病。

12.一种生产转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将权利要求1或2所述的根结线虫病相关miRNA转化入植物愈伤组织，或将权利要求3或4所述的根结线虫病相关基因从植物愈伤组织敲除和/或沉默，或用权利要求6、7所述的工程菌感染植物愈伤组织；

S2、从步骤S1获取的植物愈伤组织再生得到转基因植物。

13.如权利要求12所示的方法，其特征在于，步骤S1中敲除和/或沉默基因的方法包括：

S11、利用VIGS，CRISPR/Cas9，基因重组的方法，获得的基因CRF9敲除和/或沉默重组载体；

14.如权利要求12或13所示的方法，其特征在于，所述植物包括双子叶植物。

15.如权利要求14所示的方法，其特征在于，所述双子叶植物包括番茄。