CN112423765A - Abcb5配体和底物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于调节ABCB5+干细胞活性的方法和组合物。本发明还涉及用于操纵和表征调节ABCB5+细胞信号转导之化合物的测定和试剂。

Description

ABCB5配体和底物

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2018年4月25日提交的美国临时申请号62/662,670的权益，其全部内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于调节干细胞活性以治疗疾病的方法和组合物以及相关测定和试剂。本发明还涉及用于伤口愈合和组织工程的方法和组合物，其涉及ABCB5阳性细胞。

背景技术

肿瘤的发生和发展在DNA水平上与癌基因、抑癌基因和修复/稳定性基因的累积改变有关。在细胞水平上，人癌症已被公认为由具有不同的自我更新和肿瘤扩散能力的表型异质细胞群组成。该观察结果导致了肿瘤起始和生长的肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)模型的开发，这已经在包括黑色素瘤和结直肠癌在内的多种恶性肿瘤中得到了广泛的证实。CSC已被证明通过多种分子机制导致现有治疗无法始终根除恶性肿瘤，包括与人癌症侵袭血管系统(vasculature)并扩散至新解剖部位的能力相关的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，其导致肿瘤进展和治疗抗性。

ABCB5是在多样的人恶性肿瘤中表达的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)介体，其中其在先前发现代表CSC的治疗抗性CD133(+)肿瘤亚群中特别地过表达。ABCB5赋予癌细胞对化学治疗剂(例如5-氟尿嘧啶(5-FU))的抗药性。

ABCB5+干细胞也存在于正常组织中，并在组织再生和衰老中发挥作用。再生医学涉及使用外源材料(例如支架)来修复、再生、维持和更换组织和器官。支架可以接种有细胞，例如原代细胞或干细胞，以及多种促进组织生长的因子。然而，在用于再生医学和组织工程的合适材料的设计中仍然存在许多挑战。

发明概述

在一些方面，本发明涉及用于调节ABCB5+干细胞活性的方法和组合物。本发明还涉及用于操纵和表征调节ABCB5+细胞信号转导之化合物的测定和试剂。

本发明的一些方面涉及增强ABCB5阳性细胞功能的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的增强ABCB5-PIP2途径的组合物。

在一些实施方案中，本发明还包括在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。

在一些实施方案中，所述组合物是PIP2或PIP2激动剂。

在一些实施方案中，所述对象是人或非人动物，包括山羊、绵羊、野牛(bison)、骆驼、牛、猪、兔、水牛(buffalo)、马、大鼠、小鼠、猫、狗、美洲驼(llama)或灵长类，例如猴。

在一些实施方案中，所述组合物包含磷脂。

在一些实施方案中，所述组合物包含[PIP2(6：0/18：0)-H]-和可药用载体。

在一些实施方案中，所述组合物包含磷脂，所述磷脂包含具有本文所述结构的化合物。在一些实施方案中，所述结构包含R1和R2基团。在一些实施方案中，R1和R2是独立的脂肪酸链。在一些实施方案中，所述结构包含R1和R2，R1和R2的长度为R1和R2中另一个的至少两倍长。在一些实施方案中，所述结构具有22∶0-26∶0的总脂肪酸链。在一些实施方案中，所述结构具有24∶0的总脂肪酸链。

在一些实施方案中，所述对象是健康对象。在一些实施方案中，所述组合物促进伤口愈合。在一些实施方案中，所述组合物促进组织再生。在一些实施方案中，所述组合物促进血管生成。在一些实施方案中，所述组合物促进细胞存活。在一些实施方案中，所述组合物抑制细胞死亡。在一些实施方案中，所述组合物通过经口、静脉内、皮下、表面(topical)、肠胃外、肿瘤内、肌肉内、鼻内、颅内、舌下、气管内、经眼(ocular)或鞘内途径施用。

本发明一些的方面是抑制ABCB5阳性癌细胞功能的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的抑制ABCB5-PIP2途径的组合物，并且还包括在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。

本发明的另一些方面涉及抑制ABCB5阳性癌细胞功能的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的抑制ABCB5-PIP2结合的组合物，其中所述组合物选自包含以下的组：小分子，脂质类似物，对该蛋白质的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或片段，酶，以及改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的抗ABCB5抗体或其片段。

在一些实施方案中，改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的抗ABCB5抗体或其片段抑制PIP3的产生。在一些实施方案中，改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的抗ABCB5抗体或其片段抑制PI3K途径。

在一些实施方案中，在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。

在一些实施方案中，所述组合物是PIP2拮抗剂。在一些实施方案中，组合物选自包含以下的组：小分子，脂质类似物，对该蛋白质的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或片段，以及酶。在一些实施方案中，所述组合物是小分子。在一些实施方案中，所述组合物是对该蛋白质的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或片段。在一些实施方案中，所述组合物是改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的ABCB5抗体或片段。在一些实施方案中，所述组合物是脂质类似物。在一些实施方案中，所述组合物是酶。

在一些实施方案中，所述对象是人或非人动物，包括山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠、猫、狗、美洲驼或灵长类，例如猴。

在一些实施方案中，所述组合物通过经口、静脉内、皮下、表面、肠胃外、肿瘤内、肌肉内、鼻内、颅内、舌下、气管内、经眼或鞘内途径施用。

本发明的一些方面涉及用于鉴定ABCB5-PIP2途径的增强剂或抑制剂的方法，其包括。在一些实施方案中，本发明包括使ABCB5+细胞与调节ABCB5-PIP2结合的假定组合物接触；确定PIP2途径产物化合物的水平并将所述水平与PIP2途径产物化合物的基线水平进行比较。在一些实施方案中，如果所述水平大于基线水平，则将假定组合物鉴定为ABCB5-PIP2途径增强剂。在一些实施方案中，如果PIP2途径产物化合物的水平小于基线水平，则将假定组合物鉴定为ABCB5-PIP2途径抑制剂。

在一些实施方案中，调节ABCB5-PIP2途径的假定组合物是PIP2或PIP2激动剂。在一些实施方案中，调节ABCB5-PIP2途径的假定组合物是小分子。在一些实施方案中，调节ABCB5-PIP2途径的假定组合物是抗ABCB5抗体或其片段。在一些实施方案中，PIP2途径化合物是PIP3。在一些实施方案中，PIP2途径化合物是PI3K途径的成员。在一些实施方案中，ABCB5+细胞包含其中第970位氨基酸是赖氨酸的ABCB5同种型(isoform)1。在一些实施方案中，ABCB5+细胞包含其中第525位氨基酸是赖氨酸的ABCB5同种型2。

在一些实施方案中，该测定涉及确定ABCB5等位基因的数目，然后测试多少对K呈阳性和多少对E呈阳性，即，提取拷贝数和等位基因型信息二者的等位基因特异性定量程序。

本发明的一些方面涉及包含合成磷脂的组合物，所述合成磷脂包含具有本文所述结构的化合物。在一些实施方案中，所述结构包含R1和R1基团。在一些实施方案中，R1和R2是独立的脂肪酸链。在一些实施方案中，R1和R2的长度为R1和R2中另一个的至少两倍长。在一些实施方案中，所述磷脂具有22∶0-26∶0的总脂肪酸链。在一些实施方案中，所述磷脂具有24∶0的总脂肪酸链。在一些实施方案中，所述磷脂具有下式：C33H65O19P3。在一些实施方案中，所述磷脂包含[PIP2(6：0/18：0)-H]-和可药用载体。

在一些实施方案中，所述组合物包含PIP2类似物。在一些实施方案中，所述组合物增强ABCB5-PIP2途径。在一些实施方案中，所述组合物促进伤口愈合。在一些实施方案中，所述组合物促进组织再生。在一些实施方案中，所述组合物促进血管生成。在一些实施方案中，所述组合物促进细胞存活。在一些实施方案中，所述组合物抑制细胞死亡。

在一些实施方案中，所述磷脂包含磷酸化的PIP3(6∶0/18∶0)-H^-(C33H65O19P4)和可药用载体。

本发明的一些方面涉及抑制ABCB5-PIP2途径的人抗ABCB5抗体或其ABCB5结合片段，其中抗ABCB5抗体或其ABCB5结合片段与ABCB5的三维构型的胞外环结合。

在一些实施方案中，人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段可通过包括亲和力成熟以与ABCB5的非线性形式的胞外环特异性结合的方法来制备。在一些实施方案中，人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段具有对应于可通过包括亲和力成熟以与ABCB5的非线性形式的胞外环特异性结合的方法制备的抗体的序列。

本发明的一些方面涉及制备本文所述的抑制ABCB5-PIP2途径的人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段的方法。在一些实施方案中，使所述抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段经历亲和力成熟，以与蛋白质的非线性形式的胞外环特异性结合。

本发明的一些方面涉及用于鉴定抑制ABCB5-PIP2途径的抗体或片段的方法。在一些实施方案中，通过以下来鉴定抑制ABCB5-PIP2途径的抗体或片段：使ABCB5+细胞与结合ABCB5的假定抗体或片段接触；在用所述抗体或片段处理之后评估ABCB5-PIP2结合；确定PIP2途径产物化合物的水平并将所述水平与PIP2途径产物化合物的基线水平进行比较。

在一些实施方案中，如果PIP2途径产物化合物的水平低于基线水平，则假定抗体或片段是ABCB5-PIP2途径的抑制剂。在一些实施方案中，PIP2途径化合物是PIP3。在一些实施方案中，PIP2途径化合物是PI3K途径的成员。

本发明的一些方面涉及包含两个跨膜结构域(TMD)和12个跨膜螺旋(TM 1-12)的ABCB5同种型1。在一些实施方案中，TM12第970位谷氨酸已突变为赖氨酸，或TM12第970位为谷氨酸。

本发明的一些方面涉及包含一个跨膜结构域(TMD)和6个跨膜螺旋(TM 1-6)的ABCB5同种型2。在一些实施方案中，TM6第525位谷氨酸已突变为赖氨酸，或TM12第525位为谷氨酸。

本发明的一些方面涉及抑制ABCB5-PIP2途径的人抗ABCB5同种型抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗ABCB5抗体或其ABCB5结合片段与本文所述的ABCB5同种型1或本文所述的ABCB5同种型2特异性结合。

本发明的一些方面涉及抑制ABCB5-PIP2途径的人抗ABCB5同种型抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗ABCB5抗体或其ABCB5结合片段与本文所述的ABCB5同种型1或ABCB5同种型2特异性结合。

本发明的一些方面涉及用于鉴定ABCB5-PIP2途径的增强剂或抑制剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使本文所述的ABCB5同种型1或ABCB5同种型2与调节ABCB5-PIP2结合的假定组合物接触；确定PIP2途径产物化合物的水平并将所述水平与PIP2途径产物化合物的基线水平进行比较。在一些实施方案中，如果所述水平大于基线水平，则假定组合物是ABCB5-PIP2途径增强剂。在一些实施方案中，如果PIP2途径化合物的水平低于基线水平，则假定组合物是ABCB5-PIP2抑制剂。

在一些实施方案中，调节ABCB5-PIP2途径的假定组合物是PIP2或PIP2激动剂。在一些实施方案中，调节ABCB5-PIP2途径的假定组合物是小分子。在一些实施方案中，调节ABCB5-PIP2途径的假定组合物是抗ABCB5抗体或其片段。在一些实施方案中，PIP2途径化合物是PIP3。在一些实施方案中，PIP2途径化合物是PI3K途径的成员。在一些实施方案中，重组表达ABCB5同种型。

本发明的一些方面涉及用于在对象中治疗癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用基因编辑破坏细胞中的内源ABCB5基因。在一些实施方案中，编辑包括使细胞与Cas蛋白、与内源ABCB5基因杂交的CRISPR RNA和tracrRNA接触。在一些实施方案中，在与Cas蛋白、CRISPR RNA和tracrRNA接触之后，内源ABCB5基因被修饰，使得所述基因的编码ABCB5基因的末端跨膜螺旋的区域中的AAA序列被替换为GAA。在一些实施方案中，基因编辑在对象中治疗癌症。

在一些实施方案中，对象在基因编辑之前具有与癌症相关的ABCB+干细胞，其为ABCB5纯合同种型2K525/K525。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤或胶质母细胞瘤。

本发明的一些方面涉及用于在对象中治疗癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向对象施用抑制ABCB5-PIP2途径功能有效量的ABCB1抑制剂，以在对象中治疗癌症。在一些实施方案中。在一些实施方案中，癌症包含癌细胞，并且所述癌细胞表达可忽略不计的ABCB1或不表达ABCB1。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用步骤之前检测ABCB5+干细胞的存在。在一些实施方案中，ABCB1抑制剂是泵抑制剂，并且所述癌症不同时用化学治疗剂治疗。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。

在一些实施方案中，所述对象在基因编辑之前具有与所述癌症相关的ABCB+干细胞，其为ABCB5纯合同种型2K525/K525。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤或胶质母细胞瘤。

本发明的一些方面涉及用于表征癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从对象中分离癌细胞，确定所述癌细胞是否是ABCB5纯合同种型2 K525/K525、ABCB5纯合同种型2 E525/E525或ABCB5杂合同种型2 K525/E525，以表征所述癌症。

本发明的每个限制都可以涵盖本发明的多种实施方案。因此，预料到涉及任何一个元素或元素组合的本发明的每个限制可以包含在本发明的每个方面。本发明的应用不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的构造的细节和部件的布置。本发明能够具有其他实施方案并且能够以多种方式被实践或执行。另外，本文所使用的措词和术语是出于描述的目的，并且不应被视为限制。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式的使用旨在涵盖其后列出的项目及其等同物以及其他项目。

附图简述

附图无意按比例绘制。在附图中，在多个图中示出的每个相同或几乎相同的组件由相同的附图标记表示。为了清楚起见，并非在每个附图中标记了每个组件。在附图中：

图1A至1C.PIP2和PIP3是ABCB5的生物配体，ABCB5充当PIP2和PIP3的受体。使用ABCB5单克隆抗体的免疫印迹(图1A，上图)显示，使用抗PIP2抗体下拉进行的PIP2从人ABCB5表达黑色素瘤细胞的免疫沉淀揭示了ABCB5蛋白的共沉淀。使用PIP2抗体的免疫印迹证实了PIP2下拉(图1A，下图)。使用ABCB5单克隆抗体的免疫印迹(图1B)显示，使用抗PIP3抗体下拉进行的PIP3从人ABCB5表达黑色素瘤细胞的免疫沉淀揭示了ABCB5蛋白的共沉淀。图1C显示，PIP1、PIP2和PIP3全部与重组人ABCB5以及鼠Abcb5结合，而在Abcb5敲除的小鼠组织中没有结合检测。因此，PIP2和PIP3与ABCB5的结合比PIP1与ABCB5的结合更高效。

图2.PIP1、PIP2和PIP3与ABCB5的结合可以被竞争性药理学配体抑制。数据显示，PtdIns-(1，2-二辛酰基)可竞争性抑制PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5的结合，在低至0.1mM的浓度下作用明显饱和。

图3.ABCB5单克隆抗体可以阻断PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5的结合。表面等离子体共振(SPR)分析证明了PIP1、PIP2和PIP3与ABCB5的结合。与抗ABCB5单克隆抗体的竞争导致在所有三个表面上浓度依赖方式的信号降低(PIP3＞PIP2＞PIP1)，在PIP3表面上降低多至50％。

图4.ABCB5在功能上是更高效地将PIP2转换为PIP3所需的。ABCB5单克隆抗体而非同种型对照抗体显著降低人黑色素瘤细胞中的PIP3/PIP2比值(左图)。此外，对鼠ABCB5基因敲除的皮肤组织的检查还显示与ABCB5野生型皮肤相比存在着显著降低的PIP3/PIP2比值(右图)。

图5.需要ABCB5以维持恶性肿瘤中的PIP2/PIP3依赖性PI3K/AKT信号转导轴，并且ABCB5抑制导致PI3K/AKT信号转导轴以及相关的肿瘤生长和治疗抗性的抑制。ABCB5 WT或ABCB5 KO背景下4-HT处理可诱导的Tyr：：CreER；BrafCA；Ptenlox/lox遗传小鼠黑色素瘤模型的分析显示了与ABCB5 WT肿瘤相比ABCB5 KO中PI3K/AKT信号转导轴的显著抑制，在其他失调的分子中，p-AKT、p-mTOR和p-S6表达减弱。

图6.与ABCB5 WT状态相比，ABCB5 KO状态导致肿瘤细胞增殖降低，如通过确定增殖标志物Ki-67阳性染色的肿瘤细胞的百分比确定的。

图7A-7B.与ABCB5 WT状态相比，ABCB5 KO状态导致促血管生成分子的下调(图7A，左图)，以及结果，CD31阳性微血管密度降低(图7A右图和图7B)。

图8.ABCB5(+)CRC细胞表达维持EMT的受体酪氨酸激酶AXL，其充当ABCB5依赖性癌症侵袭的介体。显示了一组散点图，其描绘了与对照转染的细胞系相比ABCB5 KD中AXL蛋白表达的代表性流式细胞术分析。还显示了条形图，其示出了与对照转染的人CRC细胞相比ABCB5KD中的AXL mRNA表达。还显示了抗ABCB5 mAb处理的或同种型对照处理的CRC细胞中AXL、AKT和磷酸化AKT蛋白表达的蛋白质印迹分析。使用非配对t检验分析数据。误差线表示s.e.m.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图9.ABCB5通过其在维持维罗非尼(vemurafenib)抗性所需的完整PIP2/PIP3依赖性PI3K/pAKT信号转导轴中的功能在肿瘤维罗非尼抗性中起关键作用。ABCB5 WT或ABCB5KO背景下4-HT处理可诱导的Tyr：：CreER；BrafCA；Ptenlox/lox遗传小鼠黑色素瘤模型，与ABCB5 WT状态相比，ABCB5 KO状态导致对BRAF抑制剂维罗非尼的作用的完全敏感，维罗非尼抗性部分地由功能性PI3K/pAKT信号转导轴驱动。在维罗非尼处理的ABCB5 KO小鼠中在遗传诱导之后没有观察到肿瘤形成，相比之下ABCB5 WT小鼠表现出100％的维罗非尼抗性肿瘤的形成(左图)，并且与ABCB5 WT小鼠相比ABCB5 KO小鼠中的存活显著延长(右图)。

图10.与ABCB5野生型小鼠相比，在ABCB5敲除的咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中发现银屑病加剧。

图11.ABCB5同种型2的TM6的第525位氨基酸残基是ABCB5的生理配体/底物结合质量中的重要分子开关。基线时在仅表达ABCB5同种型2的野生型K525/K525人黑色素瘤细胞中通过Crispr/Cas9介导的基因编辑在一个等位基因中实验诱导从K(赖氨酸，AAA密码子)到E(谷氨酸，GAA密码子)的分子转换，得到了ABCB5信号转导功能受损的克隆杂合ABCB5K525/E525黑色素瘤细胞变体，并且导致ABCB5驱动的肿瘤生长显著抑制(P＜0.05)。

发明详述

本发明在一些方面涉及以下发现：优先在癌症干细胞和正常组织特异性干细胞的质膜中高水平表达的ATP结合盒亚家族B(MDR/TAP)成员5(ABCB5)[Frank，N.Y.etal.Regulation of progenitor cell fusion by ABCB5P-glycoprotein，a novel humanATP-binding cassette transporter.J Biol Chem 278，47156-65(2003).以及Schatton，T.et al.Identification of cells initiating human melanomas.Nature 451，345-9(2008).]作为了磷脂酰肌醇4，5-双磷酸(PtdIns(4，5)P2，也简称为PIP2)的受体，并且在较小程度上作为PIP1和PIP3的受体。如本文中所用，“ABCB5(+)干细胞”是指具有自我更新和分化成多种成年细胞谱系的成熟细胞的能力并且以在细胞表面上表达ABCB5为特征的细胞。PIP2是质膜中富含的细胞膜的次要磷酸肌醇(phosphoinositol)磷脂组分，其中其是许多重要信号转导蛋白的底物，通过PI3K途径或者G蛋白偶联受体的IP3/DAG途径调节例如通过受体酪氨酸激酶(RTK)的信号转导。通过抑制ABCB5来抑制ABCB5-PIP2途径阻断了PIP2与ABCB5的结合和随后PIP2磷酸化以产生PIP3。因此，该途径的中断导致酪氨酸激酶受体(例如VEGFR1、EGFR和AXL)的下游PI3K信号转导的抑制，并且消除了其干细胞特异性功能。可以使用本领域已知的多种方法来评估ABCB5 PIP2结合。例如，可以通过包括免疫沉淀、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光、显微镜和光谱学的方法评估ABCB5 PIP2结合(参见图1-3)。

本发明的一些方面涉及用于增强ABCB5阳性细胞功能的方法。如本文中所用，“ABCB5阳性细胞功能”是指健康对象中ABCB5的活性，并且对对象具有积极作用。例如，ABCB5阳性细胞功能包括促进伤口愈合、组织再生、血管生成、细胞存活和抑制细胞死亡。应理解的是，伤口愈合、组织再生、血管生成、细胞存活和细胞死亡是通过将每种的水平或速率与对照样品中的水平或速率进行比较来确定的。本文中“对照样品”是指缺乏ABCB5功能的样品。如本文中所用，“健康对象”是另外没有疾病的对象。

如本文中所用，短语“干细胞特异性功能”涉及与干细胞相关的ABCB5活性。例如，皮肤相关健康ABCB5+干细胞使用ABCB5增强的PI3K信号转导和下游AKT磷酸化以及mTOR信号转导用于血管生成和抗凋亡信号转导，导致干细胞存活和血管分化，以及正常伤口愈合所需的其他下游功能。ABCB5+角膜缘干细胞利用该途径用于干细胞维持所需的抗凋亡信号转导。ABCB5+癌症干细胞(例如在黑色素瘤或结直肠癌中)利用该途径用于细胞存活、血管生成拟态(vasculogenic mimicry)、耐药性和EMT以及转移性侵袭(如图1中所示，即通过ABCB5阻断抑制pAKT磷酸化和EMT以及侵袭性)。

除其他功能外，PIP2的ABCB5结合可用于提高其磷酸化至PIP3的速率，并且因此代表了干细胞特异性相互作用以增强PIP2在不表达ABCB5的细胞中的信号转导作用。ABCB5-PIP2结合也可以被小分子ABCB5竞争性配体或底物或包含它们的组合物抑制，它们也抑制关键的ABCB5依赖性生物干细胞功能的下游信号转导。因此，本发明具有数个重要的用途。

因此，本文所述的发明可用于促进健康对象中的再生。

本发明也可用于治疗患有疾病或有患疾病的风险的对象，例如患有癌症或有患癌症的风险的对象。

对象应指人或脊椎哺乳动物，包括但不限于山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠、猫、狗、美洲驼和灵长类，例如猴。因此，本发明还可以用于治疗非人对象中的疾病或病症。例如，癌症是伴侣动物(即猫和狗)中死亡的主要原因之一。优选地，对象是人。

有患癌症的风险的对象是有高的患癌症可能性的对象。这些对象包括，例如，具有遗传异常的对象，所述遗传异常的存在已被证明与更高的患癌症可能性具有相关性，以及暴露于致癌因子(例如烟草、石棉或其他化学毒素)的对象，或先前已经治疗癌症且明显缓解的对象。有患癌症的风险的对象还包括具有癌前病变的对象。癌前病变是具有改变的特性并具有变成皮肤癌的风险的组织区域。癌前病变可由例如UV辐射、遗传、暴露于致癌物(例如砷、焦油或X射线)引起。

患有癌症的对象是具有可检测的癌细胞的对象。癌症可以是恶性或非恶性癌症。癌症或肿瘤包括但不限于胆道癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞)；黑色素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌，以及其他癌症和肉瘤。优选地，癌症包括表达ABCB5的癌症干细胞。

任选地，在治疗之前，可以使用本文所述的结合分子检测ABCB5阳性干细胞的存在。本发明提供的检测或诊断方法通常包括使本发明的一种或更多种分子与对象体内或来自对象的样品接触。优选地，首先从对象收获样品，然而也设想了体内检测方法。样品可以包括怀疑含有癌症干细胞的任何身体组织或流体。例如，干细胞通常存在于在肿瘤块中或周围。

ABCB5或ATP结合盒B亚家族5

顾名思义，ABCB5是ATP结合盒转运蛋白亚家族B的成员。其为由ABCB5基因编码的跨膜蛋白。ATP结合盒(ABC)转运蛋白在生理和病理学中起着关键作用。其参与从小离子、糖和肽到更复杂的有机分子的结构多样的分子的运输(Chen et al.2005)。

如本文中所用，“ABCB5+干细胞”或“ABCB5+细胞”是指具有自我更新和分化成多种成年细胞谱系的成熟细胞的能力的细胞。在一些实施方案中，这些细胞的以表达ABCB5为特征。在本发明的一些实施方案中，ABCB5+细胞是癌症干细胞。在本发明的一些实施方案中，ABCB5+细胞是健康干细胞。

本发明的一些方面涉及鉴定涉及在癌症中的ABCB5同种型。在一些实施方案中，ABCB5同种型涉及在黑色素瘤或胶质母细胞瘤中。如本文中所用，“ABCB5同种型”是具有ABCB5结构的一种变体的ABCB5蛋白。在一些实施方案中，ABCB5同种型是ABCB5同种型1(1257个氨基酸)。ABCB5同种型1包含两个跨膜结构域(TMD)，每个跨膜结构域(TMD)具有6个跨膜(TM)螺旋，即，其总共包含12个跨膜螺旋(TM 1-12)。在一些实施方案中，ABCB5同种型是同种型2(812个氨基酸)。ABCB5同种型2包含具有6个跨膜(TM)螺旋(TM 1-6)的一个TMD。ABCB5同种型2的TM 1-6对应于ABCB5同种型1的TM 7-12。在另一些实施方案中，两种同种型中特定位置处赖氨酸残基的存在与癌症患病率有关。在另一些实施方案中，该残基是ABCB5同种型1的TM12中的970以及ABCB5同种型2的TM6中的525。本文中表明，在ABCB5同种型1的TM12中提供AA 970E＞K并且对应于ABCB5同种型2的TM6中的AA525E＞K的ABCB5编码区中的非同义单核苷酸多态性(SNP)对于癌细胞中的ABCB5功能是重要的。例如，ABCB5同种型1的TM12中的970和ABCB5同种型2的TM6中的525对于ABCB5阳性干细胞功能是重要的。在另一些实施方案中，这些残基是ABCB5阳性癌症干细胞功能所需的。

参与ABCB5底物结合的另一些残基是ABCB5同种型1的TM7中的N702和H706，对应于ABCB5同种型2的TM1中的N257和H261，以及ABCB5同种型1的TM10中的857A＞T(rs80123476)，对应于ABCB5同种型2的TM4中的412A＞T(rs80123476)。

编码较高功能ABCB5同种型2-K525蛋白序列的基因或ABCB5同种型2-K525蛋白本身以及编码较低功能ABCB5同种型2-E525蛋白序列的基因或ABCB5同种型2-E525蛋白本身是有用的组合物。这些组合物可用于例如：1.重组表达ABCB5同种型2-K525或ABCB5同种型2-E525；2.在对接和结合实验中使用ABCB5同种型2-K525和ABCB5同种型2-E525以鉴定新的序列特异性ABCB5配体和底物；在分子筛选中使用ABCB5同种型2-K525或ABCB5同种型2-E525以鉴定竞争性抑制PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5的结合并且因此也抑制ABCB5依赖性受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体信号转导的合成化合物和天然存在的物质；在分子筛选中使用ABCB5同种型2-K525或ABCB5同种型2-E525以鉴定抑制PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5的结合并且因此也抑制ABCB5依赖性受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体信号转导的新的ABCB5单克隆抗体。

竞争性抑制PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5的结合并且因此抑制ABCB5依赖性信号转导的化合物根据本发明是有用的。在一些实施方案中，这些化合物包括但不限于PtdIns-(1，2-二辛酰基)，即在n-1和sn-2位置包含C8∶0脂肪酸的天然磷脂酰肌醇(PtdIns)的合成类似物(CAS登录号899827-36-2)。这些化合物可用于治疗与ABCB5+干细胞相关的癌症。

在一些方面，本发明是通过向患有癌症的对象施用ABCB1抑制剂来治疗癌症的方法。本文中发现ABCB1抑制剂也可用于治疗ABCB5+癌症。这些化合物竞争性抑制PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5的结合，并且因此抑制ABCB5依赖性信号转导。

如本文中所用，ABCB1抑制剂是降低或消除细胞中的ABCB1功能的化合物。ABCB1抑制剂是本领域已知的，并且包括抗ABCB1抗体及其功能片段以及小分子。一些ABCB1抑制剂是用于治疗心脏病或血管疾病的ABCB1剂，用于治疗ABCB1+癌症的ABCB1剂，用于治疗感染性疾病的ABCB1剂，用于治疗胃病的ABCB1剂，以及用于治疗其他疾病的ABCB1剂。在一些实施方案中，ABCB1抑制剂包括例如PSC 833(伐司朴达(Valspodar))、Zosuquidar、Tariquidar和Laniquidar，即，高度同源的ABCB1分子的底物和/或相关底物结合位点的抑制剂。

已知ABCB1底物或抑制剂用于治疗多种疾病。基于对于PIP1、PIP2或PIP3的新ABCB5同种型2-AA525底物结合位点的发现，这些化合物因此可用作ABCB5依赖性PIP1、PIP2或PIP3结合以及PIP依赖性信号转导和pAKT磷酸化的小分子抑制剂，以便例如通过功能性ABCB5阻断治疗性抑制表达ABCB5的癌症中ABCB5驱动的人癌症生长和进展。

在一些实施方案中，可用于治疗癌症的方法的ABCB1抑制剂是用于治疗心脏病/血管疾病的ABCB1剂。这些化合物的非限制性实例显示在以下列表中。

用于治疗心脏病/血管疾病的ABCB1剂

在一些实施方案中，可用于治疗癌症的方法的ABCB1抑制剂是用于治疗感染性疾病的ABCB1剂。这些化合物的非限制性实例显示在以下列表中。

用于治疗感染性疾病的ABCB1剂

在一些实施方案中，可用于治疗癌症的方法的ABCB1抑制剂是用于治疗癌症的ABCB1剂。在一些实施方案中，癌症是ABCB5+癌症，并且癌症不具有ABCB1或具有可忽略不计的ABCB1。这些化合物的非限制性实例显示在以下列表中。

用于治疗ABCB5+癌症的ABCB1抑制剂

在一些实施方案中，可用于治疗癌症的方法的ABCB1抑制剂是用于治疗胃病的ABCB1剂。这些化合物的非限制性实例显示在以下列表中。

用于胃病的ABCB1剂

奥美拉唑(Omeprazole)

尼扎替丁(Nizatidine)

多潘立酮(Domperidone)

兰索拉唑(Lansoprazole)

雷尼替丁(Ranitidine)

泮托拉唑(Pantoprazole)

可用于本发明方法的其他ABCB1抑制剂包括但不限于：环孢素(Ciclosporin)、西咪替丁(Cimetidine)、醛固酮(Aldosterone)、他克莫司(Tacrolimus)、苯巴比妥(Phenobarbital)、地塞米松(Dexamethasone)、卡马西平(Carbamazepine)、秋水仙碱(Colchicine)、洛哌丁胺(Loperamide)、丙咪嗪(Imipramine)、氢化可的松(Hydrocortisone)、西酞普兰(Citalopram)、牛磺胆碱(Taurocholic Acid)、非索非那定(Fexofenadine)、强的松(Prednisone)、雌酮(Estrone)、地西泮(Diazepam)、洋地黄毒苷(Digitoxin)、甲泼尼龙(Methylprednisolone)、喹硫平(Quetiapine)、奥氮平(Olanzapine)、氯氮平(Clozapine)、泼尼松龙(Prednisolone)、倍他米松(Betamethasone)、阿利维A酸(Alitretinoin)、维库溴铵(Vecuronium)、雄诺龙(Stanolone)、依匹斯汀(Epinastine)、雌三醇(Estriol)、鞘氨醇(Sphingosine)、西立伐他汀(Cerivastatin)、左乙拉西坦(Levetiracetam)、苯妥英(Phenytoin)、拉莫三嗪(Lamotrigine)、西他列汀(Sitagliptin)、凯他唑仑(Ketazolam)、西洛多辛(Silodosin)、利伐沙班(Rivaroxaban)、达比加群酯(Dabigatran etexilate)、弗斯特罗定(Fesoterodine)、茚达特罗(Indacaterol)、氯巴占(Clobazam)、利拉利汀(Linagliptin)、米拉贝隆(Mirabegron)、博舒替尼(Bosutinib)、糠酸氟替卡松(Fluticasone furoate)、霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil)、拉格列净(Dapagliflozin)、乌美溴铵(Umeclidinium)、依度沙班(Edoxaban)、尼达尼布(Nintedanib)、奥比他韦(Ombitasvir)、艾尔巴韦(Elbasvir)、格佐匹韦(Grazoprevir)、奥当卡替(Odanacatib)、巴瑞克替尼(Baricitinib)、泛癸利酮(Ubidecarenone)、埃格列净(Ertugliflozin)、乙酸雄诺龙(Stanolone acetate)、乙酸雌二醇(Estradiol acetate)、苯甲酸雌二醇(Estradiolbenzoate)、环戊丙酸雌二醇(Estradiol cypionate)、二庚酸雌二醇(Estradioldienanthate)、戊酸雌二醇(Estradiol valerate)、丙酸睾酮(Testosteronepropionate)、阿舒瑞韦(Asunaprevir)、生长抑素(Somatostatin)、阿伐曲泊帕(Avatrombopag)、文拉法辛(Venlafaxine)、三甲丙咪嗪(Trimipramine)、他可林(Tacrine)、依立曲坦(Eletriptan)、舒马曲坦(Sumatriptan)、雷帕霉素(Sirolimus)、帕利瑞韦(Paritaprevir)、达萨布韦(Dasabuvir)、红霉素(Erythromycin)、短杆菌肽D(Gramicidin D)、伊曲康唑(Itraconazole)、四环素(Tetracycline)、缬氨霉素(Valinomycin)、托吡酯(Topiramate)、特非那定(Terfenadine)、安普那韦(Amprenavir)、塞利洛尔(Celiprolol)、他林洛尔(Talinolol)、氟哌噻吨(Flupentixol)、三氟拉嗪(Trifluoperazine)、罗丹明6G(Rhodamine 6G)、辛伐他汀(Simvastatin)、伐司朴达(Valspodar)、Cerliponase alfa、姜黄素(Curcumin)、抗坏血酸(Ascorbic acid)、氯丙嗪(Chlorpromazine)、吩噻嗪(Phenothiazine)、阿托伐他汀(Atorvastatin)、溴哌利多(Bromperidol)、吗啡(Morphine)、喷他佐辛(Pentazocine)、普萘洛尔(Propranolol)、新斯的明(Neostigmine)、莫昔克丁(Moxidectin)、甲氟奎(Mefloquine)、氟替卡松(Fluticasone)、丙酸氟替卡松(Fluticasone propionate)、Elagolix、氯喹(Chloroquine)、帕利哌酮(Paliperidone)、鲁索曲波帕(Lusutrombopag)、泊沙康唑(Posaconazole)、双嘧达莫(Dipyridamole)、奎宁(Quinine)、吲哚美辛(Indometacin)、对乙酰氨基酚(Acetaminophen)、氟哌啶醇(Haloperidol)、纳洛酮(Naloxone)、甘露醇(Mannitol)、贝曲西班(Betrixaban)、氯米芬(Clomifene)、奥玛环素(Omadacycline)、Grapiprant、拉罗替尼(Larotrectinib)、雷芬那辛(Revefenacin)、替诺福韦酯(Tenofovirdisoproxil)、替诺福韦艾拉酚胺(Tenofovir alafenamide)、替诺福韦(Tenofovir)、雷迪帕韦(Ledipasvir)、西地那非(Sildenafil)、伐地那非(Vardenafil)、卡麦角林(Cabergoline)、普卡必利(Prucalopride)、利培酮(Risperidone)、曲马多(Tramadol)、阿奇霉素(Azithromycin)、氟康唑(Fluconazole)、雷诺嗪(Ranolazine)、西替利嗪(Cetirizine)、替加色罗(Tegaserod)和多虑平(Doxepin)

PIP2或磷脂酰肌醇4，5-双磷酸

PIP2是以低水平存在于细胞中但是参与多种重要的细胞过程的磷脂。PIP2的一些细胞功能包括调节内吞作用、胞吐作用、吞噬作用和细胞信号转导(Czech et al.，2000)。

如本文中所用，“PIP2”是指与ABCB5结合的磷脂。

本发明的一些方面是用于通过ABCB5-PIP2结合增强剂在正常干细胞中增强ABCB5/PIP2依赖性信号转导以增强ABCB5正常干细胞功能的方法。这样的方法包括向有此需要的对象施用有效量的增强ABCB5-PIP2途径的组合物，以及在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。在一些实施方案中，所述组合物包含PIP2、PIP2激动剂、磷脂和[PIP2(6∶0/18∶0)-H]-。在一些实施方案中，所述组合物包含磷脂，所述磷脂包含具有以下结构的化合物：

在一些实施方案中，R1和R2是独立的脂肪酸链。在一些实施方案中，R1和R2的长度为R1和R2中另一个的至少两倍长。在一些实施方案中，该结构具有22∶0-26∶0的总脂肪酸链。在一些实施方案中，该结构具有22∶0、23∶0、24∶0、25∶0或26∶0的总脂肪酸链。在本发明的一些实施方案中，将组合物施用于健康对象。对象可以是人或非人动物，包括山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠、猫、狗、美洲驼或灵长类，例如猴。在一些实施方案中，所述组合物用在对象中以促进伤口愈合、组织再生、血管生成和细胞存活，降低衰老以及抑制细胞死亡。在本发明的一些实施方案中，所述组合物通过经口、静脉内、皮下、表面、肠胃外、肿瘤内、肌肉内、鼻内、颅内、舌下、气管内、经眼或鞘内途径施用。在一些实施方案中，所述组合物还包含可药用载体。

在一些实施方案中，所述组合物包含PIP2激动剂。在一些实施方案中，所述组合物包含：

本发明方法的一个优点是其允许选择性地靶向具有表达ABCB5的干细胞的组织。虽然靶向酪氨酸激酶途径的现有治疗具有潜在的广泛副作用，但也调节PI3K信号转导的靶向ABCB5/PIP2结合(增强剂或抑制剂)的方法将其作用限于也表达ABCB5的细胞亚群。因此，该方法应提供较低的潜在副作用率。ABCB5靶向可以用作散播疾病的独立治疗方法，或用作使癌细胞对化学治疗剂敏感的辅助治疗方法，尤其是在目前患有难治性转移性疾病的那些患者中。

本发明的一些方面涉及用于通过包含在组合物中的抑制性分子来抑制ABCB5-PIP2结合以抑制ABCB5依赖性癌症干细胞功能的方法。这样的方法代表了对ABCB5的功能性阻断，并且还包括在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。在一些实施方案中，所述组合物抑制PI3K途径，并抑制肿瘤发生、转移和/或对调节PI3K信号转导的药物的抗性，例如，黑色素瘤通过PI3K信号转导介导的对维罗非尼的抗性，或癌症通过ABCB5增强的PI3K信号转导上调介导的对EGFR抑制剂的抗性。

在一些实施方案中，组合物包含PIP2拮抗剂。在一些实施方案中，组合物选自包含以下的组：小分子，脂质类似物，对该蛋白质的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段，以及酶。在一些实施方案中，所述组合物包含对ABCB5的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段。在一些实施方案中，所述组合物包含改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的ABCB5抗体或ABCB5结合片段。在一些实施方案中，ABCB5抗体选自例如包含以下的列表：单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、F(ab′)2、Fab、Fd、Fv或单链Fv片段。在一些实施方案中，ABCB5抗体是与ABCB5的三维构型的胞外环结合的人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段。在一些实施方案中，使人抗ABCB5抗体经历亲和力成熟，以识别并特异性结合ABCB5的非线性形式的胞外环。本文中所述的人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段具有对应于可通过包括亲和力成熟以与ABCB5的与非线性形式的胞外环特异性结合的方法制备的抗体的序列。

本发明的一些方面涉及产生(例如制备)抑制ABCB5-PIP2途径的人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段。在一些实施方案中，使抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段经历亲和力成熟，以与蛋白质的非线性形式的胞外环特异性结合。亲和力成熟过程可以通过以下来发生：a.噬菌体展示、酵母展示或核糖体展示；或b.淘选(panning)技术。例如，一旦已经针对线性胞外环肽产生了抗体，通过呈递并允许肽蛋白经过抗原呈递细胞进行加工，可以使用展示方法使所得抗体成熟。

在本发明的一些实施方案中，将组合物施用于健康对象。

在一些实施方案中，对象可以是人或非人动物，包括山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠、猫、狗、美洲驼或灵长类，例如猴。在本发明的一些实施方案中，所述组合物抑制药物抗性、细胞存活、上皮间充质转化(EMT)和转移，以及促进细胞死亡。在本发明的一些实施方案中，所述组合物通过经口、静脉内、皮下、表面、肠胃外、肿瘤内、肌肉内、鼻内、颅内、舌下、气管内、经眼或鞘内途径施用。

本发明的一些方面涉及用于通过向有此需要的对象施用有效量的抑制ABCB5-PIP2结合的组合物来抑制ABCB5依赖性癌症干细胞功能的方法。这样的方法代表了对ABCB5的功能性阻断，并且还包括在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。在一些实施方案中，所述组合物抑制PI3K途径，并抑制肿瘤发生、转移和/或对调节PI3K信号转导的药物的抗性，例如，黑色素瘤通过PI3K信号转导介导的对维罗非尼的抗性，或癌症通过ABCB5增强的PI3K信号转导上调介导的对EGFR抑制剂的抗性。

在一些实施方案中，组合物包含PIP2拮抗剂。在一些实施方案中，组合物选自包含以下的组：小分子，脂质类似物，对该蛋白质的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段，以及酶。在一些实施方案中，所述组合物包含对ABCB5的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段。在一些实施方案中，所述组合物包含改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的ABCB5抗体或ABCB5结合片段。在本发明的一些实施方案中，将组合物施用于健康对象。

在一些实施方案中，对象可以是人或非人动物，包括山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠、猫、狗、美洲驼或灵长类，例如猴。在本发明的一些实施方案中，所述组合物抑制药物抗性、细胞存活、上皮间充质转化(EMT)和转移，以及促进细胞死亡。在本发明的一些实施方案中，所述组合物通过经口、静脉内、皮下、表面、肠胃外、肿瘤内、肌肉内、鼻内、颅内、舌下、气管内、经眼或鞘内途径施用。

在一个方面，本发明可用作抑制或增强ABCB5-PIP2结合并因此代表功能性ABCB5阻滞剂或增强剂的分子化合物的开发方法中的筛选工具。这样的化合物包括脂质类似物、PIP2或PIP2激动剂、小分子药物(例如PSC833)，以及与ABCB5结合并通过诱导该分子的空间变化来阻断PIP2结合以及抑制pAKT磷酸化和下游信号转导/效应途径的新的ABCB5抑制性单克隆抗体子集。本发明的方法还包括使ABCB5+细胞与包含调节ABCB5-PIP2结合的化合物的假定组合物接触，确定PIP2途径产物化合物的水平。如果该水平大于基线水平，则假定组合物是ABCB5-PIP2途径增强剂，并且如果PIP2途径化合物的水平低于基线水平，则假定组合物是ABCB5-PIP2抑制剂。在一些实施方案中，PIP2途径产物化合物是PIP3，或PI3K途径的化合物成员。如本文中所用，“基线水平”是指未暴露于包含调节ABCB5-PIP2结合之化合物的假定组合物的样品的PIP2途径产物化合物的水平。

本发明的一些方面公开了已经通过质谱法表征的PIP2的新磷脂类似物。PIP2类似物的脂肪酸链组成代表新的内源存在的PIP2变体化合物(式C₃₃H₆₅O₁₉P₃，具有24∶0的总脂肪酸链的PIP2，标识为[PIP2(6∶0/18∶0)-H])。该类似物在ABCB5敲除细胞中特别富集，表明ABCB5在功能上是高效PIP2转换所需的。

PIP2具有化学式C₄₇H₈₀O₁₉P₃和以下结构：

在另一些方面，本发明是以下新化合物，其为PIP2的功能类似物，并具有结构[PIP2(6∶0/18∶0)-H]-和式C₃₃H₆₅O₁₉P₃和24∶0的总脂肪酸链。在一些实施方案中，该化合物抑制ABCB5-PIP2途径。在本发明的一些实施方案中，该化合物抑制药物抗性、细胞存活、上皮间充质转化(EMT)和转移，以及促进细胞死亡。

在一些方面，本发明是具有以下结构的化合物：

其中R₁和R₂独立地是脂肪酸链，使得结构具有22∶0-26∶0的总脂肪酸链，并且其中R₁和R₂之一的长度为R₁和R₂中另一个的至少两倍长。在一些实施方案中，结构具有22∶0、23∶0、24∶0、25∶0或26∶0的总脂肪酸链。在一些实施方案中，该化合物抑制ABCB5-PIP2途径。在本发明的一些实施方案中，该化合物抑制药物抗性、细胞存活、上皮间充质转化(EMT)和转移，以及促进细胞死亡。

在一些方面，本发明是用于使用本发明的新组合物或PIP2或其他PIP2类似物筛选ABCB5拮抗剂和增强剂的方法。本发明的方法还包括使ABCB5+细胞与调节ABCB5-PIP2结合的假定组合物接触，确定PIP2途径产物化合物的水平。如果该水平大于基线水平，则假定组合物是ABCB5-PIP2途径增强剂，并且如果PIP2途径产物化合物的水平低于基线水平，则假定组合物是ABCB5-PIP2抑制剂。在一些实施方案中，PIP2途径化合物是PIP3，或PI3K途径的化合物成员。

在一些实施方案中，ABCB5+细胞包含在第970位氨基酸处具有赖氨酸的ABCB5同种型1。在一些实施方案中，ABCB5+细胞包含在第525位氨基酸处具有赖氨酸的ABCB5同种型2。表达该SNP的ABCB5最常见于人癌症。

在另一些，组合物是用于这样的筛选测定的工具。

在另一些方面，本发明是使用新组合物或PIP2或其他PIP2类似物作为治疗性化合物以在外源施用时增强ABCB5依赖性干细胞功能的方法。

有效量

在本文中所述的方法中，术语“有效量”是指可实现所期望的治疗作用(例如增强或抑制ABCB5-PIP2途径)的组合物的量。

在一些实施方案中，组合物包含PIP2、PIP2激动剂、PIP2拮抗剂、磷脂或[PIP2(6∶0/18∶0)-H]-。在一些实施方案中，组合物包含PIP2。在一些实施方案中，组合物中PIP2的量为1％至100％。在一些实施方案中，组合物中PIP2的量为至少1％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％或更多。在一些实施方案中，组合物包含PIP2激动剂。在一些实施方案中，组合物中PP2激动剂的量为1％至100％。在一些实施方案中，组合物中PIP2激动剂的量为至少1％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％或更多。

在一些实施方案中，组合物包含PIP2拮抗剂。在一些实施方案中，组合物中PIP2拮抗剂的量为1％至100％。在一些实施方案中，组合物中PIP2拮抗剂量为至少1％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％或更多。

在一些实施方案中，组合物包含磷脂。在一些实施方案中，组合物中磷脂的量为1％至100％。在一些实施方案中，组合物中磷脂的量为至少1％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％或更多。在一些实施方案中，组合物包含[PIP2(6∶0/18∶0)-H]-。在一些实施方案中，组合物中[PIP2(6∶0/18∶0)-H]-的量为1％至100％。在一些实施方案中，组合物中[PIP2(6∶0/18∶0)-H]-的量为至少1％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％或更多。

药物组合物

本文中所述的化合物、抗体以及编码核酸或核酸集合、包含这些的载体或包含所述载体的宿主细胞可与可药用载体(赋形剂)混合来形成用于治疗目标疾病的药物组合物。“可接受的”意指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选能够稳定活性成分)，并且对待治疗的对象无害。可药用赋形剂(载体)包括本领域中公知的缓冲剂。参见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)LippincottWilliams and Wilkins，Ed.K.E.Hoover.。

用于本方法的药物组合物可包含以冻干制剂或水溶液形式的可药用载体、赋形剂或稳定剂。(Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins，Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在一些实施例中，本文中所述的药物组合物包含含有化合物或抗体(或编码核酸)的脂质体，所述脂质体可通过本领域中已知的方法制备，例如在Epstein，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；和美国专利No.4,485,045和4,544,545中所述。美国专利No.5,013,556公开了循环时间延长的脂质体。特别可用的脂质体可通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine，PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体通过限定孔尺寸的过滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。

还可将化合物或抗体或编码核酸包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；包封在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中；或包封在粗滴乳剂(macroemulsion)中。这样的技术在本领域中是已知的，例如，参见Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。

在另一些实施例中，本文中所述的药物组合物可以以缓释形式来配制。缓释制剂的合适实例包括包含化合物或抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成型制品的形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的一些实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRONDEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

在另一些实施例中，本文中所述的药物组合物可以以持续释放的形式配制，其通过实施某些蛋白酶生物学技术来影响与组织或肿瘤的选择性结合，例如，通过抗体抗原结合位点的肽掩蔽，以允许在肿瘤微环境中通过一种或更多种蛋白酶例如Probody^TM或Conditionally Active Biologics^TM的选择性蛋白酶切割。在正常微环境中，活化可被表述为是可逆的。

用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这容易通过例如经由无菌过滤膜过滤来完成。通常将治疗化合物或抗体组合物放置到具有无菌进入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

本文中所述的药物组合物可以是用于经口、胃肠外或直肠施用、或通过吸入或吹入施用的单位剂量形式，例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂，或栓剂。

对于制备固体组合物(例如片剂)，可将主要活性成分与药用载体(例如，常规压片成分例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其它药用稀释剂(例如水)混合以形成包含本发明化合物或其无毒可药用盐的均匀混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组合物称为均匀时，意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可容易地再分为等效单位剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后，将该固体预配制组合物再分成包含0.1至约500mg本发明的活性成分的上述类型的单位剂量形式。新的组合物的片剂或丸剂可被包衣或以其他方式复合以提供提供延长作用的优点的剂量形式。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者是在前者上方包膜的形式。这两种组分可通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗在胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括多种聚合物酸，以及聚合物酸与例如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素之材料的混合物。

合适的表面活性剂特别地包含非离子试剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如，Tween^TM 20、40、60、80或85)和其他脱水山梨糖醇(例如Span^TM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05％至5％的表面活性剂，并且可以是0.1％至2.5％。应理解的是，如果需要的话，可添加其他成分，例如甘露糖醇或其他可药用载剂。

合适的乳剂可使用市售的脂肪乳剂来制备，例如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM和Lipiphysan^TM。活性成分可溶解在预混合的乳剂组合物中，或者作为替代可将其溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，并与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合之后形成乳剂。应理解的是，可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖来调节乳剂的张度(tonicity)。合适的乳剂通常将包含多至20％的油，例如5％至20％。脂肪乳剂可包含0.1至1.0.im.，特别是0.1至0.5.im.的脂肪滴，并且pH为5.5至8.0。

乳剂组合物可以是通过将化合物或抗体与Intralipid^TM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。

用于吸入或吹入的药物组合物包括在可药用水性或有机溶剂或其混合物中的溶液剂和混悬剂，以及散剂。液体或固体组合物可包含如上所述的合适的可药用赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过经口或经鼻呼吸途径施用以用于局部或全身作用。

在优选无菌的可药用溶剂中的组合物可通过使用气体来雾化。雾化溶液可直接从雾化装置中呼吸，或者雾化装置可连接至面罩、帐篷(tent)或间歇式正压呼吸机。溶液剂、混悬剂或散剂组合物可从以合适方式递送制剂的装置施用，优选经口或经鼻施用。

治疗应用

本文中所述的任何化合物或抗体、以及编码核酸或核酸集合、包含这些的载体或包含所述载体的宿主细胞可用于治疗癌症、炎症、感染性疾病或其他需要免疫应答刺激的恶性肿瘤。

为了实施本文中所公开的方法，可通过合适的途径，例如静脉内施用，例如作为推注(bolus)或通过在一段时间内的连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、吸入或表面途径，将有效量的本文中所述的药物组合物施用于有治疗需要的对象(例如人)。用于液体制剂的市售雾化器(包括喷射雾化器和超声雾化器)可用于施用。液体制剂可直接雾化，并且冻干粉末可在重构之后雾化。或者，可使用氟碳化合物(fluorocarbon)制剂和计量吸入器来将本文中所述的化合物或抗体气雾化，或作为冻干和经研磨粉末吸入。

通过本文中所述方法待治疗的对象可以是患有、处于患有之风险中的或怀疑患有癌症或其他需要免疫应答刺激的恶性肿瘤的人患者。患有目标疾病或障碍的对象可通过常规医学检查，例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声波来鉴定。怀疑患有任何这样的目标疾病/障碍的对象可能表现出该疾病/障碍的一种或更多种症状。处于疾病/障碍之风险中的对象可以是具有该疾病/障碍的一种或更多种风险因素的对象。

本文中所述的方法和组合物可用于治疗癌症。可用本文中所述的方法和组合物治疗的癌症的一些实例包括但不限于：肺癌、黑素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、血液癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、卵巢癌、膀胱癌、尿路上皮癌、头颈癌、癌症的转移性病变以及被诊断为高突变负担的所有类型的癌症。在一个具体实施方案中，癌症具有高突变负担。患有或处于多种癌症之风险中的对象可通过常规医疗程序来鉴定。

在一些实例中，人患者具有高微卫星不稳定性(microsatellite instability-high，MSI-H)或错配修复缺陷(mismatch repair deficient，dMMR)，其发现于软组织癌、成胶质细胞瘤、食管癌和EGJ癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢表面上皮癌、未知原发性癌、小细胞肺癌、非上皮性卵巢癌、胰腺癌、其他女性生殖道恶性肿瘤、葡萄膜黑素瘤、腹膜后或腹膜肉瘤、甲状腺癌、子宫肉瘤、胆管癌、前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma)、肝细胞癌、神经内分泌肿瘤、宫颈癌、结直肠腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌和子宫内膜癌。

如本领域技术人员所认识的，有效量根据以下而变化：所治疗的特定病症、病症的严重程度、个体患者参数，包括年龄、身体状况、身高、性别和重量、治疗持续时间、并行治疗的性质(如果有的话)、具体施用途径以及在健康实践者的知识和专长内的类似因素。经验考虑因素，例如半衰期，通常将有助于剂量的确定。例如，与人免疫系统相容的抗体，例如人源化抗体或全人抗体，可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主免疫系统攻击。施用频率可在治疗过程期间确定和调节，并且通常(但并非必须)基于目标疾病/障碍的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。或者，抗体的持续连续释放制剂可以是合适的。用于实现持续释放的多种制剂和装置在本领域中是已知的

在一个实例中，用于本文中所述化合物或抗体的剂量可在已经给予该化合物或抗体的一次或更多次施用的个体中凭经验确定。向个体给予递增剂量的化合物。为了评估化合物的效力，可追踪疾病/障碍的指标。

通常来说，对于本文中所述的任何化合物或抗体的施用，初始候选剂量可以是约2mg/kg。出于本公开内容的目的，典型的日剂量、周剂量、每两周剂量或每三周剂量可以是约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至100μg/kg至300μg/kg至0.6mg/kg、lmg/kg、3mg/kg、至10mg/kg、至30mg/kg至100mg/kg或高多中的任一种，这取决于上述因素。对于在数天、数周、数月或更长时间内的重复施用，根据病症，持续治疗直至出现期望的症状抑制，或直至达到足够的治疗水平以减轻目标疾病或障碍或其症状。示例性的给药方案包括每3周施用约3mg/kg的初始剂量，随后在6周内施用一次约1mg/kg的化合物或抗体的维持剂量，或者随后每3周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据从业人员希望实现的药代动力学衰减模式，其他剂量方案可以是可用的。例如，考虑每3周给药一次1mg/kg与至少一种另外的免疫治疗剂的组合治疗。在一些实施方案中，可使用约3μg/mg至约3mg/kg(例如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约3mg/kg)给药。在一些实施方案中，给药频率为每周、每2周、每3周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或者每月、每2个月或每3个月或更长时间一次。这种治疗的进程容易通过常规技术和测定来监测。给药方案(包括所使用的化合物或抗体)可随时间而变化。

在一些实施方案中，对于正常体重的成年患者，可施用约0.1至5.0mg/kg的剂量。在一些实例中，本文中所述的剂量可以是10mg/kg。特定的给药方案，即剂量、时间和重复，将取决于特定个体和该个体的病史(medical history)，以及单独药剂的特性(例如药剂的半衰期，以及本领域中公知的其他考虑因素)。

出于本公开内容的目的，本文中所述的化合物或抗体的合适剂量将取决于所使用的特定化合物或抗体、抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/障碍的类型和严重程度、是出于预防目的还是治疗目的施用化合物或抗体、先前的治疗、患者的临床病史和对拮抗剂的响应以及主治医师的判断。通常来说，临床医师将施用化合物或抗体，直至达到实现期望结果的剂量。在一些实施方案中，所期望的结果是降低肿瘤尺寸、延长无进展生存期和/或提高总体生存。确定剂量是否产生所期望结果的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。一种或更多种化合物或抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的以及熟练从业人员已知的其他因素。化合物或抗体的施用可在预选时间段内基本上连续，或者可以以一系列间隔剂量进行，例如在发生目标疾病或障碍之前、期间或之后。

如本文中使用的，术语“治疗”是指将包含一种或更多种活性剂的组合物应用或施用于患有目标疾病或障碍、具有疾病/障碍症状或倾向于疾病/障碍的对象，目的是治愈、治疗、减轻、缓解、改变、救治、改良、改善或影响疾病、疾病症状或者对疾病或障碍的倾向性。减轻目标疾病/障碍包括延迟疾病的发生或进展，或者降低疾病严重程度。与没有治疗相比，治疗降低了对象将发生疾病以及在对象发生疾病之后进行治疗以对抗疾病的可能性，防止疾病恶化或者减慢疾病的进展。

减轻疾病并非必须要求治愈性结果。如本文中使用的，“延迟”目标疾病或障碍的发生意指推迟、阻碍、减慢、阻止、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可具有不同的时长，这取决于疾病的病史和/或所治疗个体。“延迟”或减轻疾病发生或延迟疾病发作的方法是这样的方法：当与未使用该方法相比时，降低在给定时间范围内发生疾病的一种或更多种症状的可能性和/或降低在给定时间范围内症状的程度。这样的比较通常基于使用足以给出统计学显著结果的多个对象的临床研究。

疾病的“发生”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。疾病的发生可使用本领域中公知的标准临床技术来检测和评估。然而，发生也指可能检测不到的进展。出于本公开内容的目的，发生或进展是指症状的生物学过程。“发生”包括出现、复发和发作。如本文中使用的目标疾病或障碍的“发作”或“出现”包括初始发作和/或复发。

在一些实施方案中，本文中所述的化合物或抗体以足以在体内将ABCB5或ABCB5-PIP2途径中的其他产物的活性抑制至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于有治疗需要的对象。在另一些实施方案中，化合物或抗体以有效降低ABCB5或ABCB5-PIP2途径中的其他产物的活性水平至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用。

根据待治疗疾病的类型或疾病部位，可使用医学领域普通技术人员已知的常规方法向对象施用药物组合物。该组合物也可通过其它常规途径施用，例如胃肠外、表面、经口、通过吸入喷雾剂、经直肠、经鼻、口含、经阴道或通过植入的储库施用。如本文中使用的术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、腹膜内、瘤内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可通过可注射储库(injectable depot)施用途径例如使用1个月、3个月或6个月可注射储库或可生物降解材料和方法施用于对象。在一些实例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。

可注射组合物可包含多种载体，例如植物油、二甲基乳酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、豆蔻酸异丙酯、乙醇以及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性化合物或抗体可通过滴注方法施用，通过该方法输注包含化合物或抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包括，例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格液(Ringer’s solution)或其他合适的赋形剂。可将肌内制剂，例如化合物或抗体的合适可溶性盐形式的无菌制剂在药用赋形剂例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中溶解并施用。

在一个实施方案中，化合物或抗体通过位点特异性或靶向局部递送技术施用。位点特异性或靶向局部递送技术的一些实例包括化合物或抗体的多种可植入的储库源或局部递送导管，例如输注导管、留置导管或针导管；合成移植物；外膜包裹物(adventitialwrap)、分流器和支架或其他可植入装置；位点特异性载体；直接注射或直接应用。参见，例如PCT公开No.WO 00/53211和美国专利No.5,981,568。

也可使用包含反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗性组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术在以下中描述：例如，Findeis et al.，TrendsBiotechnol.(1993)11：202；Chiou et al.，Gene Therapeutics：Methods andApplications of Direct Gene Transter(J.A.Wolff，ed.)(1994)；Wu et al.，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu et al.，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：3655；Wu et al.，J.Biol.Chem.(1991)266：338。

包含多核苷酸(例如，编码本文中所述的抗体或其他蛋白质的那些)的治疗性组合物以约100ng至约200mg DNA施用以用于在基因治疗方案中的局部施用。在一些实施方案中，在基因治疗方案期间还可使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg以及约20μg至约100μg DNA或更高的浓度范围。

本文中所述的治疗性多核苷酸和多肽可使用基因递送载剂来递送。基因递送载剂可以是病毒或非病毒来源的(通常参见Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1∶51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1：185；和Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148)。这样的编码序列的表达可使用内源性哺乳动物或异源启动子和/或增强子来诱导。编码序列的表达可以是组成型或受调节的。

用于递送所期望多核苷酸和在所期望细胞中表达的基于病毒的载体是本领域中是公知的。示例性的基于病毒的载剂包括但不限于重组逆转录病毒(参见，例如PCT公开No.WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO91/02805；美国专利No.5,219,740和4,777,127；英国专利No.2,200,651；和欧洲专利No.0345 242)；基于甲病毒属的载体(例如，辛德毕斯病毒载体(Sindbis virus vector)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(RossRiver virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532)以及腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体(参见，例如PCT公开No.WO 94/12649、WO93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。还可使用如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的与经杀灭腺病毒连接的DNA的施用。

还可使用非病毒递送载剂和方法，包括但不限于与单独的经杀灭腺病毒连接或未与其连接的聚阳离子凝缩DNA(参见，例如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配体连接DNA(参见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核细胞递送载剂细胞(参见，例如美国专利No.5,814,482；PCT公开No.WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；和WO 97/42338)以及核电荷(nucleic charge)中和或与细胞膜融合。还可使用裸DNA(naked DNA)。示例性的裸DNA引入方法在PCT公开No.WO 90/11092和美国专利No.5,580,859中描述。可用作基因递送载剂的脂质体在以下中描述：美国专利No.5,422,120；PCT公开No.WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；以及欧洲专利No.0524968。另外的方法在Philip，Mol.Cell.Biol.(1994)14：2411和在Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述。

本文中所述方法中使用的特定剂量方案，即剂量、时间和重复，将取决于特定对象和该对象的病史。

在一些实施方案中，可向有治疗需要的对象施用多于一种化合物或抗体，或者化合物或抗体与另一种合适的治疗剂的组合。化合物或抗体也可与用于增强和/或补充药剂的有效性的其他药剂联合使用。

目标疾病/障碍的治疗效力可通过本领域中公知的方法来评估。

涉及例如本公开内容中所述的治疗方法可与针对本文中公开的目标疾病或障碍的其他类型的治疗联合使用。一些实例包括化学治疗、免疫治疗(例如，涉及治疗性抗体、抗体、CAR T细胞或癌症疫苗的治疗)、手术、放射、基因治疗等，或抗感染性治疗。这样的治疗可与根据本公开内容的治疗同时或依次(以任何顺序)施用。在一些情况下，目标疾病是癌症(例如，本文中公开的那些)并且联合治疗包括免疫检查点(例如，抑制检查点)拮抗剂。一些实例包括PD-1/PD-L1拮抗剂(例如，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和阿特珠单抗(atezolizumab))、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂、TIGIT拮抗剂、CSF1R拮抗剂、CD112R(PVRIG)拮抗剂、PVR(CD155)拮抗剂、PD-L2拮抗剂、A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂或BTLA拮抗剂。另外的实例包括增强刺激检查点活性的活化剂，例如CD122(IL2)激动剂、4-1BB、ICOS配体、GITR和OX40。

另外可用的药剂也参见Physician′s Desk Reference，59.sup.th edition，(2005)，Thomson P D R，Montvale N.J.；Gennaro et al.，Eds.Remington′s The Scienceand Practice of Pharmacy 20th edition，(2000)，Lippincott Williams and Wilkins，Baltimore Md.；Braunwald et al.，Eds.Harrison′s Principles of InternalMedicine，15.sup.th edition，(2001)，McGraw Hill，NY；Berkow et al.，Eds.The MerckManual of Diagnosis and Therapy，(1992)，Merck Research Laboratories，RahwayN.J。

当与另外的治疗剂共同施用时，每种药剂的合适的治疗有效剂量可由于加成作用或协同作用而降低。

本文中所述方法的效力可通过本领域中已知的任何方法来评估，并且对于熟练的医学专业人员将是显而易见的。例如，基于抗体的免疫治疗的效力可通过对象的存活或者对象或其组织或样品中的癌症负担来评估。在一些实施方案中，基于治疗在对象中的安全性或毒性，例如通过对象的整体健康和/或不良事件或严重不良事件的存在来评估该方法。

本发明的应用不限于在以下描述中阐述的或附图中举例说明的组分之构造和布置的细节。本发明可以是其他实施方案，并且能够以多种方式实践或实施。另外，本文中使用的词组和术语是出于描述目的的并且不应被视为进行限制。本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“包含(involving)”及其变体意指着涵盖其后列出的项目及其等同物以及另外的项目。

除非本文中另有定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文中要求，否则没有数量词修饰的名词将包括一个/种或更多个/种。本公开内容的方法和技术通常根据本领域中公知的常规方法来实施。通常来说，本文中所述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关使用的命名和技术是本领域中公知和通常使用的那些。除非另外指出，否则本公开内容的方法和技术通常根据本领域中已知的常规方法以及如在本说明书通篇所引用和讨论的多种通用和更具体的参考文献中所描述的来进行。

通过以下实施例进一步举例说明本发明，所述实施例绝不应被解释为进一步限制。贯穿本申请引用的所有参考文献(包括文献参考、授权专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入。

实施例

实施例1：ABCB5通过调节AXL促进肿瘤侵袭。

最近的研究表明，与不良结直肠癌(CRC)预后相关的受体酪氨酸激酶AXL是导致其他恶性肿瘤中EMT诱导的原因。在本文中示出与对照转染细胞相比，COLO741 ABCB5 KD CRC细胞培养物中的AXL mRNA表达降低＞90％，并且这些细胞中AXL蛋白表达降低＞50％(图8)。此外，mAb介导的ABCB5阻滞始终抑制AXL在所检测的所有四种CRC细胞系(COLO741、SW620、HT29和HCT116，其中ABCB5(+)肿瘤细胞频率为9％至27％)中的表达，如通过Western印迹分析确定的(图8)，并且还在较小程度上抑制其下游靶磷酸-AKT，这证明了ABCB5+细胞使用的重要信号传导途径。ABCB5与AXL之间的功能关系通过在经由流式细胞术从所有四种细胞系中分选的未处理的ABCB5(+)细胞中的在mRNA和蛋白质水平二者下显著上调的AXL表达得到支持(图8)。

此外，与亲代COLO741细胞相比，AXL表达(如在mRNA和蛋白质水平下确定的)和下游信号传导(p-AKT/AKT比)在转移源性COLO741MET中增强(图8)。

实施例2：如通过来自人组织的免疫沉淀确定的PIP2和PIP3是ABCB5的天然体内结合配体。

来自使用抗PIP2抗体下拉的PIP2的人ABCB5表达黑素瘤细胞的免疫沉淀揭示了ABCB5蛋白的共沉淀，如图1A中通过使用ABCB5单克隆抗体的免疫印迹所示(上图)。使用图1A中的PIP2抗体的免疫印迹证实了PIP2下拉(下图)。类似地，来自使用抗PIP3抗体下拉的PIP3的人ABCB5表达黑素瘤细胞的免疫沉淀揭示了ABCB5蛋白的共沉淀，如图1B中通过使用ABCB5单克隆抗体的免疫印迹所示。这些数据表明PIP2和PIP3是ABCB5的生物配体，ABCB5充当PIP2和PIP3的受体。

实施例3：如通过ELISA确定的PIP1、PIP2和PIP3与ABCB5结合。

将包被有PIP1、PIP2或PIP3的ELISA板与纯化的重组人ABCB5同种型2(812aa，NCBI参考序列：NP_848654.3)、野生型小鼠Abcb5表达皮肤组织或来源于ABCB5敲除小鼠的Abcb5不表达皮肤组织(作为特异性对照)一起孵育，随后使用鼠ABCB5特异性单克隆抗体进行结合ABCB5检测(Ksander et al Nature 2014)。如图1C中所示，所有PIP1、PIP2和PIP3均与重组人ABCB5以及鼠Abcb5结合，其中在Abcb5敲除小鼠组织中不存在结合检测。因此，PIP2和PIP3与ABCB5的结合比PIP1与ABCB5的结合更高效。这些数据证实了ABCB5与PIP2和PIP3结合，并且还揭示了ABCB5对PIP1的能力，尽管具有明显较低的亲和力。使用鼠ABCB5 mAb克隆3C2-1D12(Frank NY et al.J Biol Chem.2003)作为检测抗体获得了类似的结果。

实施例4：PIP1、PIP2和PIP3与ABCB5的结合可被竞争性药理学配体抑制。

在不存在或存在增加剂量的PtdIns-(1，2-二辛酰基)的情况下将包被有PIP1、PIP2或PIP3的ELISA板与纯化的重组人ABCB5(P-糖蛋白ABCB5[智人]GenBank：AAO73470.1)一起孵育用于结合，所述PtdIns-(1，2-二辛酰基)是天然磷脂酰肌醇(PTDIns)的合成类似物，在sn-1和sn-2位置包含C8∶0脂肪酸(CAS登记号899827-36-2)。图2中举例说明的数据表明，该分子可竞争性地抑制PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5的结合，在低至0.1mM的浓度下具有明显的饱和作用。

这些结果提供了以下原则证明：PIP类似物(包含不能被磷酸化为生物活性PIP3的PIP2类似物和化学PIP2变体)，或竞争ABCB5的PIP1、PIP2或PIP3结合的但与在不同受体酪氨酸激酶(在下表中列出)或多种G蛋白偶联受体的信号转导中不发挥作用的PIP1、PIP2或PIP3不同的另外的合成化学药剂或生物药剂，可用作治疗药物来调节ABCB5/PIP1、ABCB5/PIP2或ABCB5/PIP3受体/配体相互作用，所述相互作用与这样的受体在多种疾病状态下的PIP依赖性信号转导机制相关，其中ABCB5是功能性的，特别是但不限于人癌症的起始和进展。

实施例5：PIP1、PIP2和PIP3与ABCB5的结合可被ABCB5单克隆抗体抑制。

表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)分析也证明了PIP1、PIP2和PIP3与ABCB5的结合。与抗ABCB5单克隆抗体的竞争导致在所有三个表面上以浓度依赖性方式降低信号(PIP3＞PIP2＞PIP1)，在PIP3表面上降低多至50％(参见图3)。同种型对照单克隆抗体未显示出显著作用(未举例说明)。这些结果表明ABCB5单克隆抗体可阻断PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5结合。

实施例6：ABCB5是更高效地将PIP2转换为PIP3所需的。

涉及在人黑素瘤细胞中使用ABCB5单克隆抗体进行ABCB5阻滞，或在ABCB5敲除小鼠来源组织中进行ABCB5功能性消融的功能性实验，揭示了ABCB5对于更高效的将PIP2转化为PIP3在功能上是所需的，可能通过其作为PIP2对接受体的功能。如图4中所举例说明的，ABCB5单克隆抗体，而不是同种型对照抗体，显著降低了人黑素瘤细胞中的PIP3/PIP2比值(左)。此外，对鼠ABCB5敲除皮肤组织的检查也揭示了与ABCB5野生型皮肤相比存在显著降低的PIP3/PIP2比值(右)。

同样SPR分析的结果表明，ABCB5单克隆抗体可阻断ABCB5/PIP2受体/配体相互作用，这些结果表明ABCB5/PIP2结合相互作用对于更高效的将PIP2磷酸化为PIP3是功能上所需的，暗示了ABCB5在ABCB5表达细胞中有关受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体信号传导的PIP2依赖性信号转导中起着关键作用，所述ABCB5表达细胞包含在多种恶性肿瘤中参与肿瘤形成、癌症进展和治疗抗性的癌症干细胞，包括黑素瘤、结直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、SCC和肝细胞癌等。此外，生理组织特异性干细胞，包括皮肤、眼和肠干细胞以高水平表达ABCB5，并且依赖受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体信号传导来执行其组织再生功能。因此，目前的发现提供了通过ABCB5单克隆抗体或ABCB5/PIP2结合的小分子/化学抑制剂来阻断ABCB5依赖性PIP2结合和在受体酪氨酸激酶信号传导中磷酸化为PIP3，或阻断在G蛋白偶联受体信号传导中加工成IP3和DAG的手段，导致抑制癌症起始/进展/治疗抗性相关的受体酪氨酸激酶信号传导(例如，AXL(参见Guo etal.J Biol Chem.2018)、EGFR)，或抑制癌症起始/进展/治疗抗性的G蛋白偶联受体信号传导依赖性机制。此外，增强ABCB5/PIP2结合相互作用，例如通过ABCB5表达/结合增加或通过外源性PIP2添加，将增强生物干细胞功能来治疗干细胞缺乏相关障碍。

实施例7：ABCB5是维持恶性肿瘤中PIP2/PIP3依赖性PI3K/AKT信号传导轴所需的，并且ABCB5抑制导致抑制PI3K/AKT信号传导轴以及依赖性肿瘤生长和治疗抗性。

在ABCB5 WT或ABCB5 KO背景下对4-HT处理可诱导Tyr：CreER；BrafCA；Ptenlox/lox遗传小鼠黑素瘤模型的分析揭示了与ABCB5 WT肿瘤相比PI3K/AKT信号传导轴在ABCB5KO中的显著抑制，其中在另外的失调分子中p-AKT、p-mTOR和p-S6表达减弱(参见图5)。

此外，在该模型中，与ABCB5 WT状态相比ABCB5 KO状态导致降低肿瘤细胞增殖，如通过确定增殖标志物Ki-67阳性染色的肿瘤细胞的百分比确定的(参见图6)：

另外，在该模型中，与ABCB5 WT状态相比ABCB5 KO状态导致促血管生成分子的下调(参见图7，左图)，以及作为结果，降低了CD31阳性微血管密度(参见图7，右图)。

还示出了特定的ABCB5单克隆抗体破坏了结直肠癌中的PIP2/PIP3依赖性PI3K/pAKT信号传导轴(参见Guo et al.J Biol.Chem 2018)，其中处理导致抑制pAKT/AKT比，并且当检测ABCB5单克隆抗体对人黑素瘤细胞的作用时，获得了类似的结果，其中用那些也抑制PIP2/PIP3与ABCB5结合和/或PIP2向PIP3转化的ABCB5抗体的处理导致显著抑制pAKT/AKT比。这些数据表明ABCB5功能性阻滞破坏了对肿瘤生长和肿瘤血管生成而言重要的PIP2/PIP3依赖性PI3K/pAKT信号传导轴，为ABCB5/PIP2/PIP3受体/配体相互作用的功能性阻滞的抗癌治疗效用提供了明确的证据。

此外，在ABCB5 WT或ABCB5 KO背景下，在4-HT处理可诱导Tyr：Creer；BrafCA；Ptenlox/lox遗传小鼠黑素瘤模型中，与ABCB5 WT状态相比，ABCB5 KO状态导致对BRAF抑制剂维罗非尼的作用的完全敏感，维罗非尼的抗性部分地由功能性PI3K/pAKT信号传导轴驱动。与显示100％维罗非尼抗性肿瘤形成的ABCB5 WT小鼠相反，在维罗非尼处理的ABCB5 KO小鼠中在遗传诱导之后没有观察到肿瘤形成(参见图9，左图)，并且与ABCB5 WT小鼠相比ABCB5 KO小鼠中的存活显著延长(参见图9，右图)。这些结果揭示了ABCB5在肿瘤维罗非尼抗性中至关重要的作用，通过其在维持维罗非尼抗性所需的完整的PIP2/PIP3依赖性PI3K/pAKT信号传导轴中的功能。这些结果还表明，ABCB5功能性抑制可在治疗上用于逆转黑素瘤BRAF抑制剂抗性。

实施例8：鉴定ABCB5敲除组织中积累的新的PIP2结构鉴定了ABCB5依赖性磷酸化为其PIP3形式的优选生理底物。

来源于ABCB5野生型(WT)或ABCB5敲除(KO小鼠)的皮肤组织的定量脂质质谱分析检测到新的PIP2形式(PIP2(6∶0/18∶0)@29.568051，即PIP2(6∶0/18∶0)-H，总脂肪酸链为24∶0，不饱和0，分子式C33H65O19P3)特异性地存在于ABCB5敲除组织中，但在ABCB5野生型皮肤的检测阈值下未检测到(ABCB5 KO平均值：7.79E+04+/-1.67E+04；WT平均值：未检测到)，这表明这种先前在化合物数据库中未知的新发现的PIP2分子变体代表了ABCB5依赖性磷酸化为其PIP3形式的优选生理底物，即参与ABCB5依赖性受体酪氨酸激酶或G蛋白偶联受体信号转导的生物活性磷酸化的PIP3形式。举例说明了这种新的PIP2(6∶0/18∶0)-H分子(总脂肪酸链为24∶0，不饱和0，分子式C33H65O19P3)的生物信息学生成的结构模型。

这种新的PIP2(6∶0/18∶0)-H分子，或其磷酸化形式PIP3(6∶0/18∶0)-H(分子式C33H65O19P4)，代表了在其中其信号转导受损或其中ABCB5功能或ABCB5表达水平降低的那些疾病病症中可用作治疗剂以增强通过上述列出的多种受体酪氨酸激酶或G蛋白偶联受体的信号传导的组合物，特别是在与ABCB5+干细胞缺陷相关的疾病中，例如皮肤伤口愈合缺陷、角膜缘干细胞缺陷、衰老中的组织再生缺陷和另外的ABCB5缺陷障碍，例如，如银屑病，发现与ABCB5野生型小鼠相比，在ABCB5敲除的咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中加剧银屑病(参见图10)。

实施例9：ABCB5单核苷酸多态性的功能性剖析揭示了涉及下游分子效应物功能的分子ABCB5配体/底物结合位点。

ABCB5同种型1(1257aa，NCBI参考序列：NP_001157413.1)的结构由两个各自具有6个跨膜(transmembrane，TM)螺旋的跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)组成，即其总共包含12个跨膜螺旋(TM 1-12)。ABCB5同种型2(812aa，NCBI参考序列：NP_848654.3)由一个具有6个跨膜(TM)螺旋(TM 1-6)的TMD组成。ABCB5同种型2的TM 1-6对应于ABCB5同种型1的TM 7-12。ABCB5同种型1的TM12对应于ABCB5同种型2的TM6。在ABCB5同种型1的TM12中提供AA970 E＞K并且对应于ABCB5同种型2的TM6中的AA 525 E＞K的ABCB5编码区(rs6461515)中的非同义单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，在本文中揭示对ABCB5功能至关重要。注释的参考E SNP(谷氨酸/E/GAA)因此在包括小家鼠(musmusculus)在内的多种物种中是保守的。然而，参考E SNP(谷氨酸/E/GAA)实际上代表了智人中的次要密码子。群体多样性数据显示，E525编码等位基因(谷氨酸，G基因型，密码子GAA)在非洲群体中以最高频率出现，其中G/G纯合性罕见，与K525编码等位基因(赖氨酸，A基因型，密码子AAA)相反(数据未显示)。

根据分析人癌症最常表达K SNP(赖氨酸，密码子AAA)。重要的是，基线时在仅表达ABCB5同种型2的野生型K525/K525人黑素瘤细胞中通过Crispr/Cas9介导的基因编辑在一个等位基因中实验诱导从K(赖氨酸，密码子AAA)到E(谷氨酸，密码子GAA)的分子转换，得到了ABCB5信号传导功能受损的克隆杂合ABCB5 K525/E525黑素瘤细胞变体，并导致显著抑制ABCB5驱动的肿瘤生长(P＜0.05)(参见图11)。

这些结果暗示ABCB5同种型2TM6的氨基酸残基525在ABCB5，特别是PIP2及其磷酸化产物PIP3的生理配体/底物结合质量中作为重要的分子开关，已知PIP2及其磷酸化产物PIP3传递胞外RTK介导的信号以激活对于肿瘤形成和进展必不可少的下游PI3K/pAKT信号传导途径，其中K525(rs6461515)代表更具功能的变体。相应地，ABCB5同种型1的TMl2中的残基970也与ABCB5的生理配体/底物结合相关。ABCB5同种型2的两种变体肽序列及其编码RNA序列(变体残基以红色突出显示)如下列出，其中与包含E525分子的参考(SNPrs6461515)相比，包含K525的分子在PIP底物/配体结合和下游信号传导功能方面是更高功能性的变体：

ABCB5同种型2-E525蛋白序列(SEQ ID NO：1)：

ABCB5同种型2-E525编码RNA序列(SEQ ID NO：2)：

ABCB5同种型2-K525蛋白序列(SEQ ID NO：3)：

ABCB5同种型2-K525编码RNA序列(SEQ ID NO：4)：

基于生物信息学分析考虑，涉及ABCB5底物结合的另外的残基是ABCB5同种型1的TM7中的N702和H706，对应于ABCB5同种型2的TM1中的N257和H261，以及ABCB5同种型1的TM10中的857A＞T(rs80123476)对应于ABCB5同种型2的TM4中的412A＞T(rs80123476)。

另外，到目前为止的结果已经确定了ABCB5特异性单克隆抗体(结合胞外环的3维(即圆形形式)的抗体)的子集(但不是全部)能够抑制PIP1、PIP2或PIP3与ABCB5结合，并且因此抑制ABCB5介导的PIP依赖性信号转导和pAKT磷酸化。因此，显示出抑制本文中证明的ABCB5依赖性PIP1、PIP2或PIP3结合和PIP依赖性信号转导和pAKT磷酸化的ABCB5单克隆抗体构成了独特可用的新的组合物，例如，通过功能性ABCB5阻滞在治疗上抑制ABCB5驱动的人癌症生长和进展并导致抑制ABCB5依赖性受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体信号转导。

实施例10：分子对接建模。

使用可用于ABCB5同源ABCB1蛋白的生物信息学方法和结构数据，为以上列出的ABCB5同种型2-K525和ABCB5同种型2-E525多肽序列二者创建模型3D结构。另外，为以下ABCB5配体或竞争性抑制剂创建3D结构，以促进使用PyMOL软件程序包进行分子对接/结合建模：

(a)PIP2(6∶0/18∶0)-H，总脂肪酸链为24∶0，不饱和0，分子式C33H65O19P3：

这是首次通过质谱鉴定的在ABCB5 KO小鼠皮肤中积累的新的PIP2变体，表明这种新的分子可能是ABCB5依赖性磷酸化为PIP3的生理底物，如上所述。这种分子先前在化合物数据库中是未知的(模型结构如上所示)。

(b)PI(4，5)P2、diC8，分子式C25H49O19P3：该PIP2变体示出通过SPR与ABCB5结合。其从Echelon Biosciences获得。有关该分子及其结构的另外的信息见CAS登记号(204858-53-7)。

(c)磷脂酰肌醇C-8：PtdIns-(1，2-二辛酰基)是天然磷脂酰肌醇(PtdIns)的合成类似物，在sn-1和sn-2位置包含C8：0脂肪酸。如上所述，表明该分子可竞争性地抑制PIP2与ABCB5结合。有关该分子的更多信息见CAS登记号899827-36-2。

结果揭示了所有测试分子(即天然配体PIP2(6∶0/18∶0)-H、PI(4，5)P2、diC8)和竞争性抑制剂磷脂酰肌醇C-8与ABCB5同种型2-K525或ABCB5同种型2-E525结构中任一个的结合紧密接近所确定的AA525底物结合位点和ABCB5分子的TM6。另外，建模结果揭示了与ABCB5同种型2-E525相反，ABCB5同种型2-K525对PIP2的结合亲和力更高。这些数据进一步支持了非同义单核苷酸多态性(SNP)在ABCB5编码区(rs6461515)中确定ABCB5同种型2的TM6中的AA 525E相对于K残基的关键作用的实验证据，这在本文中揭示对ABCB5功能是重要的，其中ABCB5同种型2-K525是具有增强PIP2/PIP3结合能力的更具功能性的ABCB5变体，并且因此提高了信号转导能力。

本文中引用的所有参考文献均通过引用全部并入。因此已经描述了本发明的至少一个实施方案的数个方面，应理解的是，本领域技术人员将容易想到多种改变、修改和改进。这样的改变、修改和改进旨在成为本公开内容的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前述描述和附图仅作为示例。

序列表

<110> 儿童医学中心公司

<120> ABCB5配体和底物

<130> C0875.70074WO00

<140> 尚未分配

<141> 与此同时

<150> US 62/662,670

<151> 2018-04-25

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 812

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 1

Met Val Asp Glu Asn Asp Ile Arg Ala Leu Asn Val Arg His Tyr Arg

1 5 10 15

Asp His Ile Gly Val Val Ser Gln Glu Pro Val Leu Phe Gly Thr Thr

20 25 30

Ile Ser Asn Asn Ile Lys Tyr Gly Arg Asp Asp Val Thr Asp Glu Glu

35 40 45

Met Glu Arg Ala Ala Arg Glu Ala Asn Ala Tyr Asp Phe Ile Met Glu

50 55 60

Phe Pro Asn Lys Phe Asn Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ala Gln Met

65 70 75 80

Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Ala Leu Val Arg

85 90 95

Asn Pro Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ser

100 105 110

Glu Ser Lys Ser Ala Val Gln Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ser Lys Gly

115 120 125

Arg Thr Thr Ile Val Val Ala His Arg Leu Ser Thr Ile Arg Ser Ala

130 135 140

Asp Leu Ile Val Thr Leu Lys Asp Gly Met Leu Ala Glu Lys Gly Ala

145 150 155 160

His Ala Glu Leu Met Ala Lys Arg Gly Leu Tyr Tyr Ser Leu Val Met

165 170 175

Ser Gln Asp Ile Lys Lys Ala Asp Glu Gln Met Glu Ser Met Thr Tyr

180 185 190

Ser Thr Glu Arg Lys Thr Asn Ser Leu Pro Leu His Ser Val Lys Ser

195 200 205

Ile Lys Ser Asp Phe Ile Asp Lys Ala Glu Glu Ser Thr Gln Ser Lys

210 215 220

Glu Ile Ser Leu Pro Glu Val Ser Leu Leu Lys Ile Leu Lys Leu Asn

225 230 235 240

Lys Pro Glu Trp Pro Phe Val Val Leu Gly Thr Leu Ala Ser Val Leu

245 250 255

Asn Gly Thr Val His Pro Val Phe Ser Ile Ile Phe Ala Lys Ile Ile

260 265 270

Thr Met Phe Gly Asn Asn Asp Lys Thr Thr Leu Lys His Asp Ala Glu

275 280 285

Ile Tyr Ser Met Ile Phe Val Ile Leu Gly Val Ile Cys Phe Val Ser

290 295 300

Tyr Phe Met Gln Gly Leu Phe Tyr Gly Arg Ala Gly Glu Ile Leu Thr

305 310 315 320

Met Arg Leu Arg His Leu Ala Phe Lys Ala Met Leu Tyr Gln Asp Ile

325 330 335

Ala Trp Phe Asp Glu Lys Glu Asn Ser Thr Gly Gly Leu Thr Thr Ile

340 345 350

Leu Ala Ile Asp Ile Ala Gln Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ser Arg Ile

355 360 365

Gly Val Leu Thr Gln Asn Ala Thr Asn Met Gly Leu Ser Val Ile Ile

370 375 380

Ser Phe Ile Tyr Gly Trp Glu Met Thr Phe Leu Ile Leu Ser Ile Ala

385 390 395 400

Pro Val Leu Ala Val Thr Gly Met Ile Glu Thr Ala Ala Met Thr Gly

405 410 415

Phe Ala Asn Lys Asp Lys Gln Glu Leu Lys His Ala Gly Lys Ile Ala

420 425 430

Thr Glu Ala Leu Glu Asn Ile Arg Thr Ile Val Ser Leu Thr Arg Glu

435 440 445

Lys Ala Phe Glu Gln Met Tyr Glu Glu Met Leu Gln Thr Gln His Arg

450 455 460

Asn Thr Ser Lys Lys Ala Gln Ile Ile Gly Ser Cys Tyr Ala Phe Ser

465 470 475 480

His Ala Phe Ile Tyr Phe Ala Tyr Ala Ala Gly Phe Arg Phe Gly Ala

485 490 495

Tyr Leu Ile Gln Ala Gly Arg Met Thr Pro Glu Gly Met Phe Ile Val

500 505 510

Phe Thr Ala Ile Ala Tyr Gly Ala Met Ala Ile Gly Glu Thr Leu Val

515 520 525

Leu Ala Pro Glu Tyr Ser Lys Ala Lys Ser Gly Ala Ala His Leu Phe

530 535 540

Ala Leu Leu Glu Lys Lys Pro Asn Ile Asp Ser Arg Ser Gln Glu Gly

545 550 555 560

Lys Lys Pro Asp Thr Cys Glu Gly Asn Leu Glu Phe Arg Glu Val Ser

565 570 575

Phe Phe Tyr Pro Cys Arg Pro Asp Val Phe Ile Leu Arg Gly Leu Ser

580 585 590

Leu Ser Ile Glu Arg Gly Lys Thr Val Ala Phe Val Gly Ser Ser Gly

595 600 605

Cys Gly Lys Ser Thr Ser Val Gln Leu Leu Gln Arg Leu Tyr Asp Pro

610 615 620

Val Gln Gly Gln Val Leu Phe Asp Gly Val Asp Ala Lys Glu Leu Asn

625 630 635 640

Val Gln Trp Leu Arg Ser Gln Ile Ala Ile Val Pro Gln Glu Pro Val

645 650 655

Leu Phe Asn Cys Ser Ile Ala Glu Asn Ile Ala Tyr Gly Asp Asn Ser

660 665 670

Arg Val Val Pro Leu Asp Glu Ile Lys Glu Ala Ala Asn Ala Ala Asn

675 680 685

Ile His Ser Phe Ile Glu Gly Leu Pro Glu Lys Tyr Asn Thr Gln Val

690 695 700

Gly Leu Lys Gly Ala Gln Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ala

705 710 715 720

Ile Ala Arg Ala Leu Leu Gln Lys Pro Lys Ile Leu Leu Leu Asp Glu

725 730 735

Ala Thr Ser Ala Leu Asp Asn Asp Ser Glu Lys Val Val Gln His Ala

740 745 750

Leu Asp Lys Ala Arg Thr Gly Arg Thr Cys Leu Val Val Thr His Arg

755 760 765

Leu Ser Ala Ile Gln Asn Ala Asp Leu Ile Val Val Leu His Asn Gly

770 775 780

Lys Ile Lys Glu Gln Gly Thr His Gln Glu Leu Leu Arg Asn Arg Asp

785 790 795 800

Ile Tyr Phe Lys Leu Val Asn Ala Gln Ser Val Gln

805 810

<210> 2

<211> 4375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 2

attgcttctc ggccttttgg ctaagatcaa gtgtaatctg tgttcttttt tatttggtca 60

tatcttccat tctttcttac ctaattcctc taatatctct ctgtgagcct aaaccaataa 120

ttatatatta cattctattg tctttcttat ataactgcag aaagataaat atcactttgt 180

ttgttcctgt aggttttctt tagtgtaatc catagcagtt attgcattgg agcagcagtc 240

cctcactttg aaaccttcgc aatagcccga ggagctgcct ttcatatttt ccaggttatt 300

gataagaaac ccagtataga taacttttcc acagctggat ataaacctga atccatagaa 360

ggaactgtgg aatttaaaaa tgtttctttc aattatccat caagaccatc tatcaagatt 420

ctgaaaggtc tgaatctcag aattaagtct ggagagacag tcgccttggt cggtctcaat 480

ggcagtggga agagtacggt agtccagctt ctgcagaggt tatatgatcc ggatgatggc 540

tttatcatgg tggatgagaa tgacatcaga gctttaaatg tgcggcatta tcgagaccat 600

attggagtgg ttagtcaaga gcctgttttg ttcgggacca ccatcagtaa caatatcaag 660

tatggacgag atgatgtgac tgatgaagag atggagagag cagcaaggga agcaaatgcg 720

tatgatttta tcatggagtt tcctaataaa tttaatacat tggtagggga aaaaggagct 780

caaatgagtg gagggcagaa acagaggatc gcaattgctc gtgccttagt tcgaaacccc 840

aagattctga ttttagatga ggctacgtct gccctggatt cagaaagcaa gtcagctgtt 900

caagctgcac tggagaaggc gagcaaaggt cggactacaa tcgtggtagc acaccgactt 960

tctactattc gaagtgcaga tttgattgtg accctaaagg atggaatgct ggcggagaaa 1020

ggagcacatg ctgaactaat ggcaaaacga ggtctatatt attcacttgt gatgtcacag 1080

gatattaaaa aagctgatga acagatggag tcaatgacat attctactga aagaaagacc 1140

aactcacttc ctctgcactc tgtgaagagc atcaagtcag acttcattga caaggctgag 1200

gaatccaccc aatctaaaga gataagtctt cctgaagtct ctctattaaa aattttaaag 1260

ttaaacaagc ctgaatggcc ttttgtggtt ctggggacat tggcttctgt tctaaatgga 1320

actgttcatc cagtattttc catcatcttt gcaaaaatta taaccatgtt tggaaataat 1380

gataaaacca cattaaagca tgatgcagaa atttattcca tgatattcgt cattttgggt 1440

gttatttgct ttgtcagtta tttcatgcag ggattatttt acggcagagc aggggaaatt 1500

ttaacgatga gattaagaca cttggccttc aaagccatgt tatatcagga tattgcctgg 1560

tttgatgaaa aggaaaacag cacaggaggc ttgacaacaa tattagccat agatatagca 1620

caaattcaag gagcaacagg ttccaggatt ggcgtcttaa cacaaaatgc aactaacatg 1680

ggactttcag ttatcatttc ctttatatat ggatgggaga tgacattcct gattctgagt 1740

attgctccag tacttgccgt gacaggaatg attgaaaccg cagcaatgac tggatttgcc 1800

aacaaagata agcaagaact taagcatgct ggaaagatag caactgaagc tttggagaat 1860

atacgtacta tagtgtcatt aacaagggaa aaagccttcg agcaaatgta tgaagagatg 1920

cttcagactc aacacagaaa tacctcgaag aaagcacaga ttattggaag ctgttatgca 1980

ttcagccatg cctttatata ttttgcctat gcggcagggt ttcgatttgg agcctattta 2040

attcaagctg gacgaatgac cccagagggc atgttcatag tttttactgc aattgcatat 2100

ggagctatgg ccatcggaga aacgctcgtt ttggctcctg aatattccaa agccaaatcg 2160

ggggctgcgc atctgtttgc cttgttggaa aagaaaccaa atatagacag ccgcagtcaa 2220

gaagggaaaa agccagacac atgtgaaggg aatttagagt ttcgagaagt ctctttcttc 2280

tatccatgtc gcccagatgt tttcatcctc cgtggcttat ccctcagtat tgagcgagga 2340

aagacagtag catttgtggg gagcagcggc tgtgggaaaa gcacttctgt tcaacttctg 2400

cagagacttt atgaccccgt gcaaggacaa gtgctgtttg atggtgtgga tgcaaaagaa 2460

ttgaatgtac agtggctccg ttcccaaata gcaatcgttc ctcaagagcc tgtgctcttc 2520

aactgcagca ttgctgagaa catcgcctat ggtgacaaca gccgtgtggt gccattagat 2580

gagatcaaag aagccgcaaa tgcagcaaat atccattctt ttattgaagg tctccctgag 2640

aaatacaaca cacaagttgg actgaaagga gcacagcttt ctggcggcca gaaacaaaga 2700

ctagctattg caagggctct tctccaaaaa cccaaaattt tattgttgga tgaggccact 2760

tcagccctcg ataatgacag tgagaaggtg gttcagcatg cccttgataa agccaggacg 2820

ggaaggacat gcctagtggt cactcacagg ctctctgcaa ttcagaacgc agatttgata 2880

gtggttctgc acaatggaaa gataaaggaa caaggaactc atcaagagct cctgagaaat 2940

cgagacatat attttaagtt agtgaatgca cagtcagtgc agtgatgctg ttgaggtagc 3000

acatattttg atgttcgtgt aatgcaaaga aggagtactt aataattact tggcaagctt 3060

tgatctcttt tattgcatat atcaatacct agaatcatgc tactcaagta catacatgtt 3120

ctattcacac accatctgac cttcagattt ttaaaaggaa gcaaaaattt gcttatttca 3180

tgtaagtgaa ataatgctta tatccttcac tttataaaac tattctagca catttgcttg 3240

taaagcagtt ttctacaagg tgaatttatt tcccatcaac ttctgctata aaatcggaaa 3300

tatgtttcca gggggaatat tatccaatta accatgttga aggttttagc aaaggcagtg 3360

taagatagag tggggcctgt agcattgcag ggagagtgtc tttcacttgg aattttgttt 3420

tgcagcacat attacagtag ttttgctagt cccttttctc cagaccgtag ggatttctct 3480

caataagtat tcactatttc tctaaatttt attctatttt tttgttgagc agggaataga 3540

aaggattacg atgtaaaatt tctgggagga ttaggtagct atctcctact tcaccagtaa 3600

gtgaagtgcc tcacatgagc catcccaaag attcattatt ccaaaccttg ggtttggcag 3660

tataagtcac aggcctacct gtttatgaaa acttacttac ttaaaataag agctactttt 3720

gggccgggtg cggtggctca cgcctgtaat cccagaactt tgggaggccg aggagggcgg 3780

atcacttgag gtcaggagtt cgagaccagc ctggccaaca tggtgaaacc ccgtctctac 3840

taaaaacaca aaaattagcc aatcttggtg gcgggcacct ggaatcccag ctacttggga 3900

ggctgaggca ggagaatcat ttgaacctag gaggcagagg ttgcagtgag ccgagatctc 3960

accactgcac tccagcctgc gcaacagagc gagactccat ctcaaaaaat aataaataag 4020

agctaatttt attgtgggtg aaaattttta aacgtctttc tctataataa aataatttcc 4080

ttaaatttta tatatacttt atcatatata atgtgtgaat gattttaaag ttctgtgtaa 4140

ataacaatat tggtaaaatg agttacattt tcaacttact taaatatgta atgtcacctg 4200

gtgattttat ctttattctt cagtgtattt tcttccattt acacatttag ctagcctccc 4260

taaagtgtac tctaccaata attgaaatct tgttaaacaa aattaaaacc atttatatat 4320

tatgctgctt tctttaaaat gcaaaataaa aataagattg gggacttgag aatca 4375

<210> 3

<211> 812

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 3

Met Val Asp Glu Asn Asp Ile Arg Ala Leu Asn Val Arg His Tyr Arg

1 5 10 15

Asp His Ile Gly Val Val Ser Gln Glu Pro Val Leu Phe Gly Thr Thr

20 25 30

Ile Ser Asn Asn Ile Lys Tyr Gly Arg Asp Asp Val Thr Asp Glu Glu

35 40 45

Met Glu Arg Ala Ala Arg Glu Ala Asn Ala Tyr Asp Phe Ile Met Glu

50 55 60

Phe Pro Asn Lys Phe Asn Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ala Gln Met

65 70 75 80

Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Ala Leu Val Arg

85 90 95

Asn Pro Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ser

100 105 110

Glu Ser Lys Ser Ala Val Gln Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ser Lys Gly

115 120 125

Arg Thr Thr Ile Val Val Ala His Arg Leu Ser Thr Ile Arg Ser Ala

130 135 140

Asp Leu Ile Val Thr Leu Lys Asp Gly Met Leu Ala Glu Lys Gly Ala

145 150 155 160

His Ala Glu Leu Met Ala Lys Arg Gly Leu Tyr Tyr Ser Leu Val Met

165 170 175

Ser Gln Asp Ile Lys Lys Ala Asp Glu Gln Met Glu Ser Met Thr Tyr

180 185 190

Ser Thr Glu Arg Lys Thr Asn Ser Leu Pro Leu His Ser Val Lys Ser

195 200 205

Ile Lys Ser Asp Phe Ile Asp Lys Ala Glu Glu Ser Thr Gln Ser Lys

210 215 220

Glu Ile Ser Leu Pro Glu Val Ser Leu Leu Lys Ile Leu Lys Leu Asn

225 230 235 240

Lys Pro Glu Trp Pro Phe Val Val Leu Gly Thr Leu Ala Ser Val Leu

245 250 255

Asn Gly Thr Val His Pro Val Phe Ser Ile Ile Phe Ala Lys Ile Ile

260 265 270

Thr Met Phe Gly Asn Asn Asp Lys Thr Thr Leu Lys His Asp Ala Glu

275 280 285

Ile Tyr Ser Met Ile Phe Val Ile Leu Gly Val Ile Cys Phe Val Ser

290 295 300

Tyr Phe Met Gln Gly Leu Phe Tyr Gly Arg Ala Gly Glu Ile Leu Thr

305 310 315 320

Met Arg Leu Arg His Leu Ala Phe Lys Ala Met Leu Tyr Gln Asp Ile

325 330 335

Ala Trp Phe Asp Glu Lys Glu Asn Ser Thr Gly Gly Leu Thr Thr Ile

340 345 350

Leu Ala Ile Asp Ile Ala Gln Ile Gln Gly Ala Thr Gly Ser Arg Ile

355 360 365

Gly Val Leu Thr Gln Asn Ala Thr Asn Met Gly Leu Ser Val Ile Ile

370 375 380

Ser Phe Ile Tyr Gly Trp Glu Met Thr Phe Leu Ile Leu Ser Ile Ala

385 390 395 400

Pro Val Leu Ala Val Thr Gly Met Ile Glu Thr Ala Ala Met Thr Gly

405 410 415

Phe Ala Asn Lys Asp Lys Gln Glu Leu Lys His Ala Gly Lys Ile Ala

420 425 430

Thr Glu Ala Leu Glu Asn Ile Arg Thr Ile Val Ser Leu Thr Arg Glu

435 440 445

Lys Ala Phe Glu Gln Met Tyr Glu Glu Met Leu Gln Thr Gln His Arg

450 455 460

Asn Thr Ser Lys Lys Ala Gln Ile Ile Gly Ser Cys Tyr Ala Phe Ser

465 470 475 480

His Ala Phe Ile Tyr Phe Ala Tyr Ala Ala Gly Phe Arg Phe Gly Ala

485 490 495

Tyr Leu Ile Gln Ala Gly Arg Met Thr Pro Glu Gly Met Phe Ile Val

500 505 510

Phe Thr Ala Ile Ala Tyr Gly Ala Met Ala Ile Gly Lys Thr Leu Val

515 520 525

Leu Ala Pro Glu Tyr Ser Lys Ala Lys Ser Gly Ala Ala His Leu Phe

530 535 540

Ala Leu Leu Glu Lys Lys Pro Asn Ile Asp Ser Arg Ser Gln Glu Gly

545 550 555 560

Lys Lys Pro Asp Thr Cys Glu Gly Asn Leu Glu Phe Arg Glu Val Ser

565 570 575

Phe Phe Tyr Pro Cys Arg Pro Asp Val Phe Ile Leu Arg Gly Leu Ser

580 585 590

Leu Ser Ile Glu Arg Gly Lys Thr Val Ala Phe Val Gly Ser Ser Gly

595 600 605

Cys Gly Lys Ser Thr Ser Val Gln Leu Leu Gln Arg Leu Tyr Asp Pro

610 615 620

Val Gln Gly Gln Val Leu Phe Asp Gly Val Asp Ala Lys Glu Leu Asn

625 630 635 640

Val Gln Trp Leu Arg Ser Gln Ile Ala Ile Val Pro Gln Glu Pro Val

645 650 655

Leu Phe Asn Cys Ser Ile Ala Glu Asn Ile Ala Tyr Gly Asp Asn Ser

660 665 670

Arg Val Val Pro Leu Asp Glu Ile Lys Glu Ala Ala Asn Ala Ala Asn

675 680 685

Ile His Ser Phe Ile Glu Gly Leu Pro Glu Lys Tyr Asn Thr Gln Val

690 695 700

Gly Leu Lys Gly Ala Gln Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ala

705 710 715 720

Ile Ala Arg Ala Leu Leu Gln Lys Pro Lys Ile Leu Leu Leu Asp Glu

725 730 735

Ala Thr Ser Ala Leu Asp Asn Asp Ser Glu Lys Val Val Gln His Ala

740 745 750

Leu Asp Lys Ala Arg Thr Gly Arg Thr Cys Leu Val Val Thr His Arg

755 760 765

Leu Ser Ala Ile Gln Asn Ala Asp Leu Ile Val Val Leu His Asn Gly

770 775 780

Lys Ile Lys Glu Gln Gly Thr His Gln Glu Leu Leu Arg Asn Arg Asp

785 790 795 800

Ile Tyr Phe Lys Leu Val Asn Ala Gln Ser Val Gln

805 810

<210> 4

<211> 4375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 4

attgcttctc ggccttttgg ctaagatcaa gtgtaatctg tgttcttttt tatttggtca 60

tatcttccat tctttcttac ctaattcctc taatatctct ctgtgagcct aaaccaataa 120

ttatatatta cattctattg tctttcttat ataactgcag aaagataaat atcactttgt 180

ttgttcctgt aggttttctt tagtgtaatc catagcagtt attgcattgg agcagcagtc 240

cctcactttg aaaccttcgc aatagcccga ggagctgcct ttcatatttt ccaggttatt 300

gataagaaac ccagtataga taacttttcc acagctggat ataaacctga atccatagaa 360

ggaactgtgg aatttaaaaa tgtttctttc aattatccat caagaccatc tatcaagatt 420

ctgaaaggtc tgaatctcag aattaagtct ggagagacag tcgccttggt cggtctcaat 480

ggcagtggga agagtacggt agtccagctt ctgcagaggt tatatgatcc ggatgatggc 540

tttatcatgg tggatgagaa tgacatcaga gctttaaatg tgcggcatta tcgagaccat 600

attggagtgg ttagtcaaga gcctgttttg ttcgggacca ccatcagtaa caatatcaag 660

tatggacgag atgatgtgac tgatgaagag atggagagag cagcaaggga agcaaatgcg 720

tatgatttta tcatggagtt tcctaataaa tttaatacat tggtagggga aaaaggagct 780

caaatgagtg gagggcagaa acagaggatc gcaattgctc gtgccttagt tcgaaacccc 840

aagattctga ttttagatga ggctacgtct gccctggatt cagaaagcaa gtcagctgtt 900

caagctgcac tggagaaggc gagcaaaggt cggactacaa tcgtggtagc acaccgactt 960

tctactattc gaagtgcaga tttgattgtg accctaaagg atggaatgct ggcggagaaa 1020

ggagcacatg ctgaactaat ggcaaaacga ggtctatatt attcacttgt gatgtcacag 1080

gatattaaaa aagctgatga acagatggag tcaatgacat attctactga aagaaagacc 1140

aactcacttc ctctgcactc tgtgaagagc atcaagtcag acttcattga caaggctgag 1200

gaatccaccc aatctaaaga gataagtctt cctgaagtct ctctattaaa aattttaaag 1260

ttaaacaagc ctgaatggcc ttttgtggtt ctggggacat tggcttctgt tctaaatgga 1320

actgttcatc cagtattttc catcatcttt gcaaaaatta taaccatgtt tggaaataat 1380

gataaaacca cattaaagca tgatgcagaa atttattcca tgatattcgt cattttgggt 1440

gttatttgct ttgtcagtta tttcatgcag ggattatttt acggcagagc aggggaaatt 1500

ttaacgatga gattaagaca cttggccttc aaagccatgt tatatcagga tattgcctgg 1560

tttgatgaaa aggaaaacag cacaggaggc ttgacaacaa tattagccat agatatagca 1620

caaattcaag gagcaacagg ttccaggatt ggcgtcttaa cacaaaatgc aactaacatg 1680

ggactttcag ttatcatttc ctttatatat ggatgggaga tgacattcct gattctgagt 1740

attgctccag tacttgccgt gacaggaatg attgaaaccg cagcaatgac tggatttgcc 1800

aacaaagata agcaagaact taagcatgct ggaaagatag caactgaagc tttggagaat 1860

atacgtacta tagtgtcatt aacaagggaa aaagccttcg agcaaatgta tgaagagatg 1920

cttcagactc aacacagaaa tacctcgaag aaagcacaga ttattggaag ctgttatgca 1980

ttcagccatg cctttatata ttttgcctat gcggcagggt ttcgatttgg agcctattta 2040

attcaagctg gacgaatgac cccagagggc atgttcatag tttttactgc aattgcatat 2100

ggagctatgg ccatcggaaa aacgctcgtt ttggctcctg aatattccaa agccaaatcg 2160

ggggctgcgc atctgtttgc cttgttggaa aagaaaccaa atatagacag ccgcagtcaa 2220

gaagggaaaa agccagacac atgtgaaggg aatttagagt ttcgagaagt ctctttcttc 2280

tatccatgtc gcccagatgt tttcatcctc cgtggcttat ccctcagtat tgagcgagga 2340

aagacagtag catttgtggg gagcagcggc tgtgggaaaa gcacttctgt tcaacttctg 2400

cagagacttt atgaccccgt gcaaggacaa gtgctgtttg atggtgtgga tgcaaaagaa 2460

ttgaatgtac agtggctccg ttcccaaata gcaatcgttc ctcaagagcc tgtgctcttc 2520

aactgcagca ttgctgagaa catcgcctat ggtgacaaca gccgtgtggt gccattagat 2580

gagatcaaag aagccgcaaa tgcagcaaat atccattctt ttattgaagg tctccctgag 2640

aaatacaaca cacaagttgg actgaaagga gcacagcttt ctggcggcca gaaacaaaga 2700

ctagctattg caagggctct tctccaaaaa cccaaaattt tattgttgga tgaggccact 2760

tcagccctcg ataatgacag tgagaaggtg gttcagcatg cccttgataa agccaggacg 2820

ggaaggacat gcctagtggt cactcacagg ctctctgcaa ttcagaacgc agatttgata 2880

gtggttctgc acaatggaaa gataaaggaa caaggaactc atcaagagct cctgagaaat 2940

cgagacatat attttaagtt agtgaatgca cagtcagtgc agtgatgctg ttgaggtagc 3000

acatattttg atgttcgtgt aatgcaaaga aggagtactt aataattact tggcaagctt 3060

tgatctcttt tattgcatat atcaatacct agaatcatgc tactcaagta catacatgtt 3120

ctattcacac accatctgac cttcagattt ttaaaaggaa gcaaaaattt gcttatttca 3180

tgtaagtgaa ataatgctta tatccttcac tttataaaac tattctagca catttgcttg 3240

taaagcagtt ttctacaagg tgaatttatt tcccatcaac ttctgctata aaatcggaaa 3300

tatgtttcca gggggaatat tatccaatta accatgttga aggttttagc aaaggcagtg 3360

taagatagag tggggcctgt agcattgcag ggagagtgtc tttcacttgg aattttgttt 3420

tgcagcacat attacagtag ttttgctagt cccttttctc cagaccgtag ggatttctct 3480

caataagtat tcactatttc tctaaatttt attctatttt tttgttgagc agggaataga 3540

aaggattacg atgtaaaatt tctgggagga ttaggtagct atctcctact tcaccagtaa 3600

gtgaagtgcc tcacatgagc catcccaaag attcattatt ccaaaccttg ggtttggcag 3660

tataagtcac aggcctacct gtttatgaaa acttacttac ttaaaataag agctactttt 3720

gggccgggtg cggtggctca cgcctgtaat cccagaactt tgggaggccg aggagggcgg 3780

atcacttgag gtcaggagtt cgagaccagc ctggccaaca tggtgaaacc ccgtctctac 3840

taaaaacaca aaaattagcc aatcttggtg gcgggcacct ggaatcccag ctacttggga 3900

ggctgaggca ggagaatcat ttgaacctag gaggcagagg ttgcagtgag ccgagatctc 3960

accactgcac tccagcctgc gcaacagagc gagactccat ctcaaaaaat aataaataag 4020

agctaatttt attgtgggtg aaaattttta aacgtctttc tctataataa aataatttcc 4080

ttaaatttta tatatacttt atcatatata atgtgtgaat gattttaaag ttctgtgtaa 4140

ataacaatat tggtaaaatg agttacattt tcaacttact taaatatgta atgtcacctg 4200

gtgattttat ctttattctt cagtgtattt tcttccattt acacatttag ctagcctccc 4260

taaagtgtac tctaccaata attgaaatct tgttaaacaa aattaaaacc atttatatat 4320

tatgctgctt tctttaaaat gcaaaataaa aataagattg gggacttgag aatca 4375

Claims (75)

1.增强ABCB5阳性细胞功能的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的增强ABCB5-PIP2途径的组合物。

2.权利要求1所述的方法，其还包括在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。

3.权利要求1所述的方法，其中所述组合物是PIP2或PIP2激动剂。

4.权利要求1所述的方法，其中所述对象是人或非人动物，包括山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠、猫、狗、美洲驼或灵长类，例如猴。

5.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含磷脂。

6.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含[PIP2(6：0/18：0)-H]^-和可药用载体。

7.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含磷脂，所述磷脂包含具有以下结构的化合物：

其中R1和R2是独立的脂肪酸链；并且

其中R1和R2的长度为R1和R2中另一个的至少两倍长。

8.权利要求7所述的方法，其中所述结构具有22：0-26：0的总脂肪酸链。

9.权利要求7所述的方法，其中所述结构具有24：0的总脂肪酸链。

10.权利要求1所述的方法，其中所述对象是健康对象。

11.权利要求1所述的方法，其中所述组合物促进伤口愈合。

12.权利要求1所述的方法，其中所述组合物促进组织再生。

13.权利要求1所述的方法，其中所述组合物促进血管生成。

14.权利要求1所述的方法，其中所述组合物促进细胞存活。

15.权利要求1所述的方法，其中所述组合物抑制细胞死亡。

16.权利要求1所述的方法，其中所述组合物通过经口、静脉内、皮下、表面、肠胃外、肿瘤内、肌肉内、鼻内、颅内、舌下、气管内、经眼或鞘内途径施用。

17.抑制ABCB5阳性癌细胞功能的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的抑制ABCB5-PIP2途径的组合物，并且还包括在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。

18.抑制ABCB5阳性癌细胞功能的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的抑制ABCB5-PIP2结合的组合物，其中所述组合物选自包含以下的组：小分子，脂质类似物，对该蛋白质的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或片段，酶，以及改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的抗ABCB5抗体或其片段。

19.权利要求18所述的方法，其中所述改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的抗ABCB5抗体或其片段抑制PIP3的产生。

20.权利要求18所述的方法，其中所述改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的抗ABCB5抗体或其片段抑制PI3K途径。

21.权利要求18所述的方法，其还包括在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。

22.权利要求17或18所述的方法，其中所述组合物是PIP2拮抗剂。

23.权利要求17所述的方法，其中所述组合物选自包含以下的组：小分子，脂质类似物，对该蛋白质的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或片段，以及酶。

24.权利要求17或18所述的方法，其中所述组合物是小分子。

25.权利要求17或18所述的方法，其中所述组合物是对该蛋白质的胞外多肽的环状形式或线性形式具有特异性的抗ABCB5抗体或片段。

26.权利要求17或18所述的方法，其中所述组合物是改变ABCB5 PIP2结合位点的构象的ABCB5抗体或片段。

27.权利要求17或18所述的方法，其中所述组合物是脂质类似物。

28.权利要求17或18所述的方法，其中所述组合物是酶。

29.权利要求17或18所述的方法，其中所述对象是人或非人动物，包括山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠、猫、狗、美洲驼或灵长类，例如猴。

30.权利要求17或18所述的方法，其中所述组合物通过经口、静脉内、皮下、表面、肠胃外、肿瘤内、肌肉内、鼻内、颅内、舌下、气管内、经眼或鞘内途径施用。

31.用于鉴定ABCB5-PIP2途径的增强剂或抑制剂的方法，其包括：

使ABCB5+细胞与调节ABCB5-PIP2结合的假定组合物接触；确定PIP2途径产物化合物的水平并将所述水平与所述PIP2途径产物化合物的基线水平进行比较，其中如果所述水平大于所述基线水平，则所述假定组合物是ABCB5-PIP2途径增强剂，并且如果PIP2途径产物化合物的水平低于所述基线水平，则所述假定组合物是ABCB5-PIP2抑制剂。

32.权利要求31所述的方法，其中调节ABCB5-PIP2途径的所述假定组合物是PIP2或PIP2激动剂。

33.权利要求31所述的方法，其中调节ABCB5-PIP2途径的所述假定组合物是小分子。

34.权利要求31所述的方法，其中调节ABCB5-PIP2途径的所述假定组合物是抗ABCB5抗体或其片段。

35.权利要求31所述的方法，其中所述PIP2途径化合物是PIP3。

36.权利要求31所述的方法，其中所述PIP2途径化合物是PI3K途径的成员。

37.权利要求31所述的方法，其中所述ABCB5+细胞包含其中第970位氨基酸是赖氨酸的ABCB5同种型1。

38.权利要求31所述的方法，其中所述ABCB5+细胞包含其中第525位氨基酸是赖氨酸的ABCB5同种型2。

39.包含合成磷脂的组合物，所述合成磷脂包含具有以下结构的化合物：

其中R1和R2是独立的脂肪酸链；并且

其中R1和R2的长度为R1和R2中另一个的至少两倍长。

40.权利要求39所述的组合物，其中所述磷脂具有22：0-26：0的总脂肪酸链。

41.权利要求40所述的组合物，其中所述磷脂具有24：0的总脂肪酸链。

42.权利要求39所述的组合物，其中所述磷脂具有下式：C33H65O19P3。

43.权利要求39所述的组合物，其中所述磷脂包含[PIP2(6：0/18：0)-H]^-和可药用载体。

44.权利要求39所述的组合物，其中所述组合物包含PIP2类似物。

45.权利要求39所述的组合物，其中所述组合物增强ABCB5-PIP2途径。

46.权利要求45所述的组合物，其中所述组合物促进伤口愈合。

47.权利要求45所述的组合物，其中所述组合物促进组织再生。

48.权利要求45所述的组合物，其中所述组合物促进血管生成。

49.权利要求45所述的组合物，其中所述组合物促进细胞存活。

50.权利要求45所述的组合物，其中所述组合物抑制细胞死亡。

51.权利要求39所述的组合物，其中所述磷脂包含磷酸化的PIP3(6：0/18：0)-H^-(C33H65O19P4)和可药用载体。

52.抑制ABCB5-PIP2途径的人抗ABCB5抗体或其ABCB5结合片段，其中所述抗ABCB5抗体或其ABCB5结合片段与ABCB5的三维构型的胞外环结合。

53.权利要求52所述的人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段，其中所述抗体可通过包括亲和力成熟以与ABCB5的非线性形式的胞外环特异性结合的方法来制备。

54.权利要求52所述的人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段，其中所述抗体具有对应于可通过包括亲和力成熟以与ABCB5的非线性形式的胞外环特异性结合的方法制备的抗体的序列。

55.制备根据权利要求52所述的抑制ABCB5-PIP2途径的人抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段的方法，其中使所述抗ABCB5抗体或ABCB5结合片段经历亲和力成熟以与该蛋白质的非线性形式的胞外环特异性结合。

56.用于鉴定抑制ABCB5-PIP2途径的抗体或片段的方法，其包括：

使ABCB5+细胞与结合ABCB5的假定抗体或片段接触；在用所述抗体或片段处理之后评估ABCB5-PIP2结合；确定PIP2途径产物化合物的水平并将所述水平与所述PIP2途径产物化合物的基线水平进行比较，其中如果所述PIP2途径产物化合物的水平低于所述基线水平，则所述假定抗体或片段是ABCB5-PIP2途径的抑制剂。

57.权利要求56所述的方法，其中所述PIP2途径化合物是PIP3。

58.权利要求56所述的方法，其中所述PIP2途径化合物是PI3K途径的成员。

59.ABCB5同种型1，其包含两个跨膜结构域(TMD)和12个跨膜螺旋(TM 1-12)，其中TM12第970位谷氨酸已突变为赖氨酸，或其中TM12第970位为谷氨酸。

60.ABCB5同种型2，其包含一个跨膜结构域(TMD)和6个跨膜螺旋(TM 1-6)，其中TM6第525位谷氨酸已突变为赖氨酸，或其中TM12第525位为谷氨酸。

61.抑制ABCB5-PIP2途径的人抗ABCB5同种型抗体或其结合片段，其中所述抗ABCB5抗体或其ABCB5结合片段与权利要求G1所述的ABCB5同种型1或权利要求60所述的ABCB5同种型2特异性结合。

62.用于鉴定ABCB5-PIP2途径的增强剂或抑制剂的方法，其包括：

使权利要求59所述的ABCB5同种型1或权利要求60所述的ABCB5同种型2与调节ABCB5-PIP2结合的假定组合物接触；确定PIP2途径产物化合物的水平并将所述水平与所述PIP2途径产物化合物的基线水平进行比较，其中如果所述水平大于所述基线水平，则所述假定组合物是ABCB5-PIP2途径增强剂，并且如果PIP2途径化合物的水平低于所述基线水平，则所述假定组合物是ABCB5-PIP2抑制剂。

63.权利要求62所述的方法，其中调节ABCB5-PIP2途径的所述假定组合物是PIP2或PIP2激动剂。

64.权利要求62所述的方法，其中调节ABCB5-PIP2途径的所述假定组合物是小分子。

65.权利要求62所述的方法，其中调节ABCB5-PIP2途径的所述假定组合物是抗ABCB5抗体或其片段。

66.权利要求62所述的方法，其中所述PIP2途径化合物是PIP3。

67.权利要求62所述的方法，其中所述PIP2途径化合物是PI3K途径的成员。

68.权利要求62至67中任一项所述的方法，其中重组表达所述ABCB5同种型。

69.用于在对象中治疗癌症的方法，其包括：

使用基因编辑破坏细胞中的内源ABCB5基因；通过使所述细胞与Cas蛋白、与所述内源ABCB5基因杂交的CRISPR RNA、以及tracrRNA接触，其中在与所述Cas蛋白、CRISPR RNA和tracrRNA接触之后，所述内源ABCB5基因被修饰，使得所述基因的编码所述ABCB5基因的末端跨膜螺旋的区域中的AAA序列被替换为GAA，并且其中所述基因编辑在所述对象中治疗所述癌症。

70.权利要求69所述的方法，其中所述对象在基因编辑之前具有与所述癌症相关的ABCB+干细胞，其为ABCB5纯合同种型2K525/K525。

71.权利要求69或70所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤或胶质母细胞瘤。

72.用于在对象中治疗癌症的方法，其包括：

向所述对象施用抑制ABCB5-PIP2途径功能有效量的ABCB1抑制剂，以在所述对象中治疗所述癌症，其中：

i)所述癌症包含癌细胞，并且所述癌细胞表达可忽略不计的ABCB1或不表达ABCB1；或

ii)所述方法还包括在所述施用步骤之前检测ABCB5+干细胞的存在；或

iii)其中所述ABCB1抑制剂是泵抑制剂，并且所述癌症不同时用化学治疗剂治疗；或

iv)所述方法还包括在施用所述组合物之后评估ABCB5-PIP2结合。

73.权利要求72所述的方法，其中所述对象在基因编辑之前具有与所述癌症相关的ABCB+干细胞，其为ABCB5纯合同种型2K525/K525。

74.权利要求72或73所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤或胶质母细胞瘤。

75.用于表征癌症的方法，其包括：

从对象中分离癌细胞，确定所述癌细胞是否是ABCB5纯合同种型2K525/K525、ABCB5纯合同种型2E525/E525或ABCB5杂合同种型2K525/E525，以表征所述癌症。

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