CN112423649A - 胎儿组织提取物、其生产方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了能够有效预防或治疗肌肉病症或疾病的胎儿组织提取物。
Description
发明领域
本公开总体上涉及医疗产品、其生产方法及其用途。本公开更具体地但非排他性地涉及用于预防或治疗肌肉损伤或衰老相关的肌肉病症或疾病的来自胎儿或新生动物的提取物。
发明背景
肌肉系统是人体内最大的蛋白质储库,占总体重的高达45%,并有助于维持基本的代谢和功能活性。在人体中有三种肌肉:骨骼肌、心肌和平滑肌。肌肉病症或疾病包括但不限于肌病、肌肉损伤、纤维肌痛、慢性疲劳综合征、多肌炎、慢性间隔综合征、艾萨克氏综合征、横纹肌溶解、肌营养不良、肯尼迪氏病,将负面影响人类健康。衰老相关的肌肉病症或疾病在公众中,特别是在老年人中引起更多的关注。衰老相关的肌肉病症或疾病之一是肌肉减少症,其是衰老的内在“肌病”。
根据联合国报告的世界人口老龄化2015 (World Population Ageing 2015),世界人口正在老龄化。全球老龄的人口,年龄在60岁或以上,在规模上到2050年将达到两倍以上,达到21亿的惊人数量。衰老过程与身体组成的许多变化相关。从25岁到80岁,肌纤维的尺寸和数量逐渐减少30% (1)。由Irwin Rosenberg第一次引入的肌肉减少症是普遍衰老相关的肌肉质量、力量和功能下降,其影响10%的男性(95% CI:8-12%)和女性(95% CI:8-13%)。Meta分析表明肌肉减少症与较高的死亡率、肌肉功能下降、较高的跌倒率和较高的住院发生率相关(2)。流行病学研究表明肌肉衰老与许多退行性病症相关(3,4)。对开发有效方法以对抗肌肉减少症的影响以便维持功能独立性或“积极老龄化”的科学和公众关注在不断增长。
发明概述
本领域中第一次发现来源于胎儿组织的提取物可有效预防或治疗衰老相关的肌肉病症或疾病。
因此,在第一方面,本公开涉及胎儿组织提取物、通过将胎儿组织提取物给予有需要的受试者而用于预防或治疗肌肉病症或疾病的方法以及胎儿组织提取物的用途。
在本公开的第二方面,其涉及用作药物(例如用于肌生成)的胎儿组织提取物。
在本公开的第三方面,其涉及从胎儿或新生动物的一种或多种组织获得的提取物,其用作预防或治疗肌肉病症或疾病的药物。
在本公开的第四方面,其涉及包含所述提取物的植入物。
在本公开的第五方面,其涉及包含所述提取物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在本公开的第六方面,其涉及生产提取物的方法,其包括以下步骤:
a. 从所定义的胎儿或新生动物收集组织;
b. 使收集的组织均质化,以获得匀浆;
c. 过滤和/或离心匀浆以获得上清液流体(下文中也称为“滤液”);以及
d. 进一步纯化/处理滤液以获得胎儿组织提取物的最终产物。
在本公开的第七方面,其涉及通过给予提取物、植入物或药物组合物来预防或治疗肌肉病症或疾病的方法。
在本公开的第八方面,其涉及提取物、植入物或药物组合物在制造预防或治疗肌肉病症或疾病的药物中的用途。
在本公开的第九方面,其涉及提取物、植入物或药物组合物在制造预防或治疗肌肉病症或疾病的保健产品中的用途。
前述是概述,并因此必然包含细节的简化、概括和省略;因此,本领域技术人员将理解,本概述仅是说明性的,而不旨在以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其它主题的其它方面、特征和优点将在本文所述的教导中变得显而易见。提供本概述以便以简化的形式介绍概念汇集,其将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定要求保护的主题的关键特征或必要特征,也不旨在用于帮助确定要求保护的主题的范围。此外,本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。
附图的描述
图1显示通过MTT试验FSME对C2C12细胞成活力的影响。
图2A显示D-Gal对C2C12细胞成活力的影响,以及图2B显示FSME对D-Gal处理的C2C12细胞的影响。
图3显示FSME对HSMM细胞成活力的影响。
图4A显示FSME对生肌前体标志物表达的影响,以及图4B显示FSME对骨骼肌标志物表达的影响。
图5显示FSME对HSMM细胞的生肌前体标志物的影响。
图6显示FSME对C57小鼠中肌肉再生的影响,其通过氯化钡诱导的胫骨前肌肌肉损伤后幼年C57小鼠的总握力来证明。
图7A显示FSME对C57小鼠中生肌前体标志物表达的影响,以及图7B显示FSME对氯化钡诱导的肌肉损伤后幼年C57小鼠的骨骼肌标志物表达的影响。
图8显示FSME对C57小鼠中肌肉再生的影响,其通过氯化钡诱导的胫骨前肌和腓肠肌两者的肌肉损伤后幼年C57小鼠的总握力来证明。
图9显示FSME对C57小鼠中肌肉再生的影响,其通过光学显微术测量。
图10显示FSME对老龄C57小鼠中肌肉再生的影响,其通过总握力测试证实。
图11A显示FSME对老龄C57小鼠中生肌前体标志物表达的影响,以及图11B显示FSME对老龄C57小鼠中骨骼肌标志物表达的影响。
发明的详细描述
在描述本发明之前,应理解本发明不限于所述的特定方法(下文中也称为“方法(process)”)和实验条件,因为这样的方法和条件可以变化。还应理解,本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,而不是旨在限制,因为本发明的范围仅将被所附权利要求书限制。
除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。如本文所用,术语“约”当用于提及具体列举的数值时,是指该值可与列举的值变化不超过10%。
虽然与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践中,但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用以其整体并入。通过阅读随后的详细描述,其它实施方案将变得显而易见。
为了可以完全理解本文所述的发明,提出了以下详细描述。
本公开涉及胎儿组织提取物、含有该提取物的植入物、含有该提取物的药物组合物、生产该提取物的方法以及该提取物、植入物和药物组合物的医疗用途。
胎儿或新生动物
组织的来源或供体动物是指从其获得胎儿组织的动物。所述来源或供体动物优选是哺乳动物,更优选绵羊、山羊、猪、大鼠或小鼠。
在本公开的上下文中,动物是胎儿或新生动物。
如本文所用,胎儿是胎生生物体产前发育的阶段。“胎儿”对不同动物指的是不同时间段。例如,对于绵羊,胎儿阶段在受精后四周开始时开始。在一个实施方案中,动物是12-18周胎儿绵羊,例如16周胎儿绵羊。例如,“16周胎儿绵羊”是指妊娠的16周绵羊。优选地,绵羊不含特定的一种或多种病原体。
提取物的接受者是指接受细胞或提取物的动物。接受者优选是哺乳动物。该动物可以是适于接受细胞或提取物或需要接受或提取物的任何动物。
在一个实施方案中,接受者是绵羊、山羊、猪、大鼠或小鼠。
在另一个实施方案中,接受者是人。
在又一个实施方案中,接受者对于供体动物是同种异体的或异种的。在具体的实施方案中,接受者对于供体动物是异种的。
来自胎儿或新生动物的一种或多种组织的提取物
本公开还涉及来自胎儿或新生动物的一种或多种组织的提取物。
在具体的实施方案中,提取物是肌肉提取物,例如,绵羊肌肉提取物,更具体地,胎儿绵羊肌肉提取物(“FSME”)。
“提取物”、“分离物”或“组织提取物”在本文中可互换使用,是指通过提取胎儿或新生动物的部分组织或全部组织而获得的复合物。通常使用的提取溶剂包括水或生理盐水,例如PBS。在本公开的一个实施方案中,溶剂是PBS。在一些实施方案中,提取物不含细胞或者基本上不含细胞。
“组织”可以包括但不限于肌肉组织或肌肉骨骼组织。在一些实施方案中,来自胎盘的组织不包括在本公开的上下文中。
在一些实施方案中,所述组织是肌肉。肌肉是在大多数动物中发现的软组织,并且发挥产生力和运动的功能。它们主要负责维持和改变姿态、运动以及器官的移动。
在一些实施方案中,所述组织是骨骼肌、心肌或平滑肌。在具体的实施方案中,所述组织是骨骼肌。
该提取物可通过以下方法生产,其包含以下步骤:
a. 从胎儿或新生动物收集组织;
b. 使收集并切割的组织均质化,以获得匀浆;
c. 任选地,过滤和/或离心匀浆以获得滤液;以及
d. 任选地,进一步纯化/处理滤液以获得由胎儿组织提取物组成的最终产物。
在一个实施方案中,步骤(c)中的“过滤”可以使用具有所需孔径的无菌过滤器进行。例如,步骤(c)中的“过滤”可以使用能够去除碎片的过滤器(例如,细胞滤网)进行。例如,过滤器的孔径为约60-80 µm。
在一个实施方案中,步骤(d)中的“纯化”可以使用能够去除活细胞并保留生物活性组分的过滤器进行。例如,过滤器可以是灭菌过滤器,其孔径为约<= 0.22 μm。
在一个实施方案中,组织是从剖腹产术后的新生动物中立即收集的。
在另一个实施方案中,匀浆是使用磷酸盐缓冲盐水制备的。
在又一个实施方案中,离心在4℃下以5000g进行15分钟。
在又一个实施方案中,使用细胞滤网进行过滤。在还进一步的实施方案中,将提取物保持在液氮中直至使用。
在具体的实施方案中,生产提取物的方法包括以下步骤:
a. 从所定义的胎儿或新生动物收集组织;
b. 使收集的组织均质化,以获得匀浆;
c. 通过70 µm过滤器(下文也称为“细胞滤网”)过滤以去除碎片和/或离心匀浆以获得滤液;以及
d. 将滤液进一步通过0.22 µm灭菌过滤器纯化/处理以去除活细胞和细菌,以获得提取物。
本公开的提取物至少在以下方面是有效的:
-促进成肌细胞增殖;
-减轻成肌细胞老化;
-促进成肌分化;以及
-改善肌肉力量。
生产提取物的典型程序
生产目标提取物的典型方法可以包括以下程序:
-动物收获;
-组织收集;
-组织处理;以及
-任选地,产物测试。
该程序可以进行改变/修正以进行优化,这取决于未来研究的目的。
当供体动物是没有特定病原体的胎儿绵羊(SPF绵羊)时,“动物收获”可包括:
-SPF怀孕绵羊从SPF农场运输到cGMP生产区域;
-得到许可的兽医麻醉怀孕绵羊;
-得到许可的兽医在无菌条件的动物手术室中通过剖腹产获得绵羊胎儿。
“组织收集”可包括:
-由操作人员收集胎儿,立即清洁并运送到B类生产区域;
-解剖绵羊胎儿以获得相应的组织;
-清洗组织并将组织运送到A类层流;
-在置于冰/冰垫上的玻璃培养皿上将组织切割/过筛/研磨成<0.5 cm3的块。
“组织处理”可包括:
-将组织通过Glas-Col机动化匀浆器在1600rpm下进行均质化30-120s;
-使匀浆通过纱布过滤器;
-滤液收集,用于细胞计数/成活力测量
-产品制剂
-显微镜下产品检查
-样品存档,用于将来分析。
植入物
本文可互换使用的“植入物”或“胎儿组织植入物”被植入接受者的目标区,以改善接受者的病理生理状态。具体地,植入物能够预防或治疗接受者的肌肉病症或疾病。
在一个实施方案中,植入物是同种异体的或异种的植入物,优选是异种的植入物。
药物组合物
药物组合物可包含本公开的胎儿组织提取物,以及任选地药学上可接受的赋形剂。
制剂中包含的赋形剂根据不同的目的(例如给药模式)进行选择。通常使用的赋形剂的实例包括而不限于:盐水、缓冲盐水、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合、稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲剂和防腐剂、张度剂、填充剂和润滑剂。
引起治疗效果的提取物的量可以由本领域技术人员根据多种因素通过实验确定,所述因素包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食(包括例如受试者是处于禁食状态还是进食状态)、给药时间、排泄率、药物组合和给药形式。通常可以滴定治疗剂量以优化安全性和功效。通常,来自体外和/或体内测试的剂量-效应关系最初可提供关于受试者给药的适当剂量的有用指导。
在一些实施方案中,可以根据已知方法将药物组合物给予受试者,例如静脉内给药,例如作为推注或通过在一段时间内连续输注,通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。在具体的实施方案中,药物组合物经肌肉内给予。
在本公开的另一个实施方案中,本公开的药物组合物是固体剂型的形式,例如片剂(包括但不限于可吞咽片剂、可咀嚼片剂、悬浮片剂等)、胶囊、囊片、锭剂、糖锭剂、散剂、颗粒剂等。
病况、病症和疾病
本公开的来自胎儿或新生动物的提取物可用于预防或治疗肌肉病症或疾病,和/或增强肌生成。
肌肉病症或疾病包括但不限于肌病、肌肉损伤、纤维肌痛、慢性疲劳综合征、多肌炎、慢性间隔综合征、艾萨克氏综合征、横纹肌溶解、肌营养不良、肯尼迪氏病等。
肌病通常指多种类型的骨骼肌疾病。衰老相关的肌肉病症或疾病之一是肌肉减少症,其是衰老的内在“肌病”。在一些实施方案中,肌肉病症或疾病是肌肉减少症。
肌肉减少症是以骨骼肌质量和功能的损失为特征的病况。尽管它主要是老年人的疾病,但它的发展可能与不是专门在老年人中见到的病况相关。肌肉减少症是以骨骼肌质量和力量的进行性和全身性损失为特征的综合征,并且它与身体残疾、差的生活质量和死亡严格相关。肌肉减少症的危险因素包括年龄、性别和身体活动水平(5)。
肌肉损伤或肌肉损害可涉及肌肉、肌纤维或其附着的腱通过肌肉劳损、牵拉或撕裂而造成的损害。肌肉损伤的症状包括:(1)由于损伤引起的肿胀、挫伤或发红;(2)休息时的疼痛,(3)当使用特定肌肉或与该肌肉相关的关节时的疼痛;(4)肌肉或腱无力;(5)根本不能使用肌肉。在一些实施方案中,肌肉损伤是骨骼肌损伤。损伤可以是化学损伤或物理损伤。在某些实施方案中,肌肉损伤是对骨骼肌的化学损伤(例如BaCl2诱导的损伤)。在一个具体的实施方案中,肌肉损伤是对胫骨前肌的化学损伤(例如BaCl2诱导的损伤)。在又一个具体的实施方案中,肌肉损伤是对胫骨前肌和腓肠肌的化学损伤(例如BaCl2诱导的损伤)。
肌生成是肌肉组织的形成,特别是肌纤维的形成。肌纤维通常形成成肌细胞至称为肌管的多核纤维的融合。在一些实施方案中,本公开的来自胎儿或新生动物的提取物可用于肌生成。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何生产和使用本发明的完整公开和描述,并且不旨在限制发明人认为其发明的范围,其也不旨在表示以下实验是所进行的所有或唯有的实验。
实施例1:胎儿绵羊组织提取物(“FSME”)的制备
动物。在本实施例中,胎儿动物是16-18孕周胎儿绵羊。将胎儿绵羊肌肉用于FSME的制备。
肌肉组织的收集和处理。骨骼肌组织是在剖腹产术后立即从胎儿收集的。称重肌肉组织并在4℃下储存直至处理。在制备室中,在去除脂肪和结缔组织后,在冰浴上将肌肉组织切成小块,并随后用于FSME的制备。
FSME的制备。然后用匀浆器使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)从肌肉组织制备匀浆。将匀浆通过无菌纱布拭子过滤,并在4℃下以5000g离心15分钟,接着通过无菌的70µm和0.22µm过滤器过滤以去除碎片/污染物并用于灭菌。粗制的和过滤的FSME中的蛋白质含量使用BCA试剂盒根据制造商的说明进行测量。FSME保持在-20℃直到进一步使用。
体外和体内实验的FSME的稀释。对于细胞实验(体外实验,实施例2-6),在使用前将0.5mg/ml的无菌FSME (1)稀释100倍至5000 ng/ml的工作浓度。而对于动物研究(体内实验,实施例7),使用5mg/ml的工作浓度(每肢100μl)并用无菌PBS稀释。
实施例2:FSME对C2C12细胞成活力的影响
C2C12细胞。从ATCC获得鼠成肌细胞细胞系(ATCC CRL-1772)并将其用作C2C12细胞。
细胞培养。将C2C12细胞在补充有10% (v/v)胎牛血清(FBS)的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基中进行培养,并在37℃下在5% CO2中孵育。当汇合达到80%时,通过使用0.05%胰蛋白酶溶液进行传代培养。
MTT试验
FSME对C2C12细胞的细胞毒性影响通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)试验来确定。MTT基于细胞中的氧化磷酸化(“oxphos”)过程而起作用。如果细胞是活的且有活性的,它们的线粒体,即细胞内“动力室”,是有活性的,其将通过一系列氧化和磷酸化过程向细胞提供能量。换句话说,细胞增殖/成活力越大,颜色越深,并且吸光度越高。
如通过琥珀酸脱氢酶活性所反映的,通过MTT试验确定细胞成活力。将C2C12细胞(1×103/孔)接种在96孔微板中。用FSME孵育24小时、48小时或72小时后,向每个孔中添加3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT,100 μl,0.5 mg/ml),并将板在37℃孵育3小时。去除用于细胞培养的Dulbecco改良的Eagle培养基,并用100 μl MTT增溶溶液、10% Triton X-100、加0.1N HCl/无水异丙醇代替,以溶解甲臜晶体。使用微板阅读器通过测量570 nm处的吸光度,经由分光光度计定量细胞成活力。
结果:浓度在0.976 ng/mL到1000 ng/mL之间的FSME能够促进C2C12细胞增殖和成活力(图1)。
实施例3:FSME对D-Gal处理的C2C12细胞的影响
已知用D-半乳糖(“D-Gal”)处理细胞在体内小鼠和大鼠模型中生产活性氧物类,并且这些模型用于模拟衰老表型。在本实施例中,使用D-Gal建立了C2C12成肌细胞老化模型。通过MTT试验确定C2C12成活力。
C2C12细胞。从ATCC获得鼠成肌细胞细胞系(ATCC CRL-1772)并将其用作C2C12细胞。
细胞培养。将C2C12细胞在补充有10% (v/v)胎牛血清(FBS)的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基中进行培养,并在37℃下在5% CO2中孵育。当汇合达到80%时,通过使用0.05%胰蛋白酶溶液进行传代培养。
MTT试验
如通过琥珀酸脱氢酶活性所反映的,通过MTT试验确定细胞成活力。
使用D-Gal建立C2C12成肌细胞老化模型。将C2C12细胞(1×103/孔)接种在96孔微板中。用D-Gal孵育24小时、48小时或72小时后,向每个孔中添加3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT,100 μl,0.5 mg/ml),并将板在37℃孵育3小时。去除用于细胞培养的Dulbecco改良的Eagle培养基(“DMEM”),并用100 μl MTT增溶溶液、10% TritonX-100、加0.1N HCl/无水异丙醇代替,以溶解甲臜晶体。使用微板阅读器通过测量570 nm处的吸光度,经由分光光度计定量细胞成活力。
结果:使用D-Gal建立了C2C12成肌细胞老化模型。浓度为25 mM、50 mM和100 mM的D-gal能显著降低C2C12成活力(图2A)。
FSME对D-Gal处理的C2C12细胞的影响。将1000个C2C12细胞接种到96孔板的每个孔中,并在有5% CO2的37℃加湿孵育箱中,在补充10% (v/v) FBS的高葡萄糖DMEM中培养。一旦细胞附着,将含有特定浓度的D-gal和FSME的培养基添加到C2C12细胞。每24h用含有D-gal和FSME的新鲜培养基代替培养基。通过将细胞与添加到有细胞的培养基中的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓盐溶液孵育3小时,直至通过吸收波长设定在570nm和690nm的分光光度计分析,确定细胞成活力。
结果:FSME能够减轻D-gal诱导的C2C12老化。通过MTT试验确定了C2C12成活力。浓度在62.5 ng/mL - 1000 ng/mL之间的FSME能够减轻C2C12老化(图2B)。
实施例4:FSME对HSMM细胞成活力的影响
HSMM细胞。从Lonza (LONZA, CC-2580)获得人骨骼肌成肌细胞(“HSMM”)。
细胞培养。将细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)的SkGMTM-2骨骼肌细胞生长培养基-2 BulletKitTM中进行培养,并在37℃下在5% CO2中孵育。当汇合达到80%时,通过使用0.05%胰蛋白酶溶液进行传代培养。
MTT试验
如通过琥珀酸脱氢酶活性所反映的,通过MTT试验确定细胞成活力。
将HSMM (1×104/孔)接种在96孔微板中。用FSME孵育后,向每个孔中添加3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT,100 μl,0.5 mg/ml),并将板在37℃孵育3小时。去除用于细胞培养的培养基,并用100 μl MTT增溶溶液、10% Triton X-100、加0.1NHCl/无水异丙醇代替,以溶解甲臜晶体。使用微板阅读器通过测量570 nm处的吸光度,通过分光光度计定量细胞成活力。没有FSME处理的细胞作为对照。
结果:FSME能够促进HSMM成活力和增殖。如通过MTT试验所评估的,浓度在0.975ng/mL到1000 ng/mL之间的FSME能够促进HSMM成活力和增殖(图3)。
实施例5:FSME对C2C12细胞成肌分化的影响
C2C12细胞。从ATCC获得鼠成肌细胞细胞系(ATCC CRL-1772)并将其用作C2C12细胞。
细胞培养。将C2C12细胞在补充有10% (v/v)胎牛血清(FBS)的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基中进行培养,并在37℃下在5% CO2中孵育。对于C2C12分化,将3×104个细胞接种在6孔板中,并在生长培养基中培养至达到70-80%的汇合(第0天)。然后用补充有2% (v/v)马血清的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基代替培养基。将细胞保持在分化培养基中直到试验结束,通常在5天和7天之间。
FSME对C2C12细胞成肌分化的影响。每两天监测肌管形成。监测的时间点分别为0小时、24小时、3天(“3D”)、5D和7D。收集细胞,通过Trizol试剂分离总RNA,并随后进行实时PCR。用RT-qPCR确定生肌前体标志物(Pax3、Pax7和FABP3)和骨骼肌标志物(MyoD、MyoG和MyoS)的表达水平。
结果:如图4A中所示,FSME促进了C2C12细胞中的生肌前体标志物FABP3和PAX7的表达。10 ng/mL-1000 ng/mL的FSME能够显著上调生肌前体标志物。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。此外,如图4B中所示,FSME促进了C2C12细胞中骨骼肌标志物MyoD (图4B中的“MYOD”)、MyoG (图4B中的“MYOG”)和MyoS (图4B中的“MYOS”)的表达。10ng/mL-1000 ng/mL的FSME能够显著上调生肌前体标志物。**表示p<0.01,***表示p<0.001。
这些结果表明FSME在促进C2C12细胞的成肌分化中是有效的。
实施例6:FSME对HSMM细胞成肌分化的影响
HSMM细胞。从Lonza (LONZA, CC-2580)获得人骨骼肌成肌细胞(“HSMM”)。
细胞培养。在37℃下,在5% CO2中,将HSMM细胞在补充有10% (v/v)胎牛血清(FBS)的SkGMTM-2骨骼肌细胞生长培养基-2 BulletKitTM中进行培养。对于HSMM分化,将6×104个细胞接种在6孔板中,并在生长培养基中培养至达到70-80%的汇合(第0天)。然后用补充有2% (v/v)马血清的Dulbecco改良的Eagle培养基F-12代替用于细胞培养的培养基。将细胞保持在分化培养基中直到试验结束,通常在3天和5天之间。
FSME对HSMM细胞成肌分化的影响。每两天监测肌管形成。时间点为0h、24h、3D和5D。收集细胞,通过Trizol试剂分离总RNA,并随后进行实时PCR。用RT-qPCR确定生肌前体标志物(Pax3、Pax7和FABP3)的表达水平。
结果:如图5中所示,FSME促进了HSMM细胞中的生肌前体标志物FABP3、PAX7和PAX3的表达。10 ng/mL-1000 ng/mL的FSME能够显著上调生肌前体标志物。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。
这些结果表明FSME在促进HSMM细胞的成肌分化中是有效的。
实施例7:FSME对C57小鼠中肌肉再生的影响
在该实验中,进行了四批实验(批次001、002、003和004)。在本实验中使用C57小鼠作为动物模型。小鼠由CUHK的Laboratory Animal Services Centre提供。
对肌肉损伤的小鼠,特别是肌肉损伤的“幼年小鼠”(三月龄,雄性C57/6J小鼠,下文也称为“幼年C57小鼠”)进行实验的批次001和002。通过肌肉内注射氯化钡(BaCl2),然后通过腹膜内(FSME IP组)或肌肉内(FSME IM组)注射的FSME治疗(“Tx”),建立肌肉损伤模型。
对“衰老小鼠”或“老龄小鼠”(十月龄,雄性C57/6J小鼠)进行实验的批次003和004。
7.1 批次001
动物
在这批实验中使用了三月龄的雄性C57/6J小鼠(n = 10)。
化学损伤动物模型
在胫骨前肌(也称为“TA”)中使用肌肉内注射50 μl氯化钡(0.12%,在无菌PBS中)进行化学损伤。
动物的治疗
将所有小鼠平均随机分成三组:(1)PBS对照组(n = 2);(2)治疗组1,FSME IM组(n =4);和(3)治疗组2,FSME IP组(n = 4)。用异氟烷麻醉小鼠,以及两个治疗组在第2天接受腹膜内(i.p.)或TA肌肉内(i.m.)单剂量注射FSME (100 μl, 5 mg/ml),而囊泡组注射100 μl无菌PBS。在实验终点之前的任何时间没有动物变得严重患病或死亡。
全身和前肢握力测试
使用握力计测量全身和前肢的握力。当小鼠抓住抓取网格时,在数字力传感器上记录以牛顿计的峰值张力。稳定后将计量器重新设定为0 N,并将小鼠的尾巴缓慢向后拉。在小鼠从网格释放其整个身体的四肢或前肢时,通过计量器记录张力。每两天进行五次测量。
图6中显示了握力测试的结果。可以看出通过腹膜内或肌肉内途径给予FSME不会引起肌肉性能的差异。
FSME对肌肉损伤的幼年小鼠中成肌分化的影响
通过解剖从幼年C57小鼠中分离胫骨前肌和腓肠肌肌肉。将分离的肌肉组织在液氮中速冻并在Trizol (Invitrogen)中均质化,并根据制造商的说明分离RNA。分离的RNA样品用takara反转录试剂盒根据制造商的说明反转录成cDNA。使用Power SYBR Green PCR试剂盒(Invitrogen)和Applied Biosystem QuantStudio 12K Flexi 384 QPCR系统进行实时定量PCR (RT-qPCR)。用RT-qPCR确定生肌前体标志物(Pax3、Pax7和FABP3)和骨骼肌标志物(MyoD、MyoG和MyoS)的表达水平。
结果提供在图7A和7B中。
如图7A中所示,在幼年小鼠中,与腹膜内给药相比,通过肌肉内途径的单剂量FSME给药显著增加了生肌前体标志物Myf5 (图7A中的“MYF5”)、Pax3和Pax7。通过RT-qPCR确定基因表达。**表示p<0.01。
如图7B中所示,在幼年小鼠中,与腹膜内给药相比,通过肌肉内途径的单剂量FSME给药显著增加了骨骼肌标志物MyoD、MyoG和MyoS。通过RT-qPCR确定基因表达。*表示p<0.05,**表示p<0.01。
7.2 批次002
动物
在这批实验中使用了三月龄的雄性C57/6J小鼠(n = 9)。
化学损伤动物模型
在TA和腓肠肌两者中使用肌肉内注射50 μl氯化钡(0.12%,在无菌PBS中)进行化学损伤。
动物的治疗
将所有小鼠平均随机分成两组:(1)囊泡组,即PBS对照组(n = 4);(2)治疗组,即FSMEIM组(n = 5)。用异氟烷麻醉小鼠,以及治疗组在第2天接受在TA和腓肠肌两者的肌肉内(i.m.)每周两次注射FSME (50 μl, 5 mg/ml),而囊泡组用无菌PBS代替。在实验终点之前的任何时间没有动物变得严重患病或死亡。
全身和前肢握力测试
使用握力计测量全身和前肢的握力。当小鼠抓住抓取网格时,在数字力传感器上记录以牛顿计的峰值张力。稳定后将计量器重新设定为0 N,并将小鼠的尾巴缓慢向后拉。在小鼠从网格释放其整个身体的四肢或前肢时,通过计量器记录张力。每两天进行五次测量。
图8中显示了握力测试的结果。可以看出通过肌肉内途径每周两次给予FSME显著地改善BaCl2诱导的肌肉损伤后幼年小鼠的握力。*表示p<0.05。
光学显微术观察
通过解剖分离幼年C57小鼠腓肠肌肌肉。将分离的肌肉包埋于OCT包埋剂(Invitrogen)中并在-80℃冷冻直至切片。使用低温切片机将包埋的腓肠肌肌肉样品进行切片(横切面),厚度为10μm,并将切片固定在superfrost载玻片(Invitrogen)上。在苏木精和伊红(H&E)染色之前,通过将载玻片浸入PBS中5分钟,洗掉OCT基质,随后用H&E染色。首先将样品用Harris苏木精染色2分钟,并通过将载玻片浸入水和酸性乙醇中去除过量的苏木精。通过将切片浸入Scott自来水中1分钟来分化苏木精染色的细胞核。接着,使用1%伊红溶液复染切片3分钟,并通过将样品浸入水中去除过量的伊红。最后,通过浸入到逐渐增加浓度的醇溶液中使切片脱水,随后使用DPX封片剂进行封片。使用Leica显微镜进行光学显微术分析,并使用Image J分析进行肌纤维的周围细胞核的定量。
结果:如图9中所示,在BaCl2诱导肌肉损伤后,通过肌肉内途径每周两次给予FSME显著诱导肌肉修复。BaCl2诱导肌纤维损伤,而FSME给药诱导肌肉修复以及细胞侵润到肌肉周围。点状图表示PBS处理和FSME治疗的肌肉中肌肉周围的细胞核的平均数量。**表示p<0.01。
7.3 批次003和004
动物
在这批实验中使用了十月龄的雄性C57/6J小鼠(n = 20),其作为“衰老小鼠”或“老龄小鼠”。
动物的治疗
将所有小鼠平均随机分成两组:(1)囊泡组,即PBS对照组(n = 9);以及(2)治疗组,即FSME IM组(n = 11)。用异氟烷麻醉小鼠,以及治疗组在第0天接受在腓肠肌的肌肉内(i.m.) FSME(100 μl, 5 mg/ml)注射,而囊泡组用无菌PBS代替。来自PBS组的四只动物和来自治疗组的一只动物在实验终点之前死亡。
全身和前肢握力测试
使用握力计测量全身和前肢的握力。当小鼠抓住抓取网格时,在数字力传感器上记录以牛顿计的峰值张力。稳定后将计量器重新设定为0 N,并将小鼠的尾巴缓慢向后拉。在小鼠从网格释放其整个身体的四肢或前肢时,通过计量器记录张力。每两天进行五次测量。
结果。如图10中所示,通过肌肉内途径每周两次给予FSME持续2周的时间,显著改善了老龄小鼠的握力。*表示p<0.05。
FSME对衰老小鼠中成肌分化的影响
通过解剖从老龄C57小鼠分离衰老小鼠的腓肠肌肌肉。将分离的肌肉组织在液氮中速冻并在Trizol (Invitrogen)中均质化,并根据制造商的说明分离RNA。分离的RNA样品用takara反转录试剂盒根据制造商的说明反转录成cDNA。使用Power SYBR Green PCR试剂盒(Invitrogen)和Applied Biosystem QuantStudio 12K Flexi 384 QPCR系统进行实时定量PCR (RT-qPCR)。
用RT-qPCR确定生肌前体标志物(Pax3、Myf5和FABP3)和骨骼肌标志物(MyoD、MyoG和MyoS)的表达水平。
结果提供在图11A和11B中。
如图11A中所示,在老龄小鼠中,与溶媒组相比,通过肌肉内途径(FSME IM组)每周两次给予FSME显著增加了生肌前体标志物Fabp3、Myf5和Pax3的表达。通过RT-qPCR确定基因表达。*表示p<0.05,**表示p<0.01。
如图11B中所示,在老龄小鼠中,与溶媒组相比,通过肌肉内途径(FSME IM组)每周两次给予FSME显著增加了骨骼肌标志物MyoD和MyoG的表达。通过RT-qPCR确定基因表达。*表示p<0.05,**表示p<0.01。
从上述结果可以看出,FSME在预防或治疗肌肉病症或疾病或增强肌生成中是有效的。
具体地,FSME至少在以下方面是有效的:
-促进成肌细胞增殖;
-减轻由D-gal诱导的成肌细胞老化(潜在的体外老化模型);
-促进BaCl2诱导的肌肉损伤小鼠中的成肌分化;以及
-改善BaCl2损伤的小鼠和衰老小鼠两者的肌肉力量。
尽管已经参考本发明的具体实施方案描述了本发明,但是本领域技术人员应当理解,在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下,可以进行各种改变并且可以代替等同物。此外,可以进行许多修改以使特定的情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤适应本发明的目的、精神和范围。旨在所有这样的修改都在所附权利要求的范围内。
参考文献:
Claims (26)
1.从胎儿或新生动物的一种或多种组织获得的提取物,其用于预防或治疗受试者的肌肉病症或疾病或增强受试者的肌生成。
2.权利要求1所述的提取物,其中所述组织是一种或多种选自肌肉组织和肌肉骨骼组织的组织。
3.权利要求1或2所述的提取物,其中所述肌肉是骨骼肌、平滑肌或心肌。
4.权利要求1-3中任一项所述的提取物,其中所述动物是哺乳动物。
5.权利要求4所述的提取物,其中所述哺乳动物是绵羊、山羊、猪、大鼠或小鼠。
6.权利要求5所述的提取物,其中所述绵羊是胎儿绵羊,优选12-18孕周胎儿绵羊。
7.权利要求6所述的提取物,其中所述绵羊不含特定的一种或多种病原体。
8.权利要求5所述的提取物,其中所述提取物是胎儿绵羊肌肉提取物。
9.权利要求1-8中任一项所述的提取物,其中所述提取物对于所述受试者是异种的或同种异体的。
10.权利要求1-8中任一项所述的提取物,其中所述提取物不含细胞。
11.权利要求1-10中任一项所述的提取物,其中所述肌肉病症或疾病是衰老相关的肌肉病症或疾病,例如肌肉减少症。
12.权利要求1-10中任一项所述的提取物,其中所述肌肉病症或疾病是肌肉损伤,例如化学损伤。
13.前述权利要求中任一项所述的提取物,其中所述提取物具有以下性质中的一种或多种:
-促进成肌细胞增殖;
-减轻成肌细胞老化;
-促进成肌分化;以及
-改善肌肉力量。
14.包含权利要求1-13中任一项所述的提取物的植入物。
15.权利要求14所述的植入物,其中所述植入物是同种异体的或异种的植入物,优选异种的植入物。
16.药物组合物,其包含权利要求1-13中任一项所述的提取物和药学上可接受的赋形剂。
17.生产权利要求1-13中任一项所述的提取物的方法,其包括以下步骤:
a. 从所述胎儿或新生动物收集组织,其中所述组织和所述动物如权利要求1-13中任一项所定义;
b. 使收集的组织均质化,以获得匀浆;
c. 任选地,过滤和/或离心匀浆以获得滤液;以及
d. 任选地,进一步纯化/处理所述滤液以获得由胎儿组织提取物组成的最终产物。
18.权利要求17所述的方法,其中所述组织是从剖腹产术后的胎儿或新生动物立即收集的。
19.预防或治疗肌肉病症或疾病的方法,其通过向受试者给予权利要求1-13中任一项所述的提取物、权利要求14或15中任一项所述的植入物或权利要求16所述的药物组合物来进行。
20.权利要求19所述的方法,其中所述提取物、植入物或药物组合物通过肌肉内注射给予。
21.权利要求19或20所述的方法,其中所述肌肉病症或疾病是衰老相关的肌肉病症或疾病,例如肌肉减少症。
22.权利要求19或20所述的方法,其中所述肌肉病症或疾病是肌肉损伤,例如化学损伤。
23.权利要求1-13中任一项所述的提取物、权利要求14或15中任一项所述的植入物或权利要求16所述的药物组合物在制造用于预防或治疗肌肉病症或疾病或增强肌生成的药物中的用途。
24.权利要求23所述的用途,其中所述肌肉病症或疾病是衰老相关的肌肉病症或疾病,例如肌肉减少症。
25.权利要求23所述的用途,其中所述肌肉病症或疾病是肌肉损伤,例如化学损伤。
26.权利要求23-25中任一项所述的用途,其中所述药物为选自注射流体、胶囊、囊片、锭剂、糖锭剂、散剂或颗粒剂的形式。
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GR01 | Patent grant | ||
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