CN103209697A - 包含丝氨基酸和酪氨酸的用于预防及改善脑疾病的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含丝氨基酸及酪氨酸作为有效成分的用于预防及改善脑疾病的组合物及其制备方法。本发明的组合物对帕金森病、脑梗塞、中风或者痴呆具有显著的效果。

Description

包含丝氨基酸和酪氨酸的用于预防及改善脑疾病的组合物

技术领域

本发明涉及一种将丝氨基酸(silk amino acid)和酪氨酸(tyrosine)作为有效成分的用于预防及改善脑疾病的组合物及其制备方法。

背景技术

帕金森病(Parkinsonism或Parkinson′s disease，PD)为仅在美国就推算有50万名以上的患者的严重的脑疾病，其特征在于，随着脑黑质(substantia nigrapars compacta，SN)的多巴胺神经元(dopamine neurons)的损失，纹状体(striatum)的多巴胺(dopamine)分泌减少，从而丧失运动能力。作为现有的帕金森病标准治疗剂，使用多巴胺前体的L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-3，4-dihydroxyphenylalanine(_L-DOPA或者Levo-DOPA))，该药物虽然能够明显缓和症状，但是在长期使用时，伴随着严重的负作用。

丝(silk)为蛋白质聚合物，其构成物质、结构、成分根据昆虫的种类的不同而完全不同，作为最普遍特性化的丝来源于蚕(Bombyx mori)和蜘蛛(金丝蜘蛛(Nephila clavipes)和十字园蛛(Araneus diadematus))。丝由丝胶(sericin)和蚕丝蛋白(fibroin)的两种多肽形成，随着其化学组成被证明为纯天然氨基酸(amino acids)，提出基于该组合氨基酸的生理活性的多种功效。

本发明人在研究在没有负作用的情况下可长期用药的用于预防/治疗脑疾病的组合物的过程中，确认到将丝氨基酸与酪氨酸混合的组合物在由多巴胺及多巴胺能神经元的异常引起的运动能力障碍、多巴胺增加、神经元保护方面具有优异的效果，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供用于预防及改善脑疾病的组合物。

本发明的再一目的在于，提供用于预防及改善脑疾病的组合物的制备方法。

本发明的另一目的在于，提供包括施用上述组合物的步骤的预防和/或治疗脑疾病的方法。

解决技术问题手段

为了达成上述目的，本发明提供包含丝氨基酸和酪氨酸作为有效成分的用于预防及改善脑疾病的组合物。

并且，本发明提供包含丝氨基酸和酪氨酸作为有效成分的用于预防及改善脑疾病的组合物的制备方法、以及包括施用上述组合物的步骤的预防和/或治疗脑疾病的方法。

有益效果

本发明的组合物通过保护多巴胺能神经元或者增加多巴胺和/或其代谢产物的浓度，从而具有预防、改善或治疗脑疾病的效果。

附图说明

图1表示在将6-羟基多巴胺(6-OHDA)施用15天后的脑内黑质(SN)部位的TH阳性神经元。

图2表示在将6-OHDA施用30天后的脑内黑质(SN)部位的TH阳性神经元。

具体实施方式

本发明涉及用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物，其包含丝氨基酸(silkamino acid)和酪氨酸(tyrosine)作为有效成分。

并且，本发明提供用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物的制备方法，其包括将丝氨基酸(silk amino acid)与酪氨酸(tyrosine)混合的步骤。

进而，本发明提供预防和/或治疗脑疾病的方法，其包括施用包含丝氨基酸(silk amino acid)和酪氨酸(tyrosine)作为有效成分的组合物的步骤。

并且，本发明提供作为有效成分包含丝氨基酸(silk amino acid)和酪氨酸(tyrosine)的组合物在预防、治疗及改善脑疾病中的用途。

并且，本发明提供包含丝氨基酸和酪氨酸作为有效成分的组合物在用于制备预防、改善及治疗脑疾病的药物中的用途。

下面，对本发明进行详细说明。

本发明的丝氨基酸(silk amino acid)可以利用蚕或者蚕蛹来制备。并且，本发明的丝氨基酸可以利用丝蛋白质来制备。上述丝蛋白质可以是蚕丝蛋白和/或丝胶。上述丝氨基酸可以对蚕、蚕蛹或者丝蛋白质进行加酸水解来制备，但并不局限于此。

上述酪氨酸可以是合成酪氨酸，也可以是天然酪氨酸。并且，本发明的酪氨酸可以来源于丝、蚕茧等。但是，如果是酪氨酸，则在实施本发明上不存在问题，因此不管其来源为何都属于本发明的酪氨酸。

上述脑疾病是帕金森病、脑梗塞、中风、痴呆，但并不局限于此，只要是与多巴胺和/或多巴胺能神经元的异常相关的脑疾病都属于此。

本发明的用于预防及改善脑疾病的组合物通过增加多巴胺的浓度或者预防、迟延、保护神经元受破损，从而可以预防、治疗及改善脑疾病。并且，本发明的组合物可以恢复、改善由于脑疾病而引起障碍的身体的运动功能。

就本发明的用于预防及改善脑疾病的组合物而言，相对于100重量份的用于预防及改善脑疾病的组合物，可以包含0.01重量份至50重量份的酪氨酸，优选可以包含0.02重量份至20重量份，最优选可以包含0.02重量份至12重量份。相对于100重量份的组合物，如果酪氨酸超过50重量份，则预防/改善脑疾病的功效增加，与此相比，在混合酪氨酸与丝氨基酸时，难以均匀地混合，且混合时间也过度增加，从而整体工序的效率降低。并且，相对于100重量份的组合物，如果酪氨酸小于0.01重量份，则难以期待添加酪氨酸所产生的预防/改善脑疾病功效的增加。

本发明的用于预防及改善脑疾病的组合物可以成为药物组合物或者食品组合物。

本发明的用于预防及改善脑疾病的药物组合物可以口服或者非口服施用，能够以通常的医药制剂的形态使用。作为优选的药物制剂，包括如片剂、硬质或者软质胶囊剂、液剂、悬浮剂等之类的口服施用制剂，这些药物制剂可以使用可药用的通常的载体，例如，在口服施用制剂的情况下可以使用赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、保存剂或者增量剂等来调剂。

本发明的用于预防及改善脑疾病的药物组合物的施用量，根据患者的状态、年龄、性别及并发症等的多种因素，可以由专家决定，但是通常成人可以按如下用量施用：每1kg施用0.1mg至10g、优选施用10mg至5g。并且，使每单位剂型含有上述药物组合物的1天用量或者其1/2、1/3或1/4的用量，一天可以施用1次至6次。但是，在以健康及卫生为目的、或者以调节健康为目的而长期摄取时，上述量可以是上述范围以下，且由于有效成分在稳定性方面不存在任何问题，因而也能够以上述范围以上的量使用。

本发明的患者为脑疾病患者。本发明的患者可以是患有帕金森病、脑梗塞、中风、痴呆等疾病的患者，但并不局限于此。只要是患有与多巴胺和/或多巴胺能神经元的异常相关的脑疾病的患者都属于本发明的患者。

并且，本发明提供用于预防及改善脑疾病的食品组合物。上述食品是指健康辅助食品、健康功能食品、功能性食品等，但并不局限于此，在天然食品、加工食品、一般的食材等中添加本发明的用于预防及改善脑疾病的组合物的食品也包括在内。

就本发明的用于预防及改善脑疾病的食品组合物而言，可以将上述组合物直接添加、或者可以与其他食品或食品组合物一起使用，并且可根据通常的方法适当使用。有效成分的混合量可根据其使用目的(预防、健康或治疗性用药)来适当决定。通常，就本发明的用于预防及改善脑疾病的组合物而言，在制备食品或者饮料时，相对于100重量份的食品或者饮料，可以添加0.1重量份至70重量份，可以优选添加2重量份50重量份。上述用于预防及改善脑疾病的组合物的有效用量能够以上述药物组合物的有效用量为准来使用，但是在以健康和卫生为目的、或者在以调节健康为目的而长期摄取的情况下，可以为上述范围以下，且由于有效成分在稳定性方面不存在任何问题，因而能够以上述范围以上的量使用。

对上述食品的种类没有特别的限制。上述用于预防及改善脑疾病的食品组合物能够以如片剂、硬质或软质胶囊剂、液剂、悬浮剂等之类的口服施用制剂的形态利用，这些制剂可以使用可使用的通常的载体，例如，在口服施用制剂的情况下，可以使用赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、保存剂或者增量剂等来调剂。

作为可以添加上述用于预防及改善脑疾病的组合物的食品的例，可以举出将肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、快餐类、饼干类、披萨、方便面、其他面类、口香糖类、冰激凌类包括在内的乳制品、各种汤、饮料、茶、健康饮料、酒精饮料及维他命复合剂等，但并不局限于这些种类的食品。

具体实施方式

以下，基于以下的实施例及实验例，对本发明进行更详细的说明。但下述实施例及实验例仅例示本发明的内容，本发明的范围并不局限于实施例及实验例。

<材料>

丝氨基酸

丝氨基酸为对丝蛋白质进行加酸水解(acid hydrolysis)而得到的浅黄色的粉末，其由WorldWay(株)提供，将其保管在4℃并使用。在施用之前将根据不同浓度而不同的需要量溶解于灭菌精制水后口服施用，对于溶剂对照组，以同样的量施用相同的灭菌精制水。

体外试验(in vitro test)

<实验例1>

在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer)(pH 6.8)溶解丝氨基酸，以使最终浓度为200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、1500μg/mL及2000μg/mL，在96-孔板中分别放入70μL，添加20μL的蘑菇酪氨酸酶(mushroom tyrosinase)(2000U/mg)和10μL的10mM _L-DOPA。使其在37℃下反应30分钟之后，利用酶标仪(microplate reader)(Infinite 200，帝肯集团公司(Tecan Group Ltd.，)瑞士)，在475nm下测定吸光度并对酪氨酸酶(tyrosinase)的活性度进行比较。

其结果，显示出丝氨基酸浓度越增加，越阻碍酪氨酸酶(tyrosinase)的活性。即，丝氨基酸的浓度在200μg/mL-500μg/mL范围内时，酪氨酸酶的活性不存在显著变化，但在丝氨基酸的浓度为1000μg/mL的情况下，酪氨酸酶的活性度减少约5％，在1500μg/mL下减少约10％，而且在1500μg/mL下减少约14％(表1)。由此确认到，丝氨基酸不促进酪氨酸酶的活性。

表1

<实验例2>

实施例1至实施例6的制备

制备了将丝氨基酸与酪氨酸混合的组合物。对此具体而言，其是相对于100重量份的丝氨基酸，混合2重量份的酪氨酸的组合物(实施例1)，混合4重量份的酪氨酸的组合物(实施例2)，混合8重量份的酪氨酸的组合物(实施例3)，混合12重量份的酪氨酸的组合物(实施例4)，混合16重量份的酪氨酸的组合物(实施例5)，混合20重量份的酪氨酸的组合物(实施例6)。

多巴胺神经元培养及1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理

对在同样的条件下饲养的怀孕14-15天的SD大鼠进行颈椎脱骨致死，切开腹部并在无菌条件下分离了胚胎。从分离的胚胎的大脑切除包含黑质的腹侧中脑，来培养神经元。对于已完全除去脑膜的脑组织，用DMEM/F12(1∶1)培养液进行清洗而除去血液之后，使用小口径的巴斯德吸管来得到单离细胞并移到离心管，以700rpm进行离心分离8分钟。其后，用培养液使已沉淀的细胞重新悬浮，并反复执行2次相同的过程之后，利用10％的牛胎血清及含有2mM的谷氨酰胺、50U/ml的青霉素、50μg/ml链霉素的DMEM/F12(1∶1)培养液进行悬浮之后，在光学显微镜下测定细胞数，在60mm细胞培养板中，培养6×10⁶细胞，在96孔板中，每孔培养6×10⁴细胞。为了培养纯神经元而使用了不含血清的培养液。在开始培养18小时-20小时之后，将牛胎血清替换为添加有20μg/ml的胰岛素、40μg/ml的转铁蛋白、60mM的硒、20mM的孕酮、100μM的腐胺(putrescin)、1mM的丙酮酸盐、2mM的L-谷氨酰胺、50U/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素、0.25％的葡萄糖的DMEM/F 12(1∶1)培养液，在37℃、5％的CO2、95％空气(air)的培养箱中进行培养。培养容器用多聚赖氨酸(poly-L-lysine)(10μg/ml)涂敷并用蒸馏水清洗三次后，在去除水分之后使用。在开始培养的第四天，在规定浓度的MPP+培养液中处理24小时之后，观察对于多巴胺神经元的毒性，在对丝氨基酸、酪氨酸、实施例1至实施例6及_L-DOPA(阳性对照组)进行MPP+处理一天之前开始进行预处理，直到实验结束。

结果

在进行MPP+处理24小时之后，测定了培养神经元的多巴胺、二羟苯乙酸(DOPAC，dihydroxyphenyl acetic acid)、高香草酸(HVA，Homovanillic acid)的含量(表2)。一旦引发帕金森病，则多巴胺、二羟苯乙酸(DOIPAC)减少，且HVA减少至不能检测。虽然进行MPP+及丝氨基酸处理的组的多巴胺及DOPAC的含量增加，但并非显著的水平，而HVA显著增加。但是，就处理丝氨基酸和酪氨酸的组(实施例1至实施例6)而言，确认到多巴胺、DOPAC、HVA都显著增加。就仅处理酪氨酸的组而言，虽然多巴胺和HVA增加显著，但DOPAC反而比帕金森组减少。

表2

酪氨酸一日建议量：840mg/60kg

正常细胞的多巴胺、DOPAC、HVA含量＝100％

体内试验(In vivo test)

综合实验例2的结果来看，确认到，添加4％的酪氨酸的实施例2的组合物显著地增加多巴胺、DOPAC、HVA的含量，并且所述浓度4％为酪氨酸(tyrosine)之间也不相互聚集的最适当的浓度，以下利用实施例2的组合物来进行了体内试验。

<实验动物>

实验动物，由大韩Bio-Link(忠北阴城)提供7周龄的雄性斯普拉-道来(Sprague-Dawley，SD)大鼠，经过约一周的驯化过程之后，在体重约为200g-250g时使用。在每个大鼠用笼子(cage)收容2只动物。动物实验室的环境调节成温度为23℃±2℃、相对湿度为55±10％、换气次数为12次/小时、照明周期为12小时、照度为150Lux-300Lux。作为实验动物用颗粒(pellet)型固体饲料的Purina Rat Chow

(普瑞纳大鼠食物)从Biopia(京畿道军浦)供应而得到，关于饮水，自由摄取灭菌精制水。本实验在忠北大学实验动物研究支援中心的动物实验伦理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的许可下，根据同机构的标准作业程序(Standard Operation Procedures，SOP)来执行。

<动物模型的准备>

所有手术步骤在维持无菌状态的同时进行。用安氟醚(enfluorane)吸入麻醉大鼠，在立体定位仪(stereotaxic instrument)上进行校正之后，使用汉密尔顿注射器(Hamilton syringe)(26计量注射针(gauge needle))，将人6-OHDA(8μg)+抗坏血酸(ascorbic acid)(0.6μg)/3μl的盐水(saline)注射到右侧内侧前脑束(medial forebrain bundle)[目标坐标(target coordinates)：从前囱(bregma)开始，前后(anteroposterior，AP)，-4.0；中间外侧(mediolateral，ML)，0.8；后前位(dorsoventral，DV)，8.0mm]，从而诱发帕金森病。

<施用药物>

从诱发帕金森病的30分钟之前，将本发明的丝氨基酸、丝氨基酸及酪氨酸组合物按不同用量(50mg/kg、160mg/kg或500mg/kg)溶解于灭菌精制水(5ml/kg)后给帕金森病模型大鼠口服施用31天。酪氨酸也进行了口服施用(40mg/kg)，并将_L-DOPA(阳性对照组)注射到腹腔内(25mg/kg)。

<实验例3>爬杆试验(Pole test)

在开始试验的第15天和第30天，在施用测试物质30分钟后，将动物放在直径10mm、长度55cm的具有粗糙表面的杆的上端部，并使动物的头部朝上，测定了直到动物的头部朝下的时间，即转身时间(turning time，T_turn)和直到动物下降至底面的时间，即着陆时间(landing time，T_LA)。并且记录了，在着陆(Landing)过程中，因身体功能异常而降落的动物的比率，此时，将T_LA设为90秒。

在第15天，正常动物不存在掉落的例子，但是施用6-OHDA的帕金森病动物模型中，有33％掉落，呈现出因脑损伤引起的运动功能异常。对于从杆(Pole)的掉落而言，与将头部朝下时相比，在降到底面的途中掉落，因此掉落原因被推定为，脑损伤所引起的前肢的身体支撑力减弱。对于这种身体功能异常，实施例2的组合物施用组在施用50mg/kg及500mg/kg时并没有效果，但在采用中间用量的160mg/kg时，只有17％的动物掉落。另一方面，在仅施用丝氨基酸的组中，在所有用量都无法观察到改善的效果，在施用40mg/kg的酪氨酸的组中，仅有17％的动物掉落。尤其，施用25mg/kg的_L-DOPA(阳性对照组)的组中，不存在掉落的动物(表3)。

在施用6-OHDA后的第30天，诱发脑损伤的动物的86％在爬杆试验途中掉落，从而呈现出脑损伤进一步发展。但是，实施例2的组合物的改善效果比第15天更加增进，从而在50mg/kg和160mg/kg时，分别仅有15％和17％掉落，在500mg/kg时，呈现出与_L-DOPA(阳性对照组)相似的效果，从而不存在掉落的动物。并且，在酪氨酸施用组也只有15％的动物掉落，在_L-DOPA(阳性对照组)施用组中，与第15天同样，未观察到掉落的动物。在丝氨基酸施用组中确认到，第15天施用50mg/kg～500mg/kg时，与帕金森组相比，没有效果，但是在第30天的帕金森组的掉落率增加53％，而另一方面，丝氨基酸施用组在施用50mg/kg～500mg/kg时，掉落率最大增加16％，与帕金森组相比，掉落率增加量显著地减少。

表3

另一方面，在第15天测定作为在杆上动物将头部朝下的时间的T_turn和作为下降至底面的时间的T_LA的结果，正常动物中分别消耗了约15秒和约32秒。与此相比，在诱发帕金森病的动物中分别消耗了34秒和48秒，显著延迟了正常动物的约2倍和1.5倍。在施用实施例2的组合物时，这种身体功能异常得到显著改善，关于T_turn和T_LA，在50mg/kg时分别为14秒和46秒，在160mg/kg时分别为14秒和33秒，并且在500mg/kg时分别为15秒和31秒，用量依赖性地显著减少，在高用量时恢复到正常水平。在酪氨酸施用组中，有趣的是，在第15天几乎未出现效果，但在第30天为17秒和43秒，都显著地呈现出效果。在丝氨基酸施用组中，虽然T_turn、T_LA都比帕金森组减少，但在高用量施用组中也未减少至正常水平。在_L-DOPA(阳性对照组)施用组中，T_turn和T_LA分别为约8秒和约30秒，得到显著改善，呈现出最好的效果。

在诱发帕金森病的第30天，T_turn和T_LA分别延迟至46秒和81秒，与第15天相比呈现出更严重的身体功能异常。这种严重的身体功能异常，通过施用实施例2的组合物而整体上明显得到改善，在160mg/kg施用组中，T_turn显著减少，在50mg/kg及500mg/kg施用组中，T_LA显著减少。有趣的是，在第15天几乎没有效果的酪氨酸，在第30天显著缩短T_turn和T_LA至17秒和43秒。丝氨基酸施用组虽然缩短了T_turn和T_LA，但与酪氨酸施用组及混合酪氨酸与丝氨基酸的实施例2的组合物施用组相比，效果差。另一方面，在_L-DOPA(阳性对照组)施用组中，T_turn和T_LA分别为18秒和40秒，得到了显著改善(表4)。

表4

<实施例4>圆筒试验

将动物放入设有监控录像(CCTV)的玻璃圆筒(glass cyclider，21cm×34cm)，分析了在10次站立动作中将力气用于与诱发脑损伤的部位相同侧的前肢(ipsilateral forelimb，由于左右脑掌管身体的相反侧，因而当右脑受损时丧失左侧前肢的功能)，即右侧前肢的比率。

就在第15天拄着圆筒壁站立的动作而言，正常动物由于使用左右前肢的频度几乎相同，在进行10次的站立动作中，仅使用右侧前肢的情况记录为38％。与此相比，在利用6-OHDA损伤右脑来降低左肢的功能的诱发帕金森病的动物中，仅使用完整的右侧前肢的比率增加为68％。对于这种偏重使用右肢的情况，在施用实施例2的组合物时，用量依赖性地偏重频度得到改善，在500mg/kg施用组中为50％，而恢复至正常水平。并且，酪氨酸或_L-DOPA(阳性对照组)施用组的右侧前肢的使用也得到明显改善。另一方面，在仅施用丝氨基酸的组中，在施用50mg/kg、160mg/kg时未呈现出显著的效果，在施用500mg/kg的组中得到显著改善(表5)。

另一方面，在第30天，实施例2的组合物的效果进一步增进，不仅在高用量中，而且在160mg/kg施用组中也改善至正常对照组的水平。酪氨酸施用组而中，与第15天相比，效果反而略有减弱，_L-DOPA(阳性对照组)施用组中，与第15天相同，呈现出正常对照组水平的效果。另一方面，在丝氨基酸施用组中，第15天和第30天水平都相似(表5)。

表5

<实验例5>阿朴吗啡(Apomorphine)旋转试验(turning test)

将阿朴吗啡(0.05mg/kg)注射到皮下，利用CCTV，用1小时记录动物向脑损伤的相反侧旋转(contralateral circling)次数。此时，就旋转而言，利用CCTV，将完全旋转360度作为一次来进行记录。

在实验第15天，将0.05mg/kg的阿朴吗啡注射到皮下时，在正常动物中呈现每分钟旋转2次，另一方面，在诱发帕金森病的动物中以每分钟旋转8次，旋转次数增加4倍。通过施用丝氨基酸、酪氨酸、_L-DOPA(阳性对照组)、实施例2的组合物，用量依赖性地改善了这种旋转现象(表6)。

第30天也同样，在帕金森病诱发组中的旋转次数为每分钟5次，与正常动物的0.7次相比增加7倍以上，呈现出严重的脑损伤。这种现象在实施例2的组合物500mg/kg施用组、_L-DOPA(阳性对照组)施用组、酪氨酸施用组中显著减少到一半的水平(表6)。

表6

<实验例6>脑细胞死亡率的测定

测定身体功能的次日，即，在第16天和第31天，在施用测试物质的30分钟后，麻醉动物并进行了尸检。用冷盐水(cold saline)灌流脑组织之后，在10％的中性福尔马林(formalin)溶液中固定24小时之后，在30％的蔗糖(sucrose)溶液保管了一周。将固定的脑组织制成40μm的冰冻切片(frozen section)，以使黑质(AP-3.00～-3.16)部位露出。

为了测定含TH神经元数，对TH执行了免疫染色，以便掌握基于6-OHDA的多巴胺神经的死亡程度。为了除去存在于组织内的内源性过氧化物酶(endogenous peroxidase)，用3％的过氧化氢(hydrogen peroxide，H₂O₂)进行处理后，在室温下利用3％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)预处理120分钟。在4℃下，使组织玻片与作为一次抗体的抗TH一级抗体(anti-THprimary antibody)(兔多克隆(rabbit polyclonal)IgG，1∶100，密理博，蒂梅丘拉，美国)整夜进行反应之后，利用磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)清洗数次。再次与作为二次抗体的绿色荧光基团(greenAlexa Fluor 488)-或者红色荧光基团(redAlexa Fluor 594)(红)-共轭的羊抗兔IgG(conjugated goatanti-rabbit IgG)(1∶200，分子探针公司，尤金，美国)在室温下反应1小时，并利用PBS清洗之后进行封闭。

为了观察测试物质对于因施用6-OHDA而引起的脑内黑质(SN)部位的TH阳性神经元、即多巴胺神经元的死亡的保护效果，进行了免疫染色的结果，在正常动物中呈现细胞体明显密集，且不仅在细胞体内，还在由轴突(axons)和树突(dendrites)形成的纤维(fibers)也确认到呈现阳性反应的大量的TH(图1A)。另一方面，在诱发帕金森病的动物中，在第15天大部分的多巴胺神经元死亡，残留的细胞也呈现出轴突和树突消失的形状(图1B)。在实施例2的组合物的情况下确认到，与50mg/kg施用组(未图示)及160mg/kg施用组(图1C)相比，在500mg/kg施用组中，多巴胺神经元几乎维持正常(图1D)。另一方面，施用25mg/kg的酪氨酸和_L-DOPA(阳性对照组)的组也呈现出较好的效果(分别为图1E及图1F)。对于丝氨基酸施用组而言，在低用量中对多巴胺神经元的死亡程度未起到显著的影响，细胞保护效果虽然浓度依赖性地增加，但是与其他施用组相比效果并不好(未图示)。

施用6-OHDA后第30天也同样呈现出，与正常动物(图2A)相比，在诱发帕金森病的动物中大部分的多巴胺神经元死亡，并表现出残留细胞的轴突和树枝状突起也消失的现象(图2B)。与第15天相比，第30天在施用160mg/kg的实施例2的组合物的组中，也观察到相当好的细胞保护效果(图2C)，在高用量的500mg/kg施用组中几乎维持了正常水平(图2D)。另一方面，虽然相比施用500mg/kg的实施例2的组合物的组较低，但在酪氨酸施用组中也呈现出优秀的细胞保护效果(图2E)，在_L-DOPA(阳性对照组)施用组中也确认出较好的效果(图2F)。丝氨基酸施用组也与第15天相比，细胞保护效果有所增加，但并非显著的水平(未图示)。

为了对因施用6-OHDA而引起的多巴胺神经元(neuron)的杀灭和对其的测试物质的保护效果进行定量，计算TH阳性细胞数的结果，就400倍显微镜每视野的细胞数而言，在第15天正常动物为约210个，与此相比，在帕金森病诱发组中大大减少至约20个。就实施例2的组合物的施用组而言，在低用量(50mg/kg)中为约30个，未得到显著恢复，但在中间用量(160mg/kg)中显著恢复到55个，尤其在高用量(500mg/kg)中明显改善到约145个。与此相比，酪氨酸(40mg/kg)施用组中恢复到约115个，呈现出相当好的细胞保护效果，施用25mg/kg的_L-DOPA(阳性对照组)的施用组虽然没能达到实施例2的组合物的高用量施用组的效果，但同样呈现出显著的改善效果。另一方面，丝氨基酸施用组在低用量(50mg/kg)中未起到显著的影响，但在中间用量(160mg/kg)中显著地恢复到53个，在高用量(500mg/kg)中改善到约83个(表7)。

在第30天也同样，诱发帕金森病的动物的多巴胺神经元数约为50个，与正常动物的250个相比明显减少。对于这种6-OHDA的神经元毒性，施用低用量的实施例2的组合物时恢复到约70个，在中间用量中显著改善到约125个，尤其在高用量中恢复到约190个，从而呈现出优异的细胞保护功效。酪氨酸也呈现出优秀的保护效果，为约145个。另一方面，虽然_L-DOPA(阳性对照组)呈现出良好的效果，为约120个，但与实施例2的组合物的高用量施用组或者酪氨酸相比，发挥出相对弱的功效，丝氨基酸在高用量施用组中也细胞保护效果最低，为约102个。

表7

<实验例7>多巴胺及其分解产物浓度的分析

利用部分动物的脑组织，对于作为多巴胺及其代谢产物的3，4-二羟基苯乙酸(3，4-dehydroxyphenylacetic acid，DOPAC)和3-甲氧基-4-羟基苯乙酸酯(3-methoxy-4-hydroxyphenylacetic acid)(高香草酸(homovanillic acid，HVA)进行分析。用冷盐水(cold saline)灌流大脑组织，并迅速取出来测定重量之后，放入含有0.05％的乙二胺四乙酸二钠(disodium ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)的0.1M高氯酸(perchloric acid)(500μL)和10-5M异丙肾上腺素(isoproterenol)(50μL)进行均质化。

将均质液以12000rpm(0℃)进行离心分离20分钟之后，将上清稀释30倍，然后将10μL注入到高效液相色谱仪(high performance liquid chromatograph，HPLC)来进行分析。高效液相色谱系统(HPLC system)由溶剂输送泵(Solventdelivery pump)(Waters Model 1525)、电化学检测器(Electrochemical detector)(Waters Model 2465)及Watchers 120 ODS-BP色谱柱)(5μm，150×4.6mm)构成，作为流动相(mobile phase)使用了0.1M的水枸橼酸(citric acid monohydrate)、0.1M的乙酸钠(sodium acetate)、100μM的EDTA、0.01％的辛烷磺酸钠(sodiumoctane sulfonate，SOS)、7％的甲醇(methanol)，流速(flow rate)为1mL/min。

分析基于施用6-OHDA的脑组织内多巴胺和作为其代谢产物的DOPAC及HVA的浓度的结果，诱发帕金森病的动物与对照组相比，多巴胺减少为约45％，DOPAC减少为约25％的水平，HVA下降到可分析的水平以下。基于6-OHDA的这种多巴胺和其代谢物的降低，通过施用实施例2的组合物(500mg/kg)，从而都恢复到显著水平。酪氨酸也有效地恢复多巴胺及其代谢物的浓度，尤其25mg/kg的_L-DOPA(阳性对照组)将多巴胺和HVA恢复到正常水平以上。但是丝氨基酸虽然有效地恢复HVA，而多巴胺和DOPAC的增加量并非显著的水平(表8)。

表8

产业上的可应用性

本发明的包含丝氨基酸和酪氨酸作为有效成分的用于预防及改善脑疾病的组合物，对于预防及治疗帕金森病、脑梗塞、中风或者痴呆具有优异的效果。

Claims (10)

1.一种用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物，其包含丝氨基酸和酪氨酸作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物，其特征在于，上述脑疾病为帕金森病、脑梗塞、中风或者痴呆。

3.根据权利要求1所述的用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物，其特征在于，保护多巴胺能神经元或者增加多巴胺的浓度。

4.根据权利要求1所述的用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物，其特征在于，上述组合物为药物组合物或者食品组合物。

5.根据权利要求1所述的用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物，其特征在于，上述丝氨基酸为对丝蛋白质进行酸水解而得到的产物。

6.根据权利要求1所述的用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物，其特征在于，上述组合物相对于组合物100重量份包含0.01重量份至50重量份的酪氨酸。

7.一种预防及治疗脑疾病的方法，其包括给患者施用权利要求1至6中任意一项所述的用于预防及改善脑疾病的组合物的步骤。

8.一种用于预防、治疗及改善脑疾病的组合物的制备方法，其包括将丝氨基酸和酪氨酸混合的步骤。

9.一种包含丝氨基酸和酪氨酸作为有效成分的组合物在预防、治疗及改善脑疾病中的用途。

10.一种包含丝氨基酸和酪氨酸作为有效成分的组合物在用于制备预防、改善及治疗脑疾病的药物中的用途。

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