CN112400899A - 一种菊糖与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菊糖与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用，采用灌根法将菊糖与有益菌施入土壤；其中，有益菌为菌株NJHR92，分类命名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)，2012年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，菌种保藏号为CGMCC No.6629。本发明通过资源调控的方式，同时施用有益菌和菊糖，以菊糖作为资源物质，不仅能够促进有益菌生长和拮抗竞争能力，还能显著提高有益菌对青枯菌的抑制能力，从而减少番茄青枯病的发病率，防控番茄土传病害。

Description

一种菊糖与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种资源配合有益菌防控番茄青枯病的应用，具体涉及一种菊糖和有益菌NJHR92配合防控番茄土传青枯病的应用。
背景技术
番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌)引起的一种土传病害，多发于我国东部和南部地区，可导致番茄发生不可逆的萎蔫与死亡，造成番茄严重减产。近年来，利用根际有益菌防控番茄土传病害的生物防治手段受到关注，逐渐应用在农业生产过程中。但是施用的有益菌常常无法在土壤中发挥稳定的防效，原因之一便是有益菌在根际土壤环境中缺乏合适的营养而不能有效的生长、定殖，进而影响其稳定发挥生防功能，影响了以有益菌为核心的生物制剂的广泛应用。
研究表明，添加适于有益菌生长的资源可维持有益菌发酵过程中生物量的增加，尤其是糖类物质在促进有益菌生长方面具有显著作用[1]。如人体单独摄入菊糖，可调节肠道菌群，促进肠道中有益菌的增殖(如双歧杆菌)，有效地增强人体健康[2]。但菊糖配合根际有益菌是否可抑制土传病原菌的能力尚不得知，有待进一步确定。
发明内容
本发明的目的在于针对土壤中养分有限，施用有益菌防控番茄土传病害时，有益菌往往难以在土壤中大量增殖并发挥应有防效的问题。发明人研究发现：室内微孔板系统中，菊糖可以促进有益菌NJHR92生长，显著增强有益菌的拮抗竞争能力，可显著提高有益菌对青枯菌的抑制能力；温室盆栽实验中，菊糖与有益菌NJHR92同时以灌根法施入土壤中，可降低番茄土传青枯病的病情指数。说明菊糖不仅能够促进有益菌生长，还能显著提高有益菌对青枯菌的抑制能力，从而减少番茄青枯病的发病率，防控番茄土传病害。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种菊糖与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用；其中，有益菌为菌株NJHR92，分类命名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)，2012年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，菌种保藏号为CGMCC No.6629。
菌株NJHR92具体见申请人于2018年4月26日申请的发明专利申请，发明名称为：一种功能性复合微生物育苗基质及其制备方法与应用，申请号：2018103855739，公布号：CN108676741A。
作为本发明菊糖与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用的优选技术方案，采用灌根法，同时将菊糖与有益菌施入土壤，菊糖的终浓度为0.5g/kg土～1.5g/kg土，有益菌的终浓度为1×107～1×109CFU/g土。
本发明的另一个目的是提供一种菊糖与有益菌配合防控番茄土传青枯病的方法，包括：番茄幼苗移栽7～10天后，以灌根法同时将菊糖与有益菌菌悬液加入土壤中，菊糖的终浓度为0.5g/kg～1.5g/kg土，有益菌NJHR92的终浓度为107～109CFU/g土。
所述的番茄幼苗为具有3～5片真叶的番茄幼苗。
所述的有益菌菌悬液的浓度为1×107～1×109CFU/mL。
所述的有益菌菌悬液由以下方法制得：菌株NJHR92采用NA固体培养基活化；挑取NJHR92单菌落于NA液体培养基，30℃、150～190rpm振荡培养过夜；取新鲜菌液，4000～6000rpm常温离心5～10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体，除去培养基；用无菌生理盐水调节菌液浓度为1×107～1×109CFU/mL，得到NJHR92菌悬液。
本发明的有益效果：
本发明通过资源调控的方式，同时施用有益菌和菊糖，以菊糖作为资源物质，不仅能够促进有益菌生长和拮抗竞争能力，还能显著提高有益菌对青枯菌的抑制能力，从而减少番茄青枯病的发病率，防控番茄土传病害。
附图说明
图1为菊糖对有益菌NJHR92生长的影响；其中，图1A为菊糖对有益菌NJHR92 48h生物量的影响；图1B为菊糖对有益菌NJHR92生长速率的影响。
图2为菊糖对有益菌NJHR92拮抗作用的影响。
图3为菊糖对有益菌NJHR92抑制土传青枯菌生长的影响。
图4为菊糖对番茄土传青枯病病情指数的影响。
生物材料保藏信息
菌株NJHR92，分类命名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)，2012年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，菌种保藏号为CGMCC No.6629。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
菊糖促进有益菌生长的室内效果
NA液体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母膏0.5g、去离子水1000mL，调节pH 7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。
NA固体培养基为NA液体培养基加2～3％(w/w)琼脂。
菌株NJHR92，分类名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)，菌种保藏号CGMCC No.6629。
将甘油保存的NJHR92在NA固体培养基上划线，30℃培养2d；挑取平板上的单菌落转接到NA液体培养基，30℃、170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心5min，收集菌体，用无菌生理盐水(0.85％NaCl)洗涤菌体3次，除去培养基，用无菌生理盐水调节得到浓度为1×108CFU/mL的NJHR92菌悬液，待用。
试验设置2个处理：1)、菊糖组：培养基为10％NA培养基(用无菌水将NA液体培养基稀释10倍)，加入菊糖和有益菌NJHR92，菊糖终浓度为1％(w/w)，有益菌NJHR92菌悬液接种量为1％(终浓度为1×106CFU/mL)，30℃、170rpm振荡培养48h，在酶标仪上测定OD600，考察有益菌NJHR92的生长情况。2)、对照组：只添加有益菌NJHR92，并以等体积水替代菊糖，其余操作均与菊糖组相同。
菊糖对有益菌生长的促进作用见图1和表1，结果表明，与对照组相比，菊糖可显著促进有益菌NJHR92生物量和生长速率的增加(P<0.05)。
表1、菊糖对有益菌NJHR92生物量和生长速率的影响
Figure BDA0002785848660000031
注：表中同列不同字母表示差异达到0.05的显著水平，下同。
实施例2
菊糖增强有益菌拮抗竞争能力的效果
材料：分离自南京麒麟镇的青枯菌QL-Rs1115[3]，其红色荧光蛋白标记菌株QL-RFP为本发明的模式入侵病原菌，该菌株是将红色荧光蛋白基因mCherry通过质粒pYC12转入青枯菌QL-Rs1115，可以在30μg/mL庆大霉素的NA培养基平板[4]上生长，命名为QL-RFP。有益菌NJHR92筛选自南京麒麟镇，可抑制青枯菌QL-RFP的生长。
青枯菌QL-RFP在含有30μg/mL庆大霉素的NA固体培养基上复苏。将平板置于30℃培养箱中培养2d，直至出现单菌落。挑取平板上的单菌落转接到NA液体培养基，30℃、170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心5min，收集菌体，用无菌生理盐水(0.85％NaCl)洗涤菌体3次，除去培养基，最后用无菌生理盐水调节得到浓度为1×108CFU/mL的青枯菌QL-RFP菌悬液，待用。
将甘油保存的NJHR92在NA固体培养基上划线，30℃培养2d；挑取培养基上NJHR92单菌落转接到NA液体培养基，30℃、170rpm振荡培养过夜，获得种子液。设置2个处理：1)、菊糖组：10％NA培养基(用无菌水将NA液体培养基稀释10倍)中加入菊糖和有益菌NJHR92；具体为：将有益菌NJHR92种子液接入含有菊糖(1％，w/w)的10％NA培养基中，接种量为1％(终浓度为1×106CFU/mL)，30℃、170rpm振荡培养48h。2)、对照组：10％NA培养基中只添加有益菌NJHR92，并以等体积水替代菊糖，其余操作均与菊糖组相同。取出菊糖组、对照组培养48h的菌液，分别置于离心机中，8000rpm常温离心10min，取上清液过0.22μm水系滤膜，获得各处理无菌发酵液，待用。
在96孔细胞培养板(Costar)中加入10％NA培养基178μL，加入20μL上一步获得的发酵液，再加入2μL青枯菌QL-RFP(OD600＝0.5，1×108CFU/mL)菌悬液，使QL-RFP在细胞培养板中的初始OD600值为0.005。将细胞培养板置于30℃恒温摇床，170rpm连续培养48h，用酶标仪测定光密度OD600值，判断有益菌发酵液对青枯菌QL-RFP生长的影响。
结果见图2和表2，与对照组相比，培养NJHR92时添加菊糖获得的发酵液可显著增强抑制青枯菌生长的能力，青枯菌生产量显著降低(P<0.05)。
表2、菊糖对有益菌NJHR92拮抗竞争能力的影响
Figure BDA0002785848660000041
注：表中同列不同字母表示差异达到0.05的显著水平。
实施例3
菊糖增强有益菌抑制土传青枯菌的室内效果
材料：被标记红色荧光蛋白的青枯菌QL-RFP。有益菌NJHR92筛选自南京麒麟镇，可抑制青枯菌QL-RFP的生长。
将甘油保存的有益菌NJHR92在NA固体培养基上划线，30℃培养2d；挑取平板上的单菌落转接到NA液体培养基，30℃、170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心5min，收集菌体，用无菌生理盐水(0.85％NaCl)洗涤菌体3次，除去培养基，用无菌生理盐水调节得到浓度为1×108CFU/mL的NJHR92菌悬液，待用。
青枯菌QL-RFP在含有30μg/mL庆大霉素的NA固体培养基上复苏。将平板置于30℃培养箱中培养2d，直至出现单菌落。挑取平板上的单菌落转接到NA液体培养基，30℃170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心5min，收集菌体，用无菌生理盐水(0.85％NaCl)洗涤菌体3次，除去培养基，最后用无菌生理盐水调节得到浓度为1×108CFU/mL的青枯菌QL-RFP菌悬液，待用。
试验设置2个处理：1)菊糖组：培养基为10％NA培养基(用无菌水将NA液体培养基稀释10倍)，加入菊糖、有益菌和青枯菌，菊糖终浓度为1％(w/w)，有益菌NJHR92菌悬液和青枯菌QL-RFP菌悬液接种量均为1％，30℃、170rpm震荡培养48h，在酶标仪上测定OD600和红色荧光强度mCherry(发射光：587nm，吸收光：610nm)，计算青枯菌相对生长量：log10(mCherry/OD600)。2)对照组：加入有益菌和青枯菌，并以等体积水替代菊糖，其余操作均与菊糖组相同。
结果见图3和表3，与对照组相比，菊糖可显著增强有益菌NJHR92抑制青枯菌的能力(P<0.05)。
表3、菊糖对有益菌NJHR92抑制青枯菌的影响
Figure BDA0002785848660000051
注：表中同列不同字母表示差异达到0.05的显著水平。
实施例4
菊糖增强有益菌抑制土传青枯菌的盆栽效果
将有益菌NJHR92接入NA液体培养基中，30℃、170rpm振荡培养48h。取新鲜菌液，4500rpm常温离心5min，收集菌体，用无菌的生理盐水(0.85％NaCl)洗涤菌体3次，除去培养基，最后用无菌生理盐水调节得到浓度为1.0×108CFU/mL左右的NJHR92菌悬液，待用。
将青枯菌QL-Rs1115接入NA液体培养基中，30℃、170rpm下振荡培养48h。取新鲜菌液，4500rpm常温离心5min，收集菌体，用无菌的生理盐水(0.85％NaCl)洗涤菌体3次，除去培养基，最后用无菌生理盐水调节得到浓度为1.0×108CFU/mL左右的青枯菌菌悬液，待用。
番茄品种：红矮生番茄。
番茄种子经表面消毒后，置于垫有无菌去离子水浸湿滤纸的无菌平板上，30℃催芽2d。取发芽均一的种子种植入装有灭菌基质的50孔育苗盘中。待番茄长出3片真叶后，取长势一致的幼苗移栽至6孔育苗盘中。
试验设置2个处理：1)、菊糖组：幼苗移栽7天后，采用灌根法同时将菊糖与有益菌NJHR92菌悬液均匀浇入番茄根部附近，菊糖终浓度为1g/kg土，有益菌NJHR92终浓度为107CFU/g土。7天后，同样以灌根法接入青枯菌菌悬液，其终浓度为106CFU/g土。2)、对照组：幼苗移栽7天后，以灌根法接入有益菌NJHR92菌悬液，并以等体积水替代菊糖，有益菌NJHR92终浓度为107CFU/g土。7天后，同样以灌根法接入青枯菌菌悬液，其终浓度为106CFU/g土。接入青枯菌后一旦番茄出现发病症状，开始记录发病情况。
用发病率表征番茄的发病情况，计算公式为：发病率＝发病植株数量/植株总数。
结果如图4和表4，结果表明，添加菊糖后，可显著降低番茄土传青枯病的发病率(P<0.05)，减少青枯病的发生。
表4、菊糖对有益菌NJHR92抑制番茄土传青枯病的影响
Figure BDA0002785848660000061
注：表中同列不同字母表示差异达到0.05的显著水平。
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Claims (7)

1.一种菊糖与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用；其中，有益菌为菌株NJHR92，分类命名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)，2012年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，菌种保藏号为CGMCC No.6629。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于采用灌根法将菊糖与有益菌施入土壤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于菊糖的终浓度为0.5g/kg土～1.5g/kg土。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于有益菌的终浓度为1×107～1×109CFU/g土。
5.一种菊糖与有益菌配合防控番茄土传青枯病的方法，其特征在于包括：番茄幼苗移栽7～10天后，以灌根法将菊糖与有益菌菌悬液加入土壤中，菊糖的终浓度为0.5g/kg土～1.5g/kg土，有益菌NJHR92的终浓度为1×107～1×109CFU/g土。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于有益菌菌悬液的浓度为1×107～1×109CFU/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于有益菌菌悬液由以下方法制得：菌株NJHR92采用NA固体培养基活化；挑取NJHR92单菌落于NA液体培养基，30℃、150～190rpm振荡培养过夜；取新鲜菌液，4000～6000rpm常温离心5～10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体，除去培养基；用无菌生理盐水调节菌液浓度为1×107～1×109CFU/mL，得到有益菌菌悬液。
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CN108676741A (zh) * 2018-04-26 2018-10-19 南京农业大学 一种功能性复合微生物育苗基质及其制备方法与应用
CN108676741B (zh) * 2018-04-26 2022-04-22 南京农业大学 一种功能性复合微生物育苗基质及其制备方法与应用

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