CN112375842A

CN112375842A - 一种木霉属真菌tef1分子标记基因简并引物组及其应用

Info

Publication number: CN112375842A
Application number: CN202011456879.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡枫; 伊瑞娜·杜鲁兹尼娜
Original assignee: Aoshilihua Suzhou Microbial Technology Research Institute Co ltd
Current assignee: Aoshilihua Suzhou Microbial Technology Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-02-19

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种木霉属真菌tef1分子标记基因简并引物组及其应用。本发明公开的简并引物组，针对木霉属真菌tef1分子标记基因的保守区域设计，可高效、精确、特异地进行扩增木霉属真菌tef1标记基因的有效片段，提高了扩增成功率和精确度，减少实验失败重复数，突破了依赖于tef1分子标基因记鉴定木霉属真菌的技术瓶颈。本发明公开的PCR反应体系，模板浓度需求低，检测下限为4ng/μl模板DNA，检测线低，检测结果灵敏，鉴定成功率高。本发明所述的木霉属真菌菌种鉴定方法，电泳后不需纯化可直接用于测序，鉴定效率高。所述的木霉属真菌菌种鉴定试剂盒，成分简单，操作方便，适合大量样本检测，实用性好，经济及市场价值高。

Description

一种木霉属真菌tef1分子标记基因简并引物组及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种木霉属真菌tef1分子标记基因简并引物组及其应用。

背景技术

木霉(Trichoderma spp.)是工农业生产重要的发酵和植物有益菌种，属于子囊菌门(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreales)。木霉菌因其高度环境适应性，种群多样性极高，这给菌种鉴定带来巨大挑战。目前用于木霉属真菌菌种鉴定的主要分子标记常用ITS和rpb2基因片段，以及种间差异性较高的tef1 分子标记基因。

针对木霉tef1分子标记基因不同区域设计的简并引物较多，但这些简并引物扩增时不仅存在较多非特异扩增的现象，而且相应的扩增产物在后续测序时经常性地因为产物内的连续A碱基序列导致测序失败。

现行最成功的为2003年Chaverri等人发表现有文献Chaverri Priscila，Castlebury A.Lisa，Overton E.Barrie，Samuels J.Gary.(2003) Hypocrea/Trichoderma:species with conidiophore elongations and greenconidia.Mycologia,95(6),1100–1140.中所提到的EF1-983F和EF1-2218R 引物对，但该引物对在应用时也常会出现扩增产物不特异、扩增产物冗长等一系列问题。研究发现，tef1基因由6个相对保守的外显子和5个相对多变的内含子组成，并不是整个tef1基因都具有实际意义的遗传信息(即物种分类信息) 参考价值，因而并不需要对其全长进行扩增；而只需要完整地获得第4至第5 内含子区域。而Chaverri等人发表的EF1-983F和EF1-2218R引物对在扩增时包含一段较长的第6外显子区域，这部分序列在种间高度保守，无物种分类信息参考价值。

因此，tef1分子标记基因扩增一直是掣肘木霉属真菌菌种鉴定的瓶颈之一；另一方面，由于并不是tef1整个基因都具有很高的遗传信息(即物种分类信息)参考价值，因此，并不需要对其全长进行扩增。

发明内容

本发明为了解决现有技术中真菌tef1的简并引物扩增时存在较多非特异扩增，且相应的扩增产物在后续测序时经常性地因为产物内的连续A碱基序列导致测序失败的技术问题，公开了以下技术方案：

本发明公开了一种木霉属真菌tef1分子标记基因保守区域，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述SEQ ID NO.1为第四外显子3’端，核苷酸序列为： 5’-RYRACAGCCAYGTSGACTCCGGMAAGTCKACCACCGTRAGT-3’，SEQ ID NO.2为第六外显子5’端：5’-AGACGCYCCCGGYCACCGTGAYTTCATCAAGAACATGATCACTGGTAC-3’；其中R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G，M＝A/C，K＝G/T。

本发明还公开了一种简并引物组，包括序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，所述SEQID NO.3为正向引物，核苷酸序列为：5’-RYRACAGCCAYGTSGACTC-3’；所述SEQ ID NO.4为反向引物，核苷酸序列为：5’ -GARGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3’；其中，R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G；

优选的，所述简并引物组用于扩增权利要求1所述的木霉属真菌tef1分子标记基因保守区域。

本发明公开了一种PCR反应体系，包括：模板DNA、DNA聚合酶、dNTPs、所述的简并引物组和去离子水。

可选的，所述简并引物组引物浓度为0.4μM。

可选的，所述模板DNA的终浓度为0.8-20ng/μl。

本发明公开了一种上述简并引物组或上述PCR反应体系在木霉属真菌菌种鉴定领域的应用。

本发明公开了一种木霉属真菌菌种鉴定方法，包括以下步骤：

S1使用如权利要求1或2所述的简并引物组为扩增引物或采用权利要求 3-5任一项所述的PCR反应体系，对目标菌种的tef1分子标记基因有效片段进行PCR扩增；

S2将扩增产物进行凝胶电泳；

S3将经凝胶电泳确认后的产物测序，获得tef1分子标记基因有效片段的核苷酸序列，经过比对后确定目标菌种的种属。

可选的，所述PCR扩增过程中预变性温度为94-95℃；退火温度为55-58℃，延伸温度为72℃。

可选的，包括上述的简并引物组或上述的PCR反应体系。

本发明还公开了一种上述木霉属真菌菌种鉴定试剂盒的使用方法，包括上述的木霉属真菌菌种的鉴定方法。

本发明公开了本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明公开的简并引物组，针对木霉属真菌tef1分子标记基因的保守区域设计，跳过连续A碱基序列区域，可高效、精确、特异地进行扩增木霉属真菌tef1标记基因的有效片段，即第4至第5内含子，可操作性高，极大地提高了扩增成功率和精确度，减少实验失败重复数，该引物对的扩增目标序列摒弃了不必要的冗余片段区域，显著节约了扩增过程中和后续的测序成本，突破了依赖于tef1分子标记因记鉴定木霉属真菌的技术瓶颈。

2.本发明公开的PCR反应体系，模板DNA终浓度为0.8-20ng/μl，且于4ng/ μl时即拥有理想的Ct值，模板浓度需求低，不浪费DNA模板；检测下限为4ng/ μl模板DNA，检测线低，检测结果灵敏，鉴定成功率高。

3.本发明所述的木霉属真菌菌种鉴定方法，操作简单，电泳后不需纯化可直接用于测序，鉴定效率高。本发明所述的木霉属真菌菌种鉴定试剂盒，成分简单，操作方便，适合大量样本检测，实用性好，经济及市场价值高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据本发明公开的方法获得其他的附图。

图1为本发明实施例1所述定量PCR融解曲线峰图；

图2为本发明实施例2扩增产物凝胶电泳图；

图3为本发明试验例1所设计的引物扩增产物凝胶电泳结果；

图4为本发明试验例1采用对比文件1中所供引物进行扩增的产物凝胶电泳结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

本实施例公开了一种简并引物组并且利用该简并引物组进行木霉属真菌的菌种检测，具体如下所述：

通过Primer Premier 5软件式设计引物，实验验证，重新寻找木霉属真菌 tef1分子标记基因的保守区域，根据保守区域设计简并引物组。

(1)根据木霉属中已全基因组测序完成的20种木霉Trichoderma reesei、Trichoderma parareesei、Trichoderma longibrchiatum、Trichoderma citrinoviride、Trichoderma harzianum、Trichoderma afroharzianum、 Trichodermaatrobrunneum、Trichoderma guizhouense、Trichodermavirens、 Trichoderma brevicompactum、Trichoderma pleuroticola、Trichoderma simmonsii、Trichoderma cyanodichotomus、Trichoderma erinaceum、 Trichoderma arundinaceum、Trichoderma atroviride、Trichoderma gamsii、 Trichoderma hamatum、Trichoderma asperellum、Trichodermaasperelloides 以及邻近的非木霉属真菌Escovopsis webrei、Hypomyces perniciosus，多序列比对，获得相应保守区域，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

SEQ ID NO.1为第四外显子3’端：5’

-RYRACAGCCAYGTSGACTCCGGMAAGTCKACCACCGTRAGT-3’，SEQ ID NO.2为第六外显子5’端：5’-AGACGCYCCCGGYCACCGTGAYTTCATCAAGAACATGATCACTGGTAC-3’；其中R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G，M＝A/C，K＝G/T。

根据保守区域的序列，设计简并引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4如下所示：

SEQ ID NO.3为正向引物的核苷酸序列：5’-RYRACAGCCAYGTSGACTC-3’；

SEQ ID NO.4为反向引物的核苷酸序列：5’ -GARGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3’；

其中R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G。

上述核苷酸序列由擎科生物科技有限公司合成。

(2)将来自Trichoderma reesei和Trichoderma harzianum的浓度为 400ng/μl的模板DNA进行5倍系列稀释，分别制成400ng/μl、80ng/μl、16ng/ μl、3.2ng/μl、0.64ng/μl、0.128ng/μl、0ng/μl的模板DNA，定量PCR 反应体系20μl设置如下：

其中，PCR反应液中引物终浓度为0.4μM；

SYBR premix Ex Taq采用Takara宝生物工程(大连)有限公司生产的SYBR premixEx Taq(2×，货号：RR820A)，其中包括DNA聚合酶和dNTPs。

(3)定量PCR反应步骤设置如下：

95℃预变性30s；

40个循环变性(95℃变性5s，58℃退火30s)；

融解曲线反应，采用温度55-95℃，每6s升高1℃。

试验设置3个重复，PCR仪器为Eppendorf的nexus GX2。

得到的反应结果如表1和图1所示。

(4)对扩增获得的PCR产物经凝胶电泳，其大小约650bp，无须割胶或者 PCR产物纯化操作，直接送测序公司测序，测序结果为

>Trichoderma reesei(1号样品，SEQ ID NO.5)：

CCATTGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCTTCGTTCCTTAAATCTCCAGACGCGAGCCCAATCTTTGCCCATCTGCCCAGCATCTGGCGAACGAATGCTGTGCCGACACGATTTTTTTTTTCATCACCCCGCTTTCTCC TACCCCTCCTTCGAGCGACGCAAATTTTTTTTGCTGCCTTACGAGTTTTAGTGGGGTCGCACCTCACA ACCCCACTACTGCTCTCTGGCCGCTCCCCAGTCACCCAACGTCATCAACGCAGCAGTTTTCAATCAGC GATGCTAACCATATTCCCTCGAACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCGTGG GTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGA GACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGGCAGCCATCACCTCACTGCGTCGTTGACACA TCAAACTAACAATGCCCTCACAGACGCTCCCGGCCACCG

>Trichoderma harzianum(2号样品，SEQ ID NO.6)

CCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCTTCAACTCATTTTCGCCTCGATTCTCCCTCCACATTTAATTGTGCCCGATAATTCTGCAGAGAATTTTCGTGTCGACAATTTTTCATCACCCCGATTTGCATTACCCCTC CTTTGCAGCGACGCAAATTTTTTTGGCTGTCGTTTGGTTTTAGTGGGGTTTCTCGTGCACCCCACTAG GTCACTGCTTTTTTTCTGCTTCGCTCTTACTGCCCAGCCATCATTCAACGTGCTCTGCGTCTCATCAC TTTCAGCGATGCTAACCACTTTTCCATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTA CGCTTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCTCTGTGGA AGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTCTTTCCATCAACTTCACACAGCGAT TACAAGCCAGTGCTAACAAGCAATTCACAGACGCTCCCGGCCACCG

获得tef1分子标记基因有效片段的核苷酸序列：第4至第5内含子区域，用于木霉属真菌菌种鉴定，依据tef1序列鉴定得到Trichoderma reesei为瑞氏木霉种，Trichodermaharzianum为哈茨木霉种，与预期相符。

(5)另外，由表1所示，来自Trichoderma reesei的DNA在16-400ngng/ μl，即终浓度0.8-20ng/μl时可扩增出有效片段，来自Trichoderma harzianum的DNA在80-400ng/μl，即终浓度4-20ng/μl时可扩增出有效片段， Ct值落在20-30之间。

表1定量PCR的Ct读数

(6)此外，图1中的融解曲线结果显示，融解曲线为单峰，该引物对扩增获得的PCR产物具有很好的特异性，产物单一，无非特异扩增。

(7)本实施例还提供了一种木霉菌数菌种鉴定快速检测试剂盒，包括本实施例所述的PCR反应体系，采用本实施例所述反应步骤进行操作，即得目标菌种的tef1分子标记基因的有效片段的核苷酸序列，经过测序和比对，用于目标木霉菌属菌种的鉴定。

实施例2

本实施例提供了一种利用所述简并引物组进行木霉属真菌的菌种检测的方法和试剂盒，具体如下所述：

(1)取来自不同于引物设计时的10种木霉菌株，即Trichoderma inhamatum、Trichoderma effusum、Trichoderma velutinum、Trichoderma strictipile、Trichodermahelicum、Trichoderma minutisporum、Trichoderma sinense、Trichoderma orientale、Trichoderma alni、Trichoderma gamsii，提取总DNA，稀释至80ng/μl，进行PCR扩增。

(2)20μl反应体系设置如下：0.8μl的模板DNA，10μl的2×Tolo FastPfu Premix(TOLOBIO，ref：21802-3)，1μl的正向引物，1μl的反向引物，7.2μl的去离子水；

其中正向引物和反向引物的终浓度为0.4μM。

(3)以对比文件1中的引物对EF1-983F和EF1-2218R引物对(正向引物；反向引物)为对照，进行扩增，反应步骤如下：

94℃预变性5min；

32个循环(94℃变性30s、55℃退火30s和72℃延伸1min)；

最终72℃延伸10min。

(4)结果如图4所示，产物单一、条带明亮，说明换用另一种DNA聚合酶 (即Taq酶)和另外10种木霉菌，本发明所设计的引物依旧能特异性地扩增出目标tef1分子标记基因片段。

(5)其中，M为DNA分子量标准Marker；

N为阴性对照，不加模板DNA；

1-10，分别为来自另外10种木霉菌Trichoderma inhamatum、Trichodermaflagellatum、Trichoderma velutinum、Trichoderma novae-zelandiae、 Trichodermahelicum、Trichoderma minutisporum、Trichoderma spirale、Trichoderma evansii、Trichoderma alni、Trichoderma gamsii的模板DNA。

(6)对扩增获得的PCR产物经凝胶电泳，其大小约650bp，无须割胶或者 PCR产物纯化操作，直接送测序公司测序，测序结果为：

>Trichoderma inhamatum(1号样品，SEQ ID NO.7)

CCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCTTCAACTGATTTTCGCCTCGATCCTCCCTCTACATTCAATTGAACCCGACAATTCTGAAGAGAATTTTCGTGTTCGACAATTTTTCATCACCCCGCTTTCCATTACCCCT CCTTTGCAGCGACGCAAATTTTTTTGCTGTCTGTTGGTTTTAGTGGGGTTTCTTGTGCACCCCACTAG CTCACCTGTATTTTTCTGCTTCACTCACTTCCCAGCCATCATTCAGCGTGTTCTGTGTCCTTGGTCAT TCAGCGATGCTAACCACTTTTCCATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACG CTTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCTCTGTGGAAG TTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTCTTCTTCATTAACTTCATGCTTCAATTG CAAGTCAGTGCTAACAGGCAATTCACAGACGCTCCCGGCCACCG

>Trichoderma flagellatum(2号样品，SEQ ID NO.8)

CCATTGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCTCAATCGCTTCATTTCGAGCCCCTTTGGCATTTGTGCCCAAGATCTGTCGACATGGATTCGTGTCGATAGGCCTCTTGCATCACCCCGCTTTCTCTTCCTACCCCTCCTT TGAGCGACGCAAATTTTTCTTGCTGCCTCGTCGGTTTTAGTGGGGAGTGCACATCGAGCAACCCCACT ACTGCCCTCTGCCCTCTGGCCGCTCAGCCCTCTTCCCGTGTCCAGACGACATCGCCTCTGTCTTCGTT CCGTAAACAGCGATGCTAATCAGATTCCCTTCAACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCA AGTACGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTC TGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGCATCCATCGCCTGGCCACGT CATTTGACGACACGCCACTAACAAGTACATCGCAGACGCCCCCGGCCACCG

>Trichoderma velutinum(3号样品，SEQ ID NO.9)

AGTAAGCTTTATCAACTGATTTTCGCCTCGAATCTCGATTTCCCCTTCACATTCAATTGTGCCCGACAATTCTGAAAAGAACTTTCGTGTCAATAATTTTTCGTCACCCCGCTTTCCATTACCCCTCCTTTGCAGC GACGCAAATTTTTTTGCTGTCTTTTGGTTTTAGTGGGGTTCCCTGCGCACCCCACTAGCTAACTGCTG TTCTGTGCTTCACTCACTGCCTAGCCAACTTTCAACGTGCTCTGTATTCCGTTACTTTCAACGATGCT AACCACTTTCTCATCAATAGGAAGCCGCTGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCATGGGTTCTT GACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCC CAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTCTTATTCATCAACTTGATGCAGCAATTGCAAGCCAGTGC TAACAGATATTTCATAGACGCCCCCGGCCACCG

>Trichoderma novaezelandiae(4号样品，SEQ ID NO.10)

CCATTGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCTCACTCCCTTCAATTTCGAGCCCATTTCCCATCTGGCATTCCATGCCACTGCCCAACATTCGTCGACCGGACTTCCGTGTCGACAGACGGGCTTTTCCATCATCGCCCCG CTTTCTCTTCCTACCCCTCCTTTGAGCGACGCAAAATTTTCTTGCTGCCTTTCCGTTTAAGTGGGGTG CAACTCGGGCAACCCCACCACTGCCTTCGGCTGCTCTCAGTTTTCTCTCTCCCTGTGTCTCAAGACGA TCTCTTCCTGGCCCTCAGTCGCGTCATCAATTCTCGAGCGTTCTGTTCAGCGATGCTAATCATGTTCC CCTCAACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCTTTCAAGTACGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAA GGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATG TCACCGTCATTGGTATGTTGAATCCATCGCCTCGCATCGTCAATGTCGACACAGCTCTAACAAATACC TCGCAGACGCTCCCGGCCACCG

>Trichoderma helicum(5号样品，SEQ ID NO.11)

CCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCTCAATCAACTGAATTTCACATCAATTTTCCTTTTGCACTCGATTGTGCCCGACAATTCTGAACGGAATTATCGTGTCAACACAATTTTTTTTGGCATCACCCCGCTTTCG CTTCCCATTACCCCTCCTTTGCAGCGACGCAAAATTTTTTCCCTGCTTGTCATTTTAGTGGGGGCGCA CAAGCAACCCCACCACTATCTCGTAGCTTTTTTTCCCTGCTCTATCAATTGTATCAATAGTTCAGCGA TGCTAACCACCTTTCCCTCTACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTATGCTTGGGT TCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCTCTGTGGAAGTTCGAGA CTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTCTCATTCATCGCATCCGAGTCGCATCAGTCAGCCA GTGCTAACAATAGCTTCACAGACGCTCCCGGCCACCG

>Trichoderma minutisporum(6号样品，SEQ ID NO.12)

CTACTCATTTTCTCCTTTCCATGTCATGCAATTGTGCTCGATAATTCTCTTCTGAATTTTCTTGTCCATTTTTTCTCCCACTGTCACCCCGCTTTCTCTACCTACCCCTCCTTTGGGCAGATGCAAATTTTTTTTG GTTGCCTCGTTTGGCTTTAGTGGGGGTGCTCTTTGTGTGGCAACCCCACCATTACCTACGACTACCAT TTGCTGGCCTCTCTTTTGCTCGATCTGCATTGCAATTCATTTCATCAAGCCGCGTTGCCTGCTTTATT TCATTCGTATTAATCAATGCTAACCATGTTTCCTTCAATAGGAAGCCGCTGAACTCGGCAAGGGTTCC TTCAAGTACGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGC CCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTAGGTTTTTGATCTATTCTCGCT CGCCGTATTCCCAAACTCAAAGCTAATACCAAATTTCACAGACGCTCCCGGTCACCG

>Trichoderma spirale(7号样品，SEQ ID NO.13)

CCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCTCAATCAACTGATTCTCGCCTCAATTTCCCCTTCACATTCAATTGTGCTCGACAATTCTGCACGGAATTCTCTTGTCAACAATTTTTCACCACCCCGCTTTCGCTTCCAT TACCCCTCCTTTGCAGCGACGCAAATTTTTTTGCAGCTCTAGGTTTTAGTGGGGTGCACCAGCAACCC CACCGCCGCCTATCGCTGCTTTTTGCCCTTCACTACGACTACACAGTTACTCATTTTCAACGATGCTA ACCATCTTTCCCTCAACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCTTGGGTTCTTG ACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATTGATATCGCTCTGTGGAAGTTCGAGACTCCC AAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTCTCATTTATTACCTCCATGCTACAATTGCAACTCGGTGCT AATGCAAACATTACAGACGCCCCCGGCCACCG

>Trichoderma evansii(8号样品，SEQ ID NO.14)

GAGAAGTTCGAGAAGGTAAGCTCATTTCACTGCTTTTCCCCATTCATTTTGGGCACAATTGTGTCCGACAATTCTGTTCTCAGTCTTGTCGACTTTTTTCACCCAGCATTGCGCACCCCGCTTTGCCTACCTACCC CTCCTTTGGCCCAGCAAAATTTTTCTGGCTGCCTTGTTTGGTTTTTAGTGGGGTGTCAAATTTTTGGC AGCAACCCCGCTATCGTCACTGTCCCTCCATCACCCGACACATTCTACTTGTCAATTAATTTGATTTT GGTTCATTGTACTAATCATCTTTCAATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTA TGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTGTGGA AGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTTCAGTCCGACTAGTCGATATTTCA AGACCATCATTCTAACATGCTCTTCTACAGACGCTCCCGGTCACCG

>Trichoderma alni(9号样品，SEQ ID NO.15)

GATTTTCGCCTCGATTCTCCCTTCACATCCAATTGTGCTCGATCATTCTGAAGAGAATCTTCGTGTCGACAATTTTTCACCACCCCGCTTTGGGTTACCCCTCATTTGCAGCGACGCAAATTTTTTTGCTGTCGTT TGGTTTTAGTGGGGTCCCTTGTGTACCCCACTAGCTCACTGCTTTTTTTGTGCTTCACTCTCACTGCT CAGCCATCATTCAGCGCGCTCTGTCTCTCATCATGCAGCGATGCTAACCACTTTTCCATCAATAGGAA GCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCTTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGA GCGCGGTATCACCATCGACATTGCTCTGTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTG GTATGTCTGCTACATCAACTTCATGCTGCGATTGCGAGCCAGTGCTAACAGACAATTCTCAGACGCCC CCGGCCACCG

>Trichoderma gamsii(10号样品，SEQ ID NO.16)

AGGTAAGCTAATTTCACTATTTTTATCACTACGCTTTATTGGCACAGTCGTGTGTCCGACAATCCTGTTCTCAGTCTTGTCAATTTTTTTCTCGCATCGTCACACCCCGCTCTACCTGTCTCTACCCCTCCTTTGG CACAGCAAAAATTTTCTGGCTGCCTTGTTTGGTTTTTAGTGGGGTGCCAGCTTTTTTTTTTCTGGCAA CCCCGCTAATCGCCGCTGTCCCTCATCCATCGTCTTCACAATTTGTTCACTCAATCGCATCTCATTTT CTCCGTGGTTCAATGTGCTGATCATGATTCAATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCTTT CAAGTATGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCC TCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTTAGTATCCTCATTGGCGT TTCGAAATCATGATTCTAACGTGCCACTCTACAGACGCTCCCGGCCACCG

获得tef1分子标记基因有效片段的核苷酸序列：第4至第5内含子区域，用于木霉属真菌菌种鉴定，鉴定得到Trichoderma inhamatum、Trichoderma flagellatum、Trichoderma velutinum、Trichoderma novae-zelandiae、Trichoderma helicum、Trichoderma minutisporum、Trichoderma spirale、 Trichoderma evansii、Trichodermaalni、Trichoderma gamsii，与预期相符。

(6)本实施例还提供了一种木霉菌数菌种鉴定快速检测试剂盒，包括本实施例所述的PCR反应体系，采用本实施例所述反应步骤即得目标菌种的tef1 分子标记基因有效片段的核苷酸序列，经过测序和比对，用于目标木霉菌属菌种的鉴定。

试验例1

本试验例提供了一种利用所述简并引物组进行木霉属真菌的菌种检测的方法和试剂盒，具体如下所述：

(1)取来自于引物设计时的10种木霉菌株，即Trichoderma reesei、 Trichodermalongibrchiatum、Trichoderma harzianum、Trichoderma afroharzianum、Trichodermaguizhouense、Trichoderma virens、Trichoderma pleuroticola、Trichodermaatroviride、Trichoderma asperellum、 Trichoderma asperelloides，提取总DNA，稀释至80ng/μl，进行PCR扩增。

(2)设置25μl体系如下所示：1μl的模板DNA，12.5μl的2×phanta Max Master Mix(诺维赞，ref：P515)，正向引物1μl，反向引物1μl，9.5μl 的去离子水。

其中正向引物和反向引物的终浓度为0.4μM。

(3)反应步骤如下：

95℃预变性3min；

32个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min)；

最终72℃延伸5min。

将PCR反应产物经凝胶电泳，结果如图3所示，产物单一、条带明亮，本发明设计的简并引物可特异性扩增目的菌株tef1分子标记基因有效片段的核苷酸序列；

其中，图中M为DNA分子量标准Marker；

N为阴性对照，不加模板DNA；

1-10，分别为来自设计引物时的10种木霉菌Trichoderma reesei、 Trichodermalongibrchiatum、Trichoderma harzianum、Trichoderma afroharzianum、Trichodermaguizhouense、Trichoderma virens、Trichoderma pleuroticola、Trichodermaatroviride、Trichoderma asperellum、 Trichoderma asperelloides的模板DNA。

(4)采用对比文件1中的引物替代本实施例简并引物组，其正向引物 EF1-983F序列：5’-GCYCCYGGHCAYGGTGAYTTYAT-3’；反向引物EF1-2218R序列：5’-ATGACRTGRGCRACRGTYTG-3’，以本实施例所述方法进行扩增，结果如图4所示；

其中，图中M为DNA分子量标准Marker；

N为阴性对照，不加模板DNA；

(5)对扩增获得的PCR产物经凝胶电泳，其大小约650bp，PCR产物送测序公司测序，获得tef1分子标记基因有效片段的核苷酸序列：第4至第5内含子区域，用于木霉属真菌菌种鉴定，其中3号样品测序失败、4号样品测序失败，其余样品测序成功，说明对比文件1中的引物替代本发明简并引物组并不能获得与本发明相当的试验结果，有2个样品测序失败。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所做的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 申请人奥世利华（苏州）微生物科技研究院有限公司

<120> 一种木霉属真菌tef1分子标记基因简并引物组及其应用

<130> 1

<141> 2020-12-10

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ryracagcca ygtsgactcc ggmaagtcka ccaccgtrag t 41

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

agacgcyccc ggycaccgtg ayttcatcaa gaacatgatc actggtac 48

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ryracagcca ygtsgactc 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gargtaccag tgatcatgtt cttg 24

<210> 5

<211> 515

<212> DNA

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400> 5

ccattgagaa gttcgagaag gtaagcttcg ttccttaaat ctccagacgc gagcccaatc 60

tttgcccatc tgcccagcat ctggcgaacg aatgctgtgc cgacacgatt ttttttttca 120

tcaccccgct ttctcctacc cctccttcga gcgacgcaaa ttttttttgc tgccttacga 180

gttttagtgg ggtcgcacct cacaacccca ctactgctct ctggccgctc cccagtcacc 240

caacgtcatc aacgcagcag ttttcaatca gcgatgctaa ccatattccc tcgaacagga 300

agccgccgaa ctcggcaagg gttccttcaa gtacgcgtgg gttcttgaca agctcaaggc 360

cgagcgtgag cgtggtatca ccatcgacat tgccctctgg aagttcgaga ctcccaagta 420

ctatgtcacc gtcattggta tgttggcagc catcacctca ctgcgtcgtt gacacatcaa 480

actaacaatg ccctcacaga cgctcccggc caccg 515

<210> 6

<211> 522

<212> DNA

<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)

<400> 6

ccatcgagaa gttcgagaag gtaagcttca actcattttc gcctcgattc tccctccaca 60

tttaattgtg cccgataatt ctgcagagaa ttttcgtgtc gacaattttt catcaccccg 120

atttgcatta cccctccttt gcagcgacgc aaattttttt ggctgtcgtt tggttttagt 180

ggggtttctc gtgcacccca ctaggtcact gctttttttc tgcttcgctc ttactgccca 240

gccatcattc aacgtgctct gcgtctcatc actttcagcg atgctaacca cttttccatc 300

aataggaagc cgccgaactc ggcaagggtt ccttcaagta cgcttgggtt cttgacaagc 360

tcaaggccga gcgtgagcgt ggtatcacca tcgacattgc tctgtggaag ttcgagactc 420

ccaagtacta tgtcaccgtc attggtatgt tctttccatc aacttcacac agcgattaca 480

agccagtgct aacaagcaat tcacagacgc tcccggccac cg 522

<210> 7

<211> 520

<212> DNA

<213> 烟草木霉(Trichoderma inhamatum)

<400> 7

ccatcgagaa gttcgagaag gtaagcttca actgattttc gcctcgatcc tccctctaca 60

ttcaattgaa cccgacaatt ctgaagagaa ttttcgtgtt cgacaatttt tcatcacccc 120

gctttccatt acccctcctt tgcagcgacg caaatttttt tgctgtctgt tggttttagt 180

ggggtttctt gtgcacccca ctagctcacc tgtatttttc tgcttcactc acttcccagc 240

catcattcag cgtgttctgt gtccttggtc attcagcgat gctaaccact tttccatcaa 300

taggaagccg ccgaactcgg caagggttcc ttcaagtacg cttgggttct tgacaagctc 360

aaggccgagc gtgagcgtgg tatcaccatc gacattgctc tgtggaagtt cgagactccc 420

aagtactatg tcaccgtcat tggtatgtct tcttcattaa cttcatgctt caattgcaag 480

tcagtgctaa caggcaattc acagacgctc ccggccaccg 520

<210> 8

<211> 527

<212> DNA

<213> 鞭毛木霉(Trichoderma flagellatum)

<400> 8

ccattgagaa gttcgagaag gtaagctcaa tcgcttcatt tcgagcccct ttggcatttg 60

tgcccaagat ctgtcgacat ggattcgtgt cgataggcct cttgcatcac cccgctttct 120

cttcctaccc ctcctttgag cgacgcaaat ttttcttgct gcctcgtcgg ttttagtggg 180

gagtgcacat cgagcaaccc cactactgcc ctctgccctc tggccgctca gccctcttcc 240

cgtgtccaga cgacatcgcc tctgtcttcg ttccgtaaac agcgatgcta atcagattcc 300

cttcaacagg aagccgccga actcggcaag ggttccttca agtacgcgtg ggttcttgac 360

aagctcaagg ccgagcgtga gcgtggtatc accatcgaca ttgccctctg gaagttcgag 420

actcccaagt actatgtcac cgtcattggt atgttgcatc catcgcctgg ccacgtcatt 480

tgacgacacg ccactaacaa gtacatcgca gacgcccccg gccaccg 527

<210> 9

<211> 509

<212> DNA

<213> 牛皮木霉(Trichoderma velutinum)

<400> 9

agtaagcttt atcaactgat tttcgcctcg aatctcgatt tccccttcac attcaattgt 60

gcccgacaat tctgaaaaga actttcgtgt caataatttt tcgtcacccc gctttccatt 120

acccctcctt tgcagcgacg caaatttttt tgctgtcttt tggttttagt ggggttccct 180

gcgcacccca ctagctaact gctgttctgt gcttcactca ctgcctagcc aactttcaac 240

gtgctctgta ttccgttact ttcaacgatg ctaaccactt tctcatcaat aggaagccgc 300

tgaactcggc aagggttcct tcaagtacgc atgggttctt gacaagctca aggccgagcg 360

tgagcgtggt atcaccatcg acattgccct ctggaagttc gagactccca agtactatgt 420

caccgtcatt ggtatgtctt attcatcaac ttgatgcagc aattgcaagc cagtgctaac 480

agatatttca tagacgcccc cggccaccg 509

<210> 10

<211> 566

<212> DNA

<213> 野莲子木霉(Trichoderma novaezelandiae)

<400> 10

ccattgagaa gttcgagaag gtaagctcac tcccttcaat ttcgagccca tttcccatct 60

ggcattccat gccactgccc aacattcgtc gaccggactt ccgtgtcgac agacgggctt 120

ttccatcatc gccccgcttt ctcttcctac ccctcctttg agcgacgcaa aattttcttg 180

ctgcctttcc gtttaagtgg ggtgcaactc gggcaacccc accactgcct tcggctgctc 240

tcagttttct ctctccctgt gtctcaagac gatctcttcc tggccctcag tcgcgtcatc 300

aattctcgag cgttctgttc agcgatgcta atcatgttcc cctcaacagg aagccgccga 360

actcggcaag ggttctttca agtacgcgtg ggttcttgac aagctcaagg ccgagcgtga 420

gcgtggtatc accatcgaca ttgccctctg gaagttcgag actcccaagt actatgtcac 480

cgtcattggt atgttgaatc catcgcctcg catcgtcaat gtcgacacag ctctaacaaa 540

tacctcgcag acgctcccgg ccaccg 566

<210> 11

<211> 513

<212> DNA

<213> 螺旋藻木霉(Trichoderma helicum)

<400> 11

ccatcgagaa gttcgagaag gtaagctcaa tcaactgaat ttcacatcaa ttttcctttt 60

gcactcgatt gtgcccgaca attctgaacg gaattatcgt gtcaacacaa ttttttttgg 120

catcaccccg ctttcgcttc ccattacccc tcctttgcag cgacgcaaaa ttttttccct 180

gcttgtcatt ttagtggggg cgcacaagca accccaccac tatctcgtag ctttttttcc 240

ctgctctatc aattgtatca atagttcagc gatgctaacc acctttccct ctacaggaag 300

ccgccgaact cggcaagggt tccttcaagt atgcttgggt tcttgacaag ctcaaggccg 360

agcgtgagcg tggtatcacc atcgacattg ctctgtggaa gttcgagact cccaagtact 420

atgtcaccgt cattggtatg tctcattcat cgcatccgag tcgcatcagt cagccagtgc 480

taacaatagc ttcacagacg ctcccggcca ccg 513

<210> 12

<211> 533

<212> DNA

<213> 微小木霉(Trichoderma minutisporum)

<400> 12

ctactcattt tctcctttcc atgtcatgca attgtgctcg ataattctct tctgaatttt 60

cttgtccatt ttttctccca ctgtcacccc gctttctcta cctacccctc ctttgggcag 120

atgcaaattt tttttggttg cctcgtttgg ctttagtggg ggtgctcttt gtgtggcaac 180

cccaccatta cctacgacta ccatttgctg gcctctcttt tgctcgatct gcattgcaat 240

tcatttcatc aagccgcgtt gcctgcttta tttcattcgt attaatcaat gctaaccatg 300

tttccttcaa taggaagccg ctgaactcgg caagggttcc ttcaagtacg cgtgggttct 360

tgacaagctc aaggccgagc gtgagcgtgg tatcaccatc gacattgccc tctggaagtt 420

cgagactccc aagtactatg tcaccgtcat tggtaggttt ttgatctatt ctcgctcgcc 480

gtattcccaa actcaaagct aataccaaat ttcacagacg ctcccggtca ccg 533

<210> 13

<211> 508

<212> DNA

<213> 螺旋状木霉(Trichoderma spirale)

<400> 13

ccatcgagaa gttcgagaag gtaagctcaa tcaactgatt ctcgcctcaa tttccccttc 60

acattcaatt gtgctcgaca attctgcacg gaattctctt gtcaacaatt tttcaccacc 120

ccgctttcgc ttccattacc cctcctttgc agcgacgcaa atttttttgc agctctaggt 180

tttagtgggg tgcaccagca accccaccgc cgcctatcgc tgctttttgc ccttcactac 240

gactacacag ttactcattt tcaacgatgc taaccatctt tccctcaaca ggaagccgcc 300

gaactcggca agggttcctt caagtacgct tgggttcttg acaagctcaa ggccgagcgt 360

gagcgtggta tcaccattga tatcgctctg tggaagttcg agactcccaa gtactatgtc 420

accgtcattg gtatgtctca tttattacct ccatgctaca attgcaactc ggtgctaatg 480

caaacattac agacgccccc ggccaccg 508

<210> 14

<211> 522

<212> DNA

<213> 埃文氏木霉(Trichoderma evansii)

<400> 14

gagaagttcg agaaggtaag ctcatttcac tgcttttccc cattcatttt gggcacaatt 60

gtgtccgaca attctgttct cagtcttgtc gacttttttc acccagcatt gcgcaccccg 120

ctttgcctac ctacccctcc tttggcccag caaaattttt ctggctgcct tgtttggttt 180

ttagtggggt gtcaaatttt tggcagcaac cccgctatcg tcactgtccc tccatcaccc 240

gacacattct acttgtcaat taatttgatt ttggttcatt gtactaatca tctttcaatc 300

aataggaagc cgccgaactc ggcaagggtt ccttcaagta tgcgtgggtt cttgacaagc 360

tcaaggccga gcgtgagcgt ggtatcacca tcgacattgc cctgtggaag ttcgagactc 420

ccaagtacta tgtcaccgtc attggtatgt tttcagtccg actagtcgat atttcaagac 480

catcattcta acatgctctt ctacagacgc tcccggtcac cg 522

<210> 15

<211> 486

<212> DNA

<213> 阿尔尼木霉(Trichoderma alni)

<400> 15

gattttcgcc tcgattctcc cttcacatcc aattgtgctc gatcattctg aagagaatct 60

tcgtgtcgac aatttttcac caccccgctt tgggttaccc ctcatttgca gcgacgcaaa 120

tttttttgct gtcgtttggt tttagtgggg tcccttgtgt accccactag ctcactgctt 180

tttttgtgct tcactctcac tgctcagcca tcattcagcg cgctctgtct ctcatcatgc 240

agcgatgcta accacttttc catcaatagg aagccgccga actcggcaag ggttccttca 300

agtacgcttg ggttcttgac aagctcaagg ccgagcgtga gcgcggtatc accatcgaca 360

ttgctctgtg gaagttcgag actcccaagt actatgtcac cgtcattggt atgtctgcta 420

catcaacttc atgctgcgat tgcgagccag tgctaacaga caattctcag acgcccccgg 480

ccaccg 486

<210> 16

<211> 526

<212> DNA

<213> 甘木霉(Trichoderma gamsii)

<400> 16

aggtaagcta atttcactat ttttatcact acgctttatt ggcacagtcg tgtgtccgac 60

aatcctgttc tcagtcttgt caattttttt ctcgcatcgt cacaccccgc tctacctgtc 120

tctacccctc ctttggcaca gcaaaaattt tctggctgcc ttgtttggtt tttagtgggg 180

tgccagcttt tttttttctg gcaaccccgc taatcgccgc tgtccctcat ccatcgtctt 240

cacaatttgt tcactcaatc gcatctcatt ttctccgtgg ttcaatgtgc tgatcatgat 300

tcaatcaata ggaagccgcc gaactcggca agggttcttt caagtatgcg tgggttcttg 360

acaagctcaa ggccgagcgt gagcgtggta tcaccatcga cattgccctc tggaagttcg 420

agactcccaa gtactatgtc accgtcattg gtatgtttta gtatcctcat tggcgtttcg 480

aaatcatgat tctaacgtgc cactctacag acgctcccgg ccaccg 526

Claims

1.一种木霉属真菌tef1分子标记基因保守区域，其特征在于，包括SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，所述SEQ ID NO.1为第四外显子3’端，核苷酸序列为：5’-RYRACAGCCAYGTSGACTCCGGMAAGTCKACCACCGTRAGT-3’，所述SEQ ID NO.2为第六外显子5’端：5’-AGACGCYCCCGGYCACCGTGAYTTCATCAAGAACATGATCACTGGTAC-3’；其中R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G，M＝A/C，K＝G/T。

2.一种简并引物组，其特征在于，包括序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，所述SEQ IDNO.3为正向引物，核苷酸序列为：5’-RYRACAGCCAYGTSGACTC-3’；所述SEQ ID NO.4为反向引物，核苷酸序列为：5’-GARGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3’；其中，R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G；优选的，用于扩增权利要求1所述的木霉属真菌tef1分子标记基因保守区域。

3.一种PCR反应体系，其特征在于，包括：模板DNA、DNA聚合酶、dNTPs、权利要求2所述的简并引物组和去离子水。

4.根据权利要求3所述的PCR反应体系，其特征在于，所述简并引物组引物终浓度为0.4μM。

5.根据权利要求3或4所述的PCR反应体系，其特征在于，所述模板DNA的终浓度为0.8-20ng/μl。

6.一种权利要求1所述的简并引物组或权利要求3-5任一项所述的PCR反应体系在木霉属真菌菌种鉴定领域的应用。

7.一种木霉属真菌菌种鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1使用如权利要求2所述的简并引物组为扩增引物或采用权利要求3-5任一项所述的PCR反应体系，对目标菌种的tef1分子标记基因有效片段进行PCR扩增；

S2将扩增产物进行凝胶电泳；

8.根据权利要求7所述的木霉属真菌菌种鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增过程中预变性温度为94-95℃；退火温度为55-58℃，延伸温度为72℃。

9.一种木霉属真菌菌种鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的简并引物组或权利要求3-5任一项所述的PCR反应体系。

10.一种权利要9所述木霉属真菌菌种鉴定试剂盒的使用方法，其特征在于，包括权利要求7或8所述的木霉属真菌菌种的鉴定方法。