CN112375146A - 检测Anti-CD19 CAR表达水平的抗独特性抗体及其应用 - Google Patents

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CN112375146A CN202110019987.1A CN202110019987A CN112375146A CN 112375146 A CN112375146 A CN 112375146A CN 202110019987 A CN202110019987 A CN 202110019987A CN 112375146 A CN112375146 A CN 112375146A
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Abstract

本发明提供了检测Anti‑CD19 CAR表达水平的抗独特性抗体及其应用。具体而言，本发明提供了一种特异性结合CAR抗原结合位点的抗独特型抗体，该抗体的六个CDR包括：GDFRYFSW；IDNLDSIT；RAYRYMYDPR；KVSSTSSGYY；ALN；QTFYGSELP。此抗体能够特异性评估FMC63克隆号抗体来源的Anti‑CD19 CAR基因的转染阳性率及患者给药后Anti‑CD19 CAR阳性T细胞数量在患者体内的变化规律。

Description

检测Anti-CD19 CAR表达水平的抗独特性抗体及其应用
技术领域
本发明涉及能够特异性地结合到Anti-CD19 CAR抗原识别表位的抗体及来源于该抗体的能够特异性结合Anti-CD19 CAR抗原识别表位的生物活性片段，以及它们在特异性评估CAR-T细胞药物中Anti-CD19 CAR阳性T细胞占比以及患者给药后Anti-CD19 CAR阳性T细胞在患者体内的代谢规律方面的应用。
背景技术
嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是一种基于体外改造T细胞使其表面表达特异性识别肿瘤表面抗原的受体片段的癌症免疫疗法，改造后的T细胞输入患者体内，不需要抗原递呈细胞（APC）的帮助，直接靶向体内癌细胞并发挥免疫杀伤作用。对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞。CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，因此，CAR阳性表达率是CAR-T细胞开发过程中的必检项。
检测CAR阳性表达率通常采用流式细胞法。目前有针对CAR不同结构区域的检测方法，包括针对CAR抗原结合位点的，比如CD19抗原，或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体或Protein L蛋白。其中，针对抗原结合部位的CAR阳性率检测方法因其具有更好专属性而被广泛使用。
然而目前现有的CAR检测工具普遍存在灵敏度低、非特异背景高等问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种特异性结合CAR抗原结合位点的抗独特型抗体，此抗体能够特异性评估CAR转染阳性率及患者给药后CAR阳性T细胞数量在患者体内的变化规律。
本发明通过体外构建FMC63 scFv作为免疫原、小鼠免疫、细胞融合与筛选、杂交瘤细胞亚克隆获得表达一种抗体的杂交瘤细胞株。通过实验发现，所述抗体能够特异性识别FMC63克隆号抗体来源的Anti-CD19 CAR的抗原识别位点。本发明通过杂交瘤测序获得所述抗体的核苷酸序列和氨基酸序列。
具体而言，本发明提供了一种抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段，其中该抗体的六个CDR包括：
GDFRYFSW（SEQ ID NO: 1）；
IDNLDSIT（SEQ ID NO: 2）；
RAYRYMYDPR（SEQ ID NO: 3）；
KVSSTSSGYY（SEQ ID NO: 4）；
ALN；
QTFYGSELP（SEQ ID NO: 5）。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段，其中所述来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段的三个重链CDR以及三个轻链CDR包括：
重链CDR1：GDFRYFSW（SEQ ID NO: 1）；
重链CDR2：IDNLDSIT（SEQ ID NO: 2）；
重链CDR3：RAYRYMYDPR（SEQ ID NO: 3）；
轻链CDR1：KVSSTSSGYY（SEQ ID NO: 4）；
轻链CDR2：ALN；
轻链CDR3：QTFYGSELP（SEQ ID NO: 5）。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段，其中所述抗体可以为动物源抗体，也可以为嵌合抗体或人源化抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段，其包括：
(1)一个重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO: 7所示第19-135位或全长氨基酸序列，或在这些氨基酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及
(2)一个轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO: 9所示第21-131位或全长氨基酸序列，或在这些氨基酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
另一方面，本发明还提供了编码所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段的多核苷酸。具体地，所述的多核苷酸，其包括SEQ IDNO: 6和/或SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供了含有所述多核苷酸的载体。
另一方面，本发明还提供了含有所述多核苷酸或含有所述载体的细胞。
另一方面，本发明还提供了所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段在评估FMC63克隆号抗体来源的Anti-CD19 CAR基因的转染阳性率中的应用。
另一方面，本发明还提供了所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段在评估患者给药后Anti-CD19 CAR阳性T细胞数量在患者体内的变化规律中的应用。
本发明的抗体，能够特异性结合CAR抗原结合位点。在本发明的一些具体实施方案中，ELISA和SPR验证数据表明，本发明所述抗体能特异性结合FMC63来源的Anti-CD19 CAR的抗原识别位点，并具有高亲和力的特性。流式验证数据表明，本发明所述抗体流式细胞法检测FMC63来源的Anti-CD19 CAR的表达时，表现出了高灵敏度、无非特异背景的特性。
附图说明
图1显示本发明的抗FMC63 scFv的抗体的SDS-PAGE鉴定结果。
图2显示本发明的抗FMC63 scFv的抗体的SEC-MALS鉴定结果。
图3显示本发明的抗FMC63 scFv的抗体的ELISA结合分析结果。
图4显示本发明的抗FMC63 scFv的抗体的竞争ELISA分析结果。
图5显示本发明的抗FMC63 scFv的抗体的SPR分析结果。
图6A-图6C显示本发明的抗FMC63 scFv的抗体的FACS结合分析结果。
具体实施方式
本发明的内容可以通过参考下面的实例更容易理解，除非特别指明，这些实施例是以说明的方式提供，而并非旨在限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1. 抗FMC63 scFv的单克隆抗体的制备
本实施例中，按照以下方法制备抗FMC63 scFv的单克隆抗体：
1.FMC63 scFv-KLH免疫原制备：通过基因合成方法构建可表达FMC63 scFv, His Tag的表达质粒，之后利用Invitrogen Lipofectamine 2000 转染试剂将表达质粒转染到HEK293细胞中，48小时后收获培养上清，之后通过亲和层析的方法将FMC63 scFv, His Tag纯化出来，随后将纯化的FMC63 scFv偶联上KLH载体蛋白（购自Sigma, Cat. No. H7017）。
2.小鼠免疫：FMC63 scFv偶联KLH载体蛋白作为免疫原，用FMC63 scFv-KLH免疫10只Balb/c 小鼠，采用常规免疫。常规免疫计划见表1。每次免疫7天后，用ELISA方法检测免疫动物血清，以此确定免疫应答的水平。常规免疫结束后，如果免疫动物能够达到针对免疫原的免疫应答水平（OD值>1.0，效价达到1:8,000），可进行细胞融合。
Figure 43011DEST_PATH_IMAGE001
3.细胞融合与铺板
采用电融合方法进行2次细胞融合。每次融合的所有细胞都将被铺到96孔板中。
4.筛选
•初筛：用ELISA方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对抗scFv呈阳性的上清。
•确认筛选：在进行母克隆筛选时，采用间接ELISA方法筛选所有的阳性母克隆细胞上清，同时用total human IgG 以及无关his蛋白进行反筛。
•FACS binding 筛选：把阳性克隆上清进行FACS binding筛选。期望得到有结合活性的抗体。
•FACS blocking 筛选：把有FACS结合的阳性克隆上清进行FACS blocking 筛选。期望得到有中和活性的抗体。
5.克隆扩大培养和冻存
将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养，最多10株。每个扩大培养的克隆收集2毫升上清，用于间接ELISA以及阻断FACS检测。冻存这些特异性阳性克隆细胞，以避免克隆丢失。
6.亚克隆
采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，以确保这些阳性母克隆分别来自于单个母克隆细胞，用间接ELISA或阻断FACS方法进行亚克隆筛选。在抗原识别确认的基础上，从每个母克隆中选择2个稳定的亚克隆细胞系进行低温保存。低温冻存前每个亚克隆收集5毫升上清，并对所有的亚克隆进行亚型鉴定和保存。
7.抗体生产与纯化
杂交瘤细胞扩大培养，采用蛋白质 A/G 亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液（PBS）中。
8.杂交瘤细胞抗体基因测序
提取杂交瘤细胞总RNA，通过RT-PCR反应将RNA反转录成cDNA。克隆抗体轻链和重链序列，将抗体轻链和重链序列构建到T载体上，之后进行DNA测序分析获得抗体基因序列。
本发明中，按照上述方法获得一种抗体，本发明中命名为Y45克隆号抗体，所述Y45克隆号抗体VH的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，编码其的核苷酸序列优选如SEQ IDNO: 6所示。Y45克隆号抗体VL的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，编码其的核苷酸序列优选如SEQ ID NO: 8所示。
重链氨基酸序列（SEQ ID NO: 7，下划线部分为CDR区，第1-18位氨基酸为Signalpeptide区域，第19-135位氨基酸非下划线部分为FR骨架区）：
Figure 428993DEST_PATH_IMAGE002
重链DNA序列（SEQ ID NO: 6）：
atggatttcgggctcatcttcttcatagtcgcacttcttaaaggagtgcaatgcgaagtgaaacttcttgaatcaggaggaggacttgtgcaacctggaggatcacttaaactttcatgcgcagcatcaggagattttcgctactttcagtggatgtcatgggtgagacaagcacctggaaagggcctcgaatggatcggagaaatcgacaacttagacagtataacgaagtatactccttcactaaaggacaagttcataatctcaagagataacgcaaagaatactctttaccttcaaatgagaaaggttaggtcagaagatacagcactttactactgcagagcatacagatacatgtacgatcctagatgggggcaggggacatcagtgacagtgtcatca
轻链氨基酸序列（SEQ ID NO: 9，下划线部分为CDR区，第1-20位氨基酸为Signalpeptide区域，第21-131位氨基酸非下划线部分为FR骨架区）：
Figure 677572DEST_PATH_IMAGE003
轻链DNA序列（SEQ ID NO: 8）：
atggaaacagatacattactcttatgggtactactgttatgggtgcctggttcaacaggagatatcgtgcttacacaatcacctgcatcacttgcagtgtcacttggacaaagagcaacaatctcatgcagagcatcaaaggtatcttctacatcttctggatactacatgcactggtatcaacagaagccgggccaacctcctaaacttcttatctacgcacttaacaaccttgaatcaggagtgcctgcaagattcagcggttcaggcagtggcacggactttacgctcaacgtgcaccctgtggaagaagaagatgcagcaacatactactgccaaactttctacgggagtgagcttcctttcgggagtgggacgaaattggagatcaaa
在获知本发明的Y45克隆号抗体的序列后，可以按照现有技术中任何可行的方法制备获得本发明的抗体。
实施例2. 抗FMC63 scFv的单克隆抗体的分析鉴定和功能分析
本实施例中，采用领域中的已知方法对抗FMC63 scFv的单克隆抗体（即克隆Y45号抗体）进行分析鉴定和功能分析。
1.通过亚类试剂盒进行的ELISA检测结果（表2）显示，克隆号Y45的亚型为IgG1,κ。
Figure 56469DEST_PATH_IMAGE004
2.SDS-PAGE鉴定结果（图1）显示，Y45克隆号抗体还原电泳两条带分子量大小分别为27kDa和50kDa，纯度大于99%。
3.SEC-MALS鉴定结果（图2）显示，Y45克隆号抗体纯度大于99%，分子量大小154.7kDa。
4.ELISA结合数据（图3）和竞争ELISA数据（图4）表明，Y45克隆号的抗体能够特异地识别Anti-CD19 (FMC63) CAR的抗原结合位点。
5.SPR分析数据（图5）显示从上往下7条拟合线分别代表FMC63 scFv在125nM、62.5nM、31.25nM、15.625nM、7.813nM、3.906nM和1.953nM浓度下与Y45克隆号抗体之间亲和和解离随时间的变化规律，结果表明，Y45克隆号的抗体结合FMC63 scFv的亲和力高达1.08nM。
6.FACS结合数据（图6A-图6C）表明，Y45克隆号的抗体可以特异性与表达在细胞表面的Anti-CD19 (FMC63) CAR结合，与未转染CAR的293细胞和为转染CAR的PBMC细胞均无非特异结合信号。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司
<120> 检测Anti-CD19 CAR表达水平的抗独特性抗体及其应用
<130> GAI20CN7517
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR
<400> 1
Gly Asp Phe Arg Tyr Phe Ser Trp
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<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR
<400> 2
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR
<400> 3
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1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR
<400> 4
Lys Val Ser Ser Thr Ser Ser Gly Tyr Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR
<400> 5
Gln Thr Phe Tyr Gly Ser Glu Leu Pro
1 5
<210> 6
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重链DNA序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(405)
<400> 6
atg gat ttc ggg ctc atc ttc ttc ata gtc gca ctt ctt aaa gga gtg 48
Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val
1 5 10 15
caa tgc gaa gtg aaa ctt ctt gaa tca gga gga gga ctt gtg caa cct 96
Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
gga gga tca ctt aaa ctt tca tgc gca gca tca gga gat ttt cgc tac 144
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Phe Arg Tyr
35 40 45
ttt cag tgg atg tca tgg gtg aga caa gca cct gga aag ggc ctc gaa 192
Phe Gln Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
tgg atc gga gaa atc gac aac tta gac agt ata acg aag tat act cct 240
Trp Ile Gly Glu Ile Asp Asn Leu Asp Ser Ile Thr Lys Tyr Thr Pro
65 70 75 80
tca cta aag gac aag ttc ata atc tca aga gat aac gca aag aat act 288
Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
ctt tac ctt caa atg aga aag gtt agg tca gaa gat aca gca ctt tac 336
Leu Tyr Leu Gln Met Arg Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
100 105 110
tac tgc aga gca tac aga tac atg tac gat cct aga tgg ggg cag ggg 384
Tyr Cys Arg Ala Tyr Arg Tyr Met Tyr Asp Pro Arg Trp Gly Gln Gly
115 120 125
aca tca gtg aca gtg tca tca 405
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 7
<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val
1 5 10 15
Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Phe Arg Tyr
35 40 45
Phe Gln Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Glu Ile Asp Asn Leu Asp Ser Ile Thr Lys Tyr Thr Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Arg Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
100 105 110
Tyr Cys Arg Ala Tyr Arg Tyr Met Tyr Asp Pro Arg Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 轻链DNA序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(393)
<400> 8
atg gaa aca gat aca tta ctc tta tgg gta cta ctg tta tgg gtg cct 48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
ggt tca aca gga gat atc gtg ctt aca caa tca cct gca tca ctt gca 96
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
gtg tca ctt gga caa aga gca aca atc tca tgc aga gca tca aag gta 144
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Val
35 40 45
tct tct aca tct tct gga tac tac atg cac tgg tat caa cag aag ccg 192
Ser Ser Thr Ser Ser Gly Tyr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
ggc caa cct cct aaa ctt ctt atc tac gca ctt aac aac ctt gaa tca 240
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Leu Asn Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
gga gtg cct gca aga ttc agc ggt tca ggc agt ggc acg gac ttt acg 288
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc aac gtg cac cct gtg gaa gaa gaa gat gca gca aca tac tac tgc 336
Leu Asn Val His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
caa act ttc tac ggg agt gag ctt cct ttc ggg agt ggg acg aaa ttg 384
Gln Thr Phe Tyr Gly Ser Glu Leu Pro Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gag atc aaa 393
Glu Ile Lys
130
<210> 9
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Construct
<400> 9
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Val
35 40 45
Ser Ser Thr Ser Ser Gly Tyr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Leu Asn Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Val His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Thr Phe Tyr Gly Ser Glu Leu Pro Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130

Claims (10)

1.一种抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段，其中该抗体的六个CDR包括：
GDFRYFSW（SEQ ID NO: 1）；
IDNLDSIT（SEQ ID NO: 2）；
RAYRYMYDPR（SEQ ID NO: 3）；
KVSSTSSGYY（SEQ ID NO: 4）；
ALN；
QTFYGSELP（SEQ ID NO: 5）。
2.根据权利要求1所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段，该抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段的三个重链CDR以及三个轻链CDR包括：
重链CDR1：GDFRYFSW（SEQ ID NO: 1）；
重链CDR2：IDNLDSIT（SEQ ID NO: 2）；
重链CDR3：RAYRYMYDPR（SEQ ID NO: 3）；
轻链CDR1：KVSSTSSGYY（SEQ ID NO: 4）；
轻链CDR2：ALN；
轻链CDR3：QTFYGSELP（SEQ ID NO: 5）。
3.根据权利要求1所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段，其中所述抗体为动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段，其包括：
(1) 一个重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO: 7所示第19-135位或全长氨基酸序列，或在这些氨基酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及
(2)一个轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO: 9所示第21-131位或全长氨基酸序列，或在这些氨基酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
5.编码权利要求1~4任一项所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其包括SEQ ID NO: 6和/或SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列。
7.含有权利要求5或6所述多核苷酸的载体。
8.含有权利要求5或6所述多核苷酸或含有权利要求7所述载体的细胞。
9.权利要求1~4任一项所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段在评估FMC63克隆号抗体来源的Anti-CD19 CAR基因的转染阳性率中的应用。
10.权利要求1~4任一项所述的抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CAR抗原结合位点的生物活性片段在评估患者给药后Anti-CD19 CAR阳性T细胞数量在患者体内的变化规律中的应用。
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