CN112375133A - 亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法 - Google Patents

亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法。该亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，亲和层析柱配基为凝血酶，包括如下步骤：样品前处理，将含有凝血酶调节蛋白的溶液放入到透析袋袋中进行透析，充分透析后透析袋内的液体为上样液；上样及平衡液冲洗，将上样液上样亲和层析柱，然后平衡液平衡亲和层析柱；冲洗液冲洗，平衡液平衡后采用冲洗液对亲和层析柱进行冲洗；洗脱液洗脱，冲洗液冲洗后采用洗脱液对亲和层析柱进行洗脱，并收集洗脱峰；将收集的洗脱峰进行超滤浓缩，得到凝血酶调节蛋白精制品。本发明的方法，能够大批量的纯化凝血酶调节蛋白，收率较高，纯度较高。

Description

亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法
技术领域
本发明涉及蛋白提取和纯化领域，尤其是涉及亲和层析柱纯化凝血酶 调节蛋白的方法。
背景技术
人尿液凝血酶调节蛋白(Thrombomodulin，简称TM)主要存在于人血 浆和人尿液中，是由557个氨基酸残基构成的糖蛋白，分子量约为60,300Da， 等电点约为3.8，最初由N.L.Esmon等于1981年在实验中发现。
TM是一种内皮细胞膜糖蛋白，它通过与凝血酶形成复合物来中和凝血 酶活性，并且该复合物有效地激活了C蛋白。以蛋白质S为辅助因子，活 化的C蛋白通过使活化的凝血因子V和VIII失活而充当抗凝剂。人尿TM 在非还原性SDS-PAGE上表现出四种主要形式，在还原状态下SDS-PAGE 上表现出七种主要形式，这些分子大小类似于血浆TM的分子大小。TM通 过切割具有18个氨基酸的信号肽前体产生的一种成熟的跨膜蛋白，完整的 蛋白显示出五个不同的功能域，包括一个N端凝集素样结构域(TM-D1)， 其次是六个表皮生长因子(EGF)样重复序列(TM-D2)，一个丝氨酸/苏 氨酸富集区(TM-D3)，一个跨膜结构域(TM-D4)和一个细胞质结构域 (TM-D5)。
1993年Susumu Yamamoto纯化出了其中两种较大的分子，非还原性 SDS-PAGE上估计其表观分子量分别为60,000Da(I型)和55,000Da(II 型)，纯化后的I型和II型TM在还原型SDS-PAGE时表现为单链分子。去 糖基化后，两种类型的TM在还原和非还原时均显示出相似的迁移率，表 明迁移的差异是由不同的糖基化引起的。通过氨基酸含量和序列分析，发现两种类型的尿TM具有相同的氨基酸序列。然而，通过现有的技术手段， 没有办法实现TM的大批量纯化，其表现为收率较低，纯度不高等等。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供亲和层析柱纯化凝血 酶调节蛋白的方法，能够大批量的纯化凝血酶调节蛋白，收率较高，纯度 较高。
为实现上述目的，本发明亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法采用 的技术方案是：
一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，填料为琼脂糖-凝血酶偶 联复合物，琼脂糖-凝血酶偶联复合物通过湿法装柱获得亲和色谱柱。
本发明亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法制备方法采用的技术方 案是：
一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，亲和层析柱配基为凝血 酶，包括如下步骤：
(1)样品前处理
量取凝血酶调节蛋白粗制品，将含有凝血酶调节蛋白的溶液放入到透 析袋袋中进行透析，其置换液为亲和层析柱的平衡液，将透析袋放入到置 换液中进行透析，整个透析过程在4℃下进行，充分透析后透析袋内的液体 为上样液；
(2)上样及平衡液冲洗
将上样液上样亲和层析柱，然后平衡液平衡亲和层析柱，平衡液为 0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0-0.5mol/L NaCl，pH 为5.0-9.0；
(3)冲洗液冲洗
平衡液平衡后采用冲洗液对亲和层析柱进行冲洗，冲洗液冲洗5-10个 亲和层析柱体积，冲洗直至紫外峰将至基线附近，冲洗液选择 0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.1-1.0mol/LNaCl，pH 为5.0-9.0；
(4)洗脱液洗脱
冲洗液冲洗后采用洗脱液对亲和层析柱进行洗脱，洗脱液冲洗3-5个 亲和层析柱体积，并收集洗脱峰，洗脱液选择0.02-0.2mol/L的Tris-HCl 缓冲体系，所述缓冲液含0.5-3.0mol/LNaCl，pH为5.0-9.0；
(5)超滤处理
将收集的洗脱峰进行超滤浓缩，得到凝血酶调节蛋白精制品。凝血酶 调节蛋白上样最大载量为约10mg/mL填料。步骤5超滤采用分子量为 8000-30000Da的超滤膜，所述超滤膜的材质为聚砜。将浓缩后的中间体送 样检测，比活性及纯度得到有效提高。
凝血酶调节蛋白粗制品液相纯度在4-6％。
透析袋放入到置换液中进行透析，更换3-4次置换液，最后一次置换 时间为5-8小时，或者过夜，之前的置换时间为0.5-1个小时。
平衡液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.06mol/L NaCl，pH为7.4。
冲洗液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.2mol/LNaCl， pH为7.4。
洗脱液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含2.0mol/LNaCl， pH为7.4。
步骤2中上样液上样亲和层析柱流速恒定，上样后用3-5倍亲和层析 柱体积的平衡液冲洗。
使用完的亲和层析柱保存在含20％乙醇的水中。
凝血酶调节蛋白的溶液和步骤2-4的缓冲液中均加入终浓度为10-20mM 苄脒盐酸盐作为蛋白保护剂。
亲和层析柱填料的基本骨架为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、合成大分子 或天然高分子聚合物。如Sephadex系列、Sepharose系列、Sephacryl系 列等等。此外，该亲和层析柱结合凝血酶量的不同，会形成不同密度的凝 血酶亲和柱，这些不同密度的亲和柱对凝血酶调节蛋白纯化均有效果。
亲和层析柱的填料为琼脂糖-凝血酶偶联复合物，琼脂糖-凝血酶偶联 复合物通过湿法装柱。
本发明与现有技术相比，能够简单方便、成本低、收率高的大规模工 业化生产得到生物活性高、质量稳定的凝血酶调节蛋白中间体，具体优势 如下：
1、利用层析填料的吸附性，大幅度的提高了TM回收率；
2、利用填料的专一性，提升了凝血酶调节蛋白的纯度，有效的区分多 种凝血酶调节蛋白变体；
3、载量高，速度快，有利于工业化放大；
4、缩短了纯化时间，有效的保护了蛋白的生物活性；
5、操作简单易行，所需试剂简单易得。
附图说明
图1为本发明实施例1凝血酶调节蛋白粗制品检测图谱。
图2为本发明实施例1凝血酶调节蛋白纯化后液相检测图谱。
图3为本发明实施例2凝血酶调节蛋白纯化后液相检测图谱。
图4为本发明实施例2凝血酶调节蛋白纯化后SDS-PAGE检测图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施 方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后， 本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要 求所限定的范围。
一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，亲和层析柱的填料为琼 脂糖-凝血酶偶联复合物，琼脂糖-凝血酶偶联复合物通过湿法装柱获得亲 和色谱柱，具体步骤为：
(1)样品前处理
量取凝血酶调节蛋白粗制品，将含有凝血酶调节蛋白的溶液放入到透 析袋袋中进行透析，凝血酶调节蛋白粗制品液相纯度在4-6％，其置换液为 亲和层析柱的平衡液，将透析袋放入到置换液中进行透析，更换3-4次置 换液，最后一次置换时间为5-8小时，或者过夜，之前的置换时间为0.5-1 个小时，整个透析过程在4℃下进行，充分透析后透析袋内的液体为上样液；
(2)上样及平衡液冲洗
将上样液以恒定流速上样亲和层析柱，上样结束后用3-5倍亲和层析 柱体积的平衡液冲洗亲和层析柱，平衡液为0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓 冲液，所述缓冲液含0-0.5mol/L NaCl，pH为5.0-9.0；作为优选，平衡液 为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.06mol/L NaCl，pH为 7.4；
(3)冲洗液冲洗
平衡液平衡后采用冲洗液对亲和层析柱进行冲洗，冲洗液冲洗5-10个 亲和层析柱体积，冲洗直至紫外峰将至基线附近，冲洗液选择 0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.1-1.0mol/LNaCl，pH 为5.0-9.0；作为优选，冲洗液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓 冲液含0.2mol/LNaCl，pH为7.4；
(4)洗脱液洗脱
冲洗液冲洗后采用洗脱液对亲和层析柱进行洗脱，洗脱液冲洗3-5个 亲和层析柱体积，并收集洗脱峰，洗脱液选择0.02-0.2mol/L的Tris-HCl 缓冲体系，所述缓冲液含0.5-3.0mol/LNaCl，pH为5.0-9.0；作为优选， 洗脱液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含2.0mol/LNaCl，pH 为7.4；使用完的亲和层析柱保存在含20％乙醇的水中；
(5)超滤处理
将收集的洗脱峰进行超滤浓缩，得到凝血酶调节蛋白精制品。凝血酶 调节蛋白上样最大载量为约10mg/mL填料。步骤5超滤采用分子量为 8000-30000Da的超滤膜，所述超滤膜的材质为聚砜。
凝血酶调节蛋白的溶液和步骤2-4的缓冲液中均加入终浓度为10-20mM 苄脒盐酸盐作为蛋白保护剂。
亲和层析柱填料的基本骨架可以为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、合成大 分子或天然高分子聚合物。如Sephadex系列、Sepharose系列、Sephacryl 系列等等。
亲和层析柱的制备方法，采用如下步骤：
(1)凝血酶准备，将购买的凝血酶冻干粉纯水溶解后，用透析袋在4℃ 下透析除去冻干保护剂等；
(2)基质准备，取CNBr活化的琼脂糖凝胶Focurose 4FF用水洗涤；
(3)偶联，使用偶联缓冲液冲液(偶联缓冲液为0.1mol/L的NaHCO3， 含有0.5mol/L的NaCl,pH为8.3)溶涨CNBr活化的琼脂糖凝胶Focurose 4FF，迅速将琼脂糖凝胶Focurose4FF转移到含有凝血酶的偶联缓冲液中， 得到琼脂糖-凝血酶偶联复合物；
(4)封闭活性基团，步骤(3)所得琼脂糖-凝血酶偶联复合物，抽滤 除去未反应的凝血酶，然后转入含有甘氨酸(0.1M)的偶联缓冲液(偶联 缓冲液为0.1mol/L的NaHCO3，含有0.5mol/L的NaCl,pH为8.3)中，封闭 所有残留的活性基团；
(5)洗涤，依次用含有NaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1mol/L的醋 酸-醋酸钠，内含0.5mol/L的NaCl，pH为4.0)和含有NaCl的Tris-HCl 缓冲液(0.1mol/L的Tris-HCl，内含0.5mol/L的NaCl，pH为8.0)分别 洗涤步骤(4)所得琼脂糖-凝血酶偶联复合物，除去偶联后未偶联上的多余 的配体；
(6)凝血酶去活处理，用20mM Tris-HCl，pH7.5缓冲液将AEBSF溶 解，将其加入步骤(5)所得琼脂糖-凝血酶偶联复合物，轻柔震荡1.5-2.5 小时后使用纯水冲洗，制得凝血酶亲和填料；
(7)装柱，采用湿法装柱，取空柱管，装好底层筛板，先将空柱管注 满纯水，打开下端流出管，使水自然流出，排出柱底部气泡，步骤(6)获 得的缓冲液悬浮的填料一次性倒入柱管内，连接好管路，冰箱4℃保存。
凝血酶可以与TM上的表皮生长因子(EGF)样结构域EGF5、EGF6 结合。EGF6的缺失会使TM对凝血酶的Km值提升将近10倍，而EGF5 缺失凝血酶不能与TM结合。EGF4与凝血酶的结合无关，但对于蛋白C的 活性是必须的；而对于TAFI的激活，EGF3的存在是必须的。本发明正是 利用上述原理，将凝血酶与层析填料结合，制成凝血酶亲和柱，用于TM 的纯化。其保证了回收到的TM的完整性，由于其操作时间短，也保证了 TM的生物活性。
为了获得纯度较高的TM，本发明以TM粗制品为原料，使用凝血酶亲 和柱进行纯化，以获得高纯度的单一TM样品。其操作简单，易于放大， 对于从尿液中纯化TM具有明显的提纯效果。
实施例1：
(1)样品前处理
量取凝血酶调节蛋白粗制品100mL，其液相纯度在5％左右，放入到平 衡液中进行透析12小时，收集透析后溶液，准备上凝血酶亲和柱。
(2)上样及平衡液冲洗
采用低密度亲(200U/mL)和层析柱10mL预先用平衡液平衡，平衡液 为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，含0.02mol/LNaCl，pH＝7.4，平衡3-5个 柱体积。
(3)冲洗及洗脱
冲洗液采用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，含0.08mol/L NaCl，pH为 7.4，冲洗3-5个柱体积。洗脱液采用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，含2.0mol/L NaCl，pH为7.4，洗脱直至基线，收集洗脱峰样品。
步骤2和步骤3中同上样阶段流速一致，上样结束后再用平衡液冲洗5 倍柱体积，收集各个阶段样品进行检测。
(4)超滤处理
将步骤3得到的洗脱液样品用10000Da聚砜超滤膜进行超滤浓缩，最 后保存在含0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.4的缓冲液中，得到凝血酶调节蛋 白精制品Ⅰ。
(5)目标蛋白分析
将浓缩后的凝血酶调节蛋白精制品Ⅰ送样进行HPLC检测，其纯度高 于90％；ELISA检测显示，其收率高于70％。
Figure BDA0002689267470000091
Figure BDA0002689267470000101
实施例2：
(1)样品前处理
量取凝血酶调节蛋白粗制品100mL，其液相纯度在5％左右，加入NaCl 调节电导，使其低于平衡液电导2-3mS/cm，调节pH＝7.4，准备上样亲和柱。
(2)上样及平衡液冲洗
采用高密度(3200U/mL)亲和层析柱100mL预先用平衡液平衡，平衡 液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，含0.06mol/L NaCl，pH＝7.4，平衡3-5 个柱体积。
(3)冲洗及洗脱
冲洗液采用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，含0.15mol/L NaCl，pH为 7.4，冲洗3-5个柱体积。洗脱液采用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，含2.0mol/L NaCl，pH为7.4，洗脱直至基线，收集洗脱峰样品。
步骤2和步骤3中同上样阶段流速一致，上样结束后再用平衡液冲洗5 倍柱体积，收集各个阶段样品进行检测。
(4)超滤处理
将步骤3得到的洗脱液样品用10000Da聚砜超滤膜进行超滤浓缩，最 后保存在含0.05mol/L Tris-HCl，pH＝7.4的缓冲液中，得到凝血酶调节蛋 白精制品Ⅰ。
(5)目标蛋白分析
通过下表发现，蛋白的比活提升5倍以上，收率超过50％。
液相检测发现，其纯度高于95％。
如图3所示，SDS-PAGE分离胶为10％，第一泳道为Marker，第二泳 道为冲洗液浓缩后样品，第三泳道为洗脱浓缩后样品，洗脱液中蛋白落在 50-75KDa之间，大小符合预期。
Figure BDA0002689267470000111

Claims (11)

1.一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，亲和层析柱配基为凝血酶，包括如下步骤：
(1)样品前处理
量取凝血酶调节蛋白粗制品，将含有凝血酶调节蛋白的溶液放入到透析袋袋中进行透析，其置换液为亲和层析柱的平衡液，将透析袋放入到置换液中进行透析，整个透析过程在4℃下进行，充分透析后透析袋内的液体为上样液；
(2)上样及平衡液冲洗
将上样液上样亲和层析柱，然后平衡液平衡亲和层析柱，平衡液为0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0-0.5mol/L NaCl，pH为5.0-9.0；
(3)冲洗液冲洗
平衡液平衡后采用冲洗液对亲和层析柱进行冲洗，冲洗液冲洗5-10个亲和层析柱体积，冲洗直至紫外峰将至基线附近，冲洗液选择0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.1-1.0mol/LNaCl，pH为5.0-9.0；
(4)洗脱液洗脱
冲洗液冲洗后采用洗脱液对亲和层析柱进行洗脱，洗脱液冲洗3-5个亲和层析柱体积，并收集洗脱峰，洗脱液选择0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲体系，所述缓冲液含0.5-3.0mol/LNaCl，pH为5.0-9.0；
(5)超滤处理
将收集的洗脱峰进行超滤浓缩，得到凝血酶调节蛋白精制品。
2.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，凝血酶调节蛋白粗制品液相纯度在4-6％。
3.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，透析袋放入到置换液中进行透析，更换3-4次置换液，最后一次置换时间为5-8小时，或者过夜，之前的置换时间为0.5-1个小时。
4.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，平衡液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.06mol/L NaCl，pH为6.0-8.0。
5.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，冲洗液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.2mol/LNaCl，pH为6.0-8.0。
6.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，洗脱液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含2.0mol/LNaCl，pH为6.0-8.0。
7.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，步骤2中上样液上样亲和层析柱流速恒定，上样后用3-5倍亲和层析柱体积的平衡液冲洗。
8.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，使用完的亲和层析柱放入再生液中冲洗，冲洗3-5CV，再生液为pH为3.0-5.0，0.05M NaAc+1.5M NaCl，然后保存在含20％乙醇的水中。
9.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，凝血酶调节蛋白的溶液和步骤2-4的缓冲液中均加入终浓度为10-20mM苄脒盐酸盐作为蛋白保护剂。
10.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，亲和层析柱填料的基本骨架为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、合成大分子或天然高分子聚合物。
11.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，亲和层析柱的填料为琼脂糖-凝血酶偶联复合物，琼脂糖-凝血酶偶联复合物通过湿法装柱。
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