CN112370515A

CN112370515A - 一种具有治疗时疫感冒的清瘟解热中药合剂、制备方法及用途

Info

Publication number: CN112370515A
Application number: CN202010916916.7A
Authority: CN
Inventors: 温伟波; 罗艳; 李钦
Original assignee: Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2021-02-19

Abstract

本发明涉及一种具有治疗时疫感冒的清瘟解热中药合剂、制备方法及用途，属中药复方制剂领域。清瘟解热中药合剂包括以下重量份的中药组分：广藿香10‑11份、柴胡12‑14份、黄芩7‑9份、连翘7‑9份、法半夏8‑10份、厚朴(炒)6‑9份、草果3‑5份(打碎后下)、白薇9‑12份、茵陈9‑12份、马蹄香8‑10份、滑石6‑10份、神曲(炒)10‑13份、甘草4‑6份；全方共凑清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻之功效。用于时疫感冒，症见发热身痛，咽痛咳嗽，腹胀痞满，大便黏腻臭秽或便溏腹泻，纳差乏力等，具有清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻之功效，在新冠疫情期间对新型冠状病毒肺炎也具有一定的疗效。

Description

一种具有治疗时疫感冒的清瘟解热中药合剂、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种具有治疗时疫感冒的清瘟解热中药合剂、制备方法及用途，本申请以下简称清瘟解热合剂，用于时疫感冒，症见发热身痛，咽痛咳嗽，腹胀痞满，大便黏腻臭秽或便溏腹泻，纳差乏力等，具有清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻之功效，在新冠疫情期间对新型冠状病毒肺炎也具有一定的疗效。

背景技术

随着社会环境、人类生产生活方式的变化，国内外人员流动的增加以及疾病流行谱的变化，各种新发和再现传染病仍不断出现，且在全球传播和流行，新发突发传染病仍是严重威胁人类健康的重要疾病。近年来国内外新发突发传染病疫情日益严峻，甲型H1N1流感、H7N9禽流感、埃博拉病毒病和中东呼吸综合征等一系列新发突发传染病严重危害社会稳定，威胁民众健康，特别是近期新型冠状病毒肺炎暴发更是给疫情防控带来前所未有的挑战。新发突发传染病暴发速度快、传播范围广，需要研究者尽早启动干预类研究，以便为临床治疗提供依据。此次的新冠病毒，全球科学家对其认知都有所不足，虽然我国以最短的时间分离出冠状病毒，研制出诊断试剂，不断更新诊疗方案，在研发和救治能力上体现出一定优势，但也暴露出一些短板。在疫情初期，由于临床诊疗的紧迫性、对疾病认知的不充分、研究环境的特殊性、社会环境变化的不确定性和研究团队较低的顺应性等问题，导致临床研究方案关键要素的不确定性较强，临床研究组织实施难度较大。

通过对新型冠状病毒肺炎、SARS、H5N1禽流感和H7N9禽流感诊疗经验的总结，发现中医药在阻断疾病进展、缩短病程、提高疗效、促进患者康复等方面显示出较大的优势。中医药可以从多靶位、多机制及多环节综合治疗病毒性呼吸道疾病，调节机体免疫功能，发挥抗病毒效应，从而达到防治病毒性感染的作用。

目前，多数中医采取的是口服中药汤剂防治中医疫病(时疫感冒)，但汤剂存在煎煮费时费力、剂量大、不易携带、不能久贮等缺点，影响了患者的用药依从性，本专利适应临床需要，开展符合中医疫病(时疫感冒)发病特点且能够有效体现中医辨证论治特点的中药防治制剂的发明。

发明内容

本发明的目的是提供了清瘟解热中药合剂，用于时疫感冒(外感湿热证)，症见发热身痛，咽痛咳嗽，腹胀痞满，大便黏腻臭秽或便溏腹泻，纳差乏力等，具有清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻之功效。

一种具有治疗时疫感冒的清瘟解热中药合剂，其特征在于合剂包括以下重量份的中药组分：广藿香10-11份、柴胡12-14份、黄芩7-9份、连翘 7-9份、法半夏8-10份、厚朴(炒)6-9份、草果3-5份(打碎后下)、白薇 9-12份、茵陈9-12份、马蹄香8-10份、滑石6-10份、神曲(炒)10-13份、甘草4-6份；其中神曲和厚朴两味中药需按传统中医方式炒制。

本发明具体采用了以下技术方案：制作1000ml合剂，制备方法包括如下步骤：

(1)取原材料广藿香10份、柴胡13份、黄芩8份、连翘8份、法半夏10份、厚朴(炒)8份、草果4份、白薇10份、茵陈10份、马蹄香10 份、滑石10份、神曲(炒)13份、甘草6份；其中神曲和厚朴两味中药需按传统中医方式炒制而成；

(2)第一次加水至药材10倍量，常压煮沸60分钟，药液以60目滤网滤过；

第二次加水至药材8倍量，常压煮沸40分钟，60目滤网滤过；

第三次加水至药材6倍量，常压煮沸30分钟，60目滤网滤过；

上述三次滤液减压浓缩至约900ml，400目滤网滤过；

添加适量纯化水至1000ml，混匀5分钟，半成品检验合格后分装，饱和水蒸气湿热灭菌；饱和水蒸气湿热灭菌温度110℃～115℃，压力>68.6KPa，灭菌时间30min，终点F₀＝8～10，即得合剂饮品。

一种依据权利要求1-4任所述清瘟解热中药合剂作为治疗时疫感冒的用途。

本发明各原料的机理如下：广藿香：味辛，性微温，归脾、胃、肺经，有芳香化浊，和中止呕，发表解暑之功效，用于湿浊中阻，脘痞呕吐，暑湿表证，湿温初起，发热倦怠，胸闷不舒，寒湿闭暑，腹痛吐泻，鼻渊头痛。

柴胡：味苦、性微寒，归肝、胆经，有和解表里，疏肝升阳之功效，用于感冒发热、寒热往来、疟疾、肝郁气滞、胸肋胀痛、脱肛、子宫脱垂、月经不调。

黄芩：味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。

连翘：性微寒，味苦，归肺、心、小肠经，有清热解毒、消肿散结之功效，主治温热，丹毒，斑疹，痈疡肿毒，瘰疬，小便淋闭。

法半夏：味辛、性温，归脾、胃、肺经，主治燥湿化痰，用于痰多咳喘，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛。

厚朴：性温，味苦、辛。归脾经、胃经、肺经、大肠经，主治燥湿消痰、下气除满，用治湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。

草果：味辛，性温，归脾、胃经，有燥湿温中，截疟除痰功效，用于寒湿内阻，脘腹胀痛，痞满呕吐，疟疾寒热，瘟疫发热。

白薇：味苦，性大寒，入肺、胃、肾经，清热凉血，利尿通淋，解毒疗疮。用于温邪伤营发热，阴虚发热，骨蒸劳热，产后血虚发热，热淋，血淋，痈疽肿毒。

茵陈：味苦、辛，性微寒，归脾、胃、肝、胆经，有清利湿热，利胆退黄的功效，用于黄疸尿少，湿温暑湿，湿疮瘙痒。

马蹄香：味甘淡微苦辛，气香，性平，无毒，内服消风散气解暑，利尿通淋去积，入小肠膀胱经。外治痈肿疔疖等。

滑石：味甘、淡，性寒，归膀胱、肺、胃经，利尿通淋，清热解暑，祛湿敛疮。用于热淋，石淋，尿热涩痛，暑湿烦渴，湿热水泻；外治湿疹，湿疮，痱子。用于小便不利、淋沥涩痛等症。

神曲：味甘、辛，性温，归脾、胃经，消食和胃。主治饮食积滞，脘腹胀满，食少纳呆。

甘草：味甘，性平，归心、肺、脾、胃经，补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药，用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。

本申请发明人依据时疫感冒发病机理、云南热带、亚热带地区气候特点以及该类地区患者体质类型以湿热质为主，发病后以湿热证为其常见证型等情况拟定的“清瘟解热汤/合剂”。全方由藿香、柴胡、黄芩、连翘、法半夏、炒厚朴、草果、白薇等共13味药物组成。本发明药(物全)方中：君药为：柴胡，柴胡透半表半里和少阳之邪热，调畅少阳之气机。臣药为：黄芩、法半夏、藿香、连翘、白薇、茵陈、滑石，其中黄芩、法半夏与君药柴胡共奏清泄少阳邪热、降逆和中之功，藿香、连翘、白薇、茵陈、滑石清利湿毒、芳香辟秽。佐药为：马蹄香、草果、炒厚朴、炒神曲，其中按传统中药炒制后的厚朴和神曲具有温中化湿、芳香醒脾、燥湿止泻。使药为：甘草，甘草可调和诸药，具有清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻之功。

本申请方中柴胡、黄芩、法半夏、甘草共奏清泄少阳邪热、降逆和中之功，广藿香、连翘、白薇、茵陈、滑石五味药清利湿毒、芳香避秽，马蹄香、草果、厚朴(姜)、神曲(炒)温中化湿、芳香醒脾、燥湿止泻。本申请全方共凑清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻之功效。

本申请全方用于时疫感冒(外感湿热证)，症见发热身痛，咽痛咳嗽，腹胀痞满，大便黏腻臭秽或便溏腹泻，纳差乏力等。

附图说明

图1西医组患者住院病程中最后一次肺部CT结果。

图2中西医结合组患者住院病程中最后一次肺部CT结果。由图1西医组和图2中西医结合组的患者肺部CT影像可以看出，炎症均明显吸收，但局部存在条索状纤维化改变，西医组明显重于中西医结合组。因此清瘟解热合剂在联合西医常规治疗COVID-19轻中症患者疗效确切，可有效减轻炎症反应，改善预后。

图3A和图3B是高剂量组的清瘟解热合剂石油醚提取物抗甲型H1N1流感病毒活性。图3C和图3D是低剂量组的清瘟解热合剂石油醚提取物抗甲型H1N1 流感病毒活性。从图3A、图3B、图3C、图3D中可以看出当清瘟解热合剂石油醚提取物药物浓度>0.08mg/mL时，提取物对MDCK细胞具有细胞毒性，且毒性呈浓度依赖；当石油醚提取物药物浓度≤0.08mg/mL时，则无明显的细胞毒性，为实验的安全剂量范围，在此剂量下的抗流感活性结果显示,提取物表现出对流感病毒感染细胞的保护作用，在浓度为0.08mg/mL时活性较好，其保护率可达到(94.28％)，根据曲线计算其半数有效浓度EC₅₀为0.02mg/mL。说明高剂量的清瘟解热合剂石油醚提取表现出明显的抗甲型H1N1流感病毒活性。

图4A、图4B、图4C、图4D为清瘟解热合剂醇提物抗甲型H1N1流感病毒活性。其中从图4A、图4B、图4C、图4D可以看出当清瘟解热合剂石油醚提取物药物浓度>0.04mg/mL时，提取物对MDCK细胞具有细胞毒性，且毒性呈一定的浓度依赖性；当石油醚提取物药物浓度≤0.04mg/mL时，则无明显的细胞毒性，为实验的安全剂量范围，在此剂量下的抗流感活性结果显示,提取物表现出对流感病毒感染细胞的保护作用，在浓度为0.04mg/mL时活性较好，其保护率可达到(53.01％)，根据曲线计算其半数有效浓度EC₅₀为0.06mg/mL。

图5清瘟解热合剂及其提取物对RAW264.7细胞的毒性作用。其中从图5 可以看出清瘟解热合剂乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相、醇提相对RAW264.7 细胞表现出不同的细胞毒性。

图6清瘟解热合剂及其提取物抑制巨噬细胞NO生成活性作用。其中从图6 可以看出清瘟解热合剂乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相、醇提相均表现出明显的体外抑制NO生成的作用。

图7本申请清瘟解热合剂与COVID-19相关的关键靶点。

图8清瘟解热合剂治疗COVID-19关键蛋白相互作用图网络。其中从图7，图8可以看出经筛选后核心靶点中与炎症相关的靶点包括IL6、CCL3、TNF等。

图9清瘟解热合剂与COVID-19的成分-靶点-通路网络图。其中从图9可以看出红色代表通路，蓝色代表交集靶点，黄色代表活性成分，交集靶点中同样有与炎症相关的靶点IL6、CCL3、TNF。

图10A和图10B为卡维丁与ACE2分子对接的3D空间图和2D相互作用图。其中图10A为卡维丁与ACE2分子对接的3D空间图，图10B为卡维丁与ACE2 分子对接的2D相互作用图；从图10中可以看出卡维丁与ACE2对接具有较好的结合性。

图11卡维丁与SARS-CoV-2分子对接的3D空间图和2D相互作用图。其中图11A为卡维丁与SARS-CoV-2分子对接的3D空间图，图11B为卡维丁与 SARS-CoV-2分子对接的2D相互作用图。从图11中可以看出卡维丁与 SARS-CoV-2对接具有较好的结合性。

具体实施方式

下面结合附图以及具体的实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明。

实施例1：清瘟解热合剂联合西医疗法对COVID-19轻中症患者临床疗效优于纯西医疗法

处方:清瘟解热合剂中包括以下重量份的中药组分：所述清瘟解热合剂的制备方法包括如下步骤：

(1)取原材料广藿香10份、柴胡14份、黄芩7份、连翘9份、法半夏8 份、炒厚朴9份、草果3份(打碎后下)、白薇9份、茵陈9份、马蹄香8份、滑石6份、炒神曲13份、甘草6份。

(2)第一次加水至药材10倍量，冷水浸泡30分钟，常压煮沸60分钟，药液以60目滤网滤过；第二次加水至药材8倍量，常压煮沸40分钟，60目滤网滤过；第三次加水至药材6倍量，常压煮沸30分钟，60目滤网滤过；上述3次滤液减压浓缩(温度：50℃～80℃，真空度：0.04MPa～0.10MPa)至约900ml， 400目滤网滤过。添加适量纯化水至1000ml，混匀5分钟，半成品检验合格后分装，饱和水蒸气湿热灭菌(参数：温度110℃～115℃，压力>68.6KPa，灭菌时间 30min，终点F0＝8～10)，即得清瘟解热中药合剂饮品。

处方来源：云南省中医医院院长、云南省名中医温伟波教授用于防治新型冠状病毒肺炎的处方。

清瘟解热中药合剂系申请者根据时疫感冒发病机理、云南热带、亚热带地区气候特点以及该类地区患者体质类型以湿热质为主，发病后以湿热证为其常见证型等情况拟定的“清瘟解热汤”。全方由藿香、柴胡、黄芩、连翘、法半夏、炒厚朴、草果、白薇等共13味药物组成，方中柴胡、黄芩、法半夏、甘草为小柴胡汤主药，出自医圣张仲景的《伤寒杂病论》，减去滋腻温燥的大枣、人参、生姜，柴胡、黄芩、法半夏、甘草共奏清泄少阳邪热、降逆和中之功，藿香、连翘、白薇、茵陈、滑石五味药清利湿毒、芳香辟秽，蜘蛛香、草果、炒厚朴、炒神曲温中化湿、芳香醒脾、燥湿止泻。临床观察发现，清瘟解热合剂可有效减轻时疫感冒患者发热身痛，咽痛咳嗽，腹胀痞满，纳差乏力等症状。

新型冠状病毒肺炎属于中医疫病范畴，病因为感受以疫戾之气，病位在肺，基本病机特点为“湿、热、毒、瘀”。扶正祛邪是中医治疗疾病的指导原则，中医认为人们之所以会感染疾病就是因为体内的正气不足，邪气才会乘虚而入，或者体内邪气打败正气。所以，中医认为治疗疾病就是要扶正祛邪，帮助改变体内正邪的势力对比，帮助正气增加，祛除邪气使其减少或消失。扶正就是使用扶助正气的药物，或其他疗法，并配合适当的营养和功能锻炼等辅助方法，以增强体质，提高机体的抗病力，从而驱逐邪气，以达到战胜疾病，恢复健康的目的。祛邪是消除病邪以愈病的治疗原则，就是利用驱除邪气的药物，或其他疗法，以祛除病邪，达到邪去正复，恢复健康的目的。所谓“实者泻之”就是这一原则的具体应用。

本申请全(药)方共凑清热化湿，芳香避秽，燥湿止泻之功效。用于时疫感冒，症见发热身痛，咽痛咳嗽，腹胀痞满，大便黏腻臭秽或便溏腹泻，纳差乏力等；新型冠状病毒2019-nCoV感染轻中症及疑似患者见上述证候者。

临床观察发现，清瘟解热合剂可有效减轻时疫感冒患者发热身痛，咽痛咳嗽，腹胀痞满，纳差乏力等症状；我国新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019， COVID-19)暴发时，清瘟解热合剂同样取得了良好的临床疗效。

(1)收集2020年1月27日-2020年4月13日清瘟解热合剂用于云南医疗队湖北受援单位、老挝两地；治疗方案为纯西医治疗15例，中西医结合治疗8 例COVID-19轻中症患者的临床资料。患者平均年龄(45.54±12.64)岁，年龄＜ 40岁3例，40-60岁5例，轻症5例，中症3例，既往史高血压，2例、糖尿病 1例、慢阻肺1例，临床症状发热8例、咳嗽7例、乏力8例、腹泻3例。方案为西医治疗基础上，口服清瘟解热合剂，一日三次，一次一瓶(100mL)，温热服用，五天一疗程。

(2)观察指标

对比分析中西医结合组及对照组患者一般情况及淋巴细胞百分比、淋巴细胞绝对值、C-反应蛋白(C-reaction protein,CRP)、白蛋白水平、肺部CT吸收情况及转归，对比评估中西医结合及中药治疗效果(治疗后各项指标具体检查时间是患者治疗过程中最后一次检查结果，肺部影像学是住院病程中最后一次检查结果)。

(3)出院治愈标准

体温恢复正常3d以上、呼吸道症状明显好转，肺部影像学显示炎症明显吸收，连续2次呼吸道新型冠状病毒核酸检测阴性(采样时间间隔至少间隔1d)，即表示临床痊愈。

(4)治疗结果

①患者治疗前后血清指标变化情况

由表1可知，西医组、中西医结合组患者血清CRP水平经治疗后均降低，但治疗后中西医结合组均值CRP低于西医组。

表1两组患者治疗前后CRP水平变化情况

②两组患者住院天数及转归情况比较

因患者均为轻中症，两组均无患者死亡，由表2可知，中西医结合组治愈率高于对照组；中西医结合组平均住院天数少于对照组。

表2两组患者住院时间和转归情况比较

由表3可知，治疗后中西医结合组患者肺部吸收病例数占比高于与对照组。

表3两组患者肺部CT影像学吸收情况

由于两组新型冠状病毒核酸检测患者都是确症为阳性后，才收到医院开始进行治疗，所以本申请两组患者在入院前(治疗前)没有CT检查影像图片，但按常规确症的VID-19的患者，其肺部CT检查影像图片应呈毛琉璃状，本说明书中图1、图2所示为两组患者在住院病程中期间，最后一次肺部CT结果检查影像图片。

由图1西医组和图2中西医结合组的患者肺部CT影像可以看出，炎症均明显吸收，但局部存在条索状纤维化改变，西医组明显重于中西医结合组。因此清瘟解热合剂在联合西医常规治疗COVID-19轻中症患者疗效确切，可有效减轻炎症反应，改善预后。

实施例2(药方与实施例1相同)：清瘟解热方治疗时疫感冒(外感湿热证)

云南中医药大学第一附属医院急诊科2020年2月11日-2020年3月1日，将清瘟解热方临床用于11名时疫感冒(外感湿热证)患者，年龄48.73±16.32 岁，男性9人，女性2人，平均服药时间3.13±1.24天，临床疗效见表4，由表 4可知，清瘟解热方具有良好的退热效果(初始体温37.90±0.74℃，服药后体温 36.37±0.12℃)，能有效减轻患者咳嗽程度，缩短咳嗽病程，并可有效改善患者的中医临床证候(服药前中医证候积分24.75±6.14分，服药后中医证候积分 6.00±3.55分)，(具体评分标准见附表1)且服药后CRP、超敏C-反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)有降低的趋势。

表4清瘟解热方对时疫感冒(外感湿热证)患者临床疗效分析

项目	最小值(M)	最大值(X)	平均值(E)	标准偏差
					年龄	29	75	48.73	16.32
服药日期	20200211	20200226	20200218.82	6.45
					停止服药日期	20200213	20200301	20200232.88	28.25
服药前体温	36.3	39.0	37.90	0.74
					服药后体温	36.2	36.5	36.37	0.12
服药前咳嗽病程(天)	0	6	4.00	2.45
					服药后咳嗽病程(天)	0	4	1.75	1.67
服药前咳嗽程度	0	4	3.33	1.41
					服药后咳嗽程度	0	2	1.50	0.93
用药前证候积分	18.00	34.00	24.75	6.14
					用药后证候积分	0.00	10.00	6.00	3.55
服药前C反应蛋白(CRP)	19.80	193.15	86.45	90.86
					服药前超敏C反应蛋白(hsCPR)	12.51	46.39	24.77	17.22
服药前降钙素原(PCT)	0.053	0.980	0.43	0.49
					服药前D二聚体(DDimer)	0.12	6.72	1.34	2.20
服药后C反应蛋白(CRP)	10.22	81.38	16.34	5.46
					服药后超敏C反应蛋白(hsCPR)	5.67	33.21	11.65	6.88
服药后降钙素原(PCT)	0.049	1.112	0.45	0.12
					服药后D二聚体(DDimer)	0.10	5.89	1.99	0.68

实施例3(药方与实施例1相同)：清瘟解热合剂小鼠急性毒性实验预实验研究未见小鼠中毒及死亡情况

昆明小鼠24h内单次灌胃给药，最大给药体积为0.4ml/10g，高、中2个剂量组给药剂量分别为：116.3g/kg、24g/kg其中高剂量组为能用于灌胃的最大浓度的剂量(将1500g原液浓缩至309.5g)，中剂量是原药液浓度乘以最大给药体积的剂量。观察并记录各小鼠在给药后14d内的死亡情况及中毒表现。结果如下：

高剂量组：共给药10只，其中雄性5只，雌性5只。给药当日，个别动物自主活动略有减少，给药后第11天一只雌性小鼠出现流眼泪、眼睑湿润，闭眼睛，活动迟缓，其余时间未见小鼠不适，实验结束无小鼠死亡。

中剂量组：共给药7只，其中雄性3只，雌性4只。给药当日，个别动物自主活动略有减少，其余时间未见小鼠不适，实验结束无小鼠死亡。

实施例4(药方与实施例1相同)：清瘟解热合剂及粗提物体外抗甲型H1N1 流感病毒活性评价

(1)实验材料和仪器

材料：MDCK细胞；A/Puerto Rico/8/34，H1N1。

主要试剂：Gibco基础培养基，Gibco胎牛血清。

仪器：Spectra Max M2多功能读板仪、Sartorius精密电子分析天平(BT244)。

(2)样品制备方法

受试样品溶液配制：原液过滤后使用，健体抗疫原液浓度为490mg/ml，清瘟解热合剂原液为600mg/ml；水相用生理盐水溶，其他相用DMSO溶，终浓度均为200mg/ml。

(3)实验方法

取对数生长期的MDCK细胞以8×10⁴个/孔接种于96孔板中，24小时后予以药物和A/Puerto Rico/8/34病毒处理，药物组为加病毒及药物处理实验组(高剂量和低剂量)，对照组为加病毒处理对照组(vi+)，不做任何处理的孔为空白对照组(control)，奥司他韦处理组(ost+)为阳性对照组，结合观察显微镜下细胞病变和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)对细胞活力的测定，48h后于 490nm处测定其OD值，按如下公式进行数据处理，保护率％＝(加病毒处理实验组OD值-病毒对照组OD值)×100/(空白对照组平均OD值-病毒对照组OD 值)。使用IBM SPSS Statistics 23计算样品的半数有效浓度(EC₅₀)。

采用A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒株感染MDCK细胞模型，我们对清瘟解热合剂原液、清瘟解热水相、清瘟解热石油醚相、清瘟解热乙酸乙酯相、清瘟解热正丁醇相的抗H1N1流感病毒活性进行了抗流感病毒活性评价。

(4)实验结果

根据实验结果，清瘟解热合剂石油醚相与醇提相表现出显著的抗甲型H1N1 流感病毒活性，EC₅₀分别为0.02和0.06mg/mL，但同时石油醚相与醇提相也表现出较为明显的细胞毒性，其单独作用于MDCK细胞时，其CC₅₀分别为0.11 和0.14mg/mL。结果如表5，图3-4所示。

表5清瘟解热合剂石油醚提取物与醇提取物CC₅₀及EC₅₀浓度

化合物	原液	水相	乙酸乙酯	石油醚	正丁醇	醇提
							CC<sub>50</sub>(mg/mL)	—	—	—	0.11	—	0.14
EC<sub>50</sub>(mg/mL)	—	—	—	0.02	—	0.06

实施例5(药方与实施例1相同)：清瘟解热合剂体外抗炎活性实验结果

(1)清瘟解热合剂及粗提物体外抗NO生成活性评价

①实验材料和仪器

材料：RAW 264.7细胞；

主要试剂：Gibco基础培养基，Gibco胎牛血清。

②样品制备方法

受试样品溶液配制：原液过滤后使用，清瘟解热合剂原液为600mg/ml；水相用生理盐水溶，其他相用二甲基亚砜(Dimethylsurfoxide,DMSO)溶，终浓度均为200mg/ml。

③实验方法

Griess法检测NO含量原理：

NO在水溶液中易氧化形成NO₂ ^-，在酸性环境下，与重氮盐磺胺发生重氮反应(Griess A)生成重氮化合物(颜色为黄色)，再与萘基乙烯基二胺(Griess B) 发生反应(颜色为粉红色)。在540～560nm范围内有最大吸收，检测数值与NO₂ ^-量呈正相关线性。

实验方法：

取对数生长期的RAW 264.7细胞，以6×10⁴个/孔的细胞密度接种于96孔板中，于5％CO₂恒温培养箱中37℃培养24h；1μg/mL LPS处理建立巨噬细胞体外炎症模型；1‰DMSO+完全培养液的空白组、1‰DMSO+完全培养液+1 μg/mL LPS的模型组、化合物+1μg/mL LPS+1‰DMSO+完全培养液的实验组、 L-NMMA+1μg/mL LPS+1‰DMSO+完全培养液的阳性对照组。每组含有三个复孔，24h后加入Griess试剂，于540nm处使用酶标仪测得其吸光值，NO生成抑制率％＝(LPS模型组-实验组)/(LPS模型组-空白组)×100％。使用SPSS 21.0对数据进行分析处理，计算IC₅₀等。

(2)MTT法检测化合物对RAW264.7细胞活力的影响

96孔板种板细胞密度为4×10⁴/孔，培养24h，调零组只加入DMEM；空白对照组包含细胞+溶剂(DMSO+DMEM)；实验组包含细胞+(溶剂DMSO+ 不同浓度的化合物+DMEM)，每组实验设3个复孔。24h后MTT法检测，酶标仪490nm下检测吸光值(OD)。细胞相对活力(％)＝(实验组OD-调零组OD)/(空白对照组OD-调零组OD)×100％。CC₅₀:(CytotoxicityConcentration 50％)半数细胞毒性。

(3)实验结果

由表6可知，阳性药物L-NMMA的IC₅₀为5.16μg/mL，与此对照，其乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相、醇提相对RAW264.7细胞表现出不同的细胞毒性。在安全剂量下，这四种提取物均表现出明显的体外抑制NO生成的作用，CC₅₀、 IC₅₀值结果如表6-7，图5-6所示。

表6清瘟解热合剂及其提取物抑制巨噬细胞NO生成活性作用

表7清瘟解热合剂原液及粗提物CC₅₀及IC₅₀浓度

化合物	原液	水相	乙酸乙酯	石油醚	正丁醇	醇提
							CC<sub>50</sub>(μg/mL)	>400	>200	21.87	32.26	6.10	8.72
IC<sub>50</sub>(μg/mL)	138.85	74.15	2.14	4.95	2.97	4.33

实施例7(药方与实施例相同)：网络药理学分析发现IL-6、CCL3、TNF 是清瘟解热合剂治疗COVID-19的关键靶点。

通过TCMSP数据库，清瘟解热合剂共筛选出130种活性成分(OB≥30％，DL≥0.18)，预测到靶点170个。OMIM及Genecards数据库筛选出COVID-19 相关靶点752个，得到清瘟解热合剂治疗COVID-19相关的靶点28个。通过String 数据库构建的蛋白质相互作用网络中有27个作用节点，共384条相互作用连线，经筛选后发现核心靶点中与炎症相关的靶点包括白细胞介素6(interleukin 6， IL6)、趋化因子(C-C motif ligand 3，CCL3)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)等(图7-8)。

将David数据库富集的通路、药物预测的有效成分和药物与疾病交集靶点导入Cytoscape3.7.2，构建成分-靶点-通路网络来阐释其复杂的作用机制，其中红色代表通路，蓝色代表交集靶点，黄色代表活性成分(图9)。

1.7分子对接显示卡维丁是清瘟解热合剂治疗COVID-19的化合物之一

每个化合物可以作用多个靶点，按作用靶点的数量选取清瘟解热合剂前20 的化合物，同时选取中国科学院上海药物研究所筛选出的10种可能对COVID-19 有治疗作用的西药化合物作为阳性药与SARS-CoV-2和ACE2进行分子对接。 PubChem数据库中下载30种化合物分子3D结构的sdf格式文件。在RCSB数据库中下载血管紧张素转化酶II(ACE2)和SARS-CoV-2的3D结构，对其进行去除重复单元、加氢加电荷等准备，然后用化合物进行对接。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。结果显示，卡维丁与ACE2和SARS-CoV-2的对接打分最低，结合性最好，且与阳性药结果相似，优于阿比朵尔和替拉那韦，可能是治疗COVID-19的有效化合物之一，结果见表8 和图10-11。

表8清瘟解热合剂分子对接表

附表9中医证候评分表(外感湿热)

本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，只要设计与本发明的设计相同或者是只要是等同替换的都落在本发明所要求保护的范围之内。

Claims

1.一种具有治疗时疫感冒的清瘟解热中药合剂，其特征在于合剂包括以下重量份的中药组分：广藿香10-11份、柴胡12-14份、黄芩7-9份、连翘7-9份、法半夏8-10份、厚朴(炒)6-9份、草果3-5份(打碎后下)、白薇9-12份、茵陈9-12份、马蹄香8-10份、滑石6-10份、神曲(炒)10-13份、甘草4-6份；其中神曲和厚朴两味中药需按传统中医方式炒制。

2.根据权利要求1所述的具有治疗时疫感冒的清瘟解热中药合剂，其特征在于，所述合剂中包括以下重量份的中药组分：广藿香10份、柴胡13-14份、黄芩8-9份、连翘8-9份、法半夏9-10份、厚朴(炒)7-9份、草果3-4份(打碎后下)、白薇9-10份、茵陈9-10份、马蹄香9-10份、滑石9-10份、神曲(炒)12-13份、甘草5-6份。

3.一种具有治疗时疫感冒清瘟解热中药合剂的制备方法，其特征在于，以制作1000ml合剂为计，制备方法包括如下步骤：

(1)取原材料广藿香10份、柴胡13份、黄芩8份、连翘8份、法半夏10份、厚朴(炒)8份、草果4份、白薇10份、茵陈10份、马蹄香10份、滑石10份、神曲(炒)13份、甘草6份；其中神曲和厚朴两味中药需按传统中医方式炒制而成；

第二次加水至药材8倍量，常压煮沸40分钟，60目滤网滤过；

第三次加水至药材6倍量，常压煮沸30分钟，60目滤网滤过；

上述三次滤液减压浓缩至约900ml，400目滤网滤过；

每次三次滤液减压温度：50℃～80℃，真空度：0.04MPa～0.10MPa。

4.根据权利要求3所述的具有治疗时疫感冒的中药清瘟解热合剂制备方法，其特征在于，每次三次滤液减压温度：50℃～80℃，真空度：0.04MPa～0.10MPa。

5.一种依据权利要求1-4任所述清瘟解热中药合剂作为治疗时疫感冒的用途。