CN112359114B - miR-493-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及食管癌检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miR‑493‑5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及食管癌检测试剂盒。本发明首次揭示了血浆外泌体中miR‑493‑5p与食管癌、食管癌淋巴结转移相关，在食管癌、淋巴结转移患者中显著降低且具有统计学意义。基于此，本发明将miR‑493‑5p的检测试剂应用于制备食管癌的检测试剂盒，制备得到的试剂盒可以方便、快捷、特异性高的进行食管癌的早期诊断、淋巴结转移的预警、以及判断食管癌患者手术治疗情况，为食管癌患者的治疗提供指导。

Description

miR-493-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及 食管癌检测试剂盒

技术领域

本发明涉及miR-493-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及食管癌检测试剂盒，属于生物技术和医学技术领域。

背景技术

食管癌作为消化道常见恶性肿瘤，其发病率在全球范围内位居恶性肿瘤的第8位，死亡率位居第6位。我国是食管癌的高发地区，其中约90％为食管鳞癌。近年来，尽管食管癌诊疗技术得到提升，但其预后仍然较差，5年总体生存率仅为20％左右。由于食管癌早期症状的隐蔽性和非特异性，临床上一经诊治，多数患者已属中晚期。胃镜检查是目前食管癌确诊的主要手段，但对患者的创伤较大，且对操作者技术要求较高，不适用于大规模的人群筛查。而上消化道钡餐、CT等检查，因其特异性较低，不能用于食管癌的确诊。因此，目前迫切的需要一种较为敏感的标志物，为食管癌的早期诊断提供客观依据。另一方面，淋巴结转移作为食管癌患者预后的独立危险因素，是预后不佳的主要原因之一。判断淋巴结转移的主要方法为影像学检查，而一些患者术前CT检查无明显肿大的淋巴结，术后病理却证实为淋巴结阳性。明确患者术前是否确实存在淋巴结转移，指导术前新辅助化疗，对于改善患者预后，提高患者生存质量具有重要意义。

液体活检作为新型的检测手段，具有易获取、创伤小、快捷等优点，是癌症检查发展的趋势与方向。外泌体(exosomes)是细胞在生理或病理条件下释放到细胞外的直径在40-150nm的双层囊泡结构，由细胞膜内陷后通过一系列复杂的机制形成多囊泡小体，通过与细胞膜融合，释放外泌体至细胞外。外泌体可携带一系列生物活性物质，如脂质、蛋白质和核酸(microRNA，CicroRNA及LncRNA)等。研究表明多种肿瘤细胞如：食管癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胃癌细胞等均可分泌外泌体，并可通过不同分子机制影响肿瘤化疗耐药、肿瘤免疫、血管生成及迁移侵袭等过程，成为近年来肿瘤研究的热点。外泌体几乎在所有体液，如血液、尿液、唾液、母乳、精液、前列腺液、脑脊液、羊水和胸腔积液等中均有分布，且具有较高的组织特异性和稳定性，可用作肿瘤无创性检查。

microRNA是一类内源性的非编码RNA分子，长约17-24nt，其可通过调控靶基因的3'-UTR区域，进而调控细胞的分化、增殖、凋亡，发挥其促癌或抑癌基因的作用。研究表明，循环miRNA主要存在于血浆外泌体中，发现特异性高血浆外泌体microRNA并应用于食管癌的诊断及预后判断，对食管癌的诊疗必将起到巨大的推动作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了miR-493-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及食管癌检测试剂盒。本发明通过研究发现，miR-493-5p可以作为一种食管癌早期诊断的标志物、食管癌淋巴结转移的标志物、以及手术前后血浆外泌体变化的标志物，利用miR-493-5p的检测试剂制备得到一种食管癌检测试剂盒，可以方便、快捷、特异性高的进行食管癌的早期诊断、淋巴结转移的预警、以及判断食管癌患者手术治疗情况，为食管癌患者的治疗提供指导。

本发明的技术方案如下：

miR-493-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用。

根据本发明优选的，所述miR-493-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述食管癌为食管鳞癌。

根据本发明优选的，所述食管癌检测试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

根据本发明优选的，所述食管癌检测试剂盒用于检测血浆外泌体中的miR-493-5p。

一种食管癌检测试剂盒，包括miR-493-5p的逆转录反应试剂和miR-493-5p的荧光定量PCR反应试剂。

根据本发明优选的，所述miR-493-5p的荧光定量PCR反应试剂包括miR-493-5p的正向引物和反向引物，所正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物为通用引物。

根据本发明优选的，所述miR-493-5p的逆转录反应采用加尾法进行。

根据本发明优选的，所述食管癌检测试剂盒还包括内参体系。

进一步优选的，所述内参体系为内参基因U6的实时荧光定量PCR的检测体系，包括U6基因的正向引物和反向引物，所正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向引物为通用引物。

上述试剂盒中还包括用于加尾法逆转录和实时荧光定量PCR的酶液和缓冲液体系，均可为现有的市购产品。

上述试剂盒可以用于食管癌的早期诊断，可以用于预警食管癌患者的淋巴结转移，也可以用于检测食管癌患者术前术后血浆外泌体中miR-493-5p的变化，为食管癌患者的术后治疗提供指导。

本发明有益效果在于：

1、本发明首次揭示了血浆外泌体中miR-493-5p与食管癌、食管癌淋巴结转移相关，在食管癌、淋巴结转移患者中显著降低且具有统计学意义。基于此，本发明将miR-493-5p的检测试剂应用于制备食管癌的检测试剂盒，制备得到的试剂盒可以方便、快捷、特异性高的进行食管癌的早期诊断、淋巴结转移的预警、以及判断食管癌患者手术治疗情况，为食管癌患者的治疗提供指导。

2、本发明中所述血浆外泌体中的miR-493-5p作为食管癌早期诊断及预警淋巴结转移的标志物，灵敏度高，特异性好。根据miR-493-5p设计的试剂盒不仅可用于食管癌的筛查，同时可用于指导食管癌患者术前新辅助化疗，有着较高的临床使用价值及推广价值。

附图说明

图1为血浆外泌体的电镜鉴定照片。

图2为健康志愿者(Normal)与早期食管癌患者(ESCC)术前血浆外泌体中miR-493-5p的表达水平图。

图3为ROC分析血浆外泌体中的miR-493-5p对食管癌早期诊断效能的曲线图。

图4为有(LNM)、无(NLNM)淋巴结转移的食管癌患者术前血浆外泌体中的miR-493-5p的表达水平图。

图5为ROC分析血浆外泌体中的miR-493-5p对判断食管癌患者有无淋巴结转移的检验效能的曲线图。

图6为食管癌患者根治性手术前(Pre-operation)、后(Post-operation)血浆外泌体中的miR-493-5p的表达水平图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验步骤，若无特殊说明，均为本领域常规操作；实施例中的室温具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。

实验设计：

收集山东大学第二医院诊断为食管癌的患者术前及术后7天的血浆样本，提取血浆外泌体总RNA。通过实时荧光定量PCR(qPCR)的方法检测血浆外泌体中miR-493-5p表达水平，并分析食管癌患者与健康志愿者血浆外泌体中miR-493-5p表达以及有、无淋巴结转移的食管癌患者血浆外泌体miR-493-5p表达之间的差异，并分析其检验效能。

其中，miR-493-5p的核苷酸序列如下：

5'-UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU-3'(SEQ ID NO.1)。

实施例1、miR-493-5p在早期食管癌患者血浆外泌体中的表达水平

1、研究对象：纳入山东大学第二医院于2019年8月至2020年6月收治的30例早期食管癌患者(根据术后病理TNM分期为：T1N0M0)为实验组，健康志愿者30名作为对照组。所纳入的食管癌患者术前均未接受新辅助放化疗。

2、血浆收集：于手术前分别采集早期食管癌患者外周血约3mL，置于含EDTA抗凝剂的真空管中上下颠倒混匀，于1900g、4℃离心10min后收集上清；于3000g、4℃再次离心15min后小心吸取上清至冻存管，液氮速冻后储存于-80℃冰箱备用。

3、血浆外泌体的分离：采用SBI公司的Exoquick试剂盒分离血浆中的外泌体，取500μL血浆，加入5μL凝血酶，轻弹底部混匀，室温孵育5min；10000rpm离心5min后，将上清转移至EP管中，加入60μLExoquick试剂，上下颠倒混匀，于4℃孵育30min；1500g离心30min，底部可见白色沉淀即为外泌体，弃上清，1500g离心5min后再次弃上清，加入1mLBuffer MZ重悬，进行下一步操作或-80℃冰箱保存。将上述收集到的外泌体样本在电镜下观察，电镜照片如图1所示，箭头所指均为外泌体，呈囊泡结构，标尺为100nm。

4、血浆外泌体总RNA的提取：将上述含有1mLBuffer MZ的外泌体样本震荡混匀30sec，室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；室温12000rpm离心10min，取上清，转入新的RNase-Free的离心管中，加入200μL氯仿，剧烈震荡15sec后，室温放置5min；室温12000rpm离心15min，样品分为3层：分别为黄色的有机相，中间相和无色的水相，RNA主要在水相中，小心将水相转移至新EP管中；量取转移液的体积，缓慢加入1.5倍转移液体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRspin中，室温12000rpm离心30sec，弃废液，保留吸附柱；向miRspin柱中加入500μL去蛋白MRD，室温静置2min；室温12000rpm离心30sec，弃废液，向miRspin柱中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min；室温12000rpm离心30sec，弃废液；重复漂洗一遍；将miRspin柱放入2mL收集管中，室温12000rpm离心1min，弃废液，将miRspin柱置于超净台通风片刻，以充分晾干；将miRspin柱放入新的RNase-Free 1.5mLEP管中，加入30μLDEPC水，室温放置2min以充分溶解，室温12000rpm离心2min，测定RNA浓度或置于-80℃保存备用。

5、RNA浓度测定：使用“Nanodrop”机器测定RNA浓度，打开取样臂，吸取1.5μLDEPC水清洗并用无尘纸擦干测量基座，吸取1.5μLDEPC水作为空白样品调零，吸取1.5μL待测样品测定样品RNA浓度，单位为ng/μL。

6、逆转录获得cDNA：将100ng总RNA，10μL 2×miRNA RT Reaction Buffer，2μLmiRNA RT Enzyme mix，DEPC水补齐至20μL，震荡混匀并离心，42℃孵育1h，95℃孵育5min，合成的cDNA直接用于荧光定量检测或储存于-20℃。

上述逆转录是采用加尾法获得用于qPCR的cDNA，2×miRNA RT Reaction Buffer和miRNA RT Enzyme mix来自miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211，天根生化科技有限公司)。

7、实时荧光定量PCR：

根据miR-493-5p的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)设计qPCR引物，其中：

miR-493-5p的正向引物的序列为：5'-GGCTTGTACATGGTAGGCTTTCATT-3'(SEQ IDNO.2)，

miR-493-5p的反向引物为通用引物，购自天根生化科技有限公司；

以U6基因作为内参基因进行qPCR，其中：

U6基因的核苷酸序列为：5'-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT-3'；

U6基因的正向引物的序列为：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'(SEQ ID NO.3)，

U6基因的反向引物为通用引物，购自天根生化科技有限公司；

miR-493-5p和U6基因qPCR的具体反应体系见表1，反应条件见表2。

实时荧光定量PCR中使用的2×miRcute Plus miRNA Premix(SYBR&ROX)和通用引物来自miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(FP411，天根生化科技有限公司)

表1.qPCR的反应体系

表2.qPCR的反应条件

8、统计学分析：

使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析。以早期食管癌患者组△CT的均值作为对照，分别计算健康对照组和早期食管癌组2^-△△CT并绘制散点图。通过构建受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristics，ROC曲线)来评价血浆外泌体中miR-493-5p用于早期食管癌诊断的敏感性、特异性。p＜0.05视为差异有统计学意义。

9、血浆外泌体中miR-493-5p在健康志愿者与早期食管癌患者表达水平差异

采用qPCR的方法对早期食管癌患者和健康志愿者的血浆外泌体的miR-493-5p水平进行定量，以确定血浆外泌体中miR-493-5p是否可作为诊断早期食管癌的生物标记物。定量结果如图2所示，结果显示miR-493-5p的表达水平在早期食管癌患者中较健康志愿者显著降低，差异具有统计学意义(p＜0.001)。

进而利用ROC曲线分析，检测血浆外泌体中miR-493-5p对早期食管癌的诊断效能，ROC曲线如图3所示，分析显示，AUC为0.866，灵敏度为86.67％，特异性为84.08％，实验结果表明血浆外泌体中miR-493-5p对食管癌早期诊断具有较高的灵敏度及特异性。可基于血浆外泌体的miR-493-5p制作用于食管癌早期诊断的试剂盒。

实施例2、miR-493-5p在有、无淋巴结转移食管癌患者中的表达水平差异

采用qPCR的方法对术后病理检测的30组有淋巴结转移食管癌患者和30组无淋巴结转移食管癌患者的术前血浆外泌体中miR-493-5p水平进行定量，以确定血浆外泌体中miR-493-5p能否作为判断食管癌患者有无淋巴结转移的生物标记物。

收集有、无淋巴结转移食管癌患者术前的血浆，分离血浆外泌体，提取血浆外泌体的总RNA，测定提取的总RNA的浓度，采用加尾法逆转录获得cDNA，将获得的cDNA进行实时荧光定量PCR，以上均按照实施例1中的操作方法进行。

使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析。以有淋巴结转移的食管癌患者组△CT平均值作为对照，分别计算有、无伴淋巴结转移组的食管癌患者2^-△△CT并绘制散点图。通过构建受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristics，ROC曲线)来评价血浆外泌体中miR-493-5p用于判断有无淋巴结转移效能的敏感性、特异性。p＜0.05视为差异有统计学意义。

实时荧光定量结果如图4所示，结果显示有淋巴结转移的食管癌患者血浆外泌体中miR-493-5p的表达水平较无淋巴结转移的食管癌患者显著降低，差异具有统计学意义(p＜0.001)。

进而利用ROC曲线分析，检测血浆外泌体中miR-493-5p对判断食管癌患者有无淋巴结转移的检验效能，ROC曲线如图5所示，分析显示，AUC为0.920，灵敏度为90.17％，特异性为84.58％，实验结果表明，血浆外泌体中miR-493-5p对判断食管癌患者有无淋巴结转移具有较高的灵敏度及特异性。基于血浆外泌体的miR-493-5p制作的试剂盒可用来预警食管癌淋巴结转移。

实施例3、手术前后食管癌血浆外泌体的miR-493-5p表达水平差异

收集食管癌患者术前及术后7天的血浆，分离血浆外泌体，提取血浆外泌体的总RNA，测定提取的总RNA的浓度，采用加尾法逆转录获得cDNA，将获得的cDNA进行实时荧光定量PCR，以上均按照实施例1中的操作方法进行。

实时荧光定量结果如图6所示，通过将食管癌患者手术前后的血浆外泌体中miR-493-5p的表达量作对比，发现手术后食管癌患者血浆外泌体中miR-493-5p表达水平较手术前显著升高(p＜0.001)。基于血浆外泌体的miR-493-5p制作的试剂盒可用来判断食管癌患者手术治疗情况，为食管癌患者的术后治疗提供指导。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> miR-493-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及食管癌检测试剂

盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

uuguacaugg uaggcuuuca uu 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcttgtaca tggtaggctt tcatt 25

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcgcttcgg cagcaca 17

Claims (7)

1.血浆外泌体中miR-493-5p的检测试剂在制备预警食管癌患者淋巴结转移的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miR-493-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括miR-493-5p的逆转录反应试剂和miR-493-5p的荧光定量PCR反应试剂，所述试剂盒以从血浆中分离的外泌体为检测对象。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述miR-493-5p的荧光定量PCR反应试剂包括miR-493-5p的正向引物和反向引物，所述 正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物为通用引物。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述miR-493-5p的逆转录反应采用加尾法进行。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括内参体系。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述内参体系为内参基因U6的实时荧光定量PCR的检测体系，包括U6基因的正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述反向引物为通用引物。

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