CN112359095A - 一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒 - Google Patents
一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112359095A CN112359095A CN202011453030.XA CN202011453030A CN112359095A CN 112359095 A CN112359095 A CN 112359095A CN 202011453030 A CN202011453030 A CN 202011453030A CN 112359095 A CN112359095 A CN 112359095A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- sequence
- seq
- ssdna
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于雌激素检测领域,涉及一种基于多步等温循环扩增的17β‑雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒。该方法包括以下步骤:S1.构建复合DNA修饰的磁珠;S2.合成环DNA;S3.多步等温循环扩增;将含有E2的待测溶液与复合DNA修饰的磁珠混合反应,反应后将溶液进行磁分离,取溶液的上清液,加入模板DNA、链置换扩增的限制性核酸内切酶、具有链置换活性的DNA聚合酶和dNTPs混合孵育并反应后,加入circ‑DNA、滚环扩增用酶、dNTPs、分子信标进行滚环扩增和分子信标的识别;然后采用荧光分光光度计测荧光值。本发明的方法无需复杂仪器检测,产物稳定性高、成本较低,该方法检测限可达到15.85fg/mL,达到超灵敏检测的要求。
Description
技术领域
本发明属于雌激素检测领域,具体地,涉及一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法,以及一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测试剂盒。
背景技术
由于雌激素类药物的非法使用,在靠近废水处理设施的地点和全球各地的地下水中都检测到了处于污染水平的雌激素。17β-雌二醇(E2)是诸多环境雌激素中作用最强烈的一种,仅仅是nM级别的残留量即可对人类内分泌系统产生不良影响。水产品、饮用水以及牛奶和乳制品中E2残留问题日益严重,E2的污染问题已经成为严重的公共卫生问题。欧盟(EU)2015年发布的观察清单,E2以极低的检测限(0.4ng/L)被纳入监测的10种物质。由于现有的监测技术的限制,2018年监测结束时,8个成员国未达到E2所需的灵敏度。因此,E2在2018年发布的修订版观察清单中得到了保留。因此,本领域亟需建立一种超灵敏、便捷的E2检测技术。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明将适体技术和多种等温扩增技术相结合,建立了一种超灵敏、便捷的检测手段,以实现饮水及牛奶中E2的超灵敏检测。
为了实现上述目的,本发明提供一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法,该方法包括以下步骤:
S1.构建复合DNA修饰的磁珠
将3'端生物素标记的适配体和cDNA混合,得到复合DNA,将链霉亲和素修饰的磁珠与所述复合DNA混合,得到复合DNA修饰的磁珠;
所述适配体为17β-雌二醇(E2)的适配体,所述cDNA为E2适配体的互补序列;
S2.合成环DNA
将用于滚环扩增的锁式探针和引物探针混合,加入DNA连接酶进行连接,然后加入核酸外切酶去除未环化的锁式探针和引物探针,得到环DNA(circ-DNA);
S3.多步等温循环扩增
将含有E2的待测溶液与复合DNA修饰的磁珠混合反应,反应后将溶液进行磁分离,取溶液的上清液,加入模板DNA、链置换扩增用限制性核酸内切酶、具有链置换活性的DNA聚合酶和dNTPs混合孵育并反应后,加入circ-DNA、滚环扩增用酶、dNTPs、分子信标进行滚环扩增和分子信标的识别;然后采用荧光分光光度计测荧光值;
其中,所述模板DNA能够与cDNA特异性识别并经链置换扩增生成ssDNA;所述ssDNA能够与环DNA特异性识别,启动RCA-多引物RCA反应,生成L-ssDNA;所述分子信标能够与L-ssDNA特异性识别,并通过结合L-ssDNA恢复其荧光。
本发明的原理是,如图3所示,E2适配体与其互补DNA杂交后,修饰在磁球上。当检测体系中有E2目标物小分子存在时,E2结合磁珠上的适配体,使cDNA游离在上清液中。磁分离取上清,加入模板(Template)与之结合,在Klenow Fragment(3'→5'exo-)酶、Nb.BbvCI酶的作用下启动链置换扩增(SDA),生成短单链DNA(ssDNA),ssDNA也可以与Template特异性结合,继续引发SDA反应,短时间循环扩增产生大量的ssDNA。加入环DNA(circ-DNA)后,ssDNA可以与circ-DNA特异性结合,在Phi29酶的作用下引发滚环扩增(RCA),生成的长单链DNA(L-ssDNA)在Nb.BbVCI刻痕酶的作用下水解成三种不同引物序列的同时启动多引物滚环扩增,最终生成L-ssDNA产物。整个反应在短时间内可以生成大量的可被分子信标识别的L-ssDNA,加入分子信标后,L-ssDNA与分子信标的颈环结构特异性结合,恢复分子信标的荧光,输出荧光信号。
为了保证检测的特异性,结合cDNA序列设计了本发明中用到的所有DNA序列。各DNA序列之间有交叉互补序列。具体地,如表1所示,所述cDNA的序列为SEQ ID NO:1所示;所述适配体的序列为SEQ ID NO:2所示;所述锁式探针的序列为SEQ ID NO:3所示;所述引物探针的序列为SEQ ID NO:4所示;所述模板DNA的序列为SEQ ID NO:5所示;所述ssDNA的序列为SEQ ID NO:6所示;所述L-ssDNA的序列为SEQ ID NO:7所示;所述分子信标的序列为SEQ ID NO:8所示,两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团。
表1寡核苷酸序列
*相同下标线型的序列彼此互补,灰色高亮区为酶剪切位点,SEQ ID NO:6和SEQID NO:7均为扩增生成产物,其中SEQ ID NO:7是重复DNA序列的串联,表格中列的序列为一个重复单元的所有序列。
根据本发明的方法,优选地,步骤S1中,3'端生物素标记的适配体和cDNA的摩尔比为1:1-4。具体地,可以为1:1、1:1.25、1:1.3、1:1.5、1:2、1:3、1:4的配比,并且在此范围内的其他摩尔比例也可达到本发明的测试结果。
根据本发明的方法,优选地,该方法还包括制备标准曲线的步骤:按照S1-S3的方法,检测一系列已知浓度的E2,测得多个荧光值,分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图,得到标准曲线。继而,还可以包括:基于标准曲线,计算含有E2的待测溶液中E2的浓度。
根据本发明的方法,所述含有E2的待测溶液由待测样品制备,所述待测样品包括但不限于自来水、污水、牛奶、酸奶、奶酪或其他奶制品。
本发明的第二方面提供一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测试剂盒,该试剂盒包括以下组分:
(1)3'端生物素标记的17β-雌二醇(E2)的适配体;
(2)所述适配体的互补DNA(cDNA);
(3)链霉亲和素修饰的磁珠;
(4)任选的用于滚环扩增的反应体系,包括环DNA,所述环DNA由用于滚环扩增的锁式探针和引物探针连接得到;
(5)模板DNA;
(6)任选的用于链置换扩增的反应体系;
(7)任选的用于滚环扩增的反应体系;
(8)分子信标;
其中,所述模板DNA能够与cDNA特异性识别并经链置换扩增生成ssDNA;所述ssDNA能够与环DNA特异性识别,启动RCA-多引物RCA反应,生成L-ssDNA;所述分子信标能够与L-ssDNA特异性识别,并通过结合L-ssDNA恢复其荧光。
各序列如前所述,在此不再赘述。
根据本发明,所述用于滚环扩增的反应体系还可以包括:锁式探针和引物探针、DNA连接酶、核酸外切酶。所述DNA连接酶例如为T4 DNA连接酶,所述核酸外切酶例如为核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶III。
根据本发明,所述用于链置换扩增的反应体系还可以包括:限制性核酸内切酶和具有链置换活性的DNA聚合酶。所述限制性核酸内切酶例如为Nb.BbvCI酶,所述具有链置换活性的DNA聚合酶例如为Klenow Fragment(3'→5'exo-)酶。
根据本发明,所述用于滚环扩增的反应体系还可以包括:滚环扩增用酶、dNTPs。所述滚环扩增用酶例如为Phi29酶。
相较于其他检测方法,本发明方法具有较高的特异性和灵敏度。高特异性来自以下三个方面:(1)模板DNA被cDNA特异性识别生成产物ssDNA。(2)circ-DNA被ssDNA特异识别,启动RCA-多引物RCA反应,生成L-ssDNA。(3)分子信标被多步等温扩增产物L-ssDNA特异识别。高灵敏度来源于:(1)SDA、RCA和多引物RCA级联放大了微量cDNA的信号,产生了大量的L-ssDNA。(2)L-ssDNA与分子信标的环状结构特异性识别,恢复分子信标的荧光,进一步放大产物的信号。该方法也可以应用于其他目标物的检测,结合相应的目标物,设计不同的检测DNA,可以实现不同目标物的超灵敏检测。
本发明的方法无需复杂仪器检测,产物稳定性高、成本较低,该方法检测限可达到15.85fg/mL,达到超灵敏检测的要求。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述,本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为构建好的复合DNA修饰的磁珠的扫描电镜(SEM)图。M270磁珠(A)和修饰复合DNA的M270磁珠(B)。
图2为合成的环DNA序列电泳结果图。
图3为本发明的原理简图。
图4为多步等温循环扩增产物的电泳结果图。可以看出,多步等温扩增生成L-ssDNA的量,明显多于单纯的RCA反应。
图5为分子信标结合L-ssDNA前后的荧光信号变化图。其中上方的曲线代表M3+RCA(经过RCA反应的分子信标M3),中间曲线代表M3(未经RCA反应的分子信标M3),下方曲线代表水(WATER,阴性对照)。RCA反应后分子信标的荧光值出现了明显增加,说明生成的L-ssDNA产物能够与分子信标的颈环结构特异性结合,恢复分子信标的荧光。
图6为本发明的检测标准曲线。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式,然而应该理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例中未注明具体条件者,皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
以下实施例中,
M270链霉亲和素修饰的磁珠购自Thermo Fisher Scientific,β-雌二醇(E2)标准品购自北京百灵威科技有限公司。
为了保证检测的特异性,结合cDNA序列设计了本实施例中用到的所有DNA序列。各DNA序列之间有交叉互补序列(具体如表1所示)。
检测体系构建的具体实施步骤如下:
(1)复合DNA修饰的磁珠的构建。
将3'端具有生物素标记的E2的适配体(B-cDNA)和cDNA以1:1.25的摩尔比例混合后,95℃孵育10min,得到复合DNA,缓慢降至室温,4℃保存待下一步使用。链霉亲和素修饰的磁珠(M270)50μL加入低吸附离心管中,用PBS缓冲液洗涤3次,加入100nM的复合DNA溶液100μL,于37℃垂直混悬仪上反应30min,PBS洗涤三次后重悬于100μL PBS缓冲液中。即可得到复合DNA修饰的磁珠,4℃储存备用。图1是M270磁珠(A)和修饰复合DNA的M270磁珠(B)的扫描电镜(SEM)表征结果,与M270磁珠相比,修饰了复合DNA的M270磁珠表面出现了浆膜状的结构且彼此之间有轻微的粘连,说明修饰成功。
(2)环DNA的合成。
①连接反应:锁式探针和引物探针以1:1的摩尔比例混合后,95℃孵育10min,缓慢降至室温,加入1μL T4 DNA连接酶(350U/μL)、振荡混匀、离心后16℃、连接2h,随后65℃、10min灭活T4 DNA连接酶。
②消解反应:向①反应完成的产物中加入2μL核酸外切酶Ⅰ(ExonucleaseⅠ)、2μL核酸外切酶III(Exonuclease III)、2μL DEPC水,振荡混匀,37℃下酶切40min、除去未环化的锁式探针和引物探针,酶切完成后,95℃ 5min,灭活两种外切酶。即可得到环DNA,-20℃储存备用。图2为合成的环DNA序列电泳结果图。锁式探针(padlock probe)和引物探针(primer probe)在酶的作用下连接成环DNA(circ-DNA)、与padlock probe单链寡核苷酸序列相比,circ-DNA拥有更为复杂的DNA环状结构,DNA环状结构会影响DNA在电泳中的迁移速率。电泳结果中经过消解反应去除未环化的DNA后,circ-DNA的条带出现在了padlockprobe靠上的位置,说明合成circ-DNA成功。
(3)多步等温循环扩增:将E2标准品溶液滴加100μL于复合DNA修饰的磁珠中,37℃垂直混悬仪上反应30min,取上清;加入Template 10μL、Klenow Fragment(3'→5'exo-)酶1.5μL、Nb.BbvCI酶3μL、dNTPs 2μL,37℃、1h,80℃、20min;加入环DNA 10μL、Phi29酶1μL、dNTPs 4μL、分子信标10μL、30℃、1h,95℃、10min。采用荧光分光光度计测荧光值。
(4)以E2标准品溶液的浓度为横坐标,荧光值为纵坐标制作标准曲线(图6)。
实施例2
本实施例用于说明本发明的方法用于实际样品检测。
根据实施例1的步骤(1)-(2)制备复合DNA修饰的磁珠和环DNA。
S1.样品前处理:取1mL牛奶用PBS稀释成10mL,涡旋混匀,12000r/min离心10min取上清。
S2.实际样品检测:将上述样品处理液滴加100μL于复合DNA修饰的磁珠中,37℃垂直混悬仪上反应30min,取上清;加入Template 10μL、Klenow Fragment(3'→5'exo-)酶1.5μL、Nb.BbvCI酶3μL、dNTPs 2μL,37℃、1h,80℃、20min;加入环DNA 10μL、Phi29酶1μL、dNTPs4μL、分子信标10μL、30℃、1h,95℃、10min。采用荧光分光光度计测荧光值。
S3.将步骤S2测得的荧光值代入实施例1制得的标准曲线中,计算牛奶样品中E2的浓度,实际样品的加标回收实验结果如表2所示。
表2
以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒
<130> BJI2002238PY
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcttccagct tattgaatta cacgcagagg gtagcggctc tgcgcattca attgctgcgc 60
gctgaagcgc ggaagc 76
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaatttaaa atgtaattca ataagctgga agc 33
<210> 3
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attgaattac acctcagccc ctaccattat taatagactg cctcagccac catcaccttt 60
gctatttaac ctcagcgctt ccagctt 87
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtaattcaa taagctggaa gc 22
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcttccagct tattgaatta cacctcagct tccagcttat tgaattaca 49
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgaggcagt ctattaataa tggtaggggc tgag 34
<210> 7
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctgaggtta aatagcaaag gtgatggtgg ctgaggcagt ctattaataa tggtaggggc 60
tgaggtgtaa ttcaataagc tggaagc 87
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgactacac catcaccttt gctatttaat agtcat 36
Claims (10)
1.一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法,该方法包括以下步骤:
S1.构建复合DNA修饰的磁珠
将3'端生物素标记的适配体和cDNA混合,得到复合DNA,将链霉亲和素修饰的磁珠与所述复合DNA混合,得到复合DNA修饰的磁珠;
所述适配体为17β-雌二醇(E2)的适配体,所述cDNA为E2适配体的互补序列;
S2.合成环DNA
将用于滚环扩增的锁式探针和引物探针混合,加入DNA连接酶进行连接,然后加入核酸外切酶去除未环化的锁式探针和引物探针,得到环DNA(circ-DNA);
S3.多步等温循环扩增
将含有E2的待测溶液与复合DNA修饰的磁珠混合反应,反应后将溶液进行磁分离,取溶液的上清液,加入模板DNA、链置换扩增用限制性核酸内切酶、具有链置换活性的DNA聚合酶和dNTPs混合孵育反应后,加入circ-DNA、滚环扩增用酶、dNTPs、分子信标进行滚环扩增和分子信标的识别;然后采用荧光分光光度计测荧光值;
其中,所述模板DNA能够与cDNA特异性识别并经链置换扩增生成ssDNA;所述ssDNA能够与环DNA特异性识别,启动RCA-多引物RCA反应,生成L-ssDNA;所述分子信标能够与L-ssDNA特异性识别,并通过结合L-ssDNA恢复其荧光。
2.根据权利要求1所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法,其中,
所述适配体的序列为5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-Biotin-3'(SEQ ID NO:1);
所述cDNA的序列为5'-AAAATTTAAAATGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'(SEQ ID NO:2);
所述锁式探针的序列为5'-Phosphate-ATTGAATTACACCTCAGCCCCTACCATTATTAATAGACTGCCTCAGCCACCATCACCTTTGCTATTTAACCTCAGCGCTTCCAGCTT-3'(SEQ ID NO:3);
所述引物探针的序列为5'-TGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'(SEQ ID NO:4);
所述模板DNA的序列为5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACCTCAGCTTCCAGCTTATTGAATTACA-3'(SEQ ID NO:5);
所述ssDNA的序列为5'-CTGAGGCAGTCTATTAATAATGGTAGGGGCTGAG-3'(SEQ ID NO:6);
所述L-ssDNA多为重复单元序列,其中一个重复单元的序列为5'-GCTGAGGTTAAATAGCAAAGGTGATGGTGGCTGAGGCAGTCTATTAATAATGGTAGGGGCTGAGGTGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'(SEQID NO:7);
所述分子信标的序列为5'-FAM-ATGACTACACCATCACCTTTGCTATTTAATAGTCAT-BHQ1-3'(SEQ ID NO:8),两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法,其中,步骤S1中,3'端生物素标记的适配体和cDNA的摩尔比为1:1-4。
4.根据权利要求1所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法,其中,该方法还包括制备标准曲线的步骤:按照S1-S3的方法,检测一系列已知浓度的E2,测得多个荧光值,分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图,得到标准曲线。
5.根据权利要求4所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法,其中,该方法还包括:基于标准曲线,计算含有E2的待测溶液中E2的浓度。
6.根据权利要求1所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法,其中,所述含有E2的待测溶液由待测样品制备,所述待测样品为自来水、污水、牛奶、酸奶、奶酪或其他奶制品。
7.一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测试剂盒,该试剂盒包括以下组分:
(1)3'端生物素标记的17β-雌二醇(E2)的适配体;
(2)所述适配体的互补DNA(cDNA);
(3)链霉亲和素修饰的磁珠;
(4)任选的用于滚环扩增的反应体系,包括环DNA,所述环DNA由用于滚环扩增的锁式探针和引物探针连接得到;
(5)模板DNA;
(6)任选的用于链置换扩增的反应体系;
(7)任选的用于滚环扩增的反应体系;
(8)分子信标;
其中,所述模板DNA能够与cDNA特异性识别并经链置换扩增生成ssDNA;所述ssDNA能够与环DNA特异性识别,启动RCA-多引物RCA反应,生成L-ssDNA;所述分子信标能够与L-ssDNA特异性识别,并通过结合L-ssDNA恢复其荧光。
8.根据权利要求7所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测试剂盒,其中,所述适配体的序列为SEQ ID NO:1所示;所述cDNA的序列为SEQ ID NO:2所示;所述锁式探针的序列为SEQ ID NO:3所示;所述引物探针的序列为SEQ ID NO:4所示;所述模板DNA的序列为SEQ ID NO:5所示;所述ssDNA的序列为SEQ ID NO:6所示;所述L-ssDNA的序列为SEQID NO:7所示;所述分子信标的序列为SEQ ID NO:8所示,两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团。
9.根据权利要求7所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测试剂盒,其中,所述用于滚环扩增的反应体系还包括:锁式探针和引物探针、DNA连接酶、核酸外切酶;
所述用于链置换扩增的反应体系还包括:限制性核酸内切酶和具有链置换活性的DNA聚合酶;
所述用于滚环扩增的反应体系还包括:滚环扩增用酶、dNTPs。
10.根据权利要求7所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测试剂盒,其中,所述3'端生物素标记的适配体和cDNA以DNA复合物的形式提供。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011453030.XA CN112359095B (zh) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | 一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011453030.XA CN112359095B (zh) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | 一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112359095A true CN112359095A (zh) | 2021-02-12 |
CN112359095B CN112359095B (zh) | 2022-11-15 |
Family
ID=74536151
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011453030.XA Active CN112359095B (zh) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | 一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112359095B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113293165A (zh) * | 2021-06-21 | 2021-08-24 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用 |
CN113804898A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-12-17 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 同时检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的荧光传感方法和试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6291187B1 (en) * | 2000-05-12 | 2001-09-18 | Molecular Staging, Inc. | Poly-primed amplification of nucleic acid sequences |
CN104789667A (zh) * | 2015-04-08 | 2015-07-22 | 西安交通大学 | 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法 |
US20200040376A1 (en) * | 2016-12-16 | 2020-02-06 | Q-Linea Ab | Padlock probe detection method |
-
2020
- 2020-12-11 CN CN202011453030.XA patent/CN112359095B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6291187B1 (en) * | 2000-05-12 | 2001-09-18 | Molecular Staging, Inc. | Poly-primed amplification of nucleic acid sequences |
CN104789667A (zh) * | 2015-04-08 | 2015-07-22 | 西安交通大学 | 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法 |
US20200040376A1 (en) * | 2016-12-16 | 2020-02-06 | Q-Linea Ab | Padlock probe detection method |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
XUAN SUN ET AL.: "CRISPR-Cas9 Triggered Two-Step Isothermal Amplification Method for E. coli O157:H7 Detection Based on a Metal−Organic Framework Platform", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
YU WANG ET AL.: "A fluorescent amplification strategy for high-sensitive detection of 17 β-estradiol based on EXPAR and HCR", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
张凤兰: "血清β-HCG、雌二醇和孕酮联合检测对异位妊娠的诊断意义", 《中国当代医药》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113293165A (zh) * | 2021-06-21 | 2021-08-24 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用 |
CN113804898A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-12-17 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 同时检测皮质醇、血清睾酮、肌酸激酶同工酶的荧光传感方法和试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112359095B (zh) | 2022-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10400279B2 (en) | Method for constructing a sequencing library based on a single-stranded DNA molecule and application thereof | |
US5500356A (en) | Method of nucleic acid sequence selection | |
CN112359095B (zh) | 一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒 | |
CN110129415B (zh) | 一种ngs建库分子接头及其制备方法和用途 | |
CN101589154A (zh) | 单链引物-启动子-选择子构建体的ivt的应用 | |
CN104755630B (zh) | 多阶段核酸扩增 | |
CN111235313A (zh) | 一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法 | |
CN101260431A (zh) | 基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法 | |
WO1993008305A1 (en) | Method of sequencing double stranded dna | |
CN109486923A (zh) | 多重扩增子测序用引物系统、其应用以及测序文库的构建方法 | |
CN113174426B (zh) | 一种rca-纳米磁珠复合物及其制备与应用 | |
CN109252224A (zh) | 一种环状探针和基于环状探针捕获的测序文库构建方法 | |
CN108676799B (zh) | 基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的探针、试剂盒及方法 | |
TWI699435B (zh) | 建構環狀模板和檢測dna分子的方法 | |
CN113039283A (zh) | 分离和/或富集宿主源核酸和病原核酸的方法和试剂及其制备方法 | |
CN109609611A (zh) | 一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法 | |
CN101319190B (zh) | 一种核酸富集器及其应用 | |
CN110387399B (zh) | 一种线性扩增双链dna的方法及应用 | |
CN111378724B (zh) | 一种rna放大检测方法及检测试剂盒 | |
CN110643724A (zh) | Raa荧光法检测ndm的引物、探针、试剂盒和检测方法 | |
CN111996239A (zh) | 用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针及其检测方法 | |
CN107419031A (zh) | 基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法 | |
CN109991203B (zh) | 一种用于检测赭曲霉素a的试剂盒及方法 | |
CN111635956A (zh) | 一种实时检测土壤中马铃薯粉痂病菌的方法 | |
JP2905192B2 (ja) | 遺伝子発現の定量方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |