CN112359086A - 一种酶法制备植物甾醇酯的方法 - Google Patents

一种酶法制备植物甾醇酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶法制备植物甾醇酯的方法，包括以下步骤：1)预处理：去除植物油脱臭馏出物原料油中的水分；2)将预处理后的植物油脱臭馏出物原料油加入脂肪酶MAS1突变体进行反应，将原料油中的植物甾醇转化为植物甾醇酯；所述脂肪酶MAS1突变体的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明脂肪酶对植物油脱臭馏出物中植物甾醇转化为植物甾醇酯具有较高的选择性，最终可将植物油脱臭馏出物中70％的甾醇转化为甾醇酯。同时，本方法也可将原料油中的生育酚与角鲨烯得到最大限度的保留，将产品分离后，实现植物油脱臭馏出物的高值化利用。本发明反应条件温和，操作步骤简便，采用无溶剂体系，常温常压，具有良好的经济效益和环境效益。

Description

一种酶法制备植物甾醇酯的方法
技术领域
本发明涉及一种酶法制备植物甾醇酯的方法。
背景技术
植物油脱臭馏出物是油脂加工过程中所得的副产物，指植物油在脱臭过程中所得到的各种馏分的混合物。植物油脱臭馏出物中除了含有大量的游离脂肪酸与甘油酯以外，还含有丰富的活性成分，包括植物甾醇、角鲨烯、生育酚。脱臭馏出物当中含有大约40-60％的游离脂肪酸、10-30％的甘油酯、2-10％的植物甾醇、5-10％的生育酚、1-2％的角鲨烯。
植物甾醇是天然存在于食品中的微量成分，由于它可以降低人体总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，又不影响人体高密度胆固醇水平，从而降低人患冠心病的几率，是一种对人体有益的活性成分。而由于植物甾醇的物理性质，微溶于水且在油中的溶解性也不好，在常温下为晶体形式，这极大地限制了植物甾醇在食品工业中的应用。植物甾醇酯是植物甾醇的衍生物，与植物甾醇具有相同的生理功能，且相较于植物甾醇具有更好的脂溶性和更低的熔点，在工业上有着更为广泛的应用。天然生育酚在人体中可发挥重要的活性功能，抗自由基，抗衰老，提高人体的免疫功能。角鲨烯作为人体同样重要的活性成分，具有帮助人体改善心脑血管的供血作用，改善胆固醇的代谢等多种生理功能。
发明内容
本发明的目的是将一种来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1的突变体应用于植物油脱臭馏出物高值化利用领域中，该固定化酶可以用于催化甾醇和游离脂肪酸反应生成甾醇酯。
本发明为了达到上述目的，通过以下技术方案实现：
一种酶法制备植物甾醇酯的方法，包括以下步骤：
1)预处理：去除植物油脱臭馏出物原料油中的水分；
2)将预处理后的植物油脱臭馏出物原料油加入脂肪酶MAS1突变体进行反应，将原料油中的植物甾醇转化为植物甾醇酯；所述脂肪酶MAS1突变体的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
优选地，步骤2)中所述的脂肪酶添加量为基于原料油质量的25-45U/g。
优选地，步骤2)中所述反应温度30℃-40℃。
优选地，步骤1)中所述的植物油脱臭馏出物原料油为大豆油脱臭馏出物原料油。
优选地，步骤1)中所述的大豆油脱臭馏出物原料油的酸价为80～120mg/g，植物甾醇含量占原料油的2～10％。
优选地，步骤1)所述的水分去除方法为70±10℃抽真空(2h)至表面无明显气泡。
优选地，步骤2)中所述的脂肪酶MAS1突变体为固定化脂肪酶，并以超大孔疏水非极性的树脂作为固定化载体。
优选地，所述固定化载体为树脂D5753、树脂AP1090、树脂ECR1030M、树脂ECR8285、树脂AMBERLITEXAD1180N。
优选地，所述的植物油脱臭馏出物为大豆油脱臭馏出物，酸价为80～120mg/g，植物甾醇含量占原料油的2～10％。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)该固定化酶较高的酯化和转酯化以及耐甲醇能力，对植物油脱臭馏出物中植物甾醇转化为植物甾醇酯具有较高的选择性。反应最终可将植物油脱臭馏出物中70％以上的甾醇转化为甾醇酯，且将原本高酸价的原料油酸价降至2mg/g以下。
(2)在制备甾醇酯的同时，可以实现生育酚与角鲨烯最大限度的保留。
(3)本发明反应条件温和，能耗低，环境友好，操作步骤简便，采用无溶剂体系，常温常压，极大节省了工业应用上的能耗支出，具有良好的经济效益和环境效益。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明。实施例中所用的技术手段为本领域技术人员的常规手段。
实施例1制备脂肪酶MAS1-H108A
脂肪酶MAS1-H108A的制备过程如下：
(1)菌种的活化：将MAS1-H108A-pPICZαA-PDI质粒线性化，电转至毕赤酵母X33感受态中，筛选出阳性菌株；将该毕赤酵母X33甘油菌划线于含有Zeocin的YPD固体平板，于30℃的培养箱中培养60-75h；
(2)一级种子液的制备：将得到的单菌落接种到已灭菌的含有50mL YPD液体培养基的锥形瓶中，再将锥形瓶置于温度为30℃和转速为200rpm的摇床中振荡培养18-24h，即得一级种子液；
(3)二级种子液的制备：将5mL一级种子液接入到已灭菌的100mL新鲜YPD液体培养基中，于转速为200rpm的30℃摇床中振荡培养24h；
(4)发酵罐发酵：将二级种子液按照10％接种量接到发酵罐培养基中，酵母生长阶段(即未开始诱导阶段)，其发酵条件为30-35℃，pH 5.0，600rpm；当菌体湿重达到180g/L左右时，葡萄糖消耗完，开始补加甲醇进行诱导表达，在温度为24℃和pH值为6.0的条件下，诱导培养6天，在整个发酵过程中的溶氧量均控制在20-60％之间；
(5)脂肪酶MAS1-H108A的获得：诱导结束后，将发酵液置于温度为4℃和转速为12000rpm的离心机中离心15min，用0.45μm的滤膜过滤所得的上清液，再用膜包浓缩，浓缩完后，分别利用橄榄油乳化法和考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度试剂盒测定发酵液的水解酶活和蛋白浓度，并将其保存于4℃冰箱中备用。
实施例2制备固定化脂肪酶MAS1-H108A
将脂肪酶MAS1-H108A与树脂D5753(孔径200-350nm，超大孔径，购自漂莱特公司)、LifetechTMECR1030M(孔径22-34nm，介孔树脂，购自漂莱特公司)、LifetechTMECR8285(孔径45-65nm，大孔树脂，购自漂莱特公司)、AMBERLITETMXADTM1180N(孔径30-55nm，介孔树脂，购自陶氏公司)、AB-8(孔径13-14nm，介孔树脂，购自天津津达树脂厂)固定化。发酵液经过离心、浓缩后，向100mL酶液中加入占20mL磷酸盐缓冲液，调节pH为7；并按照10,000U/g的总酶活/载体的比例加入载体，与酶液混合搅拌8h，采用布氏漏斗将固定化酶抽滤，使用磷酸盐缓冲液清洗固定化酶至滤液中无蛋白存在，沥干固定化酶并于40℃下干燥6h。即可制得固定化脂肪酶。
实施例3
50mL具塞三角瓶中加入40.7g去除水分的大豆油脱臭馏出物，加入基于单位原料油质量25U/g的来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1突变体的固定化脂肪酶(载体为D5753)，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，反应12h后，71％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生育酚的保留率为99.86％，角鲨烯的保留率为99.91％。
实施例4
50mL具塞三角瓶中加入40.7g去除水分的大豆油脱臭馏出物，加入基于单位原料油质量35U/g的来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1突变体的固定化脂肪酶(载体为D5753)，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，反应12h后，72.6％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生育酚的保留率为99.82％，角鲨烯的保留率为99.92％。
实施例5
50mL具塞三角瓶中加入40.7g去除水分的大豆油脱臭馏出物，加入基于单位原料油质量45U/g的来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1突变体的固定化脂肪酶(载体为D5753)，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，反应12h后，73.1％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生育酚的保留率为99.88％，角鲨烯的保留率为99.82％。
实施例6
50mL具塞三角瓶中加入40.7g去除水分的大豆油脱臭馏出物，加入基于单位原料油质量25U/g的来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1突变体的固定化脂肪酶(载体为D5753)，置于30℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，反应12h后，70.1％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生育酚的保留率为99.72％，角鲨烯的保留率为99.81％。
实施例7
50mL具塞三角瓶中加入40.7g去除水分的大豆油脱臭馏出物，9.3g甲醇(摩尔比为1：2)，加入基于单位原料油质量25U/g的来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1突变体的固定化脂肪酶(载体为D5753)，置于40℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，0、2、4h分3次分批添加甲醇，反应12h后，72.8％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生物柴油的产率为96.4％，生育酚的保留率为99.28％，角鲨烯的保留率为99.29％，原料油酸价降为1.26mg/g。
实施例8
50mL具塞三角瓶中加入44.87g去除水分的大豆油脱臭馏出物，5.12g甲醇(摩尔比为1：1)，加入基于单位原料油质量25U/g的来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1突变体的固定化脂肪酶(载体为D5753)，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，0、2、4h分3次分批添加甲醇，反应12h后，70.5％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生物柴油的产率为95.1％，生育酚的保留率为99.19％，角鲨烯的保留率为99.92％，原料油酸价降为1.84mg/g。
实施例9
50mL具塞三角瓶中加入42.68g去除水分的大豆油脱臭馏出物，7.31g甲醇(摩尔比为1：1.5)，加入基于单位原料油质量25U/g的来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1突变体的固定化脂肪酶(载体为D5753)，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，0、2、4h分3次分批添加甲醇，反应12h后，71.4％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生物柴油的产率为95.5％，生育酚的保留率为99.85％，角鲨烯的保留率为99.97％，原料油酸价降为1.62mg/g。
实施例10
50mL具塞三角瓶中加入38.88g去除水分的大豆油脱臭馏出物，11.11g甲醇(摩尔比为1：2.5)，加入基于单位原料油质量25U/g的来源于放线菌(Streptomyces sp.)脂肪酶MAS1突变体的固定化脂肪酶(载体为D5753)，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，0、2、4h分3次分批添加甲醇，反应12h后，71.9％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生物柴油的产率为96.7％，生育酚的保留率为99.85％，角鲨烯的保留率为99.96％，原料油酸价降为1.22mg/g。
脂肪酶Novozym435对比例1
50mL具塞三角瓶中加入44.87g去除水分的大豆油脱臭馏出物，5.12g甲醇(摩尔比为1：1)，加入基于单位原料油质量25U/g的商品化脂肪酶Novozym435，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，0、2、4h分3次分批添加甲醇，反应12h后，16.6％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生物柴油的产率为44.2％，生育酚的保留率为89.34％，角鲨烯的保留率为99.31％，原料油酸价降为52.6mg/g。
脂肪酶RM对比例2
50mL具塞三角瓶中加入44.87g去除水分的大豆油脱臭馏出物，5.12g甲醇(摩尔比为1：1)，加入基于单位原料油质量25U/g的商品化脂肪酶RM，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，0、2、4h分3次分批添加甲醇，反应12h后，3.2％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生物柴油的产率为7.57％，生育酚的保留率为68.98％，角鲨烯的保留率为99.90％，原料油酸价降为72.3mg/g。
脂肪酶RMIM对比例3
50mL具塞三角瓶中加入44.87g去除水分的大豆油脱臭馏出物，加入基于单位原料油质量25U/g的商品化脂肪酶RMIM，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，反应12h后，8.22％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生育酚的保留率为97.2％，角鲨烯的保留率为99.83％。
脂肪酶TLIM对比例4
50mL具塞三角瓶中加入44.87g去除水分的大豆油脱臭馏出物，加入基于单位原料油质量25U/g的商品化脂肪酶TLIM，置于35℃水浴摇床中，摇床转速200rpm，反应12h后，2.8％的植物甾醇转化为植物甾醇酯，生育酚的保留率为99.8％，角鲨烯的保留率为96.43％。
表1
Figure BDA0002733340630000061
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种酶法制备植物甾醇酯的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Thr Ser Arg Gly
1 5 10 15
Trp Asn Asp Tyr Ser Cys Lys Pro Ser Ala Ala His Pro Arg Pro Val
20 25 30
Val Leu Val His Gly Thr Phe Gly Asn Ser Ile Asp Asn Trp Leu Val
35 40 45
Leu Ala Pro Tyr Leu Val Asn Arg Gly Tyr Cys Val Phe Ser Leu Asp
50 55 60
Tyr Gly Gln Leu Pro Gly Val Pro Phe Phe His Gly Leu Gly Pro Ile
65 70 75 80
Asp Lys Ser Ala Glu Gln Leu Asp Val Phe Val Asp Lys Val Leu Asp
85 90 95
Ala Thr Gly Ala Pro Lys Ala Asp Leu Val Gly Ala Ser Gln Gly Gly
100 105 110
Met Met Pro Asn Tyr Tyr Leu Lys Phe Leu Gly Gly Ala Asp Lys Val
115 120 125
Asn Ala Leu Val Gly Ile Ala Pro Asp Asn His Gly Thr Thr Leu Leu
130 135 140
Gly Leu Thr Lys Leu Leu Pro Phe Phe Pro Gly Val Glu Lys Phe Ile
145 150 155 160
Ser Asp Asn Thr Pro Gly Leu Ala Asp Gln Val Ala Gly Ser Pro Phe
165 170 175
Ile Thr Lys Leu Thr Ala Gly Gly Asp Thr Val Pro Gly Val Arg Tyr
180 185 190
Thr Val Ile Ala Thr Lys Tyr Asp Gln Val Val Thr Pro Tyr Arg Thr
195 200 205
Gln Tyr Leu Asp Gly Pro Asn Val Arg Asn Val Leu Leu Gln Asp Leu
210 215 220
Cys Pro Val Asp Leu Ser Glu His Val Ala Ile Gly Thr Ile Asp Arg
225 230 235 240
Ile Ala Phe His Glu Val Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ala Arg Ala Thr
245 250 255
Pro Thr Thr Cys Ala Ser Val Ile Gly
260 265

Claims (9)

1.一种酶法制备植物甾醇酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)预处理：去除植物油脱臭馏出物原料油中的水分；
2)将预处理后的植物油脱臭馏出物原料油加入脂肪酶MAS1突变体进行反应，将原料油中的植物甾醇转化为植物甾醇酯；所述脂肪酶MAS1突变体的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的脂肪酶添加量为基于原料油质量的25-45U/g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述反应温度30℃-40℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述反应温度35℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的植物油脱臭馏出物原料油为大豆油脱臭馏出物原料油。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的大豆油脱臭馏出物原料油的酸价为80～120mg/g，植物甾醇含量占原料油的2～10％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的水分去除方法为70±10℃抽真空至表面无明显气泡。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的脂肪酶MAS1突变体为固定化脂肪酶，并以超大孔疏水非极性的树脂作为固定化载体。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述固定化载体为树脂D5753、树脂AP1090、树脂ECR1030M、树脂ECR 8285、树脂AMBERLITEXAD1180N。
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