CN112359044A

CN112359044A - 植物soseki类蛋白sok2、编码基因及应用

Info

Publication number: CN112359044A
Application number: CN202011278349.3A
Authority: CN
Inventors: 付春祥; 王亚梅; 刘文文; 吴振映; 白史且; 周传恩; 杨瑞娟; 姜珊珊; 王梦琦
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2020-11-16
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2040-11-16
Also published as: US20220153785A1; CN112359044B; US11897923B2

Abstract

本发明涉及植物SOSEKI类蛋白SOK2、编码基因及应用，属于植物基因工程技术领域，植物SOSEKI类蛋白SOK2氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对植物SOSEKI类蛋白SOK2进行分子调控，不仅能够延迟柳枝稷的开花时间、增加生物量，还能够显著降低柳枝稷细胞壁中木质素含量，提高可发酵糖产量。本发明所产生的转基因能源植物能够整合到常规育种项目中，为创制高产且可高效降解的能源植物新品种提供宝贵的种质资源。同时，所鉴定的植物SOSEKI类蛋白SOK2能够为今后分子育种提供新的靶标，用于商业化能源植物产品的定向分子设计。

Description

植物SOSEKI类蛋白SOK2、编码基因及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种涉及植物未知功能的SOSEKI类蛋白SOK2的编码基因及其在增加植物生物量和可发酵糖产量方面的应用。

背景技术

由于全球人口数量的急剧增加，化石能源的过度消耗使得可再生能源开发成为必要。生物质能源具有资源丰富、环保清洁且可再生等特点，是目前最有前景的替代能源。生物质能源的开发研究多集中于生物柴油和生物乙醇两大类，其中，生物乙醇的开发利用已逐步实现商业化。木质纤维素类是纤维素、半纤维素和木质素的统称，是全球储量最为丰富且环境友好的生物乙醇原料。柳枝稷(Panicumvirgatum L.)，属于多年生C4高大草本植物，主要用作能源草和牧草，其生长迅速、生物量高、适应性广、抗逆性强且环境友好，能够在盐碱、干旱及贫瘠的边际土地上生长。作为一类重要的纤维生物质资源，增加其生物量和可发酵糖产量以提高柳枝稷生物质能的开发利用具有重要的实际应用价值。柳枝稷全基因组测序的完成、表达芯片数据库的公布以及转化体系的完善，为功能基因的挖掘和验证提供了资源保证。

SOSEKI(SOK)蛋白是一类含有DIX-like功能域，并且在动植物进化中十分保守的蛋白。目前关于SOSEKI(SOK)类蛋白家族的功能研究尚不深入。除了参与细胞极性发育之外，研究表明AtSOK2还能够调控春化后拟南芥的开花时间。AtSOK2位于开花时间负调控因子FLC同一条染色体的上游4.7kb，因此又称为UPSTREAM OF FLC(UFC；At5g10150)。与FLC相类似，SOK2的表达水平也在植物春化后显著下调。FLC和SOK2在不同拟南芥生态型的非春化植株中的表达变化是一致的，例如，与早花期生态型相比，晚花期生态型植株中FLC和SOK2的转录水平都更高。并且，这些基因表现出类似的发育调控表达模式：在萌发的种子中转录水平均较低，当第一对叶片出现前表达水平显著增加。同样地，在拟南芥晚花突变体中，FLC和SOK2也因不同的基因位点修饰协调调控植物开花时间(Finnegan et al,A Cluster ofArabidopsis Genes with a CoordinateResponse to an EnvironmentalStimulus.Current Biology,14:911-916)。目前，SOK基因及其蛋白在其它植物中功能研究较少。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种植物SOSEKI类蛋白SOK2编码基因和其在增加植物生物量和可发酵糖产量方面的应用，以解决目前能源植物生物量及品质改良基因资源库不足，不能同时满足改良植株产量和细胞壁品质分子设计的需要的问题。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

本发明的第一个目的是提供一种植物SOSEKI类蛋白SOK2的编码基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供所述基因编码的SOSEKI类蛋白SOK2，其氨基酸序列SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供含有植物SOSEKI类蛋白SOK2基因的重组载体pANIC6B-PvSOK2。

本发明的第三个目的是提供一种提高植物体内SOSEKI类蛋白SOK2表达水平的方法，所述方法利用目的二中构建的过量表达载体，提高柳枝稷体内SOK2表达水平。

本发明的第四个目的是提供植物SOSEKI类蛋白SOK2在调控植物开花时间方面的应用。

本发明的第五个目的是提供所述的针对植物SOSEKI类蛋白SOK2在增加植物生物量及可发酵糖产量方面的应用。

所述应用方法为获得植物SOSEKI类蛋白SOK2基因的CDS区序列，根据Phytozome网站中已公布的柳枝稷基因组信息，在PvSOK2全长序列两侧设计引物PvSOK2-F和PvSOK2-R，通过PCR扩增获得732bp的柳枝稷SOSEKI类蛋白PvSOK2基因全长序列。之后，将得到的全长序列片段，基于Gateway技术重组整合到过表达载体pANIC6B中；采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，转入柳枝稷胚性愈伤细胞中，通过潮霉素抗性筛选，获得抗性再生植株。通过PCR分析最终确定阳性转基因植株；开花时间、生物量及可发酵糖产量测定结果表明，组成型过表达SOK2确实能够延迟柳枝稷开花时间、提高生物量和可发酵糖产量。

本发明的核心特点和发明理念包括：

1、开花时间是影响植物生物量的一个重要因素。通过植物基因工程延迟植物开花时间从而提高生物量是其中一个重要研究方向。本发明利用基因工程的手段，针对能源植物柳枝稷的SOK2基因，通过过量表达技术提高植物SOSEKI类蛋白SOK2在柳枝稷体内的表达水平，最终推迟柳枝稷开花时间，获得生物量和可发酵糖产量增加的转基因柳枝稷植株，这对于柳枝稷和其他禾本科植物的遗传育种和定向分子设计具有重要的指导意义。

2、本发明从调控柳枝稷生物量及细胞壁品质等多种性状的基因着手，通过先进的基因工程技术同时对植物生物量及可发酵糖含量进行调控，为多年生能饲草和其它单子叶作物的生物量及细胞壁品质遗传改良和分子育种提供了新靶标。

本发明与现有技术相比的有益效果如下：

1、本发明中获得植物SOSEKI类蛋白SOK2基因是调控柳枝稷开花时间、降低木质素含量等性状的重要基因，这对于通过分子定向设计获得理想能源植物株型具有重要贡献；

2、本发明中对柳枝稷SOK2进行过表达，能够显著延迟柳枝稷开花时间、增加柳枝稷的生物量和可发酵糖产量，对于能源植物和禾本科牧草的生物量和可发酵糖产量的遗传改良具有重要的参考意义；

3、本发明中所产生的遗传改良植物能够整合到常规育种项目，从而为能源植物及禾本科牧草作物的品种培育提供新的种质资源。

附图说明

图1柳枝稷中的植物SOSEKI类蛋白PvSOK2的PCR扩增电泳图；

图2柳枝稷pANIC6B-PvSOK2过表达载体简图；

图3 PvSOK2过表达转基因柳枝稷PCR鉴定结果。1^#-10^#：PvSOK2过表达转基因柳枝稷植株；+：pANIC6B-PvSOK2质粒；-：野生型柳枝稷植株；M：DL 2000 DNA maker。

图4 PvSOK2过表达转基因柳枝稷植株中PvSOK2基因qRT-PCR结果。Control表示野生型柳枝稷植株，PvSOK2_OE-14/-35/-36分别表示三个独立的阳性转基因株系。

图5 PvSOK2OE转基因和野生型柳枝稷植株表型(A)和开花时间(B)统计。Control表示野生型柳枝稷植株，PvSOK2_OE-14/-35/-36分别表示三个独立的阳性转基因株系。

图6 PvSOK2OE转基因和野生型柳枝稷植株生物量测定。Control表示野生型柳枝稷植株，PvSOK2_OE-14/-35/-36分别表示三个独立的阳性转基因株系。

图7 PvSOK2OE转基因和野生型柳枝稷植株可发酵糖产量测定。Control表示野生型柳枝稷植株，PvSOK2_OE-14/-35/-36分别表示三个独立的阳性转基因株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所用的材料、试剂和分子标记探针等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。

实施例1：PvSOK2基因的克隆

根据Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov)网站中已公布的柳枝稷基因组信息，在PvSOK2全长序列两侧设计引物：PvSOK2-F和PvSOK2-R，以柳枝稷的cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。

所述引物序列如下：

PvSOK2-F：ATGGCGCTGCCCCACAGC

PvSOK2-R：TGGTGATCTGGTCTGCTACTTCTGC

PCR反应体系为：2μL cDNA，25μL 2×Buffer，4μL 10pM dNTP，10μM

的正/反向引物各2μL，0.5μL 5U/μLPrimerSTAR HS DNA聚合酶和14.5μL ddH₂O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：98℃3min；98℃5sec，56℃15sec；72℃30sec，35个循环；72℃5min。

将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为750bp的片段(图1)，对扩增片段进行凝胶回收(使用Promega凝胶回收试剂盒)，常规测序(北京六合华大基因科技有限公司)。测序结果显示，扩增获得的序列含有一个完整的开放阅读框，全长为732个碱基，如SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白含有243个氨基酸残基，序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：重组载体构建及在烟草细胞中瞬时表达观察亚细胞定位

以上述得到的序列片段为模板，设计PvSOK2带有与表达载体pCABIA1300-cGFP无缝连接的接头引物，用高保真酶扩增该片段；用限制性内切酶HindIII酶切表达载体pCABIA1300-cGFP。回收PvSOK2基因片段和pCABIA1300-cGFP载体片段。再利用无缝连接酶(购自Vazyme公司)将回收的两个片段进行同源重组连接。连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取单克隆菌落，在含有卡纳霉素的液体LB培养基中扩增培养，进行PCR扩增检测和测序验证，得到重组质粒pCABIA1300-PvSOK2-cGFP。

将构建成功的重组载体pCABIA1300-PvSOK2-cGFP转化到农杆菌EHA105中并保存菌种。将上述菌液通过烟草瞬时表达技术注射烟草进行亚细胞定位观察。荧光共聚焦结果显示，与典型的转录因子不同，PvSOK2除了能定位于烟草细胞核外，还可以定位于细胞膜，暗示了该基因除了作为转录因子发挥功能外，还可能具有其它重要的生物学功能。

实施例3：过量表达PvSOK2转基因柳枝稷植物的获得

设计过量表达载体中连接入门载体引物：PvSOK2-pGWC-F和PvSOK2-pGWC-R，引物末端引入AhdI酶切位点和入门载体pGWC酶切位点后18个碱基(无缝连接接头序列)，以得到的PvSOK2全长序列为模板，用上述引物进行PCR扩增。

所述引物序列如下：

PvSOK2-pGWC-F：AAAGCAGGCTTTGACTTTATGGCGCTGCCCCACAGC

PvSOK2-pGWC-R：GCTGGGTCTAGAGACTTTGGTGATCTGGTCTGCTACTTCTGC；

其中，下划线为无缝连接接头序列。

回收上述扩增片段。用限制性内切酶AhdI酶切pGWC载体，并回收。利用无缝连接酶(购自Vazyme公司)将回收的两个片段进行同源重组连接，并采用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取单克隆菌落，在卡那霉素抗性的LB培养基中扩增培养，测序。试剂盒提取测序正确的重组菌株质粒，使用Gateway技术，将重组质粒酶切回收片段转入超表达载体pANIC6B(图2)。重组反应为：100ng酶切回收片段，50ng pANIC6B载体质粒，1μL LR酶(Invitrogen，货号11791020)，然后用ddH₂O补足至10μL。25℃培养6h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并得到测序正确的阳性重组菌株质粒pANIC6B-PvSOK2，转化农杆菌EHA105。

采用农杆菌介导的柳枝稷胚性愈伤的遗传转化方法(Xi et al,Agrobacterium-mediated transformation of switchgrass and inheritance of thetransgenes.2009,Bioenergy Research,2:275-283)将pANIC6B-PvSOK2导入低地型野生型柳枝稷Alamo，获得抗性苗，使用载体通用引物ZmUbq-F与目的基因的下游引物PvSOK2-R检测目的基因，使用抗潮霉素基因的上下游引物(hph3+hph4)检测潮霉素基因，最终确定阳性转基因株系(图3)。

实施例4：转基因植株分子鉴定

取上述鉴定转基因阳性植株嫩茎组织，用TriZol Reagent试剂盒(Invitrogen公司，货号15596026)提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪(NanoDrop)检测总RNA的含量和纯度，取1.0μg总RNA做逆转录反应，采用逆转录酶(Promega公司，货号M1701)反转为cDNA，逆转录反应步骤参考该使用说明。以上述cDNA为模板，使用引物PvSOK2-qRT-F和PvSOK2-qRT-R进行荧光定量PCR检测，内参基因为柳枝稷Ubiquitin(UBQ)基因。引物序列如下：

PvUBQ-F：TTCGTGGTGGCCAGTAAG

PvUBQ-R：AGAGACCAGAAGACCCAGGTACAG

PvSOK2-qRT-F：TACTTCAGCGGCAGCATCGTG

PvSOK2-qRT-R：CCTCCTCCGTCGCCTTCCAT

实时荧光定量PCR反应体系为20μL，其中正/反向引物各1μL，cDNA模板2μL，SYBRGreen qRT Master Mix(购自宝生物工程有限公司)10μL，ddH₂O补足至20μL。实时荧光定量PCR仪使用Roche480，使用两步法反应。检测结果表明，于野生型Control相比，转基因植株PvSOK2_OE-14、PvSOK2_OE-35和PvSOK2_OE-36中PvSOK2的表达量均显著上升(图4)。

实施例5：转基因植株开花时间、生物量和可发酵糖产量分析

取生长六个月植株进行开花时间和生物量的测定，与对照植物相比，转基因植物的开花时间延迟(图5)。分别收集Control和PvSOK2_OE-14/-35/-36生长六个月大小的植株地上部材料，测定其鲜重。结果表明，与野生型相比，转基因植株的生物量增加了19.3-33.6％(图6)。可发酵糖产量测定使用苯酚硫酸酯法，具体测定如下：使用纤维素酶和纤维二糖酶混合物直接酶解细胞壁残留物72h，作为对照；使用1.5％H₂SO₄在121℃条件下预处理60min，再使用相同量的纤维素酶和纤维素二糖酶混合物酶解细胞壁残留物72h，作为处理组。酶解产物使用苯酚硫酸酯法测定可发酵糖含量(Dubois et al，Colorimetric methodfor determination of sugars and related substances.1956,Analytical Chemistry,28:350-356)。糖化效率是酶解前后可发酵糖含量的差值与酶解前可发酵糖含量的比值。因此，依据公式：可发酵糖产量(g/plant)＝地上部细胞壁碳水化合物产量(g/plant)×糖化效率，计算出转基因植株的可发酵糖产量比野生型植株增加了约65％(图7)。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 植物SOSEKI类蛋白SOK2、编码基因及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 732

<212> DNA

<213> 柳枝稷(Panicum virgatum L.)

<400> 2

atggcgctgc cccacagcca caagcagtac gtggacgcct accgggacgc cgccgcagag 60

gatccggagg acgacgagct gggctactcg taccaccacc gccgggccgg cgcgcacgcg 120

gcgggggcgc ggctcgcccg ggccgacaag cccgccgccg tctcggcccg gaccaaccgg 180

agccgccccg tggagctccc cgtcgaggag acctcgccgc cgtcctcgac ctcctcggac 240

aagccgcccg cgctggcgcc gctgcagccg ggccgggccg agtacccgga gcccgagccg 300

aaccgccccg gctccgtgct cctgcagctg atcgcgtgcg ggtcgggggc ggcgggcggc 360

ggctcgggca attgccgcgc cgagccgagg cgcagctgcg ggctggtgag ccggctctcg 420

gcccgcgcgg gcgcggacga ggaggacgac gacgaggacg cggcggcggg gggcgccgac 480

atgggccgcc ggttcgggca cctcgccgtg ccggacaagg agtacttcag cggcagcatc 540

gtggagggcg ccggcggccg cggcacgccg ctgccggcgt cgtcgctcaa gcggtccaac 600

tcgtacaatg aggagaggag gcttggcgtt gggatcggcg aggatggagc ggatgagcag 660

atggaaggcg acggaggagg gatcagggga cggtgcatcc ccggcaggaa gaagcagccg 720

ccgcagaagt ag 732

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 柳枝稷(Panicum virgatum L.)

<400> 2

Met Ala Leu Pro His Ser His Lys Gln Tyr Val Asp Ala Tyr Arg Asp

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Asp Pro Glu Asp Asp Glu Leu Gly Tyr Ser Tyr His

20 25 30

His Arg Arg Ala Gly Ala His Ala Ala Gly Ala Arg Leu Ala Arg Ala

35 40 45

Asp Lys Pro Ala Ala Val Ser Ala Arg Thr Asn Arg Ser Arg Pro Val

50 55 60

Glu Leu Pro Val Glu Glu Thr Ser Pro Pro Ser Ser Thr Ser Ser Asp

65 70 75 80

Lys Pro Pro Ala Leu Ala Pro Leu Gln Pro Gly Arg Ala Glu Tyr Pro

85 90 95

Glu Pro Glu Pro Asn Arg Pro Gly Ser Val Leu Leu Gln Leu Ile Ala

100 105 110

Cys Gly Ser Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Ala Glu

115 120 125

Pro Arg Arg Ser Cys Gly Leu Val Ser Arg Leu Ser Ala Arg Ala Gly

130 135 140

Ala Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Ala Ala Ala Gly Gly Ala Asp

145 150 155 160

Met Gly Arg Arg Phe Gly His Leu Ala Val Pro Asp Lys Glu Tyr Phe

165 170 175

Ser Gly Ser Ile Val Glu Gly Ala Gly Gly Arg Gly Thr Pro Leu Pro

180 185 190

Ala Ser Ser Leu Lys Arg Ser Asn Ser Tyr Asn Glu Glu Arg Arg Leu

195 200 205

Gly Val Gly Ile Gly Glu Asp Gly Ala Asp Glu Gln Met Glu Gly Asp

210 215 220

Gly Gly Gly Ile Arg Gly Arg Cys Ile Pro Gly Arg Lys Lys Gln Pro

225 230 235 240

Pro Gln Lys

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcgctgc cccacagc 18

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtgatctg gtctgctact tctgc 25

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaagcaggct ttgactttat ggcgctgccc cacagc 36

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgggtcta gagactttgg tgatctggtc tgctacttct gc 42

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcgtggtgg ccagtaag 18

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agagaccaga agacccaggt acag 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tacttcagcg gcagcatcgt g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctcctccgt cgccttccat 20

Claims

1.一种植物SOSEKI类蛋白SOK2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述植物SOSEKI类蛋白SOK2的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

3.含有权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于所述载体为pANIC6B-PvSOK2，包含权利要求2所述的核苷酸序SEQ ID NO.1。

4.一种提高植物体内SOSEKI类蛋白SOK2表达水平的方法，其特征在于所述方法为利用权利要求3所述的表达载体，提高柳枝稷体内SOK2表达水平。

5.权利要求1所述植物SOSEKI类蛋白SOK2在调控植物生物量及细胞壁品质方面的应用。

6.权利要求1所述的植物SOSEKI类蛋白SOK2在植物遗传改良和分子育种方面的应用。