CN108085326A - 一种柳枝稷腺苷高半胱氨酸在改变木质素单体和提高细胞壁降解效率方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个一碳代谢关键酶基因SAHH1(S‑adenosyl‑L‑homocysteine hydrolase 1)在改变木质素单体以及细胞壁降解效率方面的应用，属于植物基因工程技术领域。其主要内容包括柳枝稷SAHH1基因(PvSHH1)克隆和序列测定，确定获得序列为本发明研究的目的基因；利用Gateway克隆技术，构建PvSAHH1下调表达的干扰表达载体(pANIC8B‑PvSAHH1Ri)；采用农杆菌介导转化柳枝稷愈伤的方法，将载体导入低地型Alamo野生型柳枝稷，从而获得PvSAHHRi转基因柳枝稷植株；所获得转基因植物中一碳代谢中间物SAH(S‑adenosyl‑L‑homocysteine)明显升高，甲基化木质素单体G型和S型显著降低，细胞壁降解效率显著升高。本发明所鉴定的柳枝稷SAHH1对木质素代谢的调控，能够为今后分子育种提供新的靶标。

Description

一种柳枝稷腺苷高半胱氨酸在改变木质素单体和提高细胞壁 降解效率方面的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及柳枝稷一碳代谢腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase1，SAHH1）的分子调控，以研究其对木质素代谢以及细胞壁降解效率的影响。

背景技术

细胞壁是植物储存生物质和能量的主要场所。而细胞壁中的纤维素（Cellulose）和半纤维素 （Hemicellulose），不但可以作为牧草饲料，还可用于微生物发酵生产乙醇和丁醇等生物能源。植物细胞壁成分除纤维素、半纤维素以为，还存在另一成分木质素（lignin）。木质素在生物体内起到支撑细胞、维持水分运输、增强植物抗逆和抵抗病虫害入等生理功能，但是在生物能源转化方面和牧草消化方面，木质素是重要的限制因子，它的存在使得纤维素降解效率显著降低。柳枝稷（Panicum virgatum L.）属于禾本科（Gramineae）黍属（Panicum）的C4多年生草本植物。其产量稳定、适应性强、地理分布广且不占用耕地，既是重要的牧草来源也是理想的第二代能源植物。近年来，柳枝稷的基因组数据、转录组数据以及相关芯片数据已陆续释放，同时，柳枝稷的遗传转化体系也已经成熟稳定，因此柳枝稷已经成为能源草和禾本科牧草研究的理想模式植物。因此，解析柳枝稷木质素代谢的调控机制，为分子育种提供新的靶向位点具有重要的现实意义。

一碳代谢指的是含有一个碳原子的基团（如甲基、甲烯基、甲炔基、甲酰基等）的生成、转变、运输以及参与物质合成的反应过程。主要包括两个循环：四氢叶酸循环（THF）和甲硫氨酸循环 (MET)。一碳代谢合成的甲硫氨酸可以进一步生成甲基活性供体S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）。SAM为木质素甲基化反应提供甲基供体，最终生成甲基化程度不同的G型和S型单体，从而将一碳代谢和木质素代谢偶联起来。S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine, SAH）是SAM的去甲基化形式，研究发现SAH能够与SAM竞争性结合甲基化酶，从而抑制甲基化反应的进行（Keating et al., Evidence of brainmethyltransferase inhibition and early brain involvment in HIV-positivepatients, 1991, Lancet, 337(8747):935-9; Nguyen et al., Hypodipsichypernatremia and diabetes insipidus following anterior communicating arteryaneurysm clipping: diagnostic and therapeutic challenges in the amnesticrehabilitation patient, Brain Inj, 15(11):975-80）。SAHH对于维持植物体内SAH的水平具有重要作用（Hanson et al., One-carbon metabolism in higher plants, 2001,Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 52:119-137）。拟南芥中sahh1突变体表现出明显的发育表型（Rocha et al., The ArabidopsisHOMOLOGY- DEPENDENT GENE SILENCING1 gene codes for an S-adenosyl-L-homocysteinehydrolase required for DNA methylation-dependent gene silencing, Plant Cell,17(2):404-417）, 但是SAHH对木质素合成的影响目前尚未有报道。

木质素合成途径中单体的甲基化反应是由咖啡酰-O-甲基转移酶（CCoAOMT）和咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）催化进行的，而甲基基团是由一碳代谢的产物SAM来提供。研究报道，改变玉米四氢叶酸运输循环中的亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和拟南芥中叶酰多谷氨酸合成酶（FPGS1）编码基因的表达量能够显著影响木质素单体累积 （Tang et al.,The maize brown midrib2 (bm2) gene encodes a methylenetetrahydrofolatereductase that contributes to lignin accumulation. Plant Journal.2014, 77(3):380-392; Zhou et al., Folate Polyglutamylation Is Involved in ChromatinSilencing by Maintaining Global DNA Methylation and Histone H3K9Dimethylation in Arabidopsis. Plant Cell.2013, 25(7):2545-2559）。但是甲硫氨酸途径对木质素的影响，目前尚未有相关报道。本发明主要针对柳枝稷的SAHH1，通过干扰沉默技术获得PvSAHH在体内表达抑制的转基因柳枝稷，研究表明SAH显著升高，甲基化木质素单体显著降低，最终使得细胞壁降解效率显著升高，这为深入理解柳枝稷和其他禾本科植物木质素调控机理奠定理论基础，同时也为采用基因工程手段改变木质素提供了新的靶基因源和方向指导。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种柳枝稷一碳代谢S-腺苷高半胱氨酸水解酶PvSAHH1的编码基因；其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述核苷酸序列进行同义突变，也属于本发明的保护范围内。

本发明的第二个目的提供一种针对柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1调控区片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示。利用此片段能够显著降低甲基化木质素单体G型和S型的含量，增加细胞壁降解效率。

本发明的第三个目的提供一种柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1的干扰沉默表达载体，该表达载体克隆上述SEQ ID NO.3片段。

本发明的第四个目的是提供柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1对调控甲基活性供体SAM以及其去甲基化形式SAH方面的应用。

本发明的第五个目的是提供柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1在调控柳枝稷木质素代谢方面的应用。

本发明的第六个目的是提供柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1在提高细胞壁降解效率方面的应用。

所述柳枝稷PvSAHH1的调控区片段，基于Gateway技术重组整合到超表达载体pANIC 8B中；采用农杆菌AGL1介导的遗传转化方法，将干扰载体导入柳枝稷低地型品种Alamo的胚性愈伤细胞中，通过潮霉素抗性筛选，获得抗性再生植株，并通过PCR分析最终确定阳性转基因植株；代谢物测定数据表明转基因柳枝稷中SAH水平显著升高，SAM/SAH比值显著降低；木质素数据表明甲基化木质素单体G型和S型显著降低；细胞壁降解效率显著升高。

本发明的核心特点和发明理念包括：

1、本发明针对柳枝稷木质素这一制约生物能源转化的主要限制因子，通过先进的基因工程技术对其进行调控，能够获得显著效果。

2、本发明探索的PvSAHH1通过改变SAH以及SAM/SAH在体内的比例影响了下游木质素的积累，拓宽了对木质素调控机理的认识和研究。

本发明的有益效果如下：

1. 本发明中获得的柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1，是调控木质素单体成分的关键基因，这对于通过分子定向设计获得利于能源转化的柳枝稷植株具有重要贡献；

2. 本发明中对PvSAHH1进行分子调控，能够降低木质素单体含量，提高细胞壁降解效率，对于能源植物和禾本科牧草糖化效率的改变具有重要的参考意义；

3. 本发明中所产生的遗传改良植物能够整合到常规育种项目，从而为能源植物和禾本科牧草作物的品种培育提供新的种质资源。

附图说明

图1 柳枝稷pANIC8B-PvSAHH-RNAi干扰载体简图；

图2 转PvSAHH-RNAi基因柳枝稷植株的PCR鉴定；

图3转PvSAHH-RNAi基因柳枝稷植株的qRT-PCR分析；

图4 PvSAHHRi转基因植株代谢物SAM/SAH测定；

图5 PvSAHHRi转基因植株木质素单体测定；

图6 PvSAHHRi转基因植株细胞壁降解效率测定。

具体实施方式

下面以针对PvSAHH的干扰沉默降低木质素甲基化单体，提高细胞壁降解效率为实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂、双元载体和农杆菌等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买，MS培养基来自PhytoTechnology Laboratories (货号 M519)。

实施例1：PvSAHH基因的克隆与序列测定

取柳枝稷Alamo的嫩茎部位，用TriZol Reagent（Invitrogen公司，货号15596026）提取嫩茎总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的含量和纯度，取2.0 μg总RNA做逆转录反应，所采用的逆转录酶为M-MLV（Promega公司，货号M1701），逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录反应合成的第一链cDNA为模板，使用引物：

5’- ACTCCCAATCCAATCCGCGAG -3’

5’- GGTGTTCTAGTTGTGCTGGGC -3’

进行常规PCR扩增；PCR反应体系为：2 μL cDNA，5 μL 10×Buffer，4 μL dNTP（2.5mM），正/反向引物（10 μM）各1 μL，0.5 μL Taq酶（5 U/μL）和36.5 μL ddH₂O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：94 ^oC 5 min；94 ^oC 30 sec，56 ^oC 30 sec；72 ^oC 90 sec，32个循环；72 ^oC 10 min。PCR扩增获得约1.4 kb的片段。琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，于pMD-18T载体（TaKaRa公司，货号6011）进行连接反应，反应体系为：4.5 μL PCR产物，0.5 μLpMD-18T载体和5 μL Solution I，16 ^oC连接过夜。取5 μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800 μL液体LB培养基，复苏1 hr，涂于氨苄抗生素的LB平板上（已涂布X-gal/IPTG），37 ^oC培养14 hr。挑选白色单克隆菌落，在含氨苄抗生素的液体LB培养基中扩增培养，测序。经测序分析表明，该序列含有一个完整的开放阅读框，全长1458个碱基，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白含有485个氨基酸残基；序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：PvSAHH 基因干扰沉默表达载体构建和遗传转化

本发明所用的入门载体为pGWC，RNA干扰表达载体为单子叶表达载体pANIC系列中的pANIC8B。通过PCR反应克隆获得PvSAHH 干扰片段（SEQ ID NO.3），使用引物：

5’- CTGTGCCCTTCAAGCCCTGA -3’

5’- CCAAGCTTGCCCAAGTGGAGA -3’

进行PCR扩增，扩增模板为上述PvSAHH-pMD 18T重组质粒。PCR反应体系为：2 μL模板，5μL 10×Buffer，4 μL dNTP（2.5 mM），1 μL正/反向引物（10 μM）各，0.5 μL Taq酶（5 U/μL）和36.5 μL ddH₂O。PCR反应条件为：94 ^oC 5 min；94 ^oC 30 sec，56 ^oC 30 sec；72 ^oC 90sec，32个循环；72 ^oC 10 min。PCR扩增获得约450bp的片段，片段序列如SEQ ID NO.3所示。采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，连接pGWC载体（Invitrogen）。连接反应参考该载体使用说明。取5 μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800 μL液体LB培养基，复苏1 hr，涂于卡那霉素抗性的LB平板上（已涂布X-gal/IPTG），37 ^oC培养14 hr。挑选白色单克隆菌落，在氯霉素抗性的LB培养基中扩增培养，测序。碱裂解法提取测序正确的重组菌株质粒，EcoR V核酸内切酶37 ^oC酶切1 hr，使用Gateway技术，将重组质粒酶切回收片段转入干扰载体pANIC8B （图1）。重组反应为：100 ng酶切回收片段，50 ng pANIC8B载体质粒，1 μL LR酶（Invitrogen，货号11791020），然后用ddH₂O补足至10 μL。16 ^oC连接过夜。取5μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800 μL液体LB培养基，复苏1 hr，涂于卡那霉素抗性的LB平板上（已涂布X-gal/IPTG），37 ^oC培养14 hr。挑选白色单克隆菌落，在卡那霉素抗性的LB培养基中扩增培养，测序。碱裂解法提取测序正确的重组菌株质粒，电击法转化农杆菌AGL1感受态细胞，涂布于含卡那霉素和利福平的LB平板上，28 ^oC，暗培养2天，使用上述引物检测阳性单克隆，在卡那霉素和利福平抗性的液体LB培养基中扩增培养，用于柳枝稷胚性愈伤的遗传转化。

采用农杆菌介导的柳枝稷胚性愈伤的遗传转化方法（Xi et al, Agrobacterium-mediated transformation of switchgrass and inheritance of the transgenes.2009, Bioenergy Research, 2: 275-283）将pANIC8B-PvSAHH-RNAi导入低地型野生型柳枝稷Alamo，获得抗性苗，经PCR鉴定扩增hph基因最终确定阳性转基因株系（图2）。

实施例3：转基因植株分子鉴定

取上述鉴定转基因阳性植株嫩茎组织，使用TriZol（Invitrogen公司，货号15596026）法提取总RNA，逆转录酶（Promega公司，货号M1701）合成第一链cDNA，以柳枝稷Ubiquitin基因作为内参基因，分别采用引物PvSAHH-qF1/qR1检测阳性转基因植株SAHH基因的表达情况（图3），引物序列如下：

PvUbiquitin-qF：5’-TTCGTGGTGGCCAGTAAG-3’

PvUbiquitin-qR：5’-AGAGACCAGAAGACCCAGGTACAG-3’

PvSAHH-qF1：5’- GAAGTTAGCCACATCGGGTTATCTT -3’

PvSAHH- qR1：5’- ACTCAACCAAACTAAACCGCTCAAG -3’

如图3所示，转基因植株中PvSAHH基因的表达量明显低于野生型，说明本发明设计的带有PvSAHH区段的干扰表达载体在柳枝稷体内确实发挥了功能。

实施例4：转基因植株代谢物测定

SAM为木质素甲基化反应提供甲基生成甲基化程度不同的单体，并转换为去甲基化形式SAH, 因此为了追踪改变PvSAHH基因表达量之后，对这些代谢中间物的影响，我们进一步采用ELISA酶联免疫法检测各转基因植株中SAM、SAH和Hcy等的含量变化，ELISA酶联免疫试剂盒购自上海百趣生物有限公司。SAHHRi的三个株系中SAH稳定升高（图4a），最终导致SAM/SAH降低（图4b）。

实施例5：转基因植株的木质素单体测定

木质素单体测定采用脱硫法（Thioacidolysis）。当野生型和PvSAHH RNAi转基因植株生长至R1（Reproduction 1）时期, 取茎节研磨，分别经过烘干、提取木质素以及气相色谱-质谱（GC-MS）分析等步骤，获得不同植株的木质素单体G型、S型和H型的含量，如图5所示，转基因植株中G型、S型木质素单体显著低于野生型。

实施例6：转基因植株的细胞壁降解效率测定

利用苯酚-硫酸比色法测定转基因株系以及对照柳枝稷中细胞壁多糖含量，利用纤维素酶降解细胞壁残基CWR，苯酚-硫酸比色法测定酶解纤维素含量，细胞壁降解效率=酶解纤维素含量/细胞壁多糖含量×100%。结果表明，相比于对照组，PvSAHH RNAi转基因柳枝稷中细胞壁降解效率显著提高（图6）。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种柳枝稷腺苷高半胱氨酸在改变木质素单体和提高细胞壁降解效率方面的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 柳枝稷(Panicum virgatum L.)

<400> 1

atggcgctct ccgtggagaa gacctcgtcg gggcgggagt acaaggtcaa ggacctgtcc 60

caggccgact tcggccgcct cgagatcgag ctggccgagg tcgagatgcc cggactcatg 120

gcgtgccgcg ccgagttcgg cccatccaag cccttcgccg gcgccaggat ctcgggctcc 180

ctccacatga ccatccagac cgccgtcctc atcgagaccc tcaccgcgct cggcgccgag 240

gtccgctggt gctcctgcaa catcttctcc acgcaggacc acgccgccgc cgccatcgcg 300

cgggactccg ccgcggtctt cgcgtggaag ggggagacgc tcgaggagta ctggtggtgc 360

accgagcgct gcctcgactg gggcgagggc ggcggccccg acctcatcgt cgacgacggt 420

ggcgacgcca cgctcctcat ccacgagggc gtcaaggccg aggaggagta cgagaagacc 480

ggcaaggtcc ccgatccgga gtccaccgac aacgccgagt tcaagatcgt gctcaccatc 540

atccgcgacg ggatcaaggc tgaccccaag aagtaccgca agatgaagga taggctcgtt 600

ggagtctcgg aggagaccac taccggagtt aagaggctct accagatgca ggagaccggc 660

actctcctct tccccgccat caacgtcaac gactccgtca ccaagagcaa gttcgacaac 720

ctgtatggtt gccgccactc ccttcctgat ggtctgatga gggccaccga tgttatgatt 780

gctggcaagg ttgcggtagt atgcggttat ggtgatgttg gcaagggctg tgctgctgcc 840

ctcaagcagg ctggtgcccg tgtcatcgtc actgagattg atcccatctg tgcccttcaa 900

gccctgatgg agggtcttca ggtccttacc ttggaggatg tcgtttctga agctgacatc 960

tttgtgacca ccactggcaa caaggacatc atcatggttg accacatgag gaagatgaag 1020

aacaatgcaa ttgtctgcaa catcggtcac tttgacaatg agattgacat gcatggtctt 1080

gagacctacc ctggtgtgaa acgcatcacc atcaagcctc agacggaccg ctgggtgttc 1140

cctgagacca agactggcat cattgtcctt gctgagggtc gtctgatgaa ccttggatgc 1200

gctactggtc accccagctt tgtcatgtcc tgctcattca ctaaccaggt cattgctcag 1260

cttgagctgt ggaaggagaa gagctctggc aagtatgaga agaaggtgta cgtgctcccc 1320

aagcaccttg atgagaaggt tgctgctctc cacttgggca agcttggtgc caagctcacc 1380

aagctcacca agtctcaggc cgactacatc agcgtcccga ttgagggtcc ctacaagccc 1440

gctcactacc ggtactag 1458

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> 柳枝稷(Panicum virgatum L.)

<400> 2

Met Ala Leu Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1 5 10 15

Lys Asp Leu Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala

20 25 30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Ala Glu Phe Gly Pro

35 40 45

Ser Lys Pro Phe Ala Gly Ala Arg Ile Ser Gly Ser Leu His Met Thr

50 55 60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

100 105 110

Thr Leu Glu Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Cys Leu Asp Trp Gly

115 120 125

Glu Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

130 135 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Tyr Glu Lys Thr

145 150 155 160

Gly Lys Val Pro Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asn Ala Glu Phe Lys Ile

165 170 175

Val Leu Thr Ile Ile Arg Asp Gly Ile Lys Ala Asp Pro Lys Lys Tyr

180 185 190

Arg Lys Met Lys Asp Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Thr Gly Thr Leu Leu Phe

210 215 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225 230 235 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Cys Gly Tyr Gly Asp

260 265 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val

275 280 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu

290 295 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile

305 310 315 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

340 345 350

Asn Glu Ile Asp Met His Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg

355 360 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Glu Thr Lys

370 375 380

Thr Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385 390 395 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

405 410 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Lys Glu Lys Ser Ser Gly Lys Tyr

420 425 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

435 440 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys

450 455 460

Ser Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Val Pro Ile Glu Gly Pro Tyr Lys Pro

465 470 475 480

Ala His Tyr Arg Tyr

485

<210> 3

<211> 480

<212> DNA

<213> 柳枝稷(Panicum virgatum L.)

<400> 3

ctgtgccctt caagccctga tggagggtct tcaggtcctt accttggagg atgtcgtttc 60

tgaagctgac atctttgtga ccaccactgg caacaaggac atcatcatgg ttgaccacat 120

gaggaagatg aagaacaatg caattgtctg caacatcggt cactttgaca atgagattga 180

catgcatggt cttgagacct accctggtgt gaaacgcatc accatcaagc ctcagacgga 240

ccgctgggtg ttccctgaga ccaagactgg catcattgtc cttgctgagg gtcgtctgat 300

gaaccttgga tgcgctactg gtcaccccag ctttgtcatg tcctgctcat tcactaacca 360

ggtcattgct cagcttgagc tgtggaagga gaagagctct ggcaagtatg agaagaaggt 420

gtacgtgctc cccaagcacc ttgatgagaa ggttgctgct ctccacttgg gcaagcttgg 480

Claims (6)

1.柳枝稷一碳代谢酶基因SAHH1的全长CDS，其特征在于：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的PvSAHH全长CDS编码的氨基酸序列，其特征在于：

（1）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的PvCGS的核苷酸序列中选取一段序列保守功能区作为后续构建干扰载体的靶序列，其序列如SEQ ID NO.3。

4.含有权利要求3所述的干扰片段的植物表达载体。

5.根据权利要求4所述的植物表达载体在调控一碳代谢中间物SAH、木质素单体以及细胞壁降解效率方面的应用。

6.根据权利要求4所述的植物表达载体在柳枝稷遗传改良和分子育种方面的应用。