CN112345653B - 热裂解气相色谱质谱联用对橡胶草中天然橡胶的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热裂解气相色谱质谱联用对橡胶草中天然橡胶的检测方法。本发明利用热裂解气相色谱质谱联用仪，对橡胶草根部的天然橡胶进行高通量高灵敏度定量。该检测方法前处理过程简易，检测结果精确，不需要繁琐的前处理提纯步骤和大量的溶剂消耗。该发明可用于筛选高天然橡胶含量的橡胶草品种。

Description

热裂解气相色谱质谱联用对橡胶草中天然橡胶的检测方法

技术领域

本发明属于分析领域，涉及一种热裂解气相色谱质谱联用对橡胶草中天然橡胶的检测方法。

背景技术

天然橡胶是重要的战略物资和工业原料，其本身具有良好的回弹性、隔水性、可塑性、绝缘性，经过适当处理后可以耐酸碱、耐热、抗撕裂、耐磨，所以被广泛用于生产轮胎、鞋、医用手套、胶带和防毒面具等。天然橡胶与煤炭、钢铁、石油并称为四大基础工业原料。虽然合成橡胶兴起对天然橡胶产业发展有一定冲击，但仍然不能撼动其做为基础工业原料的地位。目前，橡胶树是天然橡胶的唯一商业化来源，但其生长对土壤有机质、温湿度、降水量、海拔等有特殊要求，所以只能在热带和亚热带地区生长。随着天然橡胶的需求量急剧增加(2014年需求量大于1210万吨)，寻找可替代的天然橡胶来源受到全球性的关注。天然橡胶作为重要的工业资源，价格受市场调控和产胶国的制约。因此，发展适合我国的天然橡胶产业，成为重要的课题。橡胶草因其根部可以大量产胶，且具有广阔的生长适应性，已成为研究天然橡胶合成的模式植物。橡胶草最早发现于哈萨克斯坦，也称俄罗斯蒲公英，菊苣属菊科植物，因其根部含有天然橡胶，俗称橡胶草。橡胶草表现出很大的种内基因和表型多样性，其天然橡胶含量占根干重的2％-15％，橡胶草经驯化后，天然橡胶含量可提高50％以上。基于橡胶草中天然橡胶裂解机理的快速定量研究对加快从橡胶草野生植物到经济作物的驯化与改良有重要意义,是培育高天然橡胶含量橡胶草的基础。

利用传统方法筛选高天然橡胶含量的橡胶草，依赖于繁琐的前处理提纯步骤或大量的溶剂消耗。植物中天然橡胶含量检测多采用称重法，索氏提取法，核磁共振法，红外光谱法等。称重法对天然橡胶进行分析，是用溶剂对样品提纯后，直接称重或采用热重法对提纯后的样品进行分析，样品提纯过程耗时，且所用有机溶剂对环境造成很大污染。索氏提取法，虽然避免了溶剂浪费，但其测试不能批量进行，且准确度欠佳。采用核磁共振对天然橡胶进行分析，需要提纯样品，通常要经过十几小时溶剂萃取后，对样品进行分析，萃取后的溶剂也会造成一定的污染，且核磁共振波谱仪价格昂贵。红外光谱法对顺式聚异戊二烯进行分析，首先也需要进行溶剂提取，提取后通过测定红外光谱中顺式-1，4和-3，4结构双键上碳-氢键变角振动吸收峰的积分面积进行定量，由于红外进行分析时易受背景干扰造成误差，还需要采用核磁共振法分析后加入校正系数。

橡胶草育种急需一种简单、快速、准确的可替代方法对天然橡胶进行定量。探索新的定量方法提高准确性，开发高通量高灵敏度的定量方法具有很大应用价值。热裂解技术是近些年对聚合物分析中发展起来的，热裂解-气相色谱-质谱联用技术(pyrolysis gaschromatography-mass spectrometry，Py-GC-MS)用于分析难溶以及复杂的有机物质，尤其适用于分析复杂高分子物质。Py-GC-MS应用于橡胶草育种的研究还未见报道，且目前在其他植物应用中，由于质谱对不同物质响应的差别很大，广泛使用的面积积分法定量准确性比较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种热裂解气相色谱质谱联用对橡胶草中天然橡胶的检测方法。

本发明提供的对橡胶草中天然橡胶含量的检测方法，包括：

1)将橡胶草根部烘干后磨碎，得到待测橡胶草样品；

2)将步骤1)所得待测橡胶草样品进行热裂解气相色谱质谱联用检测；

3)对所述待测橡胶草样品中的天然橡胶含量进行定性和定量分析，完成所述橡胶草中天然橡胶含量的检测。

上述方法的步骤1)烘干步骤中，温度为50℃；时间为48h；所述磨碎步骤中，磨碎方法为利用液氮磨碎。

所述步骤2)热裂解气相色谱质谱联用检测步骤中，热裂解的模式为双击模式；

所述双击模式中，第一段升温程序为：从50℃以40℃/min程序升温至215℃；第二段裂解温度为450℃。

所述步骤2)热裂解气相色谱质谱联用检测步骤中，气相色谱检测的条件如下：

仪器：PY-GC/MS；

进样口温度：300℃；

分流比：100:1；

样品进样量：1mg；

载气：氦气；

载气流速：1ml/min；

气质连接口温度：250℃；

色谱柱类型：Agilent HP-5ms；

色谱柱参数：30m*250μm*0.25μm；

色谱柱温程：从50℃开始，以30℃/min到290℃，290℃保持2min；

所述质谱检测的条件如下：

仪器：PY-GC/MS；

全扫描范围：m/z 29-700；

选择性离子检测：m/z 68；

色谱柱类型：Agilent HP-5ms；

色谱柱参数：30m*250μm*0.25μm；

溶剂延迟：无；

增益因子：1；

质谱四级杆温度：150℃；

离子源温度：230℃；

载气：氦气。

所述步骤3)定性分析中，外标物为聚异戊二烯，外标定性离子为柠檬烯特征离子m/z 93和m/z 136；内标物为聚苯乙烯，内标定性离子为苯乙烯特征离子m/z 51和m/z 78；

所述步骤3)定量分析中，外标物为聚异戊二烯，外标定量离子为柠檬烯特征离子m/z 68；内标物为聚苯乙烯，内标物定量离子为苯乙烯特征离子m/z 104；按内标法进行定量。

所述聚苯乙烯以聚苯乙烯的甲苯溶液的形式进行检测，所述聚苯乙烯的甲苯溶液的浓度为10mg/ml，用量为每2μl对应样品进样量为1mg；

所述步骤3)中，线性范围为1-160μg天然橡胶；

标准曲线为y＝0.61x-0.085；y为天然橡胶峰面积与内标物峰面积比值；x为天然橡胶含量与内标物含量比值；

定性限为0.004μg；

定量限为0.014μg。

本发明利用热裂解气相色谱质谱联用仪，对橡胶草根部的天然橡胶进行高通量高灵敏度定量。该检测方法前处理过程简易，检测结果精确，不需要繁琐的前处理提纯步骤和大量的溶剂消耗。该发明可用于筛选高天然橡胶含量的橡胶草品种。

附图说明

图1为橡胶草中天然橡胶的裂解过程。

图2为橡胶草根部在释放气体分析(EGA)模式下裂解气相色谱图。(a)橡胶草根部样品在从40℃至750℃程序升温过程中，裂解气相全扫描色谱图。(b)橡胶草根部样品在从40℃至750℃程序升温过程中，质荷比68的裂解气相色谱图。(c)橡胶草根部样品在从40℃至450℃程序升温过程中，裂解气相全扫描色谱图。(d)橡胶草根部样品在从40℃至450℃程序升温过程中，质荷比68的裂解气相色谱图。

图3为橡胶草根部在单击和双击模式下的裂解气相色谱图。(a)橡胶草根部样品在单击模式下450℃，裂解气相全扫描色谱图。(b)橡胶草根部样品在双击模式第一阶段程序升温过程中，裂解气相全扫描色谱图。(c)橡胶草根部样品在双击模式第二阶段热裂解后，裂解气相全扫描色谱图。

图4为天然橡胶裂解产物气相色谱质谱图。(a)天然橡胶标样在双击模式第二阶段裂解气相色谱图。(b)天然橡胶标样和聚苯乙烯内标在双击模式第二阶段裂解气相色谱图。(c)橡胶草根部粉末样品在双击模式第二阶段裂解气相色谱图。(d)天然橡胶裂解二聚体柠檬烯质谱图。(e)聚苯乙烯裂解单体苯乙烯质谱图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

仪器：PY-GC/MS(Frontier EGA/PY-3030D-Agilent 7890B/5977A)

甲苯：购买于Sigma-Aldrich

钢杯：购买于Frontier lab

天平：购买于Sartorius

下述实施例所用橡胶草橡胶草1151参考文献如下：Genome analysis ofTaraxacum kok-saghyz Rodin provides new insights into rubber biosynthesis,TaoLin,Xia Xu,etc National Science Review,0:1-12,2017,doi:10.1093/nsr/nwx101,Advance access publication 25August 2017。

实施例1、橡胶草中天然橡胶在气相色谱质谱中热裂解产物的解析及其定量方法的开发

1)将橡胶草1151洗净，取其根部。

2)收集橡胶草根部，将其在50℃烘干48h至恒重。

3)取液氮，将步骤2烘干的橡胶草样品置于液氮中，磨成粉末。

4)称取1mg步骤3中处理好的橡胶草样品，置于裂解仪专用钢杯中。

5)橡胶草中天然橡胶的裂解过程如图1所示，高分子天然橡胶在高温下裂解成自由基，再由自由基形成单体(异戊二烯)、二聚体(柠檬烯)、三聚体、四聚体。

6)将步骤4)中橡胶草根部样品在释放气体分析(EGA)模式下裂解。橡胶草根部样品在从40℃至750℃以30℃/min程序升温过程中，裂解气相全扫描色谱图如图2a。橡胶草根部样品在从40℃至750℃以30℃/min程序升温过程中，质荷比68的裂解气相色谱图如图2b。质荷比68是天然橡胶裂解产物的特征离子。由图2b可知，天然橡胶裂解产物在14min时裂解完全，此时裂解温度约为450℃。

7)将步骤4)中的样品在释放气体分析(EGA)模式下裂解。橡胶草根部样品在从40℃至450℃以15℃/min程序升温过程中，裂解气相全扫描色谱图如图2c。橡胶草根部样品在从40℃至450℃以15℃/min程序升温过程中，质荷比68的裂解气相色谱图如图2d。由图2d可确定，天然橡胶裂解产物在215℃至450℃之间裂解完全。

8)在450℃对橡胶草根部样品在单击模式下进行裂解，其全扫描色谱图如图3a所示。色谱条件：进样温度，300℃；分流比：100:1；载气：氦气；载气流速，1ml/min；气质连接口温度，250℃；色谱柱，Agilent HP-5ms(30m*250μm*0.25μm)；柱温箱从50℃开始，以30℃/min升温到290℃，290℃保持2min。质谱条件：溶剂延迟，无；质谱全扫描范围，m/z 29-700；质谱选择离子扫描模式，m/z 68；增益因子，1；质谱四级杆温度，150℃；离子源温度，230℃。对色谱图中裂解产物进行分析，并与NIST数据库进行比对，只在3.52min有天然橡胶裂解二聚体柠檬烯的色谱峰，且背景干扰严重，信噪比(S/N)9.9。

9)为了去除杂质，降低背景对橡胶草裂解产物的干扰，采用双击模式对橡胶草样品进行裂解。双击模式第一阶段，热裂解仪第一段从50℃以40℃/min程序升温至215℃；双击模式第二阶段，橡胶草在450℃进行裂解。双击模式色谱条件和质谱条件同步骤8。橡胶草根部样品在双击模式第一阶段程序升温过程中，裂解气相全扫描色谱图如图3b所示；双击模式第二阶段热裂解后，裂解气相全扫描色谱图如图3c所示。通过双击模式第一阶段去除杂质之后，双击模式第二阶段色谱图中在3.52min有明显的天然橡胶裂解二聚体柠檬烯色谱峰，信噪比(S/N)由原来的9.9提高到47.1，双击模式用于定量更准确。

10)对橡胶草中天然橡胶进行定量采用内标法，内标为聚苯乙烯，外标为聚异戊二烯。聚异戊二烯在步骤8)的色谱和质谱条件下，色谱图如图4a所示，其主要裂解产物和橡胶草根部天然橡胶裂解产物一致，为色谱峰3.52min的二聚体柠檬烯。天然橡胶标样和聚苯乙烯内标在双击模式第二阶段裂解气相色谱图如图4b所示。除天然橡胶裂解主产物柠檬烯在3.52处的色谱峰之外，聚苯乙烯裂解产物苯乙烯色谱峰保留时间在2.86min处。

11)取步骤4)的橡胶草样品1mg至钢杯中，将10mg聚苯乙烯溶于1ml甲苯中，加2μl10mg/ml聚苯乙烯的甲苯溶液至钢杯中。在双击模式第二阶段裂解气相色谱图如图4c所示。天然橡胶裂解二聚体柠檬烯质谱图如图4d所示。聚苯乙烯裂解单体苯乙烯质谱图如图4e所示。

12)内标法所用天然橡胶裂解产物定量及定性离子见表1。天然橡胶定量外标，采用裂解产物柠檬烯特征离子m/z 68作为定量离子，m/z 93和m/z 136作为定性离子，离子比误差范围小于20％。聚苯乙烯内标采用裂解产物苯乙烯特征离子m/z 104作为定量离子，m/z 51和m/z 78作为定性离子，离子比误差范围小于20％。

13)使用步骤12)的定量和定性离子，建立天然橡胶定量的标准曲线，其定量参数见表2，包括相关系数(R)平方值为0.99，线性范围为1-160μg天然橡胶，标准曲线y＝0.61x-0.085，定性限为0.004μg，定量限为0.014μg。

表1、天然橡胶裂解产物定量及定性离子。

表2、橡胶草中天然橡胶热裂解后定量参数，包括相关系数(R)，线性范围，标准曲线，定性限，定量限

实施例2、橡胶草中天然橡胶高通量高灵敏度定量应用

1)将橡胶草1151生长6个月的根洗净，取其根部。

2)收集根部，将其在50℃烘干48h至恒重。

3)取液氮，将步骤2)烘干的橡胶草样品置于液氮中，磨成粉末。

4)称取约1mg步骤3)中处理好的橡胶草样品，置于裂解仪专用钢杯中，样品设置3个生物学重复。

5)将10mg聚苯乙烯溶于1ml甲苯中，加2μl 10mg/ml聚苯乙烯的甲苯溶液至样品钢杯中。

6)将钢杯置于热裂解仪自动进样器上。

7)气相色谱-质谱条件如实施例1的步骤8)，热裂解仪的参数如实施例1的步骤9)中双击模式，进行样品数据采集。

8)采用实施例1步骤12)和步骤13)内标法建立的标准曲线，定量得橡胶草1151生长6个月根部样品中天然橡胶含量约为5.92％，生物学重复相对标准偏差0.71％。

采用本方法对橡胶草1151生长6个月根部样品定量时，检测过程自动化，检测结果线性好，灵敏度高。本发明提供的定量方法可以用于橡胶草中天然橡胶高通量高灵敏度定量研究。

Claims (3)

1.一种对橡胶草中天然橡胶含量的检测方法，包括：

1）将橡胶草根部烘干后磨碎，得到待测橡胶草样品；

所述磨碎步骤中，磨碎方法为利用液氮磨碎；

2）将步骤1）所得待测橡胶草样品进行热裂解气相色谱质谱联用检测；

所述步骤2）热裂解气相色谱质谱联用检测步骤中，热裂解的模式为双击模式；

所述双击模式中，第一段升温程序为：从50℃以40℃/min程序升温至215℃；第二段裂解温度为450℃；

3）对所述待测橡胶草样品中的天然橡胶含量进行定性和定量分析，完成所述橡胶草中天然橡胶含量的检测；

所述步骤2）热裂解气相色谱质谱联用检测步骤中，气相色谱检测的条件如下：

仪器：PY-GC/MS；

进样口温度：300℃ ；

分流比：100:1；

样品进样量：1 mg；

载气：氦气；

载气流速：1 ml/min；

气质连接口温度：250℃ ；

色谱柱类型：Agilent HP-5ms；

色谱柱参数：30 m× 250 µm × 0.25 µm；

色谱柱温程：从50℃开始，以30℃/min到290℃，290℃ 保持2 min；

所述质谱检测的条件如下：

全扫描范围：m/z 29-700；

选择性离子检测：m/z 68；

溶剂延迟：无；

增益因子：1；

质谱四级杆温度：150°C；

离子源温度：230°C；

所述步骤3）定性分析中，外标物为聚异戊二烯，外标定性离子为柠檬烯特征离子m/z93和m/z 136；内标物为聚苯乙烯，内标定性离子为苯乙烯特征离子m/z 51和m/z 78；

所述步骤3）定量分析中，外标物为聚异戊二烯，外标定量离子为柠檬烯特征离子m/z68；内标物为聚苯乙烯，内标物定量离子为苯乙烯特征离子m/z 104；按内标法进行定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）烘干步骤中，温度为50℃；时间为48h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，线性范围为1-160μg天然橡胶；

标准曲线为y = 0.61x - 0.085；y为天然橡胶峰面积与内标物峰面积比值；x为天然橡胶含量与内标物含量比值；

定性限为0.004μg；

定量限为0.014μg。

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