CN112341471A

CN112341471A - 罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针及合成方法和应用

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Publication number: CN112341471A
Application number: CN202011229784.7A
Authority: CN
Inventors: 杨征; 许甜甜; 刘向荣; 赵顺省; 杨再文; 加晓丹
Original assignee: Xian University of Science and Technology
Current assignee: Xian University of Science and Technology
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-11-06
Also published as: CN112341471B

Abstract

本发明属于化学检测技术领域，涉及一种罗丹明‑苯并噻唑功能化光敏探针及合成方法和应用，罗丹明‑苯并噻唑功能化光敏探针其结构为

可用于ClO^‑检测以及细胞中ClO^‑检测。本发明提供的罗丹明‑苯并噻唑功能化光敏探针具备六元螺内酰肼结构，探针分子稳定性高、探针的反应结合位点增加、生物亲和性好，可用于环境和生物细胞中ClO^‑检测，具有抗干扰能力好、响应时间短、荧光持续时间长、适用pH范围宽、检测灵敏度高和检测浓度范围广的特点，具有重要的科研价值和广阔的应用推广前景。

Description

罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针及合成方法和应用

技术领域

本发明属于化学检测技术领域，涉及一种罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针及合成方法和应用。

背景技术

活性氧物质(ROS)，包括超氧自由基(O₂ ^·-)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧(¹O₂)和次氯酸以及次氯酸盐(HClO/ClO^-)，与众多生理学和病理性进程如信号转换、神经性损伤、炎症和致癌作用等息息相关。次氯酸和次氯酸盐一起存在用以调节生理pH，是一种重要的ROS。作为日常生活中十分有效的抗菌剂和漂白剂，次氯酸广泛应用于自来水和泳池等水质的消毒。而在细胞中它能快速将氨基酸中的氨基基团氧化为氯胺，而氯胺及次氯酸自身均为强亲核性氧化剂，它们直接作用于半胱氨酸的巯基和甲硫氨酸的硫醚基，使得病原微生物的酶、蛋白酶抑制剂及载体蛋白等失活，从而起到杀灭病原微生物的作用，是生物体免疫系统中重要的杀菌剂。然而，由于具有高反应活性和天然的扩散性，过量ClO^-则会引起氧化应激，导致许多疾病如炎症性疾病、动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症和肾脏疾病等。鉴于ClO^-在实际生产生活和生物体中的重要性，可视化样品中ClO^-浓度变化情况及其在生物组织和器官中的动态分布，亦是当今化学、环境科学和生物学等领域的一项重要课题。

在众多检测方法中，荧光探针由于具有良好的检测灵敏性、靶向选择性、响应迅速且适用于实时成像等优点收到广大研究工作者青睐。传统的罗丹明基探针分子中均含有一个五元螺内酰胺环，探针对ClO^-的靶向选择性一般是通过Schiff碱结构氧化水解引起螺环的开启与关闭而实现荧光信号变化，但是由于五元螺环和Schiff碱结构稳定性较差，结合的位点力较少，影响检测结果的稳定性和准确性。

发明内容

为了解决现有的罗丹明基探针存在的问题，本发明提供一种罗丹明-苯并噻唑功能化的光敏探针及其制备方法和应用，探针具备六元螺内酰肼结构，分子稳定性高、探针的反应结合位点增加、生物亲和性好，可用于环境和生物细胞中ClO^-检测，具有抗干扰能力好、响应时间短、荧光持续时间长、适用pH范围宽、检测灵敏度高和检测浓度范围广的特点，具有重要的科研价值和广阔的应用推广前景。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，结构式如下所示：

一种罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针的合成方法是：

1)在5mL的1,2-二氯乙烷溶剂中将1mmol罗丹明B和1mL POCl₃反应生成罗丹明B酰氯；

2)在2.5mL乙腈溶剂中，将步骤1)生成的罗丹明B酰氯与1mmol 2-肼基-6-甲氧基苯并噻唑反应，同时向体系中加入1mL三乙胺作为缚酸剂；反应后经二氯甲烷萃取、分离后得到淡黄色固体产物。

一种罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在ClO^-检测方面的应用。

一种罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在细胞中ClO^-检测方面的应用。

进一步的，所述罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在用于ClO^-检测时，向探针中加入光学混合溶剂。

进一步的，所述光学混合溶剂包括有机溶剂和水。

进一步的，所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N’-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、甲醇或乙醇。

进一步的，所述有机溶剂为乙醇时，所述乙醇与水的体积比为0～10:10～0。

进一步的，所述乙醇与水的体积比为4:6。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针具有独特的六元螺内酰肼结构，能提高探针分子的稳定性，增加探针的反应结合位点，同时提升探针的生物亲和性；具有重要的科研价值和广阔的应用推广前景。

2、本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在ClO^-检测方面的应用。由于ClO^-会使探针螺酰肼结构发生氧化水解，进而酰肼键断裂得到开环的罗丹明，最大吸收和发射波长分别出现在547nm和563nm。因此，检测时整个响应过程具有响应时间短、荧光持续时间长、适用pH范围宽、检测灵敏度高和检测浓度范围广等优点。

3、本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在细胞中ClO^-检测方面的应用。在检测时，不受共存的活性氧物质(ROS)、活性氮物质(RNS)、生物硫醇和其它活性小分子干扰，可检测出活细胞中ClO^-的浓度和分布情况，显示出较强的应用性。

4、本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在用于ClO^-检测时，向含有ClO^-的待测溶液中加入光学混合溶剂。光学混合溶剂包括有机溶剂和水。经过研究发现，探针在EtOH-H₂O混合溶剂体系中的检测响应情况较好，且EtOH与水的体积比为4:6时，探针的紫外吸收和荧光发射强度均增强，探针荧光发射强度在ClO^-浓度0.01μmol·L^-1-100μmol·L^-1的范围内表现出明显的线性关系，检测限为70nmol·L^-1。

附图说明

图1为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的离子选择性紫外可见吸收图；

图2为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的离子选择性荧光发射光谱图；

图3为该探针在不同溶剂中紫外可见吸收强度的变化图；

图4为该探针在不同溶剂中荧光发射强度的变化图；

图5为该探针在不同比例的EtOH-H₂O溶剂中的紫外可见吸收强度变化图；

图6为该探针在不同比例的EtOH-H₂O溶剂中的荧光发射强度变化图；

图7为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的紫外可见吸收发射强度随pH变化图；

图8为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的荧光发射强度随pH变化图；

图9为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的抗干扰能力紫外可见吸收图；

图10为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的抗干扰能力荧光发射光谱图；

图11为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的紫外可见吸收滴定图；

图12为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的荧光发射光谱滴定图；

图13为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的紫外可见吸收强度随ClO^-浓度的变化图；

图14为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的荧光发射强度随ClO^-浓度的变化图；

图15为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的紫外可见吸收强度与ClO^-浓度的线性关系图；

图16为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中的荧光发射强度随ClO^-浓度的线性关系图；

图17为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中加入ClO^-后的时间响应紫外可见吸收图；

图18为该探针在EtOH-H₂O(4:6,v/v)溶剂中加入ClO^-后的时间响应荧光发射光谱图；

图19为该探针在活的L929细胞和MG-63细胞中对ClO^-检测的细胞成像图。

具体实施方式

现结合附图以及实施例对本发明做进详细的说明。

本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，结构式如下所示：

本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针的合成方法是：

本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在ClO^-检测方面的应用。

本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在细胞中ClO^-检测方面的应用。

本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在用于ClO^-检测时，向含有ClO^-的待测溶液中加入光学混合溶剂。光学混合溶剂包括有机溶剂和水。有机溶剂为四氢呋喃、N,N’-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、甲醇或乙醇。

本发明提供的有机溶剂为乙醇时，乙醇与水的体积比为0～10:10～0。优选的，乙醇与水的体积比为4:6。

实施例

本实施例提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针的合成方法路线是：

本实施例具体的合成过程是：

1)在洁净且绝对干燥的50mL圆底烧瓶中，准确称量0.4780g干燥的罗丹明B(1.000mmol)加入其中，量取5.0mL干燥的1,2-二氯乙烷作为溶剂，稍加摇晃使罗丹明B全部溶解，然后量取1.0mL三氯氧磷POCl₃加入到反应瓶中，加入磁力搅拌子，使用回流冷凝装置，并装置干燥管和尾气吸收装置，设置反应温度为90℃，加热回流反应约8h。反应过程中有刺激性气味的气体放出；反应完毕后，将反应瓶冷却至室温，然后用旋转蒸发仪蒸出溶剂1,2-二氯乙烷和为反应完的三氯氧磷，得到暗红色粘稠固体；

2)量取2.5mL干燥的乙腈加入到反应瓶中，稍加摇晃使瓶内粘稠物全部溶解；准确称量0.1802g(1.000mmol)2-肼基-6-甲氧基苯并噻唑，使用5.0mL干燥的乙腈溶解，并量取1.0mL三乙胺NEt₃加入其中，在搅拌下使用滴液漏斗缓慢滴加到反应瓶中，约15min滴加完毕，滴加过程中会有大量热放出，同时产生大量白色烟雾；设定反应温度为90℃，加热回流反应约4-6h，使用薄层色谱检测反应进程；反应结束后，将反应瓶冷却至室温，用旋转蒸发仪蒸出溶剂，然后向反应瓶中加入10mL水和10mL二氯甲烷，室温搅拌30min。然后用二氯甲烷作为萃取剂萃取产物，收集有机相到100mL锥形瓶中，水洗之后将有机相用无水硫酸镁干燥30min，得到紫红色溶液；干燥结束后，将干燥后的溶液过滤，并用少量二氯甲烷冲洗锥形瓶和滤纸，将所得滤液用旋转蒸发仪蒸出溶剂，然后用二氯甲烷-甲醇混合溶剂(30:1,v/v)作为洗脱剂柱层析分离即可得到淡黄色粉末状产物。

本实施例中，合成得到的淡黄色粉末状产物作为罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，其产量为0.1638g，产率为26.5％。

本实施例给出了在实验室合成罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针的较优用量和合成参数，但是当各原料的用量符合本实施例提供的用量配比时，采用本实施例的合成路线和方法能够得到淡黄色粉末状产物。

本实施例中，采用现有的通用检测方法，测定其熔点为熔点(Mp.):238-239℃。

本实施例中，采用现有的元素分析，结果是：Anal.calcd for C₃₇H₃₈N₄O₃S:H,6.19；C,71.82；N,9.05。Found:H,6.18；C,71.84；N,9.05。

本实施例中，采用红外光谱分析，得到的结果是：IR(KBr,υ/cm^-1):3359.9,3064.8,2968.4,1664.5,1633.7,1612.5,1541.1,1512.1,1467.8,1427.3,1379.1,1338.6,1261.4,1220.9,1118.7,1064.7,1022.2,935.4,846.7,758.0。

本实施例中，通过核磁共振对罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针进行表征：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.35(d,J＝8.16Hz,1H),7.58(d,J＝8.85Hz,1H),7.50(p,J＝7.28Hz,2H),7.23(d,J＝2.05Hz,1H),7.13(d,J＝7.02Hz,1H),6.95(dd,J＝8.88,1.97Hz,1H),6.88(d,J＝8.83Hz,2H),6.73(s,1H),6.42(d,J＝2.08Hz,2H),6.27(dd,J＝8.87,2.11Hz,2H),3.84(s,3H),3.32(q,J＝7.00Hz,8H),1.14(t,J＝6.96Hz,12H)。

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ161.2,156.6,154.7,152.5,148.8,145.6,142.8,134.8,133.8,130.4,127.9,127.6,122.0,114.8,108.5,107.3,103.0,97.9,59.0,55.8,44.4,12.6。

本实施例中，通过分析，得到高分辨质谱：MS(ESI)m/z＝620.2749,calc.for[M+H]⁺＝620.2744。

经过检测分析得到罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针的结构数据参数，如表1所示。

表1晶体学结构数据参数

本实施例合成的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，结构式为：

通过参数和其晶型可知，本实施例提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针具有独特的六元螺内酰肼的晶体结构，具有很高的分子稳定性，探针的反应结合位点增加，生物亲和性增强；具有重要的科研价值和广阔的应用推广前景。

为了进一步证明本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在检测方面的性能优越性，进行以下验证试验。

试验1探针的离子选择性测定

采用实施例合成的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，对含有不同离子的选择性进行测定。

试验过程：以EtOH-H₂O(4:6,v/v)为溶剂准确配置探针浓度为20μmol·L^-1，分别与5倍当量的各种活性氧物质(ROS)、活性氮物质(RNS)、生物硫醇和活性小分子混合后的溶液，测定其紫外吸收光谱及在520nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图1和图2所示。

从图1和图2可以看出，该探针只对ClO^-表现出明显的选择性响应，对其它生物活性物质均无明显响应。

试验2探针溶剂选择性测定

采用实施例合成的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，对探针在不同光学测试溶剂中对ClO^-响应进行测定，用以提高探针对ClO^-的响应强度。

试验过程：光学测试溶剂是由有机溶剂和水形成的混合溶剂体系，有机溶剂分别选用四氢呋喃THF、N,N’-二甲基甲酰胺DMF、丙酮Me₂CO、乙腈MeCN、二甲基亚砜DMSO、甲醇MeOH或乙醇EtOH。

将上述7种不同的有机溶剂分别与和水溶液混合形成7种混合溶剂体系，分别作为光学测试溶剂准确配置浓度为20μmol·L^-1的探针和5倍当量的ClO^-的混合溶液，测定其紫外吸收光谱及在520nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图3和图4所示。

从图3和图4可以看出，当使用不同有机溶剂和水混合溶剂体系时，探针在EtOH-H₂O混合溶剂体系中的检测响应情况较好，因此，EtOH-H₂O混合溶剂被选作光学测试溶剂。

为了得到EtOH-H₂O混合溶剂中，EtOH和H₂O最优配比，分别以不同比例的EtOH-H₂O混合溶剂准确配置浓度为20μmol·L^-1的探针和5倍当量的ClO^-的混合溶液。测定其紫外吸收光谱及在520nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图5和图6所示。

试验时，EtOH-H₂O混合溶液中，EtOH与H₂O的体积比分别为0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0。

从图5和图6可以看出，随着溶剂体系中EtOH含量的增加，探针的紫外吸收和荧光发射强度均有所增强，当EtOH与H₂O的体积比大于4:6时，紫外吸收和荧光发射强度增强但是增大幅度缓慢，且超过8:2后呈下降趋势，综合考虑，选择EtOH-H₂O(4:6v/v)混合溶液体系作为光学测试溶剂。

试验3探针的适用pH范围测定

采用实施例合成的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，在溶液不同pH值下，测定探针对ClO^-响应程度。

试验过程：以EtOH-H₂O(4:6,v/v)为溶剂分别准确配置在不同pH值下，探针浓度为20μmol·L^-1的纯探针；探针浓度为20μmol·L^-1与5倍当量的ClO^-混合的两组溶液，测定其紫外吸收光谱及在520nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图7和图8所示。

试验时，pH值分别为1.7、2.3、2.8、3.6、4.8、5.4、6.8、7.1、7.4、7.8、8、9.1、10、11.6、12、13。

从图7和图8可以看出，探针适用于pH值为5.0-9.0的体系中ClO^-的检测，此时探针对ClO^-的响应测试结果稳定。

试验4探针的抗干扰能力测定

采用实施例合成的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，测定探针抗干扰能力。

试验过程：以EtOH-H₂O(4:6,v/v)为溶剂准确配置探针浓度为20μmol·L^-1，先与5倍当量的ClO^-混合，再分别与5倍当量的各种ROS、RNS、生物硫醇和活性小分子干扰物质混合后的溶液，测定其紫外吸收光谱及在520nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图9和图10所示。

从图9和图10可以看出，该探针对ClO^-的响应过程基本不受其它共存离子的干扰。

试验5探针的滴定和检测范围测定

采用实施例合成的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，测定探针对不同ClO^-浓度的响应程度。

试验过程：以EtOH-H₂O(4:6,v/v)为溶剂准确配置探针浓度为20μmol·L^-1，分别与0-5.0倍当量的ClO^-混合后的溶液，测定其紫外吸收光谱及在520nm激发波长下的荧光发射光谱测定结果如图11和图12所示。

从图11和图12可以看出，该探针荧光发射强度与ClO^-浓度的增加而逐渐增强，表明ClO^-浓度越大，探针的荧光感应度越好。

此外，根据图11和图12的测试结果，分别做出紫外可见吸收强度随ClO^-浓度以及荧光强度随ClO^-浓度变化曲线图和线性关系图，结果如图13-16所示。

从图13-16可以看出，ClO^-浓度在0.01μmol·L^-1-100μmol·L-1的范围内，探针感应强度与ClO-浓度变化之间表现出明显的线性关系，且检测限为70nmol·L-1，检测灵敏度高。

试验6探针响应时间测定

采用实施例合成的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，测定探针对ClO^-浓度的响应时间。

试验过程：以EtOH-H₂O(4:6,v/v)为溶剂分别准确配置浓度为20μM的探针和5倍当量的ClO^-的混合溶液，测定其紫外吸收光谱及在520nm激发波长下的荧光发射光谱随时间的变化情况，测定结果如图17和图18所示。

从图17和图18可以看出，探针对ClO^-的响应时间在3s内，且随着时间推移探针荧光强度并未减弱。

试验7探针在小鼠成纤维细胞(L929)和人成骨肉瘤细胞(MG-63)中的像

采用实施例合成的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，测定探针对细胞中ClO^-浓度的响应。

试验过程：将L929和MG-63细胞37℃的恒温培养箱中培养30min，向培养皿中加入20μmol·L^-1的探针溶液培养4h。共聚焦未呈现出明显的荧光发射(图19-a)。

然后向体系中5倍浓度ClO-和10％乙醇并在37℃的恒温培养箱内培养4h，细胞中出现明显的荧光发射(图19-b)；明视场图片(图19-c)表明在成像过程中细胞始终保持活性，证明该探针对细胞的毒性较小。

图19表示探针在L929和MG-63细胞中对ClO^-的荧光共聚焦成像；其中图19-d图是图19-b和图19-c的叠加图。

实验结果表明，该罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针可用于L929和MG-63细胞中ClO^-的检测和成像。

综上所述，本发明提供的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针具有独特的六元螺内酰肼结构，分子稳定性好，反应结合位点增加，生物亲和性高；在用于环境中ClO^-检测和生物细胞中ClO^-检测，且检测时具有响应时间短、荧光持续时间长、适用pH范围宽、检测灵敏度高、抗干扰能力强和检测浓度范围广等优点，具有重要的科研价值和广阔的应用推广前景。

Claims

1.一种罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，其特征在于，所述结构式如下所示：

2.如权利要求1所述的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针的合成方法，其特征在于，所述合成方法是：

3.如权利要求1所述的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在ClO^-检测方面的应用。

4.如权利要求1所述的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在细胞中ClO^-检测方面的应用。

5.根据权利要求3所述的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，其特征在于，所述罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针在用于ClO^-检测时，向探针中加入光学混合溶剂。

6.根据权利要求5所述的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，其特征在于，所述光学混合溶剂包括有机溶剂和水。

7.根据权利要求6所述的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，其特征在于，所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N’-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、甲醇或乙醇。

8.根据权利要求7所述的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇时，所述乙醇与水的体积比为0～10:10～0。

9.根据权利要求8所述的罗丹明-苯并噻唑功能化光敏探针，其特征在于，所述乙醇与水的体积比为4:6。