CN112322774A - 小麦面筋品质QTL qWGQ-1DS的分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明属于小麦基因组解析及小麦分子育种技术领域，具体涉及一个基于小麦面筋品质性状相关QTL qWGQ‑1DS左侧标记Marker14785的分子标记。该分子标记命名为：KASP.WGQ‑1DS，为一组PCR扩增用引物序列，碱基序列如SEQ ID No.1~3所示。利用面筋峰值仪这一仪器设备，发明人对前期所构建的遗传材料群体中与面筋品质性状相关的基因进行了定位分析，并在此基础上，开发了与qWGQ‑1DS紧密连锁的KASP标记。基于该分子标记，可以初步检测判定小麦品种的面筋强度高低，而且具有检测通量高、时间短、准确性高、易于实现自动化、成本低、环境友好等特点。

Description

小麦面筋品质QTL qWGQ-1DS的分子标记
技术领域
本发明属于小麦基因组解析及小麦分子育种技术领域，具体涉及一个基于小麦面筋品质性状相关QTL qWGQ-1DS左侧标记Marker14785的分子标记。
背景技术
小麦是世界上重要的粮食作物之一，约占全世界粮食种植面积的17%。目前，小麦的年消耗量超过了680万吨，为全世界五分之一的人口提供了食物来源。以小麦粉为主的原料可以制成许多食品，如面包、面条、馒头、蛋糕等，而其可以制成不同类型的制品取决于小麦的面筋强度，例如：高筋面粉可以用于制作面条、面包等；而低筋面粉可以用于制作蛋糕、饼干等。面筋由醇溶蛋白和麦谷蛋白组成,分别决定着面筋的延展性和弹性,与小麦品质、特别是二次加工品质关系密切, 在很大程度上决定了面粉的实际用途和加工品质。
小麦面筋蛋白作为小麦粉中一种独特的蛋白质，鉴于其在面制品的加工过程中不可替代的作用，因此，基于小麦相关基因组研究，开发和定位与小麦面筋蛋白相关基因，对于小麦品质改良具有十分重要的技术价值。
发明内容
本申请目的在于提供一组针对小麦面筋品质性状相关QTL qWGQ-1DS区间左侧标记Marker14785的SNP分子标记KASP WGQ-1DS，基于该标记，可为小麦新品种培育、小麦面筋品质性状改良奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
Marker14785在小麦品质中的应用，Marker14785与小麦面筋品质性状相关；所述Marker14785，为小麦面筋品质性状相关QTL qWGQ-1DS区间左侧标记，位于小麦1D染色体短臂2.81cM处，其101位碱基为C/T突变位点（该突变导致序列的核苷酸多态性）；具体如下（205bp）：
GTGCAGTTTGTCTCCGGCGATATGTTTGACTACATTCCACCAGCGGATGCCGTTCTACTCAAGGTACGTACTTACATAGTACTCCCTCCGTAAGGATATA[T/C]AAGAGCATTTAGATCATTATTATTTTAGTGATTGATCCAAACGCACTTATATTTCTTTACAGAGGGAGTAGCACATACAAATGCAGCAAGCTATCCATTT。
基于小麦面筋相关Marker14785的分子标记，该分子标记命名为：KASP.WGQ-1DS，为一组PCR扩增用引物序列，碱基序列如SEQ ID No.1~3所示，具体为：
F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATAATAATGATCTAAATGCTCTTG-3’，（引物5’端“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”部分序列添加有FAM荧光标签）；
F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATAATAATGATCTAAATGCTCTTA-3’，（引物5’端“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”部分序列添加有HEX荧光标签）；
R：5’-CATTCCACCAGCGGATGCCG-3’；
所述Marker14785，为小麦面筋品质性状相关QTL qWGQ-1DS区间左侧标记，位于小麦1D染色体短臂2.81cM处，其101位碱基为C/T突变位点（该突变导致序列的核苷酸多态性）；具体如下（205bp）：
GTGCAGTTTGTCTCCGGCGATATGTTTGACTACATTCCACCAGCGGATGCCGTTCTACTCAAGGTACGTACTTACATAGTACTCCCTCCGTAAGGATATA[T/C]AAGAGCATTTAGATCATTATTATTTTAGTGATTGATCCAAACGCACTTATATTTCTTTACAGAGGGAGTAGCACATACAAATGCAGCAAGCTATCCATTT。
所述小麦面筋相关Marker14785的分子标记KASP.WGQ-1DS在小麦种质资源鉴定、改良及分子标记辅助育种中的应用。
利用所述小麦面筋相关Marker14785的分子标记对小麦面筋品质性状的检测判定方法，具体包括如下步骤：
（一）提取待测样品基因组
提取待测小麦样品基因组DNA；所述小麦样品，具体例如为小麦叶片；
（二）RT-qPCR扩增
以步骤（一）中所提取DNA为模板，利用所述分子标记KASP.WGQ-1DS引物组进行RT-qPCR扩增；
具体PCR扩增时，10μL扩增体系参考设计如下：
KASP Mix，5ul；
Primer mix，1.4ul；
MgCl2，0.08ul；
步骤（一）所提取DNA模板 (100ng)，1 ul；
ddH2O加至10ul；
上述反应体系中，所述Primer mix，100μL体系，参考如下比例配制：
F1，10umol、12ul；
F2，10umol、12ul；
R，10umol、30ul；
ddH2O，46ul；
PCR反应程序如下：
95℃、变性15min；95℃、变性20s，65℃~55℃退火1min，连续10个循环，循环过程中，从65℃开始，每个循环退火温度降低1℃；94℃、变性20s，57℃、退火1min，30个循环；37℃、1min，结束扩增程序；
（三）检测判定
对步骤（二）中PCR产物进行检测判定，检测判定时，以漯珍一号(SNP位点基因型为CC)与郑育麦9987(SNP位点基因型为TT)的检测结果作为分型对照；具体而言：
对PCR扩增产物进行荧光扫描，根据荧光标签的分型结果来判定待检样品的SNP位点为哪种碱基，并进行数据基因分型判定，进一步而言：
分型结果偏向于FAM的一侧，SNP位点的碱基为加FAM标签引物的碱基；
分型结果偏向于HEX的一侧，SNP位点的碱基为加HEX标签引物的碱基；
纯合态基因型CC，表示高筋品质；
纯合态基因型TT，表示低筋品质；
杂合态基因型CT，表示中筋品质。
面筋峰值仪（面筋聚集仪，GlutoPeak）是一种基于高剪切力原理、快速测定面筋强度、反映面筋黏聚特性的仪器，其原理是基于高剪切力的作用，使面筋的网络结构快速形成后被破坏，其特点是试验时间不超过10 min，样品用量少（＜10 g），可快速了解小麦粉面筋特性。利用这一仪器设备，发明人对前期所构建的遗传材料群体中与面筋品质性状相关的基因进行了定位分析，结果在1D染色体上发现了与面筋品质性状相关的QTL qWGQ-1DS，其物理位置为5291496-8008493之间，位于标记Marker14785-Marker14822之间，LOD值5.88～10.01，解释表型变异6.05％～9.36％。在此基础上，本申请开发了与qWGQ-1DS紧密连锁的KASP(竞争性等位基因特异性PCR)标记KASP.WGQ-1DS。基于该分子标记，可以初步检测判定小麦品种的面筋强度高低，而且由于利用SNP分子标记检测小麦面筋品质性状具有检测通量高、时间短、准确性高、易于实现自动化、成本低、环境友好等特点，因此可为小麦面筋品质改良和优质小麦新品种的培育（尤其是分子育种）奠定一定技术基础。
附图说明
图1为部分面筋峰值仪参数在原阳、延津两环境下的QTL共定位图；
图2为面筋峰值仪（GlutoPeak）的测试曲线图，其中：PMT为峰值时间；BEM为峰值扭矩；AM为峰前值；PM为峰后值；A1为从开始测试到第一个峰时曲线与横轴所围区域的面积；A2为从第一个峰到第一个峰后低谷点时曲线与横轴所围区域的面积；A3为从第一个峰后低谷点到峰前值时曲线与横轴所围区域的面积；A4为从峰前值到峰值时曲线与横轴所围区域的面积；A5为从峰值到峰后值时曲线与横轴所围区域的面积；
图3为分子标记KASP.WGQ-1DS在183份小麦品种中的分型结果；
图4为分子标记KASP.WGQ-1DS的分型结果与品质性状的关联分析，其中：A为分子标记与面筋峰值仪参数A3的关联分析；B为分子标记与粉质参数稳定时间的关联分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
实验背景：
前期研究工作过程中，发明人以强筋小麦品种漯珍一号为母本，以弱筋小麦品种郑育麦9987为父本构建获得一个高世代遗传分离群体，利用该群体的RIL5材料，发明人构建了一个覆盖小麦全基因组的高密度遗传连锁图谱，进一步地，以该群体的196个家系的第六代重组自交系(RIL) 2018年河南原阳、延津两地种植所得实验材料为基础，发明人利用面筋峰值仪（面筋聚集仪LM3100，GlutoPeak，Perten公司）对与小麦面筋品质性状基因进行了初步定位。
实施例1
本实施例就利用面筋峰值仪（面筋聚集仪，GlutoPeak）对与小麦面筋品质性状相关QTL基因的定位方法简介如下。
具体定位时：
前期研究中，利用SLAF测序技术，用196个家系的第五代群体构建了高密度的遗传连锁图谱，结果表明：图谱含标记8518个，覆盖小麦21条染色体3140.54cM；
针对第六代群体196个家系的实验材料，利用面筋峰值仪测定九个参数（PMT、BEM、AM、PM、A1、A2、A3、A4、A5），以此测定结果作为表型数据基础，用于后续QTL定位；
以前述高密度遗传图谱作为基础，采用R/qtl软件的全基因组复合区间作图法，阈值设定为2.5，扫描步长为1cM，结合前述九个参数数据进行QTL定位，从而得到与面筋品质性状相关的QTL区间。
根据面筋峰值仪对多个参数在原阳、延津两个地区共定位的结果（如图1所示）来看，在小麦染色体1D上共同存在着一个QTL，我们将其命名为qWGQ-1DS，其物理位置在5291496-8008493之间，所述5291496-8008493的遗传距离为2.81-5.90cM，位于标记Marker14785-Marker14822之间，LOD值5.88～10.01，解释表型变异6.05％～9.36％（对数概率得分LOD为10.01时，累加效应值(ADD)为60.34，表型变异率(PVE)为9.36％）。
需要说明的是，利用面筋峰值仪来对小麦面筋品质性状相关QTL表型值（即，前述九个参数）进行测定时，参考现有技术（Chandi et.al., Optimization of gluten peaktester: A statistical approach，Journal of Food Quality，2012，35（1）: 69-75）即可，或者具体参考如下：
首先，制备全麦粉：采用锤式旋风磨粉碎小麦样品，全麦粉样品过0.8 mm 圆孔筛板，混合均匀后低温（4~6℃）条件下储存备用；
随后，用近红外谷物分析仪对全麦粉的水分含量进行测定；
最后，利用面筋峰值仪对全麦粉样品进行测定，测试条件为：
将小麦全麦粉和0.5mol/L的CaCl2 溶液按比例进行混匀，具体混合前，以样品水分为依据，在软件GlutoPeak中自动计算出样品重量和溶液重量，然后进行称取并混匀；测定时：转速1900 r/min，温度34℃，运行时间10min。
某一样品测定结果如图2所示。
实施例2
在实施例1基础上，发明人针对QTL qWGQ-1DS区间左侧Marker14785的SNP位点开发了KASP分子标记KASP.WGQ-1DS，该分子标记为一组PCR扩增用引物序列，另一方面，在设计的引物中，发明人增加了荧光标签（引物由生工生物工程（上海）有限公司合成提供），以便于后续的检测、判定和应用。具体引物设计序列如下：
F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATAATAATGATCTAAATGCTCTTG-3’，（引物5’端序列“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”部分添加有FAM荧光标签）；
F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATAATAATGATCTAAATGCTCTTA-3’，（引物5’端序列“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”部分添加有HEX荧光标签，下划线部分）；
R：5’-CATTCCACCAGCGGATGCCG-3’。
以上述所设计分子标记为基础，发明人进一步在部分自然群体（GWAS）中进行了检测、判定和验证，具体操作参考如下。
（一）提取DNA模板
以申请人种植于原阳基地的183份不同小麦品种为实验材料，选择小麦种子长至三叶一心的嫩叶片为样品，将适量小麦嫩叶片(约0.1克)放入2.0mL离心管中，加入钢珠，在液氮中冷却后，利用打样机对叶片进行研磨处理；随后，采用CTAB法提取小麦叶片DNA；提取完成后，进行DNA完整性电泳检测，并利用浓度仪测定样品DNA浓度，并根据测定结果将所有样品浓度稀释至100ng/ul，以此作为后续KASP标记分型的模板DNA。
（二）PCR扩增
PCR扩增时，10μL扩增体系参考设计如下：
KASP Master Mix（购自LGC公司），5ul；
Primer mix，1.4ul；
MgCl2，0.08ul；
步骤（一）所提取DNA模板 (100ng)，1 ul；
ddH2O加至10ul；
所述Primer mix，100μL体系，参考如下比例配制：
F1，10umol、12ul；
F2，10umol、12ul；
R，10umol、30ul；
ddH2O， 46ul。
PCR反应程序如下：
95℃、15min；95℃、20s，65℃~55℃，1min，10个循环(每个循环降低1℃)；94℃、20s，57℃、1min，30个循环；37℃、1min。
PCR反应过程中，如果分型不好，可在上述30个循环基础上适当增加3~5个循环。
（三）结果分析和判定
依据PCR结果，对分子标记KASP.WGQ-1DS在183个小麦品种中进行基因分型，具体结果如文本最后的表1所示。
统计汇总结果如图3所示，不同颜色荧光显示不同基因型，橙色（FAM标签）、蓝色（HEX标签）、绿色和黑色荧光分别表示基因型为CC、TT、CT和空白对照；可以看出，分子标记KASP.WGQ-1DS在小麦材料中分型良好。而依据前述基因图谱结果而言，按照突变位点基因分型，基因型CC代表SNP位点与母本漯珍一号基因型一致的纯合态，其面筋强度较强；基因型CT代表杂合态，其面筋强度适中；基因型TT代表SNP位点与父本郑育麦9987基因型一致的纯合态，其面筋强度较弱。据此，统计结果表明：该183个样本中基因型为纯合态CC（面筋强度较高）的共9个，基因型为纯合态TT（面筋强度较低）的共168个，基因型为杂合态CT（面筋强度适中）的共6个。
已有研究认为，面筋峰值仪测定全麦粉时，参数A3值与小麦粉最大拉伸阻力显著相关，可以解释其变异的86.1%，可见全麦粉面筋峰值仪的A3值是预测小麦粉其面团揉混和延展特性的重要指标，对面筋品质性状具有重要的影响。而面团的稳定时间与面筋有着重要的作用，稳定时间越长，其面粉筋力越强，因此，面筋峰值仪参数A3以及面团形成时间可以作为小麦面筋品质的评定指标。基于此，为验证上述判定结果的准确性，发明人利用面筋峰值仪对上述183个样本进行了测定（具体结果参见表1）。
进一步将纯合态CC、TT与A3参数结果以及形成时间的数据分别进行关联统计分析，结果如图4所示。可以看出：
基于面筋峰值仪A3参数和稳定时间的关联结果表明基因型CC与TT存在着显著差异（P<0.05）（图4A）或极显著差异（P<0.01）（图4B），也即，进一步证明了基因型CC与TT差异是导致面筋品质存在差异的根本性原因，换言之，对于CC或TT基因型的检测可以用来判定面筋品质；也即，基于分子标记KASP.WGQ-1DS可以作为小麦面筋品质性状的有效分子标记或者用来指导相关小麦分子育种工作。
表1，183份小麦品种分子标记的检验结果及相关品质数据（表中基因型指Marker14785基因型）
Figure DEST_PATH_IMAGE001
续上表：
Figure 843548DEST_PATH_IMAGE002
续上表：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
续上表：
Figure 904564DEST_PATH_IMAGE004
续上表：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
<120> 小麦面筋品质QTL qWGQ-1DS的分子标记
<130> none
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc taataataat gatctaaatg ctcttg 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat taataataat gatctaaatg ctctta 46
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 3
cattccacca gcggatgccg 20

Claims (6)

1.小麦面筋品质QTL qWGQ-1DS的分子标记，其特征在于，该分子标记命名为：KASP.WGQ-1DS，该分子标记针对小麦面筋品质性状相关QTL qWGQ-1DS区间左侧标记Marker14785设计，为一组PCR扩增用引物序列，碱基序列如SEQ ID No.1~3所示，具体为：
F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATAATAATGATCTAAATGCTCTTG-3’，
F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATAATAATGATCTAAATGCTCTTA-3’，
R：5’-CATTCCACCAGCGGATGCCG-3’；
所述Marker14785，为小麦面筋品质性状相关QTL qWGQ-1DS区间左侧标记，位于小麦1D染色体短臂2.81cM处，其101位碱基为C/T突变位点；具体如下：
GTGCAGTTTGTCTCCGGCGATATGTTTGACTACATTCCACCAGCGGATGCCGTTCTACTCAAGGTACGTACTTACATAGTACTCCCTCCGTAAGGATATA[T/C]AAGAGCATTTAGATCATTATTATTTTAGTGATTGATCCAAACGCACTTATATTTCTTTACAGAGGGAGTAGCACATACAAATGCAGCAAGCTATCCATTT。
2.Marker14785在小麦品质改良中的应用，其特征在于，Marker14785与小麦面筋品质性状相关；所述Marker14785，为小麦面筋品质性状相关QTL qWGQ-1DS区间左侧标记，位于小麦1D染色体短臂2.81cM处，其101位碱基为C/T突变位点；具体如下：
GTGCAGTTTGTCTCCGGCGATATGTTTGACTACATTCCACCAGCGGATGCCGTTCTACTCAAGGTACGTACTTACATAGTACTCCCTCCGTAAGGATATA[T/C]AAGAGCATTTAGATCATTATTATTTTAGTGATTGATCCAAACGCACTTATATTTCTTTACAGAGGGAGTAGCACATACAAATGCAGCAAGCTATCCATTT。
3.权利要求1所述小麦面筋品质QTL qWGQ-1DS的分子标记在小麦中的应用，其特征在于，用于小麦种质资源鉴定、小麦品种改良或小麦分子标记辅助育种。
4.利用权利要求1所述小麦面筋品质QTL qWGQ-1DS的分子标记对小麦面筋品质性状的检测判定方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（一）提取待测样品基因组
提取待测小麦样品基因组DNA；
（二）RT-qPCR扩增
以步骤（一）中所提取DNA为模板，利用所述分子标记KASP.WGQ-1DS引物组进行RT-qPCR扩增；
（三）检测判定
对步骤（二）中PCR产物进行检测判定，检测判定时，
纯合态基因型CC，表示高筋品质；
纯合态基因型TT，表示低筋品质；
杂合态基因型CT，表示中筋品质。
5.如权利要求4所述小麦面筋品质性状的检测判定方法，其特征在于，步骤（二）中，10μL扩增体系设计如下：
KASP Mix，5ul；
Primer mix，1.4ul；
MgCl2，0.08ul；
DNA模板，100ng；
ddH2O加至10ul；
所述Primer mix，100μL体系中，按如下比例配制：
F1，10umol、12ul；
F2，10umol、12ul；
R，10umol、30ul；
ddH2O，46ul。
6.如权利要求4所述小麦面筋品质性状的检测判定方法，其特征在于，步骤（二）中，PCR反应程序如下：
95℃、变性15min；95℃、变性20s，65℃~55℃退火1min，连续10个循环，循环过程中，从65℃开始，每个循环退火温度降低1℃；94℃、变性20s，57℃、退火1min，30个循环；37℃、1min。
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