CN112321588A - 一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针其结构式如下式Ⅰ所示。本发明以嘌呤衍生物和8‑甲酰基‑4‑甲基伞形酮为荧光基团，水合肼为连接基团，所制备的荧光探针对溶液中Zn2+表现出高灵敏度和高选择性，本发明的探针还可以以固体状态检测锌离子；该荧光探针制备方法步骤简单，原料易得，所得产品为固体粉末，易于存储，具有广阔的应用前景，可以大规模生产应用。
Figure DDA0002803441230000011

Description

一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
锌离子(Zn2+)广泛存在于人体内，是生物体必须的微量元素之一，具有重要的生理功能。但是，不合理的锌离子摄入，会导致神经系统紊乱以及引起很多如阿尔茨海默氏病，免疫缺陷和癫痫等疾病。因此，对游离锌离子的选择性识别和有效检测，对于化学、生物学、临床医学和农学等领域的相关研究具有重要的意义。
目前常用的锌离子检测方法包括原子吸收光谱法(AAS)，原子发射光谱法 (AES)，电感耦合等离子体质量探针和电化学方法等，但是这些测试方法价格昂贵，样品预处理比较复杂，测量时间相对较长以及需要专业的操作人员。然而，荧光探针具有设计简单、易于操作、高灵敏度等诸多优点而广泛应用。至今为止，已有许多有锌离子荧光探针的报道，但是设计与制备高选择性、高灵敏度的荧光探针仍然是环境与生命科学研究热点。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针，该荧光探针化合物对锌离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高等优点。
本发明还提供了基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针的制备方法和应用。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针，其结构式如下式I所示：
Figure BDA0002803441210000011
本发明所述的基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
先将4-甲基伞形酮和乌洛托品于有机溶剂中反应，得到8-甲酰基-4-甲基伞形酮；再将4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺通过取代反应得到中间体II；再以中间体II和噻吩酸为原料，于有机溶剂中进行反应，得到中间体III；再将中间体III 溶于有机溶剂中与水合肼反应，得到中间体IV；最后将中间体IV和8-甲酰基-4- 甲基伞形酮通过缩合反应得到基于嘌呤母体的荧光探针I即为基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针；
其反应路线如下所示：
Figure BDA0002803441210000021
其中，所述4-甲基伞形酮和乌洛托品加入到有机溶剂乙酸中，加热反应完全后，冷却至室温，再加入质量分数20％盐酸水溶液，继续加热反应，待反应完全后，将反应物冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，通过柱层析方法，使用 PE/EA(v/v,3/1)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，烘干得到8-甲酰基-4-甲基伞形酮。
其中，所述4,6-二氯-5-氨基嘧啶，1-萘胺加入到有机溶剂甲醇中，待溶解后加入浓盐酸，回流搅拌，待反应完全后，减压蒸馏除去有机溶剂，用NaOH溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，减压蒸馏除去乙酸乙酯，最后用甲醇与水重结晶，烘干后得到II式中间体。
其中，所述中间体II、噻吩-2-甲酸、多聚磷酸、十二烷基三甲基氯化铵分别溶于三氯氧磷中，进行回流搅拌，待反应完全后，将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，在冰水浴条件下，向反应体系中加入冰水混合物，通过柱层析方法，使用MeOH/DCM(v/v,1/250)纯化洗脱，烘干后得到III式中间体。
其中，所述中间体III溶于乙醇中，待固体全部溶解后，加入水合肼，进行加热搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗固体，烘干得到IV式中间体。
其中，所述中间体IV和8-甲酰基-4-甲基伞形酮溶解于有机溶剂乙醇中，将混合物料回流搅拌，待反应完全后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物进行重结晶纯化，烘干后得到荧光探针I。
作为优选，本发明的荧光探针的合成路线如下所示：
Figure BDA0002803441210000031
其中，式II中间体为6-氯-N4-(萘-1-基)嘧啶-4,5-二胺，式III中间体为6- 氯-9-(萘-1-基)-8-(噻吩-2-基)-9H-嘌呤，式IV中间体为6-肼基-9-(萘-1-基) -8-(噻吩-2-基)-9H-嘌呤，式I化合物(E)-7-羟基-4-甲基-8-((2-(9-(萘-1-基) -8-(噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)腙)甲基)-2H-铬-2-酮为本发明所述检测锌离子荧光探针化合物。
进一步地，所述制备过程包括：
(1)制备8-甲酰基-4-甲基伞形酮
将4-甲基伞形酮和乌洛托品加入到有机溶剂乙酸中，在70℃下搅拌，待反应完全后，冷却至室温，再加入质量分数20％盐酸水溶液，继续70℃加热反应，待反应完全后，将反应物冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，PE/EA(v/v,3/1) 洗脱，减压蒸馏除去溶剂后得到8-甲酰基-4-甲基伞形酮。
(2)制备II式中间体
将4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺分别加入到有机溶剂甲醇中，待溶解后加入浓盐酸，在65℃下回流搅拌，待反应完全后，减压蒸馏除去有机溶剂，用 1M NaOH溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，减压蒸馏除去乙酸乙酯，用甲醇与水重结晶，得到II式中间体。
(3)制备Ⅲ式中间体
将所述式II中间体、噻吩-2-甲酸、多聚磷酸、十二烷基三甲基氯化铵溶于三氯氧磷中，在80℃下回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，在0～5℃冰水浴下向反应体系中加入冰水混合物， MeOH/DCM(v/v,1/250)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后得到III中间体。
(4)制备IV式中间体
将所述式III中间体溶于乙醇后，加入水合肼，在50℃加热搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗固体3次，得到式IV中间体。
(5)制备基于嘌呤母体的锌离子探针化合物I
将中间体IV和8-甲酰基-4-甲基伞形酮溶解于有机溶剂乙醇中，在N2保护下，将反应体系于80℃下回流搅拌，反应完全后，将反应物料冷却至室温，减压除去溶剂，将粗产物通过重结晶进行纯化，得到荧光探针化合物I。
本发明所述的基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针在检测溶液中锌离子的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明以嘌呤环和8-甲酰基-4-甲基伞形酮为荧光基团，水合肼为连接基团，制备了一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针，该制备方法原料易得，方法简单，所得产品为固体粉末，易于存储，稳定性好；选用嘌呤类衍生物为平面刚性平面，具有生物毒性低，氮原子与金属结合能力强等优点。该荧光探针对锌离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高，对溶液中Zn2+表现出高灵敏度和高选择性，本发明的探针还可以以固体状态检测锌离子，具有很好便携性和稳定性。
附图说明
图1为实施例1中制得的锌离子荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对锌离子(Zn2+)的紫外吸收光谱图；
图2为实施例1中制得的锌离子荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同的金属离子选择性荧光光谱图；
图3为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同浓度锌离子(Zn2+)的荧光光谱响应图；
图4为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同离子选择干扰性检测的荧光响应图；
图5为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)与锌离子(Zn2+) 络合比的Job-plot曲线；
图6为实施例1中制得的荧光探针制备的探针试纸与不同浓度的锌离子；
图7为实施例1中制得的荧光探针检测锌离子时的响应时间图；
图8为实施例1中制得的荧光探针的质谱MS谱图；
图9为实施例1中制得的荧光探针的核磁共振1H-NMR谱图；
图10为实施例1中制得的荧光探针的核磁共振13C-NMR谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。
其中，实施例中各种属离子溶液是由纯度为99％以上的氯化盐化学试剂如无水氯化锌、无水氯化铁等加去离子水配置而成的。
实施例1
基于嘌呤母体的锌离子荧光探针化合物，采用如下方法制备而成：
1、制备8-甲酰基-4-甲基伞形酮
在100mL圆底烧瓶中，将4-甲基伞形酮(1.06g,6mmol)和乌洛托品(1.96 g,14mmol)加入到15mL乙酸中，在70℃下搅拌7h，待反应完全后，冷却至室温，再加入质量分数20％盐酸水溶液(15mL)，继续70℃加热反应45min，待反应完全后，将反应物冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，PE/EA(v/v,3/1) 洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，烘干得到8-甲酰基-4-甲基伞形酮，为浅黄色固体 (0.541g,收率44％)。
2、制备中间体II(6-氯-N4-(萘-1-基)嘧啶-4,5-二胺)
在100mL圆底烧瓶中，加入4,6-二氯-5-氨基嘧啶(5.00g，30mmol)和1- 萘胺(8.58g，60mmol)并溶于50mL甲醇，然后加入5mL 12mol/L HCl。将混合物在65℃下回流搅拌5天。待反应液冷却，减压蒸馏除去有机溶剂。然后将得到的全部粗产品溶于50mL的1M NaOH水溶液中，并将混合物用乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏除去乙酸乙酯。有机相用1.2M HCl洗涤，然后用饱和食盐水除水，干燥，得到粗产物。粗产物用CH3OH/H2O(v/v，1∶5)重结晶，烘干后得到中间体Ⅱ，为浅紫色固体粉末(5.75g，收率71％)。
所得中间体Ⅱ的结构式为：
Figure BDA0002803441210000061
(3)制备中间体Ⅲ(6-氯-9-(萘-1-基)-8-(噻吩-2-基)-9H-嘌呤)
将中间体Ⅱ(1.00g，3.70mmol)，噻吩-2-甲酸(2.37g，18.50mmol)和 DTAC(0.10g，10％mmol)溶解在25mL POCl3中，待上述固体物质溶解后加入多聚磷酸(5.00g，14.80mmol)。将反应混合物在80℃下回流搅拌72小时。反应完成后，将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，得到褐色油状物。在冰水浴条件下，向反应体系中加入100mL冰水混合物，搅拌后析出大量固体，抽滤，得到粗产物，通过硅胶柱色谱法纯化，使用CH3OH/CH2Cl2(v/v，1/250) 洗脱，减压蒸馏除去溶剂后，烘干得到中间体Ⅲ，为浅黄色固体(0.56g，收率 42％)。
所得中间体Ⅲ的结构式为：
Figure BDA0002803441210000071
(4)制备中间体IV(6-肼基-9-(萘-1-基)-8-(噻吩-2-基)-9H-嘌呤)
将中间体Ⅲ(0.29g，0.80mmol)溶解在20mL乙醇中，然后加入水合肼(0.25 g，4mmol)。将混合物在50℃下加热搅拌3小时。反应完成后，将混合物冷却至室温，会有固体析出，抽滤，固体并用冰甲醇冲洗三遍，烘干后得到浅黄色粉末(0.20g，收率70％)。
所得中间体IV的结构式为：
Figure BDA0002803441210000072
制备基于嘌呤母体的锌离子荧光探针化合物
将中间体IV(50mg，0.14mmol)和8-甲酰基-4-甲基伞形酮(43mg,0.21 mmol)溶解在2mL乙醇中，在N2保护下，然后将该混合物80℃回流搅拌5 小时。点板(TLC)跟踪反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂。将粗产物通过石油醚-乙酸乙酯重结晶纯化，加入少量的乙酸乙酯溶解粗产物后，加入大量的石油醚至浑浊，放置冰箱里冷藏待晶体析出即可，抽滤，干燥后得到探针基于嘌呤母体的锌离子荧光探针化合物I，为黄色粉末(75.9mg， 70％)。
所得到的荧光探针化合物结构式为：
Figure BDA0002803441210000073
本发明制得锌离子荧光探针化合物1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.48(s, 1H),12.28(s,1H),8.96(s,1H),8.31(d,J＝8.3Hz,1H),8.24(s,1H),8.18(d,J＝8.2 Hz,1H),7.87(dd,J＝7.3,1.2Hz,1H),7.78(dd,J＝8.2,7.3Hz,1H),7.71(d,J＝8.9 Hz,1H),7.66–7.56(m,2H),7.48(m,2H),7.17(d,J＝8.5Hz,1H),7.05(d,J＝9.0 Hz,2H),6.26(d,J＝1.4Hz,1H),2.45–2.40(m,3H).13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ159.84,154.27,152.64,134.49,131.36,131.06,130.86,130.76, 129.03,128.57,128.05,127.54,126.45,122.31,118.97,114.41,112.28,111.04, 106.85,18.81.
实施例1中制得的荧光探针的质谱MS谱图、核磁共振1H-NMR谱图、核磁共振13C-NMR谱图分别如图8、图9和图10所示，说明本发明的荧光探针成功合成。
实施例2
将实施例1制得的锌离子检测荧光探针用DMSO制成1mM的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3mM的金属离子储备液，向3mL的空白溶液 DMSO-H2O(v/v＝9:1)中加入30μL的探针储备液和50μL的金属离子储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为 384nm，最大发射波长为484nm，具体测试结果如下：
取两个比色皿，分别加入3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9:1)中和30μL 的探针储备液，向其中一个比色皿加入50μL的锌离子储备液，另外一个比色皿不加锌离子储备液，进行紫外光谱测试。实验结果如图1所示，荧光探针化合物本身在波长λ＝355nm处较强的紫外吸收，当往溶液中加入锌离子后，紫外吸收峰渐渐的降低，除此之外，荧光探针在波长420nm处几乎没有紫外吸收，当往溶液中增加锌离子浓度后，紫外吸收峰渐渐的加强。此外，添加锌离子导致探针溶液的在紫外下从浅黄色变为深黄色。结果表明探针对Zn2+具有很高的灵敏度并且可以可视化，肉眼可见的颜色变化可能是由于探针和Zn2+之间形成了新的配合物。
如图2，锌离子检测荧光探针加入各种金属离子后的荧光光谱图。向3mL 的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的各种金属离子储备液，结果表明加入锌离子时导致探针溶液的荧光颜色在从黄色变为亮蓝色，荧光光谱在484nm处荧光强度发生了明显的增强，而加入其他金属离子时，荧光无明显变化，即本发明的荧光探针对锌离子有很好的选择性。
如图3，锌离子检测荧光探针对不同浓度锌离子(Zn2+)的荧光光谱响应图。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和0～ 50μL(0、1、2、3……40、45、50μL)的锌离子溶液(3mM的锌离子储备液)，该荧光探针在溶液中显示为黄色荧光，但随着锌离子浓度的增加，在484nm处荧光也在不断的增强，说明荧光强度随着锌离子浓度的增加而增加。
如图4，锌离子检测荧光探针在不同干扰金属离子存在的情况下与锌离子反应后的荧光强度柱状图。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30 μL的探针储备液和50μL的其他任意一种金属离子(Co2+,Ni2+,Al3+,Cr3+,Mn2+, Mg2+,Pb2+,K+,Ca2+,Cs2+,Na+,Ag+,Cd2+,Pd2+,Cu+和Fe3+)储备液，最后向空白液加入50μL的Zn2+储备液，测试其荧光强度。结果表明，Pb2+,Cu+和Fe3+对锌离子荧光探针具有一定的淬灭作用，其它金属离子的存在对本发明锌离子荧光探针化合物识别锌离子无明显干扰。
如图5，通过Job's plot方法研究了探针与Zn2+的结合率，向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入一定体积探针储备液和Zn2+储备液(3mM)，使得锌离子检测荧光探针和锌离子的浓度总和为50μM，通过改变二者的浓度比 (锌离子检测荧光探针和锌离子物质的量比依次为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶ 5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1)得到484nm处的荧光强度与该浓度下锌离子荧光探针化合自身荧光强度的差值，与离子占总浓度的比例作图。通过此图5可知，当锌离子所占比例为0.7时纵坐标达到最高值，可以确定该荧光探针化合物与锌离子之间主要以2∶1形式结合形成稳定的络合物。
如图6所示，将滤纸浸入含有荧光探针储备溶液中，浸泡半小时，然后将测试条取出在空气中干燥，得到干燥的含有探针的试纸条。将试验条分别浸泡在0 mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM锌离子浓度溶液中，浸泡几分钟后，晾干，在365nm紫外灯下观察到图6所示的快速变色的条带，说明本发明的探针可以以固体状态检测锌离子。
如图7所示，向3mL的空白缓冲液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL 的探针储备液和50μL的Zn2+储备液，探针的荧光强度迅速增强到最高，并且在 10分钟内达到最高值。此外，在加入Zn2+响应60分钟后，探针的荧光强度逐渐见底趋于稳定，这说明探针对于Zn2+检测足够稳定，并且速度快。

Claims (8)

1.一种基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针，其结构式如下式I所示：
Figure FDA0002803441200000011
2.一种权利要求1所述的基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
先将4-甲基伞形酮和乌洛托品于有机溶剂中反应，得到8-甲酰基-4-甲基伞形酮；再将4,6-二氯-5-氨基嘧啶和1-萘胺通过取代反应得到中间体II；再以中间体II和噻吩酸为原料，于有机溶剂中进行反应，得到中间体III；再将中间体III溶于有机溶剂中与水合肼反应，得到中间体IV；最后将中间体IV和8-甲酰基-4-甲基伞形酮通过缩合反应得到基于嘌呤母体的荧光探针I即为基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针；
其反应路线如下所示：
Figure FDA0002803441200000012
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述4-甲基伞形酮和乌洛托品优选加入到有机溶剂乙酸中，加热反应完全后，冷却至室温，再加入盐酸，继续加热反应，待反应完全后，将反应物冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，通过柱层析方法，然后再通过减压蒸馏除去溶剂后得到8-甲酰基-4-甲基伞形酮。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述4,6-二氯-5-氨基嘧啶，1-萘胺加入到有机溶剂甲醇中，待溶解后加入浓盐酸，回流搅拌，待反应完全后，减压蒸馏除去有机溶剂，用NaOH溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，减压蒸馏除去乙酸乙酯，最后用甲醇与水重结晶，烘干后得到II式中间体。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体II、噻吩-2-甲酸、多聚磷酸、十二烷基三甲基氯化铵分别溶于三氯氧磷中，进行回流搅拌，待反应完全后，将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，在冰水浴条件下，向反应体系中加入冰水混合物，纯化洗脱，烘干后得到III式中间体。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体III溶于乙醇中，待固体全部溶解后，加入水合肼，加热搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗固体，烘干得到IV式中间体。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体IV和8-甲酰基-4-甲基伞形酮溶解于有机溶剂中，将混合物料回流搅拌，反应完全后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物进行重结晶纯化，烘干后得到荧光探针I。
8.一种权利要求1所述的基于嘌呤母体的锌离子检测荧光探针在检测溶液中锌离子的应用。
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