CN112314824A - 一种植物乳杆菌、基于该菌株发酵的荔枝果汁发酵饮料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于饮料技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌、基于该菌株发酵的荔枝果汁发酵饮料及其制备方法，其公开了一种保藏编号为CGMCC NO.19875的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2‑2，还公开了用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2‑2发酵的荔枝果汁发酵饮料，以及提供该荔枝果汁发酵饮料的制备方法。本发明的荔枝果汁发酵饮料荔枝风味浓郁，乳酸含量高，无苦涩味，口感极佳。
Description
技术领域
本发明属于饮料技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌、基于该菌株发酵的荔枝果汁发酵饮料及其制备方法。
背景技术
植物乳杆菌是一种常见的益生菌，是乳酸菌的一种，具有调节血脂、降低胆固醇、提高免疫力、改善肠道菌群环境等多种保健作用。目前，市场上存在的乳酸发酵饮料均以乳饮料为主，部分产品加入果蔬汁，同时需要添加大量的蔗糖、甜味剂、酸味剂、防腐剂等食品添加剂，降低了产品的健康特性，并且产品风味与品质也难以提高，同时也无法满足乳糖不耐受人群的消费需求。
另外，荔枝成熟期集中、保鲜期短、不耐储运，因此难以实现新鲜果品的长期供应，加上荔枝加工产品中普遍存在颜色氧化褐变、风味散失严重的问题，目前加工产品主要以荔枝干、荔枝罐头、荔枝汁、速冻荔枝等初加工产品为主，精深加工产品较少。国内外相关研究表明，乳酸菌发酵应用于果蔬汁的制备，是最简单有效保持与提高果蔬风味、安全、营养、品质和货架期的加工方式。
而用现有的乳酸菌发酵荔枝果汁，得到的发酵饮料风味不佳且有苦涩感。因此筛选出一种新的植物乳杆菌用于发酵荔枝果汁以获得风味俱佳的健康高品质荔枝发酵饮料非常有必要，也是新的研究热点与市场方向。
发明内容
本发明旨在解决上述技术问题，提供一种保藏编号为CGMCC NO.19875的植物乳杆菌LLZB2-2、基于该菌株发酵的荔枝果汁发酵饮料及其制备方法，用本发明方法制备得到的菌株发酵荔枝果汁，发酵时间短，荔枝风味浓郁，乳酸含量高，无苦涩味，口感极佳。
本发明的技术方案为：
本发明提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2，保藏编号为CGMCC NO.19875，已于2020年5月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所述植物乳杆菌的筛选方法，具体为：采摘新鲜荔枝，破碎后装入容器中，添加25mg/L亚硫酸溶液，每日取发酵液1ml，稀释至10-4-10-5梯度，涂MRS平板，加入放线菌酮50mg/L，28℃培养3天，挑取呈圆形，边缘整齐，形状较为扁平，有轻微粘性，菌落颜色为白色，表面光滑湿润，质地较为松散的单菌落，进行分离、纯化、保藏。
本发明提供基于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料，该饮料荔枝风味浓郁，乳酸含量高，无苦涩味，口感极佳。
本发明还提供基于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料的制备方法，包括以下步骤：
1)将荔枝去皮去核，果肉打浆，筛网过滤，获得荔枝果汁；
2)将荔枝果汁加热至80-85℃，保持8-12min，冷却后加入28-30mg/L亚硫酸盐，搅拌均匀；
3)将发酵液与步骤2)得到荔枝果汁混合均匀，保持发酵温度39-41℃，发酵14-30h，得到发酵果汁；
4)向发酵果汁中添加40-60mg/L亚硫酸盐，70-75℃加热10-12min后，放于0-4℃下冷却，用300-500mg/L清水浸泡10小时后的皂土澄清，5-7天后，倒罐，过滤，装瓶。
优选地，本发明所述步骤3)中，发酵时间为16h，在这个发酵时间内，荔枝果汁具有优异的发酵性能，且可以在保证荔枝发酵饮料具有俱佳口感的前提下，缩短制备周期，提高产量，这个时间下发酵得到的荔枝果汁发酵饮料荔枝风味浓郁，酸甜适中，可以消除荔枝特有的涩感，且无苦味。
优选地，本发明所述发酵液的加入量为荔枝果汁的3-7wt％，所述发酵液由保藏编号为CGMCC NO.19875的植物乳杆菌LLZB2-2扩培制成。
优选地，本发明所述发酵液扩培方法具体为：将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LLZB2-2从甘油冻存管取出后接种到MRS液体培养基，33-36℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养2-3天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得发酵液。
由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：
1、本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2用于发酵果汁饮料，特别是用于发酵荔枝果汁饮料，具有优异的发酵性能，发酵时间短。
2、本发明方法发酵得到的荔枝果汁发酵饮料荔枝风味浓郁，酸甜适中，可以消除荔枝特有的涩感，且无苦味，用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵，无需添加外加剂即可获得良好的口感，天然健康。
本发明所涉及的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2，已于2020年5月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC NO.19875。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)植物乳杆菌LLZB2-2菌株的筛选方法：从果园采摘新鲜荔枝，破碎后装入容器中，添加25mg/L亚硫酸溶液抑制破败，使果浆自然发酵，每日取发酵液1ml，稀释至10-4，涂MRS平板，加入放线菌酮50mg/L抑制酵母生长，28℃培养3天。挑取呈圆形，边缘整齐，形状较为扁平，有轻微粘性，菌落颜色为白色，表面光滑湿润，质地较为松散的单菌落进行分离，纯化，DNA提取、26S DNA测序，blast对比分析，获得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2，于2020年5月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC NO.19875。
2)对植物乳杆菌LLZB2-2菌株的进行发酵碳源、氮源基础鉴定结果，见表1。
表1植物乳杆菌LLZB2-2碳源、氮源基础鉴定结果
3)植物乳杆菌LLZB2-2耐受性特征，见表2：
表2植物乳杆菌LLZB2-2耐受性特征
通过DNA提取、26S DNA测序、blast对比分析，以及上述耐受试验以及碳源、氮源基础鉴定，同时结合LLZB2-2的形态特征，鉴定得到的菌株为植物乳杆菌LLZB2-2。
实施例2
基于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将荔枝去皮去核，果肉打浆，筛网过滤，获得荔枝果汁；
2)将荔枝果汁加热至80℃，保持12min，冷却后加入28mg/L亚硫酸盐，搅拌均匀；
3)在步骤2)中得到的荔枝果汁中加入3wt％的发酵液，混合均匀，保持发酵温度39℃，发酵14h，得到发酵果汁；
4)向发酵果汁中添加40mg/L亚硫酸钠，75℃加热10min后，放于0℃下冷却，用300mg/L清水浸泡10小时后的皂土澄清，7天后，倒罐，过滤，装瓶。
所述发酵液由保藏编号为CGMCC NO.19875的植物乳杆菌LLZB2-2扩培制成，具体为：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2从甘油冻存管取出后接种到MRS液体培养基(产品货号:HB0384-5)，33℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养2天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基(产品货号:HB0384-5)进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得活性为3.2×108CFU/g的植物乳杆菌发酵液。
实施例3
基于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将荔枝去皮去核，果肉打浆，筛网过滤，获得荔枝果汁；
2)将荔枝果汁加热至83℃，保持10min，冷却后加入29mg/L亚硫酸盐，搅拌均匀；
3)在步骤2)中得到的荔枝果汁中加入5wt％的发酵液，混合均匀，保持发酵温度40℃，发酵16h，得到发酵果汁；
4)向发酵果汁中添加50mg/L亚硫酸钠，70℃加热10min后，放于4℃下冷却，用400mg/L清水浸泡10小时后的皂土澄清，6天后，倒罐，过滤，装瓶。
所述发酵液由保藏编号为CGMCC NO.19875的植物乳杆菌LLZB2-2扩培制成，具体为：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2从甘油冻存管取出后接种到MRS液体培养基(产品货号:HB0384-5)，33℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养2天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基(产品货号:HB0384-5)进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得活性为4.6×108CFU/g的植物乳杆菌发酵液。
实施例4
基于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将荔枝去皮去核，果肉打浆，筛网过滤，获得荔枝果汁；
2)将荔枝果汁加热至85℃，保持8min，冷却后加入30mg/L亚硫酸盐，搅拌均匀；
3)在步骤2)中得到的荔枝果汁中加入7wt％的发酵液，混合均匀，保持发酵温度41℃，发酵30h，得到发酵果汁；
4)向发酵果汁中添加60mg/L亚硫酸钠，70℃加热12min后，放于4℃下冷却，用500mg/L清水浸泡10小时后的皂土澄清，5天后，倒罐，过滤，装瓶。
所述发酵液由保藏编号为CGMCC NO.19875的植物乳杆菌LLZB2-2扩培制成，具体为：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2从甘油冻存管取出后接种到MRS液体培养基(产品货号:HB0384-5)，33℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养2天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基(产品货号:HB0384-5)进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得活性为2.1×108CFU/g的植物乳杆菌发酵液。
实施例5
基于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料的制备方法，包括以下制备步骤：
1)将荔枝去皮去核，果肉打浆，筛网过滤，获得荔枝果汁；
2)将荔枝果汁加热至85℃，保持8min，冷却后加入30mg/L亚硫酸盐，搅拌均匀；
3)在步骤2)中得到的荔枝果汁中加入7wt％的发酵液，混合均匀，保持发酵温度41℃，发酵30h，得到发酵果汁；
4)向发酵果汁中添加60mg/L亚硫酸钠，70℃加热12min后，放于4℃下冷却，用500mg/L清水浸泡10小时后的皂土澄清，5天后，倒罐，过滤，装瓶。
所述发酵液由保藏编号为CGMCC NO.19875的植物乳杆菌LLZB2-2扩培制成，具体为：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2从甘油冻存管取出后接种到MRS液体培养基(产品货号:HB0384-5)，36℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养3天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基(产品货号:HB0384-5)进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得活性为1.8×1010CFU/g的植物乳杆菌发酵液。
实施例6
与实施例3不同的是：发酵时间为14h，其余同实施例3。
实施例7
与实施例3不同的是：发酵时间为30h，其余同实施例3。
对比例1
与实施例3不同的是：发酵时间为12h，其余同实施例3。
对比例2
与实施例3不同的是：发酵时间为32h，其余同实施例3。
对比例3
与实施例3不同的是：所述发酵液由保藏编号为CGMCC NO.5495的植物乳杆菌N13扩培制成，具体为：将植物乳杆菌N13从甘油冻存管取出后接种到MRS液体培养基(产品货号:HB0384-5)，33℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养2天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基(产品货号:HB0384-5)进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得活性为8.1×108CFU/g的植物乳杆菌发酵液，其余同实施例3。
对比例4
1)将荔枝去皮去核，果肉打浆，筛网过滤，获得荔枝果汁；
2)将荔枝果汁加热至83℃，保持10min，冷却后加入29mg/L亚硫酸盐，搅拌均匀；
3)在步骤2)中得到的荔枝果汁中加入5wt％的活性为5.1×108CFU/g市售北京川秀科技有限公司的酸奶发酵粉(16菌)的复合菌株液，混合均匀，保持发酵温度40℃，发酵16h，得到发酵果汁；
4)向发酵果汁中添加50mg/L亚硫酸钠，70℃加热10min后，放于4℃下冷却，用400mg/L清水浸泡10小时后的皂土澄清，6天后，倒罐，过滤，装瓶。
试验例：本发明基于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料情况
1)以广西灵山县红绣球品种的荔枝作为荔枝果汁原料，按照实施例3、6、7和对比例1-4的方法制备得到的荔枝发酵饮料，分别测定它们的总糖、胞外多糖、pH、有机酸等数据，其中总糖采用DNS法测定，胞外多糖采用苯酚-硫酸法测定，pH值用pH计测定，有机酸采用高效液相色谱法测定，具体结果见表3。
表3不同实施例和对比例的荔枝发酵饮料发酵特性
| 总糖(g/L) | 胞外多糖(mg/L) | pH | |
| 实施例3 | 86.93 | 393.7 | 3.9 |
| 实施例6 | 87.09 | 332.2 | 4.0 |
| 实施例7 | 83.23 | 384.6 | 3.7 |
| 对比例1 | 93.35 | 128.9 | 5.3 |
| 对比例2 | 60.14 | 176.8 | 3.1 |
| 对比例3 | 53.48 | 238.4 | 4.4 |
| 对比例4 | 51.63 | 241.5 | 4.6 |
从表3可知，本实施例3、6、7的总糖相对高，所含的糖量不需要额外加糖，即可使得发酵饮料口感酸甜适口，对比例1糖分太高，得到的发酵饮料过于甜腻，对比例2-4所含的总糖相对少，在不外加糖的情况下，发酵饮料会比较酸，消费者难以接受，此外，本发明实施例3、6、7的胞外多糖含量较高，胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是乳酸细菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的一类长链、高分子化合物，胞外多糖具有较高的生物学活性，同时对提高饮料稳定性有重要作用，利于本发明的荔枝发酵饮料在不添加稳定记得情况下，色泽均匀，不分层，具有较好的稳定性，而对比例1-4胞外多糖含量相对比，在不添加稳定剂的情况下，制备得到的饮料会有沉淀和分层的情况，饮料整体贮存性能不稳定。对于发酵后的pH值实施例3、6、7相对比较低，较低的pH值起到一定的抑菌、延长保质期和调整风味的作用。说明本发明的不同发酵时间和发酵菌种对荔枝发酵饮料具有显著影响，特别是发酵菌种的选择，并不是任意的植物乳酸菌用于荔枝发酵都能够获得本发明的效果。
表4不同实施例和对比例的荔枝发酵饮料有机酸含量的情况 单位：g/L
| 草酸 | L-苹果酸 | 乳酸 | 醋酸 | 柠檬酸 | 琥珀酸 | D-苹果酸 | |
| 实施例3 | 0.70±0.05 | 0.28±0.03 | 11.97±0.21 | nd | 0.01±0.01 | 0.07±0.02 | nd |
| 实施例6 | 0.83±0.46 | 0.26±0.05 | 10.68±1.4 | nd | 0.01±0.03 | 0.09±0.03 | nd |
| 实施例7 | 0.76±0.03 | 1.56±0.08 | 9.55±1.35 | nd | 0.05±0.05 | 0.08±0.05 | nd |
| 对比例1 | 0.79±0.02 | 1.47±0.04 | 4.61±0.07 | 4.1±0.69 | 0.1±0.01 | 0.2±0.01 | 0.78±0.01 |
| 对比例2 | 0.59±0.03 | 1.25±0.09 | 2.46±0.09 | 1.63±0.66 | 0.08±0.06 | 0.06±0.06 | 0.09±0.01 |
| 对比例3 | 0.71±0.01 | 1.46±0.05 | 3.47±0.08 | 2.65±0.55 | 0.12±0.02 | 0.23±0.06 | 0.34±0.02 |
| 对比例4 | 0.76±0.02 | 1.35±0.06 | 2.96±0.03 | 2.92±1.12 | 0.03±0.02 | 0.44±0.06 | 0.02±0.01 |
注：nd表示未检测到。
从表4可知，本实施例3、6、7通过本发明的方法发酵荔枝果汁，得到的发酵饮料中，不含醋酸和D-苹果酸，柠檬酸含量也较低，使得发酵饮料酸甜适口，不会过酸，影响饮料的口感，另外，通过粗略统计，实施例3乳酸含量达到约为91.91％，实施例6乳酸含量达到约为89.93％，实施例7乳酸含量达到约为81.91％，而对比例1中乳酸含量仅为约37.95％，对比例2中乳酸含量仅约为39.84％，对比例3中乳酸含量仅约为38.64％，对比例4中乳酸含量仅为34.88％，说明不同的发酵时间和发酵菌种会影响本发明荔枝发酵饮料的有机酸组成，特别是影响乳酸的含量，发酵时间过长过短，都不利于乳酸含量的提高，也并非任意的菌种用来发酵荔枝果汁都能获得本发明的效果。
2)组织10名受过训练的专业品尝员以广西灵山县红绣球品种的荔枝作为荔枝果汁原料，按照实施例3、6、7和对比例1-4方法制备得到的荔枝发酵饮料的口感、香气、色泽等3个方面进行评分，具体评价标准见表5，每方面评分取平均值，具体感官评价结果见表6。
表5荔枝发酵饮料感官评价标准
表6不同实施例和对比例的荔枝发酵饮料感官评价结果
| 口感(40分) | 香气(30分) | 色泽(30分) | 总评分 | |
| 实施例3 | 37.6 | 27.1 | 28.6 | 93.3 |
| 实施例6 | 36.7 | 27.5 | 27.3 | 91.5 |
| 实施例7 | 35.2 | 27.3 | 28.1 | 90.6 |
| 对比例1 | 20.3 | 21.9 | 23.7 | 65.9 |
| 对比例2 | 18.8 | 23.2 | 18.2 | 60.2 |
| 对比例3 | 28.3 | 25.1 | 23.4 | 76.8 |
| 对比例4 | 23.7 | 24.5 | 21.4 | 69.6 |
从表6可知，本实施例3、6、7通过本发明方法制备得到的荔枝发酵饮料酸甜适中、爽口，无苦涩感，感官评价较高，具有荔枝特有的清香和酸乳香，风味协调，香气纯正，浓郁，乳白色，色泽均匀一致，无分层，半透明，无沉淀，本实施例3、6和7荔枝发酵饮料放置6个月以上，也未见有分层和沉淀，具有良好的贮存性能，感官评价至少达到90.6％以上，而对比例1发酵时间过短，饮料过甜，有涩味且酸乳香不够，还有部分沉淀，而对比例2发酵时间过长，过酸，有微涩、苦感，夹有荔枝酸味，色泽深暗有分层，对比例3的发酵菌选用另一种植物乳杆菌，发酵得到的饮料香味不足，过酸，有涩感且浑浊、有部分沉淀，对比例4的发酵菌为市售的酸奶发酵菌，发酵的得到的荔枝发酵饮料过酸，香味不够，有沉淀，还有微涩、苦感，酸乳香味淡，饮料体系不稳定，出现分层和沉淀。本发明的发酵时间对于获得本发明的发酵饮料很关键，且并非任意的发酵菌种都能够获得本发明的技术效果。另外，其他条件与实施例3相同的情况下，当发酵液的活性小于2.1×108CFU/g或者大于1.8×1010CFU/g，发酵饮料的体系不稳定，会出现分层或者沉淀，而且还具有苦涩感，饮料的感官评价不好。
3)测定实施例3、6、7和对比例1-4制备得到的荔枝发酵饮料的澄清度，具体地，在700nm下测定荔枝发酵饮料透光率，具体结果见表7。
表7不同实施例和对比例的荔枝发酵饮料的澄清度
从表7可知，本发明方法制备得到的荔枝发酵饮料具有较高的澄清度，稳定，不浑浊，无沉淀和分层，而对比例1-4的发酵饮料体系不稳定，澄清度不高，不利于饮料的感官评价的评分，也不利于饮料的长期贮藏。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (6)
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2，保藏编号为CGMCCNO.19875。
2.基于如权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料。
3.基于如权利要求2所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2发酵的荔枝果汁发酵饮料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将荔枝去皮去核，果肉打浆，筛网过滤，获得荔枝果汁；
2)将荔枝果汁加热至80-85℃，保持8-12min，冷却后加入28-30mg/L亚硫酸盐，搅拌均匀；
3)将发酵液与步骤2)得到荔枝果汁混合均匀，保持发酵温度39-41℃，发酵14-30h，得到发酵果汁；
4)向发酵果汁中添加40-60mg/L亚硫酸盐，70-75℃加热10-12min后，放于0-4℃下冷却，用300-500mg/L清水浸泡10小时后的皂土澄清，5-7天后，倒罐，过滤，装瓶。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于：所述步骤3)中，发酵时间为16h。
5.如权利要求3所述方法，其特征在于：所述发酵液的加入量为荔枝果汁的3-7wt％，所述发酵液由保藏编号为CGMCC NO.19875的植物乳杆菌LLZB2-2扩培制成。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于：所述发酵液扩培方法具体为：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LLZB2-2从甘油冻存管取出后接种到MRS液体培养基，33-36℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养2-3天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得发酵液。
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