CN112300163A

CN112300163A - 苦参碱类生物碱及其制备方法和应用

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Publication number: CN112300163A
Application number: CN202011208967.0A
Authority: CN
Inventors: 胡占兴; 郝小江; 赵立华; 安巧; 易平; 邹吉斌; 何龙祥
Original assignee: Key Laboratory of Natural Product Chemistry of Guizhou Academy of Sciences
Current assignee: Key Laboratory of Natural Product Chemistry of Guizhou Academy of Sciences
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2040-11-03
Also published as: CN112300163B

Abstract

本发明公开了一种苦参碱类生物碱及其制备方法和应用,苦参碱类生物碱包括新的化合物1～化合物12，还提供了苦参碱类生物碱的制备方法，从山豆根种子中提取出总生物碱后，再分别经多次不同的流动相洗脱提取分离获得，并验证了该苦参碱类生物碱在预防、治疗TMV和杀虫上具有显著的作用。

Description

苦参碱类生物碱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种农作物的农药技术领域，特别是一种苦参碱类生物碱及其制备方法和应用。

背景技术

病毒病是农作物的一类重要病害，因其危害大、难防治，俗有“植物癌症”之称。病毒病的发生不仅可引起农作物产量、质量下降，种质退化，引起直接经济损失，还可导致误用和滥用农药引起的农药残留超标等农产品质量安全问题。烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)是最早被发现的病毒，也是目前研究最为深入的一种典型植物病毒，它寄主范围广，可侵染茄科、十字花科、藜科和苋科等36科350余种植物，包括烟草、番茄、马铃薯、辣椒、黄瓜等经济作物。由该病毒引起的烟草花叶病毒病是一种系统侵染性病害，在全世界主要烟草产区均有分布。全球每年因烟草花叶病毒造成的经济损失可达1亿多美元。TMV在我国烟草产区中已被列为主要发生病害，烤烟产业损失严重，该病在云南的田间株发病率一般5％～20％，幼苗期或大田期感染损失可达30％～50％，甚至个别田块可高达90％～100％，造成绝收，烟农的经济损失惨重。

现有技术中对TMV的防治主要采用喷施抗植物病毒的化学药剂、种植抗病品种等措施，但都不能很好地解决TMV的感染问题。对于抗植物病毒的化学药剂，目前我国登记的抗植物病毒的化学药剂抗植物病毒只有24种，其中单剂仅11种，大部分均为复配制剂。使用的大部分化学药剂虽然能抑制或减少TMV病毒在植物体内的增殖，但不能根除病毒，甚至有些化学药剂会对烟叶产生药害和残留；而抗病品种也因为资源少且易出现抗性缺失等问题而收效不高。迄今为止，仍没有发现能够彻底根除或有效防治TMV的化学农药或措施。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种苦参碱类生物碱及其制备方法和应用。本发明从山豆根种子提取到一种新的苦参碱类生物碱，经药效试验证明具有有效防治TMV和杀虫的特点。

本发明的技术方案：苦参碱类生物碱，所述苦参碱类生物碱包括以下化学结构的化合物1～化合物12：

前述的苦参碱类生物碱中，所述苦参碱型生物碱是从山豆根种子中提取分离获得或通过人工合成获得。

上述的苦参碱类生物碱的制备方法，包括以下步骤：

(1)取干燥的山豆根种子以甲醇回流提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用酸碱处理得总生物碱；

(2)取总生物碱经MCI柱色谱分离，用甲醇:水以体积比为0:100～100:0为流动相进行梯度洗脱，得馏分A、馏分B、馏分C和馏分D；

(3)将馏分A经RP-18柱层析，用甲醇:水以体积比为10:90～100:0为流动相进行梯度洗脱，得A-1、A-2和A-3；

(4)将A-3经甲醇凝胶纯化，再经半制备HPLC纯化，流动相为乙腈-水，体积比为30:70～70:30，得化合物2、化合物3和化合物5；

(5)将馏分B经300～400目硅胶柱层析，用石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为100:1:1～1:1:0.02为流动相进行梯度洗脱，得B-1、B-2、B-3和B-4；

(6)将B-2经甲醇凝胶纯化，再经半制备HPLC纯化，流动相为乙腈-水，体积比为30:70～70:30，得化合物4、化合物6、化合物7和化合物8；

(7)将B-3经甲醇凝胶纯化，再通过300～400目硅胶柱层析，用石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为50:1:0.1～1:1:0.1为流动相进行梯度洗脱，得化合物1、化合物9和化合物12；

(8)将馏分C经300～400目硅胶柱层析，用二氯甲烷:甲醇以体积比为200:1～40:1为流动相进行梯度洗脱，再经半制备HPLC纯化，流动相为甲醇-水，体积比为30:70～80:20，得化合物10和化合物11。

前述的制备方法中，步骤(1)中，所述回流提取为回流提取3次，每次2～3小时。

前述的制备方法中，步骤(1)中，所述酸碱处理具体为，先用0.1％的盐酸调pH值为1-3，然后用石油醚萃取除去非生物碱成分，酸水层再用25％～28％的浓氨水调pH为9-11，然后碱水层依次使用二氯甲烷和正丁醇萃取。

前述的制备方法中，步骤(1)中，所述山豆根为豆科植物越南槐。

前述的制备方法中，步骤(2)中，所述馏分A是甲醇:水以体积比为20:80洗脱得到，馏分B是甲醇:水以体积比为40:60洗脱得到，馏分C是甲醇:水以体积比为60:40洗脱得到，馏分D是甲醇:水以体积比80:20洗脱得到。

前述的制备方法中，步骤(3)中，所述A-1是甲醇:水以体积比为25:75洗脱得到，A-2是甲醇:水以体积比为50:50洗脱得到，A-3是甲醇:水以体积比为75:25洗脱得到。

前述的制备方法中，步骤(5)中，所述B-1是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为50:1:1洗脱得到，B-2是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为25:1:1洗脱得到，B-3是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为10:1:1洗脱得到，B-4是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为1:1:0.02洗脱得到。

上述方法制备得的苦参碱型生物碱为白色粉末，化合物1-化合物12的核磁氢谱(¹H-NMR)和碳谱(¹³C-NMR)数据如表1-表3，其中表1为化合物1-化合物6的氢谱(¹H-NMR)数据，表2为化合物7-化合物12的氢谱(¹H-NMR)数据，表3为化合物1-化合物6的碳谱(¹³C-NMR)数据；表4为化合物6-化合物12的碳谱(¹³C-NMR)数据。

表1.化合物1-6的¹H NMR数据(δ in ppm,J in Hz)

^a600MHz in CDCl₃；^b600MHz in CD₃OD.

表2.化合物7-12的¹H NMR数据(δ in ppm,J in Hz)

^a600MHz in CDCl₃；^b600MHz in DMSO-d₆.

表3.化合物1-6的¹³C NMR数据(δinppm)

Position

1a

2b

3a

4a

5a

6a

2

48.6,CH2

56.3,CH2

56.5,CH2

56.2,CH2

56.4,CH2

3

24.4,CH2

22.2,CH2

22.5,CH2

22.6,CH2

4

39.6,CH2

36.6,CH2

36.8,CH2

5

211.3,C

67.0,C

68.8,C

68.1,C

68.3,C

6

70.2,C

67.3,CH

67.2,CH

67.4,CH

67.5,CH

7

43.8,CH

37.1,CH

36.4,CH

36.5,CH

38.3,CH

38.4,CH

8

20.3,CH2

34.5,CH2

31.7,CH2

32.4,CH2

31.6,CH2

32.2,CH2

9

21.5,CH2

61.8,CH

65.7,CH

67.6,CH

65.8,CH

67.6,CH

10

49.6,CH2

63.6,CH2

59.8,CH2

60.9,CH2

59.8,CH2

60.9,CH2

11

58.0,CH

51.4,CH

52.1,CH

52.2,CH

53.6,CH

53.7,CH

12

27.8,CH2

27.5,CH2

26.5,CH2

26.6,CH2

26.9,CH2

13

20.9,CH2

139.3,CH

138.0,CH

137.9,CH

18.7,CH2

18.8,CH2

14

31.1,CH2

122.8,CH

124.2,CH

124.3,CH

32.7,CH2

32.8,CH2

15

169.3,C

166.9,C

171.2,C

171.3,C

17

51.9,CH2

46.0,CH2

47.4,CH2

46.6,CH2

COCH3

-

170.4,C

-

170.4,C

-

COCH3

-

21.2,CH3

-

21.2,CH3

-

CH2SCH3

-

73.1,CH2

-

73.0,CH2

CH2SCH3

-

13.8,CH3

-

13.7,CH3

OCH3

-

^a150MHz in CDCl₃；^b150MHz in CD₃OD；^c150MHz in DMSO-d₆.

表4.化合物6-12的¹³C NMR数据(δinppm)

Position

7a

8a

9a

10c

11c

12a

2

69.0,CH2

57.2,CH2

53.3,CH2

47.5,CH2

47.6,CH2

47.2,CH2

3

16.6,CH2

20.9,CH2

20.6,CH2

19.9,CH2

19.3,CH2

19.7,CH2

4

25.9,CH2

27.7,CH2

33.4,CH2

27.7,CH2

31.5,CH2

5

33.9,CH

34.8,CH

66.6,C

82.8,C

82.5,C

72.9,C

6

67.0,CH

63.0,CH

139.0,C

81.8,C

81.4,C

171.3,C

7

43.2,CH

43.8,CH

106.3,C

83.5,C

84.3,C

208.1,C

8

33.5,CH2

32.6,CH2

30.7,CH2

25.2,CH2

26.1,CH2

34.5,CH2

9

59.5,CH

71.9,CH

65.3,CH

17.7,CH2

18.6,CH2

21.1,CH2

10

73.7,CH2

61.3,CH2

53.8,CH2

47.0,CH2

47.9,CH2

44.7,CH2

11

53.8,CH

53.7,CH

58.8,CH

55.7,CH

59.1,CH

71.5,CH

12

28.6,CH2

27.3,CH2

28.6,CH2

24.3,CH2

25.9,CH2

25.0,CH2

13

18.6,CH2

19.0,CH2

19.7,CH2

140.6,CH

140.4,CH

18.9,CH2

14

32.8,CH2

32.1,CH2

125.0,CH

124.8,CH

32.5,CH2

15

170.5,C

169.3,C

170.4,C

164.0,C

163.3,C

173.7,C

17

41.6,CH2

41.4,CH2

50.6,CH2

47.5,CH2

48.3,CH2

59.1,CH2

COCH3

-

170.6,C

-

COCH3

-

21.2,CH3

-

CH2SCH3

-

CH2SCH3

-

OCH3

-

56.3,CH3

-

^a150MHz in CDCl₃；^b150MHz in CD₃OD；^c150MHz in DMSO-d₆.

经过上述结构鉴定，得化合物1-化合物12为：

化合物1：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：202(4.25)nm；ECD(0.0015M，CH₃OH)λ_max(Δε)223(+2.31)，319(-1.71)；IR(KBr)v_max 2360，1716，1624，1559，1451，1261，1032，802cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表1和表3；HRESIMS m/z 263.1747[M+H]⁺，(计算值C₁₅H₂₃N₂O₂，263.1754)。

化合物2：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：203(2.97)，235(2.13)，258(2.23)，IR(KBr)v_max 2358，1669，1653，1593，1457，1261cm^-1；¹H and¹³C NMR数据(CD₃OD，600 and 150MHz)见表1和表3；HRESIMS m/z 279.1703[M+H]⁺(计算值C₁₅H₂₃N₂O₃，279.1703)。

化合物3：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：207(4.02)，260(3.36)nm；IR(KBr)v_max 2360，1731，1661，1595，1446，1244，825cm^-1；¹H and ¹³CNMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表1和表3；HRESIMS m/z 321.1799[M+H]⁺(计算值C₁₇H₂₅N₂O₄，321.1809)。

化合物4：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：196(3.09)，240(2.03)，260(2.07)nm；IR(KBr)v_max 2359，1733，1667，1614，1457，1313，1267，1119，1064cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表1和表3；HRESIMS m/z339.1736[M+H]⁺(计算值C₁₇H₂₇N₂O₃S，339.1737)。

化合物5：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：201(3.16)nm；ECD(0.0005M，CH₃OH)λ_max(Δε)209(+14.30)；IR(KBr)v_max 3478，2957，2797，1708，1632，1474，1260，1135cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表1和表3；HRESIMS m/z 323.1956[M+H]⁺(计算值C₁₇H₂₇N₂O₄，323.1965)。

化合物6：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：196(3.46)，260(2.06)nm；ECD(0.0003M，CH₃OH)λ_max(Δε)210(+10.07)；IR(KBr)v_max 2359，1733，1616，1472，1262，1067，668cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表1和表3；HRESIMS m/z 363.1710[M+Na]⁺(计算值C₁₇H₂₈N₂O₃SNa，363.1713)。

化合物7：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：206(4.28)nm；IR(KBr)v_max 2359，1652，1599，1472，1252，1071，668cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表2和表4；HRESIMS m/z 281.1852[M+H]⁺(计算值C₁₅H₂₅N₂O₃，281.1860)。

化合物8：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：204(4.22)nm；ECD(0.0014M，CH₃OH)λ_max(Δε)211(+0.90)；IR(KBr)v_max 3401，2935，2805，1630，1442，1333，1292，1116，1031cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表2和表4；HRESIMS m/z 279.2059[M+H]⁺(计算值C₁₆H₂₇N₂O₂，279.2067)。

化合物9：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：196(3.0)nm；IR(KBr)v_max 2359，1665，1604，1558，1457，1284，820cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表2和表4；HRESIMS m/z 343.1625[M+Na]⁺(计算值C₁₇H₂₄N₂O₄Na，343.1628)。

化合物10：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：198(3.23)，240(2.52)nm；ECD(0.0007M，CH₃OH)λ_max(Δε)199(+11.50)，219(-0.66)，250(+7.95)；IR(KBr)v_max 2358，1733，1653，1594，1448，1321.6，1261，1016，801cm^-1；¹H and ¹³CNMR数据(DMSO-d₆，600 and 150MHz)见表2和表4；HRESIMS m/z 277.1542[M+H]⁺(计算值C₁₅H₂₁N₂O₃，277.1547)。

化合物11：白色粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)：197(3.43)，240(2.78)，250(2.79)nm；ECD(0.0006M，CH₃OH)λ_max(Δε)201(+12.88)，218(-1.92)，250(+11.74)；IR(KBr)v_max2359，1633，1595，1442，1256，819，668cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(DMSO-d₆，600 and 150MHz)见表2和表4；HRESIMS m/z 277.1542[M+H]⁺(计算值C₁₅H₂₁N₂O₃，277.1547)。

化合物12：白色粉末；

IR(KBr)v_max2359，1700，1653，1635，1558，1489，1329，668cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据(CDCl₃，600 and 150MHz)见表2和表4；HRESIMS m/z 317.1472[M+Na]⁺(计算值C₁₅H₂₂N₂O₄Na，317.1472)。

本发明还提供一种药物组合物，包括上述的苦参碱型生物碱以及其在农药学上可接受的衍生物及其盐类或者农药上可接受的载体。

所述的药物组合物为药物制剂。药物制剂包括：粉剂、可湿性粉剂、乳油、颗粒剂、悬浮剂、可溶性液剂、乳粉、水剂、烟剂、种衣剂、微囊剂等。

本发明还提供上述的苦参碱型生物碱或上述的药物组合物在制备抗植物病毒农药和杀虫剂中的应用。

与现有技术相比：

本发明首次以山豆根种子为原料，采用了一种新的提取分离方式，经过多次不同流动相的洗脱分离，提取出了12种新化合物，结构新颖，鉴定为苦参碱型生物碱。该制备方法简便易操作，经试验验证，该苦参碱型生物碱对烟草花叶病毒，在治疗和预防方面均具有较强的抗TMV活性，对于杀虫性也起到了较强的作用，效率高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1。

苦参碱类生物碱，包括以下化学结构的化合物1～化合物12：

苦参碱类生物碱的制备方法，包括以下步骤：

(1)取干燥的山豆根种子7.5kg以甲醇回流提取3次，每次2～3小时，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用酸碱处理，即先用0.1％的盐酸调pH值为2，然后用石油醚萃取除去非生物碱成分，酸水层再用26％的浓氨水调pH为10，然后碱水层再依次使用二氯甲烷和正丁醇萃取，得总生物碱为304g；

(2)取总生物碱经MCI柱色谱分离，用甲醇:水以体积比为0:100～100:0为流动相进行梯度洗脱，以体积比为20:80洗脱得馏分A、以体积比为40:60洗脱得馏分B、以体积比为60:40洗脱得馏分C和以体积比80:20洗脱得馏分D；

(3)将馏分A经RP-18柱层析，用甲醇:水以体积比为10:90～100:0为流动相进行梯度洗脱，以体积比为25:75洗脱得A-1、以体积比为50:50洗脱得A-2和以体积比为75:25洗脱得A-3；

(4)将A-3经甲醇凝胶纯化，再经半制备HPLC纯化，流动相为乙腈-水，体积比为40:60，得化合物2为3.2mg、化合物3为21.2mg和化合物5为15.1mg；

(5)将馏分B经300～400目硅胶柱层析，用石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为100:1:1～1:1:0.02为流动相进行梯度洗脱，以体积比为25:1:1洗脱得B-1、以体积比为25:1:1洗脱得B-2、以体积比为10:1:1洗脱得B-3和以体积比为1:1:0.02洗脱得B-4；

(6)将B-2经甲醇凝胶纯化，再经半制备HPLC纯化，流动相为乙腈-水，体积比为30:60，得化合物4为3.4mg、化合物6为6.2mg、化合物7为13mg和化合物8为3.8mg；

(7)将B-3经甲醇凝胶纯化，再通过300～400目硅胶柱层析，用石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为50:1:0.1～1:1:0.1为流动相进行梯度洗脱，以体积比为25:1:0.1洗脱得化合物1为2.1mg、以体积比为10:1:0.1洗脱得化合物9为21.6mg和以体积比为5:1:0.1洗脱得化合物12为2.1mg；

(8)将馏分C经300～400目硅胶柱层析，用二氯甲烷:甲醇以体积比为200:1～40:1为流动相进行梯度洗脱，再经半制备HPLC纯化，流动相为甲醇-水，体积比为40:60，得化合物10为3.5mg和化合物11为3.7mg。

一种药物组合物，包括上述的苦参碱型生物碱以及其在农药学上可接受的衍生物及其盐类或者农药上可接受的载体。

本发明还提供上述的苦参碱型生物碱或者药物组合物在制备抗植物病毒农药和杀虫剂中的应用。

实验例1。

将上述得到的苦参碱型生物碱进行抗TMV活性研究验证，具体方法如下：

a、烟草花叶病毒准备：烟草花叶病毒普通株系U1，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供。繁殖于普通烟K326上，提纯后用紫外分光光度计测定其浓度为16mg/mL，保存于-70℃冰箱中，备用；

b、接种病毒和施药：

先施药后接毒：挑选健康、长势一致的心叶烟，每株烟挑选叶龄和叶片大小一致的3片叶片，供试苦参碱型生物碱，稀释为100μg/mL，每片叶子的一半均匀施药，另一半施用相应浓度的DMSO水溶液作为对照，24h后每片叶片摩擦接种TMV 200μL。接种病毒后10min用水将叶表面的金刚砂冲洗干净。在无虫温室中培养3～4天，待枯斑症状明显时统计试验结果。每个样品做三个重复，实验采用宁南霉素作为阳性对照。

先接毒后施药：挑选健康、长势一致的心叶烟，每株烟挑选叶龄和叶片大小一致的3片叶片，每片烟叶摩擦接种TMV 200μL，10min后用水将叶表面的金刚砂冲洗干净。24h后每片叶子的一半均匀施用100μg/mL的苦参碱型生物碱，另一半施用相应浓度的DMSO溶液水溶液作为对照。在无虫温室中培养3～4天，待枯斑症状明显时统计试验结果，计算抑制率。每个样品做三个重复，实验采用宁南霉素作为阳性对照。

抑制率＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数*100％

抗TMV活性结果见表5。

表5.化合物1-12抗TMV活性结果

^a三次平均值；^b宁南霉素作为阳性对照.

体内抗TMV试验表明；化合物4和化合物6(100μg/mL)在先施药后接种病毒的处理中表现出较强的抗TMV活性，其抑制率分别为81.15％和78.75％，明显高于阳性对照宁南霉素74.23％；化合物2和4(100μg/mL)在先接种病毒后施药的处理中表现出较强的抗TMV活性，其抑制率分别为78.32％和68.40％，高于或者相似与阳性对照宁南霉素68.09％。

实验例2。

对上述的苦参碱型生物碱的杀虫活性进行研究验证，具体如下：

供试靶标：蚕豆蚜(Aphis fabae)系室内以蚕豆苗饲养多年的敏感品系，试验用虫为3日龄若蚜；棉红蜘蛛(Tetranychus urticae)系室内以蚕豆苗饲养多年的敏感品系。试验用虫为健康成螨。

培养条件：供试靶标及试验后靶标的培养条件为温度25±5℃，相对湿度65±5％，光照周期12/12h(L/D)。

仪器设备：电子天平(感量万分之一)、喷雾塔、100ml烧杯、玻璃试管、量筒、培养皿、帕拉膜、海绵、滤纸、移液管、镊子、毛笔、显微镜等。

试验药剂：苦参碱型生物碱中的化合物3、化合物5、化合物6、化合物7和化合物9，含量均以100％计。

试验浓度：蚕豆蚜：500mg/L；棉红蜘蛛：500mg/L。

药剂配制：原药：用万分之一电子天平称取所需量；溶剂：N，N二甲基甲酰胺(DMF)，0.2％；乳化剂：Tween 80，0.2％；加入清水稀释到所需浓度。

试验方法：

参照《农药生物活性评价SOP》。

蚕豆蚜采用喷雾法。将带有3日龄蚕豆若蚜的蚕豆苗连根拔出，置于装有清水的烧杯中，用parafilm封口膜封住烧杯口，卡上塑料垫片，用电动喉头喷雾器进行喷雾处理，喷雾量2mL/株，每处理4次重复。待植株晾干后，罩上马灯罩，放到恢复室内培养，48h后检查并记载死亡情况，计算死亡率。

棉红蜘蛛采用喷雾法。将带有红蜘蛛成虫的两叶一心期蚕豆苗连根拔出，置于装有清水的烧杯中，用parafilm封口膜封住烧杯口，卡上塑料垫片，用电动喉头喷雾器进行喷雾处理，喷雾量2mL/株，每处理4次重复。待植株晾干后，罩上马灯罩，放到恢复室内培养，72h后检查并记载死亡情况，计算死亡率。

调查方法：

48或者72h后检查试虫死亡情况，并进行记录，试虫死亡判断标准为：以毛笔轻轻接触试虫无反应计为死亡。

生物活性评价方法：

死亡率在90％以上为A级，70～90％之间为B级，50～70％之间为C级，在0～50％之间为D级。活性达到A级或B级可以考虑进行进一步筛选。

杀虫活性测定结果见表6。

表6.化合物3、5、6、7和9杀虫活性测定结果(红蜘蛛72h，蚜虫48h)

以上表6的结果显示，化合物7在供试浓度下对蚕豆蚜虫表现出A级活性。

实施例3。

对化合物7对蚜虫的杀虫活性进行进一步评价，具体方法如下：

将化合物7分别设定200mg/L、50mg/L、12.5mg/L、3.125mg/L、0.7813mg/L和0.1953mg/L六个浓度采用上述方法进行抗蚜虫活性研究。

数据统计分析：所有试验数据均采用DPS V 7.0统计软件进行分析。根据试验数据计算死亡率，求出毒力回归方程、相关系数(r)、LC₅₀、LC₉₀及其95％置信限，见表7。

表7.LC₅₀化合物7对蚜虫的活性测试结果

由表7可得，化合物7具有较高的杀虫活性。

Claims

1.苦参碱类生物碱，其特征在于：所述苦参碱类生物碱包括以下化学结构的化合物1～化合物12：

2.根据权利要求1所述的苦参碱类生物碱，其特征在于：所述苦参碱型生物碱是从山豆根种子中提取分离获得或通过人工合成获得。

3.根据权利要求1所述的苦参碱类生物碱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述酸碱处理具体为，先用0.1％的盐酸调pH值为1-3，然后用石油醚萃取除去非生物碱成分，酸水层再用25％～28％的浓氨水调pH为9-11，然后碱水层依次使用二氯甲烷和正丁醇萃取。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述馏分A是甲醇:水以体积比为20:80洗脱得到，馏分B是甲醇:水以体积比为40:60洗脱得到，馏分C是甲醇:水以体积比为60:40洗脱得到，馏分D是甲醇:水以体积比80:20洗脱得到。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述A-1是甲醇:水以体积比为25:75洗脱得到，A-2是甲醇:水以体积比为50:50洗脱得到，A-3是甲醇:水以体积比为75:25洗脱得到。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述B-1是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为50:1:1洗脱得到，B-2是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为25:1:1洗脱得到，B-3是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为10:1:1洗脱得到，B-4是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为1:1:0.02洗脱得到。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(7)中，所述化合物1是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为25:1:0.1洗脱得到，化合物9是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为10:1:0.1洗脱得到，化合物12是石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为5:1:0.1洗脱得到。

9.一种药物组合物，包括权利要求1所述的苦参碱型生物碱以及其在农药学上可接受的衍生物及其盐类或者农药上可接受的载体。

10.权利要求1所述的苦参碱型生物碱或权利要求9所示的药物组合物在制备抗植物病毒农药和杀虫剂中的应用。