CN115772178A

CN115772178A - 一种生物碱化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用

Info

Publication number: CN115772178A
Application number: CN202111049804.7A
Authority: CN
Inventors: 张玉波; 代小勇; 王国才; 李药兰; 罗钉; 陈能花; 洪刚
Original assignee: Guangzhou Jiqing Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Jiqing Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-09-08
Also published as: CN115772178B

Abstract

本发明公开了生物医药领域的一种生物碱化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用。该生物碱化合物的分子式为C₁₅H₂₂N₂O₄，命名为Sophflarine C，具有如式I所示的化学结构。本发明公开的生物碱化合物不属于现有已分离的生物碱类化合物，该生物碱化合物或其药学上可接受的盐具有明显的抗肿瘤活性，尤其是对非小细胞肺癌细胞A549、HB20具有明显的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及对细胞迁移能力、侵袭能力的抑制作用。该化合物具有制备预防或治疗肿瘤及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，为开发抗肿瘤创新药物提供了新的物质基础。

Description

一种生物碱化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用

技术领域

本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及一种生物碱化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用。

背景技术

肺癌(Lung cancer)是全球最常见的恶性肿瘤之一，随着全球人口数量的增长和人口老龄化的增加，肺癌发生率不断增加，成为致死率最高的肿瘤。2015年世界卫生组织发布的统计数据表明，2012年全球肺癌新发病例约180万，占到全部肿瘤类型的13％。2013年中国肺癌死亡约55万例，占全球该类癌症死亡例数1/3。在我国，男性肺癌发病率和病死率均占所有恶性肿瘤的第1位，女性发病率占第2位，病死率占第1位。国家癌症中心统计，2015年中国肺癌发病例数约73万例，其中男性约51万例、女性约22万例；同年，中国死亡的肺癌病例数约61万例，其中男性约43万例、女性约18万例。肺癌发病和死亡率随着年龄增长而上升，一般40岁以后上升明显，75岁左右达到高峰，然后有所下降。

非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)是一种常见的肺部恶性肿瘤，指的是肺部组织内细胞生长失去控制的疾病，这种细胞生长可能会造成转移，就是侵入相邻的组织和渗透到肺部以外。非小细胞肺癌约占肺癌总数的80-85％，它是一种异质性肿瘤，可进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。绝大多数非小细胞肺癌起源于支气管粘膜上皮。NSCLC大部分患者确诊时已是晚期。局部晚期、身体状况好的NSCLC患者经一系列化疗、放疗和(或)手术治疗能达到8个月的无病生存(disease-free survival，DFS)期，5年生存率＜15％。因此寻找新的有效治疗药物是十分必要的。

苦参(Sophora flavescens Ait.)为豆科槐属植物，以根入药，别名为地槐、野槐、山槐等。广泛分布于我国的南北各地。此外，在俄罗斯、印度、日本等国家均有分布。传统上苦参用于杀虫，利尿，清热燥湿，宁心止悸。现代临床中主要用于治疗乙型肝炎、细菌性痢疾、湿疹，以及癌症的辅助治疗等。药理学研究表明，苦参中生物碱在抗炎、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等方面具有重要作用。苦参根茎中含有大量的生物碱类成分，且结构相似，难以分离，目前分离得到的生物碱类成分有几十种，因此，亟待需要开发和分离生物碱化合物。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明提出一种生物碱化合物或其药学上可接受的盐及其制备和应用。具体技术方案如下：

本发明第一方面提供一种生物碱化合物或其药学上可接受的盐，所述生物碱化合物的分子式为C₁₅H₂₂N₂O₄，命名为Sophflarine C，具有如式I所示的化学结构：

本发明第二方面提供一种生物碱化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)粉碎后的干燥苦参药材进行85％～95％乙醇提取，优选为95％乙醇提取，提取液减压浓缩，得到浸膏；

(2)将所得浸膏分散于水中，调节pH到2～4，加入氯仿萃取，弃去有机层，得到水层；

(3)调节所得水层pH到7.5～9，加入氯仿萃取，保留氯仿层，即得到苦参总碱；

(4)将所得苦参总碱混悬于水中，上样于非极性树脂，依次用水、40％、65％和95％乙醇梯度洗脱，收集95％乙醇部位；

(5)所得95％乙醇部位经反相色谱柱分析，以甲醇-水系统作为洗脱液，按照体积比(30:70)～(100:0)进行梯度洗脱，经TLC检视合并，得到5个馏分Fr.1-Fr.5；

(6)所得Fr.5部分经制备型高效液相色谱纯化后，得到生物碱化合物。

进一步地，85％～95％乙醇的用量为苦参药材的8～12倍量；优选为10倍量；

所述非极性树脂选自D101大孔树脂；

所述反相色谱柱选自ODS柱；

所述制备型高效液相色谱以乙腈-水-二乙胺为流动相，按体积比乙腈：水：二乙胺＝35:65:0.01进行等度洗脱。

本发明第三方面提供所述生物碱化合物和/或其药学上可接受的盐，或所述制备方法制备的生物碱化合物和/或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤为肺癌；优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。更优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌细胞A549或HB20。

本发明第四方面提供一种预防或治疗肿瘤的药物制剂，包含所述生物碱化合物和/或其药学上可接受的盐，或所述制备方法制备的生物碱化合物和/或其药学上可接受的盐。

进一步地，所述药物制剂进一步包括治疗有效量的至少一种其他治疗剂或其组合物；

优选地，所述其他治疗剂或其组合物选自任意的具有抗肿瘤活性的物质或其组合物。

进一步地，所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述药学上可接受的辅料选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素和交联聚维酮中的一种以上。

进一步地，所述药物制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂。这些制剂较为方便服用，能单独或者搭配其他药剂服用，通过内服能将药性通过血液快速输送至病症部位进行有效治疗。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的生物碱化合物不属于现有已分离的生物碱类化合物，属于首次发现，该生物碱化合物及其药学上可接受的盐具有明显的抗肿瘤活性，对肿瘤细胞有很好的抑制作用，尤其是对非小细胞肺癌细胞A549、HB20具有明显的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及对细胞迁移能力、侵袭能力的抑制作用。该化合物具有制备预防或治疗肿瘤及其相关疾病的药物制剂的成药潜力，为开发抗肿瘤创新药物提供了新的物质基础，有利于中药材苦参药用价值的进一步开发。本发明为非小细胞肺癌等提供有效的治疗小分子药物，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。

2、本发明提供的生物碱化合物制备方法简单、成本低、污染小、成药经济效益好，有利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景好。

3、本发明提供的生物碱化合物还具有祛风除湿、舒筋活血等功效，可用于风湿性关节炎、跌打损伤、瘀积肿痛、产后风瘫等症，可以在用于预防或治疗肿瘤的同时起到治疗其他合并症的效果。

附图说明

图1为生物碱化合物Sophflarine C化学结构式；

图2为生物碱化合物Sophflarine C的分子编号和关键2D信号[COSY(-)；HMBC(→)]；

图3为生物碱化合物Sophflarine C的单晶结构图；

图4为生物碱化合物Sophflarine C对非小细胞肺癌细胞A549、HB20增殖的影响作用；A，Sophflarine C化合物在不同作用时间下对非小细胞肺癌细胞A549增殖影响；B，化合物Sophflarine C在不同作用时间下对非小细胞肺癌细胞HB20增殖影响；

图5为生物碱化合物Sophflarine C对非小细胞肺癌细胞A549凋亡影响作用；A，化合物Sophflarine C对非小细胞肺癌细胞A549凋亡影响；B，凋亡统计；

图6为生物碱化合物Sophflarine C对非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭的影响作用；A，化合物Sophflarine C对非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭影响；B，迁移统计；C，侵袭统计；

图7为生物碱化合物Sophflarine C对非小细胞肺癌细胞A549克隆形成的影响作用；A，化合物Sophflarine C对非小细胞肺癌细胞A549克隆形成影响；B，克隆统计；

图8为生物碱化合物Sophflarine C对非小细胞肺癌细胞A549血管形成的影响作用；A，化合物Sophflarine C对HUVEC细胞血管形成影响；B，血管长度统计；C，血管百分比统计；C，血管连接长度统计。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

干燥的苦参根茎(30kg)粉碎后，用300L的95％乙醇渗漉提取3次,每次12h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得浸膏(1.9Kg)。将所得浸膏分散于水(10L)中，用1％的盐酸调PH到3，并加入氯仿(5L)，充分萃取后弃去有机层。剩下的水层用2％的氨水调pH到8，再用氯仿(5L)萃取，保留氯仿层，得苦参总碱(897g)。苦参总碱混悬于水(10L)中后，上D101大孔树脂，依次用水、40％、65％和95％乙醇梯度洗脱后得水部位(302g)、40％乙醇部位(317g)、65％乙醇部位(177g)和95％乙醇部位(35g)。95％乙醇部位再经ODS柱分析，采用甲醇：水(30:70→100:0，v:v)系统梯度洗脱，经TLC检视合并，得到5个馏分(Fr.1-Fr.5)。Fr.5部分再经制备型高效液相(乙腈：水：二乙胺＝35:65:0.01，v:v:v)纯化后得到生物碱化合物，命名为Sophflarine C，化合物结构如图1所示。

结构鉴定依据：

化合物Sophflarine C的结构，通过分析高分辨质谱(HRESIMS)、红外光谱(IR)、核磁共振谱(NMR)及x-射线单晶衍射推测得到。化合物Sophflarine C,无色透明晶体；光学纯，其比旋光度为[α]²⁵ _D-25.1(c 0.10,CH₃OH),高分辨电喷雾离子质谱给出其分子式为C₁₅H₂₂N₂O₄(m/z 317.1479,calcd for C₁₅H₂₂N₂O₄Na,317.1472)，说明不饱和度为6；紫外光谱显示其最大吸收在203nm处，提示无长共轭体系；红外光谱显示其有羟基(3429cm-1)和羰基(1590cm-1)的吸收带；一维核磁谱图(包括氢谱¹H，碳谱¹³C，无畸变变偶谱DEPT 135°)显示其有两个羰基(δ_C 183.4，168.5)，两个脂肪族季碳包括一个特征的半缩酮碳信号(δ_C98.8)，一个次甲基(δ_C 161.7,δ_H 8.07s)以及10个亚甲基信号；除了两个羰基碳占了两个不饱和度，仍需一个四环系统以满足总共6个总的不饱和度；分子的平面二维结构主要由2D谱图建立，三个孤立的相互耦合自旋系统H₂-2/H₂-3/H₂-4,H₂-8/H₂-9/H₂-10,和H-11/H₂-12/H₂-13/H₂-14可通过¹H-¹H COSY谱分析得到，这些耦合的子片段进一步由HMBC谱确立连接，HMBC谱中的H₂-4/H₂-17至C-5的相关，从H₂-8/H₂-9/H-11/H₂-12到C-7的相关确立了分子全部碳氢结构归属，此外剩余一个不饱和度，归属为5,7位的氧桥，由这两个位点处特征的低场核磁位移确定(表1)；整个分子的平面结构由此确定，其关键性相关信号如图2所示。该分子的绝对构型由X射线铜靶单晶衍射鉴定(图3)，合理的绝对构型因子参数-0.09(4)可以准确的确定其5S,7S,11R的绝对构型。

表1. 1H,13C,DEPT和2D相关信号

No.	<sup>13</sup>C,type	<sup>1</sup>H	COSY	HMBC
					2	44.8,CH2	a 3.96td(10.5,2.6)；b2.78m	H-3	C-3,4,10
3	19.4,CH2	a1.81；b1.54	H-2,4	-
					4	30.6,CH2	1.75		-
5	75.2,C	-	-	-
					6	183.4,C	-	-	-
7	98.8,C	-	-	-
					8	29.8,CH2	a 1.81；b1.56	H-9	-
9	22.3,CH2	a 2.22；b1.41	H-8,10	C-7,8,10
					10	52.7,CH2	a 3.81td(13.1,2.77)；b2.89dt(13.1,2.77)	H-9	C-2.8,9
11	63.2,CH	3.15,t,6.4	H-12	C-7,8,12,13,15
					12	23,CH2	a 1.86；b1.48	H-11,13	-
13	18.6,CH2	a 1.67；b1.48	H-12,14	C-11,14,15
					14	32.5,CH2	2.18m	H-13	C-12,13,15
15	168.5,C	-	-	-
					17	43.3,CH2	a 4.68d(13.1)；b2.30d(13.1)	-	C-5,6,11,15

本发明通过实验例1-5验证化合物Sophflarine C在抗肿瘤方面的效果。实验例1-5中，培养细胞的培养基为DMEM加10％FBS，在说明书附图中化合物Sophflarine C记为SFC。

实验例1：化合物Sophflarine C可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549、HB20的增殖

1.将非小细胞肺癌细胞A549、HB20以5ⅹ10³个/孔分别接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μl，在37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养24h，然后饥饿过夜；

2.加入不同浓度梯度(100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)的化合物Sophflarine C分别培养24h、48h、72h；

3.培养结束后，每孔加入20μl的MTT工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4h；

4.培养结束后，弃培养板中的上清，加入150μl DMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。结果如图4。

图4显示，不同浓度的化合物Sophflarine C可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549、HB20的增殖，并且随着作用时间的增加，化合物抑制非小细胞肺癌细胞增殖的作用也更为显著。

实验例2：生物碱化合物Sophflarine C可以促进非小细胞肺癌细胞A549的凋亡

1.将非小细胞肺癌细胞A549以5ⅹ10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1ml，在37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养24h，然后饥饿过夜；

2.加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物培养48小时，同时设置不给药组作为对照组；

3.培养结束后，先将上清收集到离心管中，再用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞培养液到离心管，500g左右离心5分钟，沉淀细胞；

4.用预冷的PBS洗涤细胞两次，500g左右离心5分钟收集细胞；

5.加入100μl预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，重悬细胞；

6.加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI，轻轻混匀，室温避光反应15分钟；

7.加入400μl预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，轻轻混匀，将样品至于冰上避光放置，1h内用流式细胞仪检测。分析检测结果。结果如图5。

图5显示，通过流式细胞仪分析发现，随着作用浓度的升高，化合物Sophflarine C可以明显促进非小细胞肺癌细胞A549发生凋亡。^**P<0.01与对照组相比较。

实验例3：生物碱化合物Sophflarine C可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549的迁移和侵袭

1.Transwell上室接种2×10⁵个细胞，加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物Sophflarine C在37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养24h，同时设置不给药组作为对照组；

2.下室加入800ul含有10％FBS的培养基；

3.用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；

4.多聚甲醛固定结束后，用PBS洗3次，0.5％的结晶紫染色1h；

5.结晶紫染色结束后，用棉签小心刮掉上层细胞，显微镜下拍照。结果如图6。

图6显示，通过实验发现，随着作用浓度的升高，化合物Sophflarine C可以明显抑制非小细胞肺癌细胞A549迁移和侵袭。^**P<0.01与对照组相比较。

实验例4：生物碱化合物Sophflarine C可以显著抑制非小细胞肺癌细胞A549的体外克隆形成能力

1.将非小细胞肺癌细胞A549以1000个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1ml，在37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养10天，然后饥饿过夜；

2.加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物作用24h，同时设置不给药组作为对照组；

3.PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；

4.多聚甲醛固定结束后，用PBS洗3次，加入0.5％的结晶紫染色1h；

5.结晶紫染色结束后，用PBS洗3次，显微镜拍照。结果如图7。

图7显示，通过克隆实验发现，随着作用浓度的升高，化合物Sophflarine C可以明显抑制非小细胞肺癌细胞A549克隆形成。^**P<0.01与对照组相比较。

实验例5：生物碱化合物Sophflarine C可以显著抑制HUVEC血管形成能力

1.先用Matrigel铺板24孔板过夜；

2.将HUVEC细胞以5×10⁴个/孔接种于24孔细胞培养板中，加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的化合物培养6h，同时设置不给药组作为对照组；

3.用PBS洗3次，显微镜拍照。结果如图8。

图8显示，随着作用浓度的升高，化合物Sophflarine C可以明显抑制HUVEC血管形成。^**P<0.01与对照组相比较。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims

1.一种生物碱化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述生物碱化合物的分子式为C₁₅H₂₂N₂O₄，命名为Sophflarine C，具有如式I所示的化学结构：

2.一种生物碱化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)粉碎后的干燥苦参药材进行85％～95％乙醇提取，提取液减压浓缩，得到浸膏；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，85％～95％乙醇的用量为苦参药材的8～12倍量；

所述非极性树脂选自D101大孔树脂；

所述反相色谱柱选自ODS柱；

4.权利要求1所述生物碱化合物和/或其药学上可接受的盐，或权利要求2或3所述制备方法制备的生物碱化合物和/或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌；优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

6.一种预防或治疗肿瘤的药物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述生物碱化合物和/或其药学上可接受的盐，或权利要求2或3所述制备方法制备的生物碱化合物和/或其药学上可接受的盐。

7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述肿瘤为肺癌；优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。

8.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂进一步包括治疗有效量的至少一种其他治疗剂或其组合物；

9.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料；

10.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂。