CN112251359A - 一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻及其应用。所述等鞭金藻D.sp3（保藏编号CGMCC No.19159）和D.sp4（保藏编号CGMCC No.19160），可在33‑40℃水温中生长和存活，可用于夏季高温期海水养殖的育苗、保苗和养殖，亦可用于南北方夏季高温高光照条件下鲜活饵料或相关产品的开发中，具有较好的经济价值。

Description

一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻及其应用。
背景技术
等鞭金藻是一种水产育苗和养殖过程中常用的饵料微藻。是贝类、蛤类、单环刺螠等重要海水养殖经济品种育苗和养殖的主要饲料。以饵料微藻培养的轮虫、卤虫（丰年虫）等也是许多重要鱼类、虾类，如大菱鲆、牙鲆、南美白对虾等的主要饵料。因此，等鞭金藻在水产育苗、保苗和养殖中占有重要地位。
山东烟台莱州是全国海水育苗基地。作为著名的中国海湾扇贝之乡、渤海湾最优的扇贝育苗区域，近几年，扇贝每年出口量占到了海产品总量的70%-80%。2016年，莱州市的扇贝达到了20多万吨，产值达12亿元。
实际生产中应用的金藻主要以的育苗或养殖企业内部生产为主，目前市场上有为水产养殖提供服务的相关企业出售浓缩藻液、藻砖、藻泥等初级产品；其最适培养温度大致会在20-30℃，平均粒径大小为2.5-7μm。存在价格较高，活性较低， 同时在育苗期间，需要经过高温高光照的夏季。正常自然通风的条件下，夏季中午饵料大棚的水温会达到 30℃以上。在高温高光照条件下，目前所常用的金藻极易衰败，无法满足水产幼苗和养殖对于活体饵料微藻的需求及时足量供给等问题。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻及其应用。
为实现上述目的，本发明所具有的技术方案为：
一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻，等鞭金藻为等鞭金藻D.sp3或等鞭金藻D.sp4；其中，等鞭金藻D.sp3已于2019年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为球等鞭金藻 Isochrysis galbana，保藏编号为CGMCC No. 19159；
等鞭金藻D.sp4已于2019年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为球等鞭金藻 Isochrysis galbana，保藏编号为CGMCC No. 19160。
所述等鞭金藻D.sp.3或等鞭金藻D.sp.4的单细胞粒径为4-10μm（平均为5μm），两株藻的23S rDNA基因核心序列片段如下：
AGTTTTGATCCGAGAATTCCCGAATAAGGAAACTTCGAGAACTACTTCTTGAATTCATAAAGAAGAAAGAGCAAACCTAGTGAATTGAAACATCTTATTAACTAGAGGAAAAGAAAGCAAAAGCGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGCGAAATGGGACCAGTCTAAACTCTAATTTTAGAGGGTTGTGGGACAGTAAATTAGTAAAGAACAAATGTTAGTTGAAACGGTTGGAATACCGTACCAAAGAAGGTGAAAGTCCTGTAATCGAAAACTTTAGTACCTTTAATCTGTATCCCAAGTAGGAAGAGACACGTGAAACCTCTTCTGAATTTGCGAGGACCACCTCGTAAGACTAAATATTCCTGAATAACCGATAGTGAACCAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGAACCCCGGGAGGGGAGTGAAATAGAACATGAAATCGTAAGTTTACAAGCAGTAGAAGAGCGACTTAACGCTCGACTTCGTGCCTGTTG
所述藻株采用单细胞分离技术进行等鞭金藻的单细胞分离。通过耐高温测试获得，所得藻株具有较好耐高温性能的藻株。
所述单细胞分离技术，是指采用显微操作技术或流式细胞术进行金藻单细胞的分离。
一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻的培养方法，所述等鞭金藻D.sp.3或等鞭金藻D.sp.4培养至改良的f/2培养基中，盐度为28-35，光暗周期为12h/12h，光照强度为13-16μmol/(cm2·s)，pH为7-9，培养基中N/P（质量比）为11-15:1，培养温度为25-40℃。
所述改良的f/2培养基成分为：NaNO3：60-90g/L；NaH2PO4：5-8g/L；EDTA：4-5g/L；FeCl3： 2-3g/L；CuSO4：10-50mg/L；ZnSO4：20-50mg/L；CoCl2：5-20mg/L；MnCl2：100-250mg/L；Na2MoO4：2-5mg/L；VB12：0.1-0.5mg/L；VB1:100-150mg/L；生物素0.5-1.5mg/L。pH值7-9。
所述等鞭金藻D.sp.3或等鞭金藻D.sp.4培养温度为30-40℃。经高温筛选获得等鞭金藻藻株D.sp.3和D.sp.4，可在温度为30-35℃时可正常生长。其最适培养条件为盐度为30，pH=7，N/P=14:1。
一种用于夏季海水育苗和养殖的等鞭金藻的应用，所述等鞭金藻在作为饵料中的应用。
所述等鞭金藻在作为物种育苗期或养殖期的鲜活饵料中的应用。
所述物种为贝类、蛤类、螠类、鱼类的幼苗期或保苗期。
所述等鞭金藻在作为培育或养殖卤虫、轮虫或枝角类的次级饵料中的应用。
本发明的有益效果是：
目前在水产育苗和养殖中常用的饵料金藻包括叉鞭金藻、等鞭金藻等。这些常用种一般难以耐受高水温，如在水温达到或超过35℃时极易发生衰败，死亡。给高温季节的育苗和养殖造成不利影响。
本发明通过单细胞分离技术结合高温筛选，获得能够在30-35℃正常生产、且在40℃时不发生快速衰败的等鞭金藻，平均粒径为5μm，可作为贝类、蛤类、螠虫类、鱼类育苗和保苗期的鲜活饵料应用，亦可可用于鱼类、虾类、海参育苗和养殖期间的水质调节，或用于卤虫、轮虫等次级饵料的培育和养殖，以及用以开发浓缩微藻、藻泥、藻砖、干粉等，以及以此为基础进行相关食品、保健品、特殊配方食品的生产。
附图说明
图1为本发明中筛选获得的等鞭金藻藻株显微观察图。
图2为本发明中筛选获得的等鞭金藻藻株35℃下接种后第7天的培养物效果图。
图3为本发明中筛选获得的等鞭金藻藻株在35℃时的生长曲线图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。
实施例1：耐高温等鞭金藻的分离
从夏季高温期海水育苗场的饵料培育池中的藻液中通过流式细胞术分离获得耐高温菌株，具体为：
采用的流式细胞术进行等鞭金藻单细胞的分离、培养与鉴定，具体步骤包括：
1）吸取样品到三凹片；
2）倒置显微镜下找到所需的藻细胞；
3）用毛细管对准藻细胞，慢慢吸入；
4）如果杂细胞太多，可以先用毛细管吸走它们，留下所需的藻细胞；
5）在第二凹孔慢慢吹出，再仔细吸入，确保是单细胞；
6）有必要在第三凹孔重复操作；
7）将单细胞吹入24孔细胞培养板；
8）24孔板长成后，转移到12孔板及50 mL细胞培养瓶中进行备份保种；
从夏季高温期海水育苗场的饵料金藻养殖池中分离得到的4株等鞭金藻，经培养发现藻株生长状态良好，镜检无原生动物污染（参见图1）。
实施例2：等鞭金藻的高温存活测试
将所得菌株进一步培养获得耐高温藻株，具体为：
将上述获得各藻种按照10%接种量分别接种至250 mL改良的f/2培养基中进行单细胞培养，分别置于温度为35℃、40℃的恒温振荡培养箱中进行培养，以灯管作为光源，光暗比为12 h：12 h，用GLZ-A光合有效辐射计测试其有效光强，有效光强为16 μmol/(cm2·s)。每天定时摇匀藻液1次，以防细胞贴壁生长对实验结果产生干扰（参见图2），并利用显微测量法测定单细胞粒径为4-10μm，平均为5μm。同时采取MTT法进行细胞计数测定其存活能力（参见图3），获得具有较好耐高温性能的等鞭金藻藻株D.sp.3和D.sp.4。
改良的f/2培养基成分为：NaNO3：75g/L；NaH2PO4：8g/L；EDTA：4.5g/L；FeCl3： 3g/L；CuSO4：10mg/L；ZnSO4：23mg/L；CoCl2：10mg/L；MnCl2：150mg/L；Na2MoO4：5mg/L；VB12：0.6mg/L；VB1:100mg/L；生物素0.5mg/L，pH值7-9。
经高温筛选获得的等鞭金藻藻株D.sp.3和D.sp.4，可在温度为35℃时可正常生长。其最适培养条件为盐度为30，pH=7，N/P=14:1。并且最高耐受温度为40℃。
MTT法：于SW-CJ-2FD双人单面洁净工作台中取耐高温叉鞭金藻各200 μL至96孔细胞培养板中，将 96 孔细胞培养板各孔接种细胞加20 μL MTT ，置于4℃冰柜中4 h，加20 μL DM SO 溶解，于SuPerMax 3100 型多功能酶标仪下检测其OD 570。
利用生产中常用的等鞭金藻3011绘制生长曲线，得到其OD 570与细胞数量的对应关系为A=0.0253X+0.039，R2=0.998，X(108 cfu/mL)，与筛选获得金藻对比，以OD值计算其存活率（%）的变化。
存活率（%）=C1-C2。其中：C1—接种后第n d细胞浓度；C2—接种后第1 d的细胞浓度。
如图2和3所示，所筛选获得的耐高温金藻均可在35℃正常生长，且等鞭金藻藻株D.sp.3和D.sp.4细胞数量和存活率随时间延长逐渐提高。
进一步将所得藻株利用总DNA提取试剂盒提取D.sp.3和D.sp.4的总DNA，利用23srDNA核心序列引物（F：CCCTTBAAAGAGTGCGTA；R:AKTTTGCCGAGTTCCTTA）扩增后测序，测序结果与Genbank中现有数据对比，显示D.sp.3和D.sp.4为球等鞭金藻。
其23S rDNA核心序列为：
AGTTTTGATCCGAGAATTCCCGAATAAGGAAACTTCGAGAACTACTTCTTGAATTCATAAAGAAGAAAGAGCAAACCTAGTGAATTGAAACATCTTATTAACTAGAGGAAAAGAAAGCAAAAGCGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGCGAAATGGGACCAGTCTAAACTCTAATTTTAGAGGGTTGTGGGACAGTAAATTAGTAAAGAACAAATGTTAGTTGAAACGGTTGGAATACCGTACCAAAGAAGGTGAAAGTCCTGTAATCGAAAACTTTAGTACCTTTAATCTGTATCCCAAGTAGGAAGAGACACGTGAAACCTCTTCTGAATTTGCGAGGACCACCTCGTAAGACTAAATATTCCTGAATAACCGATAGTGAACCAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGAACCCCGGGAGGGGAGTGAAATAGAACATGAAATCGTAAGTTTACAAGCAGTAGAAGAGCGACTTAACGCTCGACTTCGTGCCTGTTG
应用例1：单环刺螠幼苗饲喂实验
选取4-5月龄单环刺螠幼苗，体重为0.32 g-0.90 g，体长为2.10 cm-3.90 cm的单环刺螠幼苗。用实施例1筛选出的D.sp.1-4藻株于每天5:30 pm定时饲喂单环刺螠幼苗同时以目前常用的金藻3011作为对照，其他育苗方式按现有技术实施，投喂饵料微藻的初始细胞浓度为2 CFU/mL -3.5 CFU/mL。饲喂实验共持续5 d，于实验开始后第3 d取样。取样前先停止曝气2 min，取水样用SuPerMax 3100 型多功能酶标仪，于 472 nm 波长下检测其的吸光值做为初始OD 472值；6:30 pm 停止曝气2 min，取水样用SuPerMax 3100 型多功能酶标仪，于472 nm 波长下检测其的吸光值做为1 h后OD 472值。计算饲喂单环刺螠后的初始浊度及1 h后浊度，其中 ：A —吸光度；N —浊度，NTU。根据Fi =ΔN=ΔN1－ΔN2计算单环刺螠幼苗的摄食强度(Fi)，其中: ΔN1—试验组投饵 1 h 后因单环刺螠摄食和沉降造成浊度的改变值，NTU； ΔN2—对照组投饵 1 h 后因沉降造成浊度的改变值，NTU。单环刺螠幼苗对Dsp4的平均摄食强度（Fi）为1.4381。
Figure 107610DEST_PATH_IMAGE001
由上述可见，单环刺螠幼体对筛选获得的等鞭金藻均有较好的摄食效果，其中D.sp.4效果最优。
应用例2：扇贝幼苗饲喂实验
选取3-4月龄扇贝幼苗。用实施例1筛选出的D.sp.1-4藻株于每天8:00am、1:00pm、5:30pm、定时投喂，同时以目前常用的金藻3011作为对照；并且其他培育方式按现有技术。投喂饵料微藻的初始细胞浓度为2 CFU/mL -3.5 CFU/mL。饲喂实验共持续5 d，于实验开始后第3 d取样。取样前先停止曝气2 min，取水样用SuPerMax 3100 型多功能酶标仪，于 472 nm波长下检测其的吸光值做为初始OD 472值；6:30 pm 停止曝气2 min，取水样用SuPerMax3100 型多功能酶标仪，于 472 nm 波长下检测其的吸光值做为1 h后OD 472值。计算饲喂后的初始浊度及1 h后浊度，其中 ：A —吸光度；N —浊度，NTU。根据Fi =ΔN=ΔN1－ΔN2计算幼苗的摄食强度(Fi)，其中: ΔN1—试验组投饵 1 h 后因摄食和沉降造成浊度的改变值，NTU； ΔN2—对照组投饵 1 h 后因沉降造成浊度的改变值，NTU。幼苗对Dsp4的平均摄食强度（Fi）为3.6289。
Figure 768399DEST_PATH_IMAGE002
由上述可见，扇贝幼苗对筛选获得的等鞭金藻均有较好的摄食效果，其中D.sp.4效果最优。
由上述可见耐高温等鞭金藻D.sp.3和D.sp.4具有较好的耐高温性能，可在30-35℃时正常生长，从而为夏季高温季节进行水产苗种繁育提供鲜活的饵料微藻。同时，作为饵料使用时，与常用的金藻3011相比，单环刺螠及扇贝幼苗对其具有更好的摄食能力。故本发明提供的两种新型耐高温金藻可保障在30-35℃高温期间饵料藻的培育和生产，有助于解决高温季节鲜活饵料供应不足的问题。
同时培育的耐高温金藻可作为贝类、蛤类、螠虫类、鱼类育苗和保苗期的鲜活饵料应用，亦可可用于鱼类、虾类、海参育苗和养殖期间的水质调节，或用于卤虫、轮虫等次级饵料的培育和养殖，以及用以开发浓缩微藻、藻泥、藻砖、干粉等，以及以此为基础进行相关食品、保健品、特殊配方食品的生产。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
莱州市顺昌水产有限公司
<120> 一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttttgatc cgagaattcc cgaataagga aacttcgaga actacttctt gaattcataa 60
agaagaaaga gcaaacctag tgaattgaaa catcttatta actagaggaa aagaaagcaa 120
aagcgattcc ctcagtagcg gcgagcgaaa tgggaccagt ctaaactcta attttagagg 180
gttgtgggac agtaaattag taaagaacaa atgttagttg aaacggttgg aataccgtac 240
caaagaaggt gaaagtcctg taatcgaaaa ctttagtacc tttaatctgt atcccaagta 300
ggaagagaca cgtgaaacct cttctgaatt tgcgaggacc acctcgtaag actaaatatt 360
cctgaataac cgatagtgaa ccagtaccgt gagggaaagg tgaaaagaac cccgggaggg 420
gagtgaaata gaacatgaaa tcgtaagttt acaagcagta gaagagcgac ttaacgctcg 480
acttcgtgcc tgttg 495

Claims (8)

1.一种用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻，其特征在于：等鞭金藻为等鞭金藻D.sp3或等鞭金藻D.sp4；其中，等鞭金藻D.sp3已于2019年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为球等鞭金藻 Isochrysis galbana，保藏编号为CGMCC No. 19159；
等鞭金藻D.sp4已于2019年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为球等鞭金藻 Isochrysis galbana，保藏编号为CGMCC No. 19160。
2.按权利要求1所述的用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻，其特征在于：所述等鞭金藻D.sp3或等鞭金藻D.sp4的单细胞粒径为4-10μm。
3.一种权利要求1所述的用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻的培养方法，其特征在于：所述等鞭金藻D.sp3或等鞭金藻D.sp4培养至改良的f/2培养基中，盐度为28-35，光暗周期为12h/12h，光照强度为13-16μmol/(cm2·s)，pH为7-9，培养基中N/P质量比为11-15:1，培养温度为25-40℃。
4.按权利要求3所述的用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻的培养方法，其特征在于：所述等鞭金藻D.sp3或等鞭金藻D.sp4培养温度为33-40℃。
5.一种权利要求1所述的用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻的应用，其特征在于：所述等鞭金藻在作为饵料中的应用。
6.按权利要求5所述的用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻的应用，其特征在于：所述等鞭金藻在作为物种育苗期或养殖期的鲜活饵料中的应用。
7.按权利要求6所述的用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻的应用，其特征在于：所述物种为贝类、蛤类、螠类、鱼类的幼苗期或保苗期。
8.按权利要求5所述的用于夏季海水育苗或养殖的等鞭金藻的应用，其特征在于：所述等鞭金藻在作为培育或养殖卤虫、轮虫或枝角类的次级饵料中的应用。
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