CN112245594B - 一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子，由以下步骤制成：常温下，将右旋糖酐加入二甲亚砜中，搅拌至完全溶解得到右旋糖酐溶液，将1,1’‑羰基二咪唑加入右旋糖酐溶液中搅拌活化12‑24h，然后逐滴加入双‑(3‑二甲基丙氨基)胺，搅拌反应24‑36h得到反应液，将反应液离心分离后得到沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀除去未反应的右旋糖酐得到用于基因分子传递的非病毒纳米粒子。本发明还公开了该非病毒纳米粒子的制备方法。本发明提供的非病毒纳米粒子既能避免病毒转染的强免疫原性和潜在传染性，又能提高聚阳离子聚合物的转染效率。

Description

一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种非病毒纳米粒子，特别是涉及一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
遗传物质作为治疗剂可为多种疾病的治疗提供许多潜在益处。在基因治疗中，将基因递送到靶宿主细胞中以产生或沉默功能蛋白以达到治愈疾病的目的。通常，带负电荷的寡核苷酸在没有递送系统的情况下不能穿透质膜，因此，被称为“基因载体”的高效基因传递系统被创造出来。与具有强免疫原性和潜在传染性的病毒载体相比，非病毒载体已被证实具有减弱不被希望的临床反应并使基因传递受到控制的优势。其中，通过利用与聚阴离子核酸的电荷-电荷相互作用，阳离子聚合物材料被设计为非病毒载体，形成的复合物不仅可以保护基因分子免于基因分子酶促降解，还可以促进细胞摄取。许多报告还表明，形成的复合物的净正电荷增加可以增强配合物与带负电的细胞膜接触，进一步改善细胞吞咽。
然而，低细胞毒性和高转染效率是临床实际应用中理想的非病毒载体的两个主要要求。简单、低成本的聚阳离子聚乙烯亚胺（PEI）已证明其具有体外极高的转染率，但是，它的高细胞毒性使其不太可能成为体内使用载体的的选择。在此基础上，许多生物相容性聚阳离子聚合物被认为并发展为具有低细胞毒性的非病毒载体，例如聚赖氨酸（PPL），壳聚糖，聚（氨基共酯），环糊精分子等。尽管这些生物相容性聚阳离子具有许多吸引人的特性，但低基因转染效率仍然限制了它们作为基因载体的应用。目前，人们已经采取了许多策略来提高基因传递效率。例如与PEI物理或共价结合的生物相容性聚合物旨在获得高基因传递效率的同时降低PEI的细胞毒性。此外，开发了一系列具有环糊精核心的阳离子星形聚合物，以有效地传递基因。
转染效率可以通过许多参数来调节，例如聚合物分子量及其分布，以及聚合物组成。由开环聚合得到的可降解聚合物也证实了它们作为高效基因载体的作用。从化学观点来看，阳离子基团和阴离子基团之间的非共价相互作用主要是由阳离子基团的类型和数量决定的。此外，基因传递效率不仅取决于基因结合能力，还取决于基因在细胞内的释放。因此，重要的是平衡静电相互作用（基因分子及其载体）和在生理环境下相互作用的不稳定以实现有效的基因转染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子，其既能避免病毒转染的强免疫原性和潜在传染性，又能提高聚阳离子聚合物的转染效率。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子，由以下步骤制成：
常温下，将右旋糖酐加入二甲亚砜中，搅拌至完全溶解得到右旋糖酐溶液，将1,1’-羰基二咪唑加入右旋糖酐溶液中搅拌活化12-24h，然后逐滴加入双-(3-二甲基丙氨基)胺，搅拌反应24-36h得到反应液，将反应液离心分离后得到沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀除去未反应的右旋糖酐得到用于基因分子传递的非病毒纳米粒子。
进一步地，本发明所述右旋糖酐、二甲亚砜、1,1’-羰基二咪唑、双-(3-二甲基丙氨基)胺的比例为1g:40mL:2g:（4-8）mL。
进一步地，本发明所述搅拌活化的时间为12h。
进一步地，本发明所述搅拌反应的时间为24h。
本发明要解决的另一技术问题是提供上述用于基因分子传递的非病毒纳米粒子的制备方法。
为解决上述技术问题，技术方案是：
一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
常温下，将右旋糖酐加入二甲亚砜中，搅拌至完全溶解得到右旋糖酐溶液，将1,1’-羰基二咪唑加入右旋糖酐溶液中搅拌活化12-24h，然后逐滴加入双-(3-二甲基丙氨基)胺，搅拌反应24-36h得到反应液，将反应液离心分离后得到沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀除去未反应的右旋糖酐得到用于基因分子传递的非病毒纳米粒子。
进一步地，所述右旋糖酐、二甲亚砜、1,1’-羰基二咪唑、双-(3-二甲基丙氨基)胺的比例为1g:40mL:2g:（4-8）mL。
进一步地，所述搅拌活化的时间为12h。
进一步地，所述搅拌反应的时间为24h。
本发明要解决的又一技术问题是提供上述非病毒纳米粒子在基因分子传递的应用，包括以下步骤：
在无菌环境中，将非病毒纳米粒子加入PBS中，搅拌至完全分散得到非病毒纳米粒子溶液，将目的基因加入非病毒纳米粒子溶液中搅拌至混合均匀，常温孵育2h后得到右旋糖酐-DNA复合物，将右旋糖酐-DNA复合物加入培养有宿主细胞的培养皿，完成转染过程。
进一步地，所述非病毒纳米粒子、PBS、目的基因的比例为0.1:10mL:（2-6）μg。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1）右旋糖酐是一种具有优良生物相容性的高分子多糖，无毒，不引起细胞、组织的刺激，不会对细胞造成毒害。由于右旋糖酐生物相容性好，可生物降解，使得右旋糖酐可以减少在基因分子传递过程中的异物刺激产生从而起到保护作用。本发明利用双-(3-二甲基丙氨基)胺对其进行改性，使得右旋糖酐的表面电荷等可调控，能高效吸附DNA，保证非病毒纳米粒子的高效运载。
2）本发明所述非病毒纳米粒子可以有效搭载基因分子并将其转染入细胞基因组，同时具有良好的生物安全性，没有强免疫原性和潜在传染性，可在短时间内安全、高效地实现目的基因的转染。
3）本发明所述非病毒纳米粒子的制备和操作方法简单，反应条件温和，所需条件要求不苛刻，可以在常温下进行反应。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为本发明实施例1制得的非病毒纳米粒子以及右旋糖酐的红外谱图，图中两条线上面的是右旋糖酐，下面的是实施例1制得的非病毒纳米粒子，其1706cm-1处出现强吸收峰，为羰基峰，证明改性成功。
图2为吸附pDNA实验图，图中：a为Maker；b为5μg纯pDNA；c为5μg纯pDNA经DNA酶处理；d为5μg纯pDNA与2.5mg实施例1制得的非病毒纳米粒子吸附；e为5μg纯pDNA与5mg实施例1制得的非病毒纳米粒子吸附；f为5μg纯pDNA与7.5mg实施例1制得的非病毒纳米粒子吸附；g为5μg纯pDNA与实施例1制得的10mg非病毒纳米粒子吸附。图2证明本发明所述非病毒纳米粒子具有明显的基因分子吸附能力。
图3为运载编码荧光蛋白基因分子实验。由图3可见，右旋糖酐无法运载基因分子转染入靶细胞；经胺改性的右旋糖酐即本发明实施例1制得的非病毒纳米粒子能顺利高效地将编码荧光蛋白分子运载进入细胞。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
按照以下步骤制备用于基因分子传递的非病毒纳米粒子：
常温下，将1g右旋糖酐加入40mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解得到右旋糖酐溶液，将2g1,1’-羰基二咪唑加入右旋糖酐溶液中搅拌活化12h，然后逐滴加入4mL双-(3-二甲基丙氨基)胺，搅拌反应24h得到反应液，将反应液离心分离后得到沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀除去未反应的右旋糖酐得到用于基因分子传递的非病毒纳米粒子。
上述步骤制得的非病毒纳米粒子在基因分子传递的应用包括以下步骤：
在无菌环境中，将0.1g非病毒纳米粒子加入10mLPBS中，搅拌至完全分散得到非病毒纳米粒子溶液，将2μg目的基因加入非病毒纳米粒子溶液中搅拌至混合均匀，常温孵育2h后得到右旋糖酐-DNA复合物。在无菌环境中，用含胎牛血清（10%）的培养基（DMEM）完全分散上述右旋糖酐-DNA复合物,浓度为10μg/mL，再加入培养有软骨细胞的培养皿（8000/孔，96孔板）37℃，5%CO2培养48h，完成转染过程。
实施例2
按照以下步骤制备用于基因分子传递的非病毒纳米粒子：
常温下，将1g右旋糖酐加入40mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解得到右旋糖酐溶液，将2g1,1’-羰基二咪唑加入右旋糖酐溶液中搅拌活化24h，然后逐滴加入6mL双-(3-二甲基丙氨基)胺，搅拌反应24h得到反应液，将反应液离心分离后得到沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀除去未反应的右旋糖酐得到用于基因分子传递的非病毒纳米粒子。
上述步骤制得的非病毒纳米粒子在基因分子传递的应用包括以下步骤：
在无菌环境中，将0.1g非病毒纳米粒子加入10mLPBS中，搅拌至完全分散得到非病毒纳米粒子溶液，将4μg目的基因加入非病毒纳米粒子溶液中搅拌至混合均匀，常温孵育2h后得到右旋糖酐-DNA复合物。在无菌环境中，用含胎牛血清（10%）的培养基（DMEM）完全分散上述右旋糖酐-DNA复合物,浓度为10μg/mL，再加入培养有软骨细胞的培养皿（8000/孔，96孔板）37℃，5%CO2培养48h，完成转染过程。
实施例3
按照以下步骤制备用于基因分子传递的非病毒纳米粒子：
常温下，将1g右旋糖酐加入40mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解得到右旋糖酐溶液，将2g1,1’-羰基二咪唑加入右旋糖酐溶液中搅拌活化24h，然后逐滴加入8mL双-(3-二甲基丙氨基)胺，搅拌反应24h得到反应液，将反应液离心分离后得到沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀除去未反应的右旋糖酐得到用于基因分子传递的非病毒纳米粒子。
上述步骤制得的非病毒纳米粒子在基因分子传递的应用包括以下步骤：
在无菌环境中，将0.1g非病毒纳米粒子加入10mLPBS中，搅拌至完全分散得到非病毒纳米粒子溶液，将6μg目的基因加入非病毒纳米粒子溶液中搅拌至混合均匀，常温孵育2h后得到右旋糖酐-DNA复合物。在无菌环境中，用含胎牛血清（10%）的培养基（DMEM）完全分散上述右旋糖酐-DNA复合物,浓度为10μg/mL，再加入培养有软骨细胞的培养皿（8000/孔，96孔板）37℃，5%CO2培养48h，完成转染过程。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子，其特征在于：由以下步骤制成：
常温下，将右旋糖酐加入二甲亚砜中，搅拌至完全溶解得到右旋糖酐溶液，将1,1’-羰基二咪唑加入右旋糖酐溶液中搅拌活化12-24h，然后逐滴加入双-(3-二甲基丙氨基)胺，搅拌反应24-36h得到反应液，将反应液离心分离后得到沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀除去未反应的右旋糖酐得到用于基因分子传递的非病毒纳米粒子；所述右旋糖酐、二甲亚砜、1,1’-羰基二咪唑、双-(3-二甲基丙氨基)胺的比例为1g:40mL:2g:（4-8）mL。
2.根据权利要求1所述的一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子，其特征在于：所述搅拌活化的时间为12h。
3.根据权利要求1所述的一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子，其特征在于：所述搅拌反应的时间为24h。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的用于基因分子传递的非病毒纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
常温下，将右旋糖酐加入二甲亚砜中，搅拌至完全溶解得到右旋糖酐溶液，将1,1’-羰基二咪唑加入右旋糖酐溶液中搅拌活化12-24h，然后逐滴加入双-(3-二甲基丙氨基)胺，搅拌反应24-36h得到反应液，将反应液离心分离后得到沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀除去未反应的右旋糖酐得到用于基因分子传递的非病毒纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述右旋糖酐、二甲亚砜、1,1’-羰基二咪唑、双-(3-二甲基丙氨基)胺的比例为1g:40mL:2g:（4-8）mL。
6.根据权利要求4所述的一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述搅拌活化的时间为12h。
7.根据权利要求4所述的一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述搅拌反应的时间为24h。
8.根据权利要求1-3任意一项所述的一种非病毒纳米粒子在基因分子传递的应用，其特征在于：包括以下步骤：
在无菌环境中，将非病毒纳米粒子加入PBS中，搅拌至完全分散得到非病毒纳米粒子溶液，将目的基因加入非病毒纳米粒子溶液中搅拌至混合均匀，常温孵育2h后得到右旋糖酐-DNA复合物，将右旋糖酐-DNA复合物加入培养有宿主细胞的培养皿，完成转染过程。
9.根据权利要求8所述的一种用于基因分子传递的非病毒纳米粒子的应用，其特征在于：所述非病毒纳米粒子、PBS、目的基因的比例为0.1:10mL:（2-6）μg。
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