CN113082054A - 一种干细胞转染的基因递送载体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种干细胞转染的基因递送载体及其制备方法和用途，具体涉及一种靶向内质网，规避不利于基因递送入核的胞内转运路径且实现有效的溶酶体逃逸，在核周部位响应干细胞内还原性微环境进行基因递送的载体。该基因递送载体由可响应干细胞内微环境降解的连接键，具备溶酶体逃逸功能的侧链和可靶向内质网的侧链组成，通过迈克尔加成反应进行共价连接构建，载体与DNA通过静电作用结合，经能量依赖的内吞方式进入细胞后，靶向内质网，同时规避可能造成基因损失的其他胞内转运途径且实现有效的溶酶体逃逸，在细胞核核周部位还原性微环境下实现降解，从而实现较高的干细胞基因递送效率。

Description

一种干细胞转染的基因递送载体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，涉及一种干细胞转染的基因递送载体及其制备方法和用途，靶向内质网，规避不利于基因递送的胞内转运途径且实现溶酶体逃逸，并且响应干细胞内还原性微环境降解，在核周部位释放基因的基因递送的载体，在干细胞上实现低毒高效的基因递送。
背景技术
干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的未分化细胞，并且在体内长期存活，根据人体需求分化为多种细胞。由于干细胞免疫原性低，具有一定的归巢特性(如肿瘤、炎症部位以及损伤部位等归巢)，另外其所携带的基因可以在体内长期发挥作用。基于以上特性，以基因修饰后的干细胞在神经损伤、组织损伤以及肿瘤等对多种疾病的治疗中具有重要意义。因此，提高基因导入干细胞的效率将有助于促进干细胞基因治疗的发展。
目前的基因递送方法主要包括物理方法以及基因递送载体。物理方法主要包括电穿孔、基因枪、显微注射等，但其对细胞造成的刺激较大，引起严重毒性；基因递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体如慢病毒、腺病毒及逆转录病毒等，其转染效率较高，但是具有较高的免疫原性，基因整合引起致癌风险并且成本较高，因此病毒载体在干细胞基因递送中的应用受到限制；非病毒载体生物相容性好，安全性高且易于大规模生产，然而由于干细胞的细胞增殖速度慢，导致基因入核困难，从而使得基因递送效率较低；并且干细胞受到刺激后，易发生分化，导致细胞性质发生改变而影响进一步的应用。因此在降低毒性的同时，促进基因递送进入细胞核对于设计开发干细胞基因递送载体至关重要。
发明内容
目的：为了解决以上问题，本发明提供一种干细胞转染的基因递送载体及其制备方法和用途，该载体可显著提高干细胞基因递送效率。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种干细胞基因递送载体，所述干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn的化学结构如下：
Figure BDA0002976943640000011
其中，m、n为正整数；linker表示能够响应干细胞内还原性微环境进行生物降解的连接键，X表示可结合基因同时具备溶酶体逃逸功能的侧链，Y表示可靶向内质网的侧链。
所述的干细胞基因递送载体以可响应干细胞内还原性微环境进行生物降解的结构作为连接键，通过迈克尔加成反应，将可结合基因并且具备溶酶体逃逸功能的侧链和可靶向内质网的侧链共价连接形成。
所述干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn靶向内质网且同时规避不利于基因转染的胞内转运路径，并且响应干细胞内还原性微环境降解。
所述的干细胞基因递送载体，Xm-linker-Yn的合成路线如下：
Figure BDA0002976943640000021
由linker提供剂(化合物1)，X-NH2，Y-NH2，经过迈克尔加成反应，通过连接键将可结合基因同时具备溶酶体逃逸功能的侧链X和可靶向内质网的侧链Y共价连接形成。
在一些实施例中，干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn的制备方法，具体如下：
称取linker提供剂，X-NH2，Y-NH2(摩尔比优选为linker:X:Y＝m+n:m:n)于耐压瓶中，加入溶剂搅拌溶解，量取适量的三乙胺(溶剂与三乙胺的体积比优选为10:1)，通氮气保护，60-95℃(优选为90℃)油浴反应，即得。进一步纯化如下：反应结束后用透析袋，透析结束后，将产物水溶液用冷冻干燥机中冻干，制备得到载体Xm-linker-Yn。
进一步的，所述的linker提供剂(化合物1)选自N,N'-双(丙烯酰)胱胺，N,N'-双(丙烯酰)硒代胱胺。
进一步的，所述的X-NH2选自组胺、胍丁胺和精氨酸中的一种或者几种。
进一步的，所述的Y-NH2选自磺胺、4-(2-氨乙基)苯磺酰胺、4-氨基-N-甲基苯磺酰胺中的一种或者几种。
进一步的，所述的溶剂选自无水甲醇或者无水二甲基亚砜中的一种。
进一步的，所述的干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn在制备干细胞基因转染试剂中的应用，用于干细胞基因递送。
进一步的，所述的应用，所述的干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn与基因共孵形成复合物Xm-linker-Yn/基因。
一种基因递送复合物，由所述的干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn与基因共孵形成，命名复合物Xm-linker-Yn/基因。
在一些实施例中，复合物Xm-linker-Yn/基因的制备方法包括：在载体Xm-linker-Yn中涡旋逐滴加入基因，在15℃-35℃的温度中静置孵育15min以上，即得复合物Xm-linker-Yn/基因；
所述基因为DNA、RNA，优选为DNA，包括GFP、P53、PDCD4。
在一些实施例中，复合物Xm-linker-Yn/基因中，加入的Xm-linker-Yn与基因的质量比为30：1。
进一步的，所述干细胞包括：脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞。
有益效果：本发明由可响应干细胞内还原性微环境降解的连接键，可结合基因同时具备溶酶体逃逸功能的侧链和可靶向内质网的侧链组成，通过迈克尔加成反应进行共价连接构建，载体与DNA通过静电作用结合形成复合物，经能量依赖的内吞方式进入细胞后，靶向内质网且规避其他可能造成基因损失的其他胞内转运途径，同时通过溶酶体逃逸减少胞内运输中溶酶体对基因的破坏作用，从而使得尽可能多的有效基因更快速靠近细胞核，增加基因入核，提高干细胞的基因递送效率。
附图说明
图1是本发明按照实施例1制备的基因递送载体Xm-linker-Yn的核磁氢谱图。
图2是本发明按照实施例1制备的基因递送载体Xm-linker-Yn与基因结合情况示意图。
图3是本发明按照实施例4中基因递送复合物CA3S2/DNA的粒径及分布。
图4为本发明按照实施例5中基因递送复合物CA3S2/DNA在还原性环境下的响应性降解。
图5是本发明按照实施例1中基因递送载体CA3S2的细胞毒性实验
图6是本发明按照实施例7中基因递送复合物CA3S2/DNA的转染流式定量实验。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。
本发明以胍丁胺(Agm)作为X-NH2、N,N'-双(丙烯酰)胱胺(CBA)作为linker提供剂、4-(2-氨乙基)苯磺酰胺(ABS)作为Y-NH2为例，则Xm-linker-Yn对应(Agm)m-CBA-(ABS)n,缩写为CAmSn，通过以下的技术方案实现，具体步骤如下：
称取N,N'-双(丙烯酰)胱胺,胍丁胺，4-(2-氨乙基)苯磺酰胺(摩尔比：N,N'-双(丙烯酰)胱胺:胍丁胺:4-(2-氨乙基)苯磺酰胺＝5:3:2)于耐压瓶中，加入3ml无水甲醇搅拌溶解，量取900μL的三乙胺，通氮气保护，90℃油浴反应24h。反应结束后使用0.1M HCl调pH至产物完全溶解，用截留分子量MwCO为500的透析袋透析2天，透析结束后，将产物水溶液用冷冻干燥机中冻干，制备得到载体CA3S2。
实施例1
CA3S2的合成：称取N,N'-双(丙烯酰)胱胺,胍丁胺，4-(2-氨乙基)苯磺酰胺(摩尔比：N,N'-双(丙烯酰)胱胺:胍丁胺:4-(2-氨乙基)苯磺酰胺＝5:3:2)于耐压瓶中，加入3ml无水甲醇搅拌溶解，量取900μl的三乙胺(通氮气保护，90℃油浴反应24h。反应结束后使用0.1M HCl调pH至产物完全溶解，用截留分子量MwCO为500的透析袋透析2天，透析结束后，将产物水溶液用冷冻干燥机中冻干，制备得到载体CA3S2。
实施例2
CA3S2通过核磁氢谱鉴定结构。CA3S2的核磁氢谱谱图上包含以下特征峰：化学位移值1.52-1.70ppm是胍基的亚甲基的特征峰、化学位移值7.34-7.37ppm是4-(2-氨乙基)苯磺酰胺的苯环的氢的特征峰、化学位移值7.77-8.00ppm是N,N'-双(丙烯酰)胱胺的亚甲基的氢的特征峰，并且根据特征峰峰面积的比值计算，胍丁胺与4-(2-氨乙基)苯磺酰胺在聚合物中的的摩尔比1.49，证实了CA3S2的成功合成。结果如图1所示。
实施例3
按照实施例1制备的基因递送载体CA3S2与基因结合能力考察。将CA3S2分别溶解为0.1mg/mL、0.4mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL，并与浓度为0.2mg/mL的DNA溶液等体积混合，室温孵育30min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测基因的结合能力。结果如图2所示。
实施例4
按照实施例1制备的基因递送复合物CA3S2/DNA的粒径及分布。结果如图3所示
实施例5
按照实施例1制备的基因递送复合物CA3S2/DNA在还原性环境下的响应性降解。将制备的基因递送复合物CA3S2/DNA与浓度为20mM二硫苏糖醇(DTT)溶液等体积混合，37℃孵育2h。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA释放情况，同时通过透射电镜(TEM)观察在37℃条件下孵育2h后基因递送复合物CA3S2/DNA的形态变化。结果如图4所示。
实施例6
基因递送载体CA3S2的细胞毒性试验。将脂肪间充质干细胞接种在96孔细胞培养板中培养，当细胞覆盖率达到80％时，将培养基弃去，更换为基因递送载体CA3S2(浓度为20μg/mL-200μg/mL)。在细胞培养箱中培养24小时后，加入噻唑兰(MTT)后再培养4h。然后，弃去培养基，加入150μL DMSO溶解增殖细胞形成的蓝紫色结晶甲臜。最后使用酶标仪测定吸光度计算细胞的增殖情况。结果如图5所示。
实施例7
基因递送复合物CA3S2/DNA的转染流式定量实验。将脂肪间充质干细胞接种于24孔培养板，在含10％胎牛血清的新鲜培养基中培养过夜。然后，用不含胎牛血清的新鲜培养基稀释基因递送复合物CA3S2/DNA(1μg DNA/孔)，与细胞孵育4小时，培养基被1mL含10％胎牛血清的新鲜培养基取代，然后再培养20h。以PEI 25K作为阳性对照组，空白组为阴性对照组组。最后用流式细胞仪定量测定荧光强度。结果如图6所示。

Claims (10)

1.一种干细胞基因递送载体，其特征在于，所述干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn的化学结构如下：
Figure FDA0002976943630000011
其中，m、n为正整数；linker表示能够响应干细胞内还原性微环境进行生物降解的连接键，X表示可结合基因同时具备溶酶体逃逸功能的侧链，Y表示可靶向内质网的侧链。
2.根据权利要求1所述的干细胞基因递送载体，其特征在于，Xm-linker-Yn的合成路线如下：
Figure FDA0002976943630000012
3.根据权利要求2所述的干细胞基因递送载体，其特征在于：化合物1选自N,N'-双(丙烯酰)胱胺，N,N'-双(丙烯酰)硒代胱胺。
4.根据权利要求2所述的干细胞基因递送载体，其特征在于：所述的X-NH2选自组胺、胍丁胺和精氨酸中的一种或者几种。
5.根据权利要求2所述的干细胞基因递送载体，其特征在于：所述的Y-NH2选自磺胺、4-(2-氨乙基)苯磺酰胺、4-氨基-N-甲基苯磺酰胺中的一种或者几种。
6.根据权利要求2所述的干细胞基因递送载体，其特征在于：所述的溶剂选自无水甲醇、无水二甲基亚砜中的一种。
7.如权利要求1-6任一项所述的干细胞基因递送载体在制备干细胞基因转染试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述的干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn与基因共孵形成复合物Xm-linker-Yn/基因。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，复合物Xm-linker-Yn/基因的制备方法包括：在干细胞基因递送载体Xm-linker-Yn中涡旋逐滴加入基因，在15℃-35℃的温度中静置孵育15min以上，即得复合物Xm-linker-Yn/基因；
和/或，所述基因为DNA、RNA，优选为DNA，包括GFP、P53、PDCD4。
10.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述干细胞包括：脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞。
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