CN112229993B - Gm-csf因子作为生物标志物在筛选辅助生殖移植胚胎中的应用及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及GM‑CSF因子作为生物标志物在筛选辅助生殖移植胚胎中的应用及方法，该方法以GM‑CSF因子作为生物标志物，胚胎的囊胚培养液中所述GM‑CSF因子浓度的高低与所述胚胎的移植成功率正相关。移植成功是指筛选出的胚胎移植后能够妊娠，所述妊娠包括HCG阳性、临床妊娠、继续妊娠。所述HCG阳性为移植后11天检测血清或尿液中妊娠标志物HCG为阳性。所述临床妊娠指移植后30天经阴道超声发现宫内妊娠囊。所述继续妊娠为，妊娠超过3个月。该方法还可以与形态学评分结合，GM‑CSF因子的浓度越高且形态学评分质量越优的胚胎移植成功率越高。

Description

GM-CSF因子作为生物标志物在筛选辅助生殖移植胚胎中的应 用及方法

技术领域

本发明涉及辅助生殖领域，具体而言，涉及GM-CSF因子作为生物标志物在筛选辅助生殖移植胚胎中的应用及方法。

背景技术

不孕不育已成为当下十分严峻的重大社会问题，人类辅助生殖技术(AssistedReproductive Technology，ART)是目前治疗不孕不育症最有效的治疗方法。尽管ART技术日趋成熟，但依然存在一些急需解决的难题，如卵子利用率偏低、多胎妊娠率高、平均移植周期数多等。这些问题产生的一个重要原因在于目前ART技术中基于胚胎的形态学评分的移植胚胎挑选方法比较单一，存在主观性强、标准不统一、准确性差等问题。所以据此选择的“优质”胚胎种植率仍较低，仅35％左右，流产率达到15％左右。低的胚胎种植率会增加患者的平均移植周期数，给患者带来巨大的经济和精神压力。与此同时，为提高患者妊娠率，临床医生往往会选择移植2-3个胚胎，这势必会导致多胎妊娠率的提高，目前国内各中心的多胎妊娠率约为30％，众所周知，多胎妊娠对孕妇和子代均存在安全隐患。找到与妊娠结局相关的因子，作为移植胚胎挑选的生物标志物，开展基于生物标志物的移植胚胎无创优选方法，有助于推动目前辅助生殖技术的发展，为患者带来更加精确和优质的治疗。

胚胎生长发育过程中存在普遍的蛋白分泌现象，胚胎分泌蛋白与胚胎的相关功能密切相关。通过对胚胎分泌蛋白进行分析，能够真实客观地反映胚胎的相关功能是否健全。巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种多功能的细胞因子，研究表明在早期胚胎中GM-CSF已有表达，并起到促进囊胚形成，阻止内细胞团凋亡等作用，除此之外GM-CSF还与胚胎植入密切相关，参与妊娠过程母体免疫环境的建立和维持。

Logit模型又称逻辑回归，是离散选择法模型之一。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)，又称为感受性曲线(sensitivity curve)，是以真灵敏性为纵坐标，特异性为横坐标绘制的曲线。而ROC的曲线下面积AUC(Area Under Roc Curve)是一种用来度量分类模型好坏的一个标准。采用上述两种方式评价一个因子的预测价值，其结果客观有效。

尽管GM-CSF因子与妊娠结局的关系已有报道，但目前尚无研究对胚胎条件培养液(embryonic conditioned medium，ECM)GM-CSF浓度进行定量检测，ECM中GM-CSF与妊娠结局的关系尚未建立，也并无研究对ECM中GM-CSF作为生物标志物用于妊娠结局预测或移植胚胎挑选进行报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供GM-CSF因子作为生物标志物在筛选辅助生殖移植胚胎中的应用及方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于筛选辅助生殖移植胚胎的生物标志物，所述生物标志物为GM-CSF因子，所述GM-CSF因子的浓度与辅助生殖胚胎的移植成功率正相关。

进一步，所述GM-CSF因子浓度范围在其最低检出限至487.59fg/mL之间，其浓度与辅助生殖胚胎的移植成功率正相关。

本发明提供一种筛选辅助生殖移植胚胎的方法，所述方法使用如上述的GM-CSF因子作为生物标志物，筛选出胚胎囊胚培养液中GM-CSF因子浓度在高浓度范围内的胚胎，筛选出的所述胚胎具有高的移植成功率。

进一步，所述移植成功指胚胎移植后能够实现妊娠；所述妊娠包括HCG呈阳性、实现临床妊娠以及实现继续妊娠；所述HCG呈阳性为移植后11天检测血清或尿液中妊娠标志物HCG为阳性；所述实现临床妊娠指移植后30天经阴道超声发现宫内妊娠囊；所述实现继续妊娠为，妊娠超过3个月。

进一步，所述GM-CSF因子的高浓度范围为3.72fg/mL～487.59fg/mL。。

进一步，包括如下步骤：

1)收集囊胚培养液：卵子取出后实施受精操作，观察受精情况，将受精卵转移至卵裂期培养液滴中培养，随后被转移至囊胚培养液滴中，胚胎在囊胚培养滴中培养直至形成囊胚，囊胚移植或冷冻后收集囊胚培养液滴；

2)检测所述步骤1)中的囊胚培养液滴中的GM-CSF因子浓度；

3)筛选所述步骤2)中检测的GM-CSF因子浓度在高浓度范围内的胚胎。

进一步，所述步骤1)中，所述受精操作后，等待16～18小时再观察受精情况。

进一步，所述步骤1)中，所述受精卵在卵裂期培养液滴中培养三天，第三天形成D3卵裂期胚胎。

进一步，其特征在于，将所述GM-CSF因子的浓度与形态学评分结合，分别检测胚胎囊胚培养液中GM-CSF因子的浓度和胚胎形态学评分，筛选同时具有高浓度的GM-CSF因子以及高得分的形态学评分的胚胎。

本发明提供一种如上所述的生物标志物的应用，所述GM-CSF因子的浓度用于筛选具有高移植成功率的的胚胎。

本发明的有益效果在于，通过定量检测胚胎囊胚培养液中的GM-CSF因子的浓度，直接预测该胚胎的移植成功率，通过ROC分析评价GM-CSF因子的浓度具有高于现有技术中的形态学评分的预测方法的准确性，因此能够有效预测妊娠结局，并且更具客观性。同时将GM-CSF因子的浓度与现有技术中的形态学评分的预测方法相结合，能够使预测结果更加准确可靠。本发明通过具体的概率统计方法评估了以GM-CSF因子的浓度作为重要指标的预测方法具有高的预测价值。

附图说明

图1为本发明囊胚培养液中不同GM-CSF因子浓度分组的样品所对应的胚胎的HCG阳性率的柱形图；

图2为本发明囊胚培养液中不同GM-CSF因子浓度分组的样品所对应的胚胎的临床妊娠率的柱形图；

图3为本发明囊胚培养液中不同GM-CSF因子浓度分组的样品所对应的胚胎的继续妊娠率的柱形图；

图4为本发明采用囊胚培养液中GM-CSF浓度预测所对应的胚胎HCG为阳性的ROC曲线；

图5为本发明采用囊胚培养液中GM-CSF浓度预测所对应的胚胎临床妊娠的ROC曲线；

图6为本发明采用囊胚培养液中GM-CSF浓度预测所对应的胚胎继续妊娠的ROC曲线；

图7为本发明采用形态学评分预测所对应的胚胎HCG为阳性的ROC曲线；

图8为本发明采用形态学评分预测所对应的胚胎临床妊娠的ROC曲线；

图9为本发明采用形态学评分预测所对应的胚胎继续妊娠的ROC曲线；

图10本发明采用囊胚培养液中GM-CSF浓度结合形态学评分预测所对应的胚胎HCG为阳性的ROC曲线；

图11为本发明采用囊胚培养液中GM-CSF浓度结合形态学评分预测所对应的胚胎临床妊娠的ROC曲线；

图12为本发明采用囊胚培养液中GM-CSF浓度结合形态学评分预测所对应的胚胎继续妊娠的ROC曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明的一种GM-CSF因子作为生物标志物在筛选辅助生殖移植胚胎中的应用及方法，包括如下步骤：

1)收集囊胚培养液：

根据患者自身情况制定相应的促排卵方案，卵子取出后实施常规体外受精(IVF)或卵泡浆内单精子注射(ICSI)，授精操作16～18小时后观察受精情况，将受精卵转移至卵裂期培养液滴中培养至第三天形成D3卵裂期胚胎，D3卵裂期胚胎随后被转移至囊胚培养液滴中，囊胚培养液滴体积定量为30μL，每个培养滴只培养一枚胚胎，胚胎在囊胚培养滴中培养2～3天直至形成囊胚，囊胚移植或冷冻后囊胚培养液滴被收集并在-80℃保存备用。

2)检测囊胚培养液中的GM-CSF因子浓度：

用单分子阵列检测平台(Single Molecule Array，SIMOA)及单分子阵列GM-CSF检测试剂盒检测每一份囊胚培养液样本中的GM-CSF浓度。

上述方法所用仪器和试剂均为现有产品，所使用的检测流程为现有技术，具体流程包括：将囊胚培养液样本转移至试剂盒自带的96孔板中，用试剂盒中稀释缓冲稀释到100微升，之后进行自动化检测。

3)GM-CSF浓度与妊娠结局的关系分析：

根据步骤2)中检测的GM-CSF因子浓度预测辅助生殖妊娠结局及挑选移植胚胎；GM-CSF因子浓度的大小与辅助生殖胚胎移植成功率正相关；选择GM-CSF因子浓度大的胚胎作为移值胚胎。

本发明通过以下实施例对上述方法中GM-CSF因子浓度的大小与辅助生殖胚胎移植成功率正相关的关系进行验证，并通过统计学方法评估了以GM-CSF因子浓度作为主要指标进行预测的方法的预测价值。

实施例1

1)样品的准备及具体评价标准的解释：

本实施例使用上述通过GM-CSF因子的浓度预测辅助生殖胚胎移植成功率及挑选移植胚胎的方法对77个样品进行检测，并根据不同浓度将待测样品分为高浓度、中浓度以及低浓度组，并在同样条件下收集未培养胚胎的6个囊胚培养液滴作为阴性对照组。

本实施例中，待测样品所对应的受试者年龄、BMI、不孕年限、原发不孕比例、子宫内膜厚度等基础条件无显著差异。

本实施例通过SPSS中的卡方检验分析不同分组中妊娠结局的差异，进而得到GM-CSF浓度与移植成功率的关系。移植成功率高是指，筛选出的胚胎移植后能够实现妊娠的可能性大，而妊娠的判定包括三项指标：HCG阳性、实现临床妊娠和实现继续妊娠。其中，

HCG阳性：在胚胎移植11天后检测患者血清或尿液妊娠标志物HCG呈阳性。

临床妊娠：移植后30天经阴道超声发现宫内妊娠囊，视为临床妊娠。

继续妊娠：妊娠超过3个月而未出现流产，视为继续妊娠。

本实施例的所有分析结果中p＜0.05表示有统计学意义。

2)评估GM-CSF浓度在预测妊娠结局中的价值：

分别建立GM-CSF浓度、形态学评分以及GM-CSF浓度结合形态学评分的二元逻辑回归方程作为预测妊娠结局的模型，建立模型使用的软件为SPSS23.0，同时采用ROC曲线分析上述三个模型的预测价值。

GM-CSF浓度预测妊娠结局的模型建立：该模型包括因变量和协变量；因变量为妊娠结局的三项指标，即HCG阳性率、临床妊娠率和继续妊娠率；协变量为GM-CSF浓度。其中，妊娠结局的三项指标的阳性定义为1，阴性定义为0。

GM-CSF浓度的方法检测限为0.5fg/mL，低于该浓度的的样本以该浓度赋值。

形态学评分预测妊娠结局的模型建立：该模型包括因变量和协变量；因变量为妊娠结局的三项指标，即HCG阳性率、临床妊娠率和继续妊娠率；协变量为形态学评分。

其中，妊娠结局为阳性定义为1，阴性定义为0。

本实施例中，形态学评分规则为Gardner评分规则，即根据囊胚腔扩张程度、滋养层和内细胞团细胞数量及排列紧密度对囊胚进行评分，根据形态学评分将胚胎分为4级，其中按照形态学评分1级胚胎质量最优，4级胚胎质量最差。

GM-CSF浓度结合形态学评分预测妊娠结局的模型建立：该模型包括因变量和协变量；妊娠结局的三项指标，即HCG阳性率、临床妊娠率和继续妊娠率；协变量为两个，分别为GM-CSF浓度和形态学评分。

其中，妊娠结局为阳性定义为1，阴性定义为0。

3)检测结果及分析：

本实施例中，在77个样品的检测中，48个样品本能够检测到GM-CSF因子，并且浓度的中位数为7.10fg/mL(1/4位数为2.20fg/mL,3/4位数为14.80fg/mL)；另外29个样品GM-CSF浓度低于方法检测限0.5fg/mL，该29个样品中的GM-CSF因子均视为0.5fg/mL。在6个阴性对照组中，均检测到GM-CSF因子，即空白培养液中也存在GM-CSF因子，其中阴性对照组样品中的GM-CSF因子浓度的中位数为3.72fg/mL(1/4位数为3.58fg/mL,3/4位数为4.05fg/mL)。

根据GM-CSF浓度将样品分成高浓度组、中浓度组以及低浓度组；其中，

高浓度组(n＝30)：检测到的GM-CSF因子浓度高于阴性对照组的浓度的中位数3.72fg/mL；n为样品数量；在该高浓度中，最低浓度为4.64fg/mL，最高浓度为487.59fg/mL；

中浓度组(n＝18)：检测到的GM-CSF因子浓度高于检测限0.5fg/mL，但低于阴性对照组的浓度的中位数3.72fg/mL；n为样品数量；

低浓度组(n＝29)：检测到的GM-CSF因子浓度低于检测限0.5fg/mL；n为样品数量。

对上述各组中的胚胎移植分别进行移植，比较不同浓度组的妊娠结局，其中，HCG阳性率、临床妊娠率和继续妊娠率三项指标均与GM-CSF浓度呈正相关。

具体的，根据附图1～3所示，高浓度组中，各胚胎的HCG阳性率高达86.67％，显著高于低浓度组55.57％；高浓度组中，各胚胎临床妊娠率和继续妊娠率分别为80.00％和73.33％，二者均显著高于中浓度组临床妊娠率50.00％和继续妊娠率38.89％,也显著高于低浓度组临床妊娠率34.48％和继续妊娠率0.69％，因此，高浓度组的胚胎具有高于中浓度组和低浓度组中胚胎移植成功率。各附图中，*p＜0.05，**p＜0.01。

根据上述检测结果可知，本实施例的所有样品中，GM-CSF因子浓度范围与HCG阳性率、临床妊娠率和继续妊娠率三项指标的关系均呈正相关，因此，GM-CSF因子浓度与胚胎的移植成功率正相关。

4)对GM-CSF因子浓度与胚胎移植成功率正相关性的预测价值评价

本实施例采用SPSS软件建立GM-CSF浓度、传统形态学评分以及传统形态学评分结合GM-CSF浓度预测HCG阳性妊娠、临床妊娠和继续妊娠的逻辑回归预测模型，并利用ROC曲线分析各预测模型的预测价值，以评价GM-CSF因子浓度与胚胎移植成功率正相关性的预测价值。具体的评价过程为：

a)建立上述三种模型中妊娠结局的三项指标的逻辑分析公式：

GM-CSF浓度预测妊娠结局的逻辑回归模型的三项指标的逻辑分布公式为如下：

Logit(p＝HCG阳性)＝0.346+106.46×GM-CSF浓度；

Logit(p＝临床妊娠)＝-0.486+145.23×GM-CSF浓度；

Logit(p＝继续妊娠)＝-1.039+154.70×GM-CSF浓度。

形态学评分预测妊娠结局的逻辑回归模型三项指标的逻辑分布公式如下：

Logit(p＝HCG阳性)＝0.442+0.944×评分1级+0.069×评分2级+0.839×评分3级；

Logit(p＝临床妊娠)＝-0.629+2.015×评分1级+0.880×评分2级+1.070×评分3级；

Logit(p＝继续妊娠)＝-1.281+1.974×评分1级+1.281×评分2级+1.368×评分3级。

GM-CSF浓度结合形态学评分预测妊娠结局的逻辑回归模型三项指标的逻辑分布公式分别如下：

Logit(p＝HCG阳性)＝0.014+0.689×评分1级-0.139×评分2级+0.815×评分3级+113.384×GM-CSF浓度；

Logit(p＝临床妊娠)＝-1.350+1.961×评分1级+0.759×评分2级+1.1165×评分3级+148.263×GM-CSF浓度；

Logit(p＝继续妊娠)＝-2.300+2.038×评分1级+1.358×评分2级+1.663×评分3级+159.516×GM-CSF浓度。

ROC分析：绘制上述每个逻辑回归模型的逻辑分布公式对应的ROC曲线，ROC曲线的建立以上述每个预测模型预测妊娠结局的概率值作为检测变量，状态变量为妊娠结局，状态变量值为1。曲线下面积(AUC)作为评估各模型预测价值的指标。上述每个逻辑分布公式所对应的ROC曲线参数如表1所示，ROC曲线图如附图4～12所示。

表1 ROC曲线的统计学参数

根据附图4～6以及表1中的部分数据为GM-CSF浓度预测妊娠结局的预测情况，附图7～9以及表1中的部分数据为形态学评分预测妊娠结局的预测情况；具体可以看出，对于三项妊娠结局指标，GM-CSF浓度预测的曲线下面积(AUC)分别是0.666、0.720以及0.759，均大于形态学评分预测的曲线下面积(AUC)0.609、0.675以及0.676。因此可以说明，GM-CSF浓度对妊娠结局有较好的预测价值，GM-CSF浓度可以作为预测妊娠结局及移植胚胎挑选的生物标志物。

另外，附图10～12以及表1中的部分数据为GM-CSF浓度结合形态学评分预测妊娠结局的预测情况；具体而言，该方法预测三项妊娠结局指标的曲线下面积(AUC)分别是0.703、0.776以及0.791，显著的优于GM-CSF浓度预测妊娠结局的预测情况，因此可以认为，将GM-CSF浓度与传统的形态学评分相结合能够得到更好的预测结果，在传统的形态学评分预测的基础上结合GM-CSF浓度作为生物标志物，能有有效提高挑选移植胚胎的准确性。

通过上述实验结果，本发明还提供了将GM-CSF因子的浓度与形态学评分结合进行胚胎筛选的方法，该方法中，筛选时，分别对胚胎的囊胚培养液中GM-CSF因子浓度和形态学评分进行考察，筛选同时具有高GM-CSF因子浓度和优质胚胎评分的胚胎。

上述方法中，胚胎的形态学评分可以分为4AA，4AB，4BA，4BB，4AC，4CA，4BC，4CB，4CC等级别，其中，没有C的评分为优质胚胎评分，并且其中评分为4AA的胚胎为形态学评分最优的胚胎。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种妊娠结局预测模型的建立方法，其特征在于，包括：

1）收集囊胚培养液：

对卵子实施常规体外受精或卵泡浆内单精子注射，授精操作16~18小时后观察受精情况，将受精卵转移至卵裂期培养液滴中培养至第三天形成D3卵裂期胚胎，D3卵裂期胚胎随后被转移至囊胚培养液滴中，囊胚培养液滴体积定量为30μL，每个培养滴只培养一枚胚胎，胚胎在囊胚培养滴中培养2~3天直至形成囊胚，囊胚移植或冷冻后囊胚培养液滴被收集并在-80℃保存备用；

2）检测囊胚培养液中的GM-CSF因子浓度：

用单分子阵列检测平台及单分子阵列GM-CSF检测试剂盒检测每一份囊胚培养液样本中的GM-CSF浓度；

3）GM-CSF浓度与妊娠结局的关系分析：

GM-CSF因子浓度的大小与辅助生殖胚胎移植成功率正相关；

4）GM-CSF浓度结合形态学评分预测妊娠结局的模型建立：该模型包括因变量和协变量；因变量为妊娠结局的三项指标，即HCG阳性率、临床妊娠率和继续妊娠率；协变量为两个，分别为GM-CSF浓度和形态学评分；

其中，妊娠结局为阳性定义为1，阴性定义为0；

所述形态学评分规则为Gardner评分规则，即根据囊胚腔扩张程度、滋养层和内细胞团细胞数量及排列紧密度对囊胚进行评分，根据形态学评分将胚胎分为4级，其中按照形态学评分1级胚胎质量最优，4级胚胎质量最差；

GM-CSF浓度结合形态学评分预测妊娠结局的逻辑回归模型三项指标的逻辑分布公式分别如下：

Logit HCG阳性概率=0.014+0.689×评分1级-0.139×评分2级+0.815×评分3级+113.384×GM-CSF浓度；

Logit 临床妊娠概率=-1.350+1.961×评分1级+0.759×评分2级+1.1165×评分3级+148.263×GM-CSF浓度；

Logit 继续妊娠概率=-2.300+2.038×评分1级+1.358×评分2级+1.663×评分3级+159.516×GM-CSF浓度；

其中，所述GM-CSF浓度的方法检测限为0.5fg/m，低于该浓度的样本以该浓度赋值；

所述妊娠结局预测模型的建立方法用于非诊断和/或治疗目的。

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