CN112210075A - 一种抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法及其应用，包括：将天然多酚溶解获得天然多酚溶液，与辣根过氧化物酶混合获得反应溶液，对反应溶液进行超声处理，超声频率为40KHz，超声功率为400‑600W，且超声处理在1.6s开/0.4s关的脉冲模式下工作；同时控制反应温度为45‑65℃，反应0.5‑12小时后，将反应溶液进行离心、洗涤即得聚天然多酚纳米材料。本发明简单方便，可调可控，实用性强，对各种天然多酚小分子化合物的大分子化具有普适性。本发明所制备的聚天然多酚纳米材料具有优异的抗氧化性，可有效地在体外与细胞生物两个层面起到优异的抗氧化效果；还可有效加速伤口愈合。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法及其应用。
背景技术
皮肤存在于人体表层，是人体抵御外界侵袭内环境的重要器官，同时也是人体最大的器官，在解剖学与生理学层面上均具有重要的意义，因此皮肤的完整对于人体的健康、安全极为重要。但是在复杂多变的外界环境下，皮肤经常会遭受一定程度的破坏与损伤，破坏皮肤作为人体第一道防线的完整性，轻则引起疼痛、炎症等不良反应，重则可能危害生命安全，因此在皮肤受到损伤后尽快进行修复，保持其完整性，并尽力抑制这一过程中炎症等不良反应的发生显得尤为重要。目前已经有一些研究制备了多种可以用于皮肤创口修复的敷料，对于促进皮肤的修复过程起到了一定的作用。但这些敷料也存在着一些问题，比如对炎症的抑制效果有限、修复速度较慢、修复结果不够完整等等；还有些敷料存在潜在的安全性问题以及敷料制备过程复杂、成本整体较高等问题。因此制备一种有效、安全、简易、廉价、可加速创口修复的创口敷料十分重要。
自然界中存在着许多种类的植物、动物、微生物，这些生物大都存有一定量的多酚组分，广泛的分布使得天然多酚来源广泛、种类丰富，自然存在的多酚就有超过八千种。其中我们日常食用的苹果，葡萄，饮用的茶叶，甚至于人类自身之中都含有许多多酚成分，多酚在生命活动中起到了重要的作用。天然多酚由于其特殊的化学结构，因此具备着丰富的化学性质以及应用前景，其中最为重要的特性即其抗氧化能力，可以有效抑制炎症、清除自由基，且其源于天然，生物相容性十分良好，因此基于天然多酚构筑的材料在生物领域的应用十分广泛。
从植物中提取的多酚大多数为小分子化合物，应用前，需要进行大分子化以消除小分子的不稳定性、渗透性等问题，同时保留天然多酚本身具有的性质以实现有效的功能传递。目前多酚小分子的大分子化方法有氧化、接枝、共聚等，这这些方法一般仅针对某一种或某几种多酚奏效，不具备普适性，无法更为有效的利用自然界中存在的丰富的天然多酚原材料，因此一种通用性强、可控性强、制备方法简便且能实现有效功能传递的大分子化方法仍需要解决。
发明内容
概括来说，天然多酚在自然界广泛存在且具备优异性能，但天然多酚大多为小分子化合物，稳定性较差且具有一定刺激性，因此在投入使用前需进行大分子化。但现有的多酚大分子化方法往往只针对单一多酚奏效，而且不同多酚可能需要分别设计工艺。同时许多方法的实现还需要加入大量的外来物质，这样又降低了多酚本身的功效。所以目前天然多酚大分子产品普遍存在效果较差、制备繁琐、产品单一等问题。
针对上述缺陷，本发明提供了一种具有普适性、可调性、可控性的抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，该方法所制备的聚天然多酚纳米材料具备优异的抗氧化性能与良好的生物相容。
本发明提供的一种抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，包括：
将天然多酚溶解获得天然多酚溶液，与辣根过氧化物酶混合获得反应溶液，对反应溶液进行超声处理，超声频率为20-50KHz,超声功率为400-600W，且超声处理在1-2s开/0.2-0.6s关的脉冲模式下工作；同时控制反应温度为45-65℃，反应0.5-12小时后，将反应溶液进行离心、洗涤即得聚天然多酚纳米材料。
需要说明的是，1-2s开/0.2-0.6s关的脉冲模式指超声以开启1-2s，之后停止0.2-0.6s，以此循环。
作为优选，天然多酚和辣根过氧化物酶的重量份分别为3重量和0.02-0.40重量份。
进一步的，天然多酚为单宁酸、EGCG、原花青素、葡萄籽多酚、石榴皮多酚、茶多酚、红酒多酚、苹果多酚中的一种或多种。
进一步的，天然多酚溶液的溶剂为水、或为水、乙醇的混合物。
当天然多酚为单宁酸、茶多酚、EGCG时，反应溶液的溶剂采用水。
当天然多酚为红酒多酚、石榴皮多酚、葡萄籽多酚、原花青素、苹果多酚时，反应溶液的溶剂采用水、乙醇的混合物，且混合物中水的质量百分比为85％，乙醇的质量百分比为15％。
进一步的，超声处理时所采用的功率和频率优选为400W、40KHz,脉冲模式优选为1.6s开/0.4s关。
作为优选，预先对天然多酚溶液进行2-5分钟的超声处理，以使天然多酚提取物分散均匀，之后再加入辣根过氧化物酶。
本发明方法可得到粒径均一、形貌良好的聚天然多酚抗氧化纳米材料，见图1所示。
所获得的聚单宁酸纳米材料粒径为121-151纳米，所获得的聚红酒多酚纳米材料粒径为142-160纳米，所获得的聚茶多酚纳米材料粒径为159-187纳米，所获得的聚石榴皮多酚纳米材料粒径为184-214纳米，所获得的聚葡萄籽多酚纳米材料粒径为200-218纳米，所获得的聚原花青素纳米材料粒径为225-245纳米，所获得的聚苹果多酚纳米材料粒径为234-288纳米，聚EGCG纳米材料粒径为311-371纳米。
上述制备方法所制备的聚天然多酚纳米材料具有优异的抗氧化性，可有效地在体外与细胞生物两个层面起到优异的抗氧化效果，可用作抗氧剂的用途。
上述制备方法所制备的聚天然多酚纳米材料可有效加速伤口愈合，减少炎症发生，促进组织上皮再生，从而更为有效、迅速、安全的修复受损创口，所以可应用于伤口敷料，来加速皮肤创口修复。
和现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明所采用的多酚原料均为天然提取物，其提取过程自然环保，且价格低廉，安全高效；所采用的辣根过氧化物酶原料也同样来自于辣根的天然提取，提取过程同样绿色环保，且温和高效。
(2)本发明反应体系所处的超声波环境是一种温和、高效、安全的机械力化学作用，对环境不会造成额外的破坏，也不容易引发安全事故，且存在良好的化学效应与剪切力作用，可高效的引发聚合反应。
(3)本发明制备方法可调可控性很强，可以从多个方面对反应过程和所得材料进行调节，包括辣根过氧化物酶的用量、超声作用的功率、超声作用时间等都可以对反应体系进行良好的调节，同时可以对反应体系进行瞬时可控性，将超声作用的开关延展为纳米粒子生长的开关。
(4)本发明所制备的聚天然多酚纳米材料具备十分优异的抗氧化性能，且与细胞具有良好的生物相容性，作用于细胞也具有良好的抗氧化性。
(5)本发明所制备的聚天然多酚纳米材料可应用于皮肤创口的快速修复，有效减少修复时间，减少炎症发生。
综合来说，本发明制备方法可以将多种天然多酚制备成聚天然多酚纳米材料，该制备方法采用一锅法制备，简单方便，可调可控，实用性强，对各种天然多酚小分子化合物的大分子化具有普适性；且绿色环保，成本低廉，应用潜力巨大。
附图说明
图1为本发明方法所合成聚天然多酚纳米材料的台式扫描电镜图；
图2为实施例1-8所得样品的台式扫描电镜图，图中(a)-(h)分别为实施例1-8所得样品的电镜图；
图3为不同用量辣根过氧化物酶合成的聚原花青素纳米粒子的台式扫描电镜图，图中(a)-(d)分别为所采用辣根过氧化物酶溶液的体积分别为50μL、400μL、700μL、1000μL时所合成聚天然多酚纳米粒子的电镜图；
图4为不同超声功率下合成的聚茶多酚纳米粒子的台式扫描电镜图，其中图(a)-(c)分别为在400W、500W、600W的超声功率下所合成聚茶多酚纳米粒子的电镜图；
图5为不同超声时间下合成的聚原花青素纳米粒子的台式扫描电镜图，图中(a)-(h)分别为30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h的超声时间下所合成聚原花青素纳米粒子的电镜图；
图6为聚茶多酚纳米粒子聚合过程中瞬间开关特性示意图；
图7为实施例3所得聚茶多酚纳米材料的电子顺磁共振谱图；
图8为实施例1-8所得样品的DPPH自由基清除能力示意图；
图9为实施例1-8所得样品的ABTS自由基清除能力示意图；
图10为施加不同浓度聚茶多酚纳米材料在24h的细胞活性；
图11为每10000细胞的活性氧荧光强度；
图12为大鼠皮肤在受创后0、5、10、15天的创口面积比例对比图。
具体实施方式
本发明中，在超声波作用下，由于声波空化效应反应溶液会产生一定的双氧水，同时结合可以无差别催化酚类聚合的辣根过氧化物酶，对多酚单体进行催化聚合。辣根过氧化物酶迅速地将超声波产生的双氧水催化为过氧化氢自由基，同时将多酚单体氧化为自由基形式并释放水分子，而后两分子自由基耦合终止。本发明方法可实现多种多酚的无差别聚合，其本质为水溶液的自由基聚合方法，其为一种普适性非常强的制备方法。进一步的，可通过调节酶用量、超声功率及反应时间，来对反应进行调节与控制，从而实现可调、可控地聚多酚纳米材料制备方法。本发明首次将超声机械力用来引发多酚小分子的聚合、组装，提供了一种普适性的抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，并制备出了形貌良好、分布均一的纳米粒子，所获得纳米粒子具有优异的抗氧化能力，可应用于加速皮肤创口愈合。
下面将结合实施例1-8进一步说明本发明的可行性及有益效果，但本发明保护范围显然并不局限于此些具体实施例。
实施例1-8中，天然多酚粉末分别采用单宁酸、红酒多酚、茶多酚、石榴皮多酚、葡萄籽多酚、原花青素、苹果多酚、EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)，均购于南京道斯夫生物科技有限公司；辣根过氧化物酶购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，活性＞300U/mg。
实施例1-8的原料、原料用量、具体反应条件及粒径表征见表1，表1中提供的天然多酚和辣根过氧化物酶的浓度是指在反应溶液中的浓度。
表1实施例1-8的原料配比、反应条件及粒径表征
实施例1-8的制备及表征步骤如下：
(1)按表1所示，称取相应量的天然多酚粉末溶于溶剂中，溶解可为去离子水或为去离子水、乙醇的混合溶剂；超声处理2-5分钟使其分散均匀，此时溶液呈透明状。将反应溶液置于设定的超声工作状态下，调整超声频率及功率对反应溶液进行超声波处理，同时加入相应量的辣根过氧化物酶溶液。采用水浴循环方式控制反应溶液温度，反应温度为45-65℃。
(2)对反应溶液持续进行超声波作用，可以观察到反应过程中，反应溶液由澄清透明逐渐转变为均匀的浑浊液，3-5小时后，得到最终浑浊的反应溶液。
(3)将反应溶液冷却至室温，之后进行离心处理，离心机转速设定为12000-16000r/min，离心机作用时间设定为5-10分钟，最终得到固体物，用去离子水洗涤三次并进行冻干处理，即得最终的纳米材料样品。
(4)对所得样品分别进行台式扫描电镜测试，具体操作方法为：配置2mg/mL的样品溶液旋涂于光滑的云母片表面，经干燥、喷金处理后进行观察，电镜图见图2所示，其中图(a)-(h)分别为实施例1-8所得样品的电镜图，比例尺均为500nm。从电镜图中可直观观察到，所得样品均为纳米尺度，粒子形貌良好，分布均一，且粒子尺寸依次增大。基于所得电镜图分别统计各实施例样品的粒子粒径，并列于表1中，粒径统计数据与直观观察规律一致。
由此表明本发明成功制备了一系列聚天然多酚的纳米材料，进一步表明本发明制备方法的普适性。
进一步的，通过下述几种实施例来验证本发明的可调控性。
①多酚单体采用原花青素，调整辣根过氧化物酶在反应溶液中的浓度，即调整辣根过氧化物酶的用量，其他条件保持不变，合成4种聚原花青素纳米粒子。
具体过程如下：
原花青素粉末充分溶解于去离子水与乙醇的混合溶液中，加入不同量的辣根过氧化物酶溶液,所采用辣根过氧化物酶溶液的浓度为10mg/mL；所加入辣根过氧化物酶溶液的体积分别为50μL、400μL、700μL、1000μL。所得4种反应溶液的溶剂满足去离子水占比85％，乙醇占比15％，反应溶液中，原花青素质量浓度为3mg/mL，辣根过氧化物酶质量浓度为0.02mg/mL，0.16mg/mL，0.28mg/mL，0.40mg/mL。
将超声探头浸没于反应溶液，调整探头至工作状态(功率400W，频率40KHz)对反应溶液进行超声波处理,在1.6s开/0.4s关的脉冲模式下工作。反应时外加水浴装置使反应溶液维持在65℃。经超声波处理一段时间后，观察到反应溶液由棕红色透明逐渐转变为棕色浑浊。经过4h反应，停止超声波作用，将所得四组溶液迅速进行离心处理(离心机转速15000rpm/min,离心时间8min)，将所得棕色沉淀用去离子水洗涤三次，得到由酶调控的4组聚原花青素纳米粒子。
用台式扫描电镜可以观察到4组聚原花青素纳米粒子均为分布均匀、形貌良好的纳米粒子，见图3所示，其中图(a)、图(b)、图(c)、图(d)分别为酶用量为50μL、400μL、700μL、1000μL时所得纳米粒子的电镜图。从图中可以看出，纳米粒子粒径随酶用量增大而增大，分别为：酶用量50μL时粒子粒径为54-74纳米，酶用量400μL时粒子粒径为186-210纳米，酶用量700μL时粒子粒径为225-245纳米，酶用量1000μL时粒子粒径为402-432纳米。
②多酚单体采用茶多酚，调整超声波工作状态，其他条件保持不变，合成3种聚茶多酚纳米粒子。
具体过程如下：
茶多酚粉末溶解于去离子水，加入600μL的辣根过氧化物酶溶液获得反应溶液,所采用辣根过氧化物酶溶液的浓度为10mg/mL；所得反应溶液满足茶多酚质量浓度为3mg/mL，辣根过氧化物酶质量浓度为0.24mg/mL。
将超声探头浸没于反应溶液，调整探头为3种不同功率，分别为400W、500W、600W，频率均为40KHz；探头对反应溶液进行超声波处理,以1.6s开/0.4s关的脉冲模式工作。并外加水浴装置使反应溶液维持在45℃。经超声波处理一段时间后，观察到反应溶液由橙黄色透明逐渐转变为棕黄色浑浊。经过4h反应，停止超声波作用，将所得3组溶液迅速进行离心处理(离心机转速15000rpm/min,离心时间8min)，将所得棕黄色沉淀用去离子水洗涤三次，得到由功率调控的3组聚茶多酚纳米粒子。
用台式扫描电镜可以观察到所得3组聚茶多酚纳米粒子均为分布均匀、形貌良好的纳米粒子，见图4所示，其中图(a)、图(b)、图(c)分别为功率400W、500W、600W时所得纳米粒子的电镜图。从图中可以看出，纳米粒子粒径随超声功率增大而增大，分别为：功率400W时粒子粒径为159-187纳米，功率500W时粒子粒径为192-232纳米，功率600W时粒子粒径为242-284纳米。
③多酚单体采用原花青素，调整超声波作用时间，其他条件保持不变，合成4种聚原花青素纳米粒子。
具体过程如下：
原花青素粉末溶解于去离子水与乙醇的混合溶液，加入300μL的辣根过氧化物酶溶液获得反应溶液,所采用辣根过氧化物酶溶液的浓度为10mg/mL；所得反应溶液满足茶多酚质量浓度为3mg/ml，辣根过氧化物酶质量浓度为0.12mg/ml。
将超声探头浸没于反应溶液，调整探头至工作状态(功率400W，频率40KHz)，对反应溶液进行超声波处理,以1.6s开/0.4s关的脉冲模式工作。并外加水浴装置使反应溶液维持在65℃。经超声波处理一段时间后，观察到反应体溶液由棕红色透明逐渐转变为棕色浑浊，经过不同时间间隔后对反应溶液停止超声波作用，不同的时间间隔为30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，得到8组溶液。将所得8组溶液迅速进行离心处理(离心机转速15000rpm/min,离心时间8min)，并将所得棕色沉淀用去离子水洗涤三次，得到8组聚原花青素纳米粒子。
用台式扫描电镜可以观察到8组聚原花青素纳米粒子均为分布均匀、形貌良好的纳米粒子，见图5所示，其中，图(a)、图(b)、图(c)、图(d)、图(e)、图(f)、图(g)、图(h)分别为30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h的超声时间所得纳米粒子的电镜图。从图5可以观察到，施加超声作用时，粒子会持续生长；撤去超声作用，粒子生长也随之停止，维持在一个相对静态的过程，超声作用的开关可以作为粒子生长的开关对其进行开关调控。当超声时间不大于4h时，随着时间延长，粒子粒径逐渐生长，直至4小时后粒子粒径逐渐趋于稳定。其中前4个小时中4个时间点的粒径分别为：超声0.5小时时粒径为58-70纳米，超声1小时时粒径为93-105纳米，超声2小时时粒径为107-127纳米，超声4小时时粒径为143-159纳米。
④多酚单体采用茶多酚，研究聚合过程中的瞬时开关特性。
具体过程如下：
将75mg茶多酚单体粉末充分溶解于25mL去离子水中，加入500μL的辣根过氧化物酶，所采用辣根过氧化物酶溶液的浓度为10mg/mL；搅拌均匀后将超声探头浸没于反应溶液，调整探头至工作状态(功率400W，频率40KHz)，对反应溶液进行超声波作用处理，以1.6s开/0.4s关的脉冲模式工作；并外加水浴装纸使反应溶液维持在45℃。超声波作用1h后停止作用，取少量反应溶液进行离心处理(离心机转速15000rpm/min,离心时间8min)，并用去离子水进行三次洗涤，剩余反应溶液在常温搅拌作用下维持搅拌。停止作用1h后并取样做同样处理，而后分别在时间点2h时开启，3h时停止，4h时开始，6h时停止，以同样的方式处理剩余反应溶液维持常温搅拌在10h时进行相同离心处理方式，并将所得样品利用动态光散射进行分析，所得电子顺磁共振谱图见图6所示。从图中可以看到聚合过程存在显著的开关瞬时可控性，即施加超声作用时，聚多酚纳米粒子开始生长；当超声作用停止后粒子即同时停止生长，间隔一段时间后当再次恢复超声波作用后粒子可以继续生长。
进一步的，对实施例1-8所得聚天然多酚纳米材料的抗氧化能力、乙醇相自由基清除能力、水相自由基清除能力、细胞抗氧化进行检测。
①抗氧化能力的检测
具体采用电子顺磁共振技术表征抗氧化能力，本具体实施方式中在Bruker EPREMX_Plus仪器上对实施例1-8所得样品进行电子顺磁共振测试，仪器的运行条件为X-band(9.85GHz),得到样品的顺磁共振谱图(0.1mW,100kHz)。图7所示为实施例3所得抗氧化聚茶多酚纳米材料的电子顺磁共振谱图，该电子顺磁共振谱图的纵坐标表示强度，可用来表示羟基自由基的相对含量。从图中可以看出，约3517G处有一信号峰，与许多具有抗氧化能力特别是优异的抗氧化材料黑色素材料的谱图类似，表明实施例3所得抗氧化聚茶多酚纳米材料含有大量的羟基自由基，具备作为抗氧化材料的基础，后面将进一步探索其自由基清除能力。
②乙醇相自由基清除能力的检测
本具体实施方式使用2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)方法评定实施例1-8所得8种聚天然多酚纳米材料样品的乙醇相自由基清除能力。具体操作为：分别制备0.1mM的DPPH乙醇溶液与1mg/mL样品的乙醇相溶液。取300μL DPPH溶液与2600μL乙醇混合均匀，而后加入100μL样品溶液混合均匀开始测定清除速率。利用517nm处的吸光度来评价其清除效果，以评估样品的乙醇相抗氧化能力，检测样品在30分钟后吸光度的变化。8种聚天然多酚纳米材料的DPPH自由基清除能力见图8所示，从图中可以发现，8种聚天然多酚纳米材料均具备良好的自由基清除能力，根据天然多酚种类不同，其清除能力存在着一定的差别。
③水相自由基清除能力的检测
本具体实施方式使用2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)方法评定实施例1-8所得8种聚天然多酚纳米材料样品的水相自由基清除能力。具体操作为：分别制备7mM的ABTS水溶液与2.45mM的过硫酸钾水溶液；将ABTS水溶液与过硫酸钾水溶液以1：2的摩尔比混合，并在室温下静置过夜，并使其处于黑暗状态得到最终的ABTS检测试剂。制备1mg/mL的聚天然多酚纳米材料样品水相溶液，取100μLABTS试剂加入2800μL去离子水并混合均匀，而后加入100μL样品溶液混合均匀开始测定清除速率。利用734nm处的吸光度来评价其清除效果，以评估样品的水相抗氧化能力，检测样品在30分钟后吸光度的变化。实施例1-8所得8种聚天然多酚纳米材料的ABTS自由基清除能力见图9所示，从图中可以发现，8种聚天然多酚纳米材料均具备良好的自由基清除能力，根据天然多酚种类不同，其清除能力存在着一定的差别。
④细胞抗氧化实验
本实验以人脐静脉内皮细胞为细胞株，采用阿尔玛蓝比色法方法验证实施例3所得聚茶多酚纳米材料的细胞毒性。细胞的培养方式为：将10％的胎牛血清(FBS)加入到DMEM培养基中共同孵育，培养的氛围为含有5％的CO2的潮湿气氛，温度维持在37℃。将培养好的细胞以每孔1000个细胞的密度在96孔板中孵育24h,以不同浓度的聚茶多酚纳米粒子样品处理24小时，然后采用阿尔玛蓝比色法检测相应细胞存活率，检测结果见图10所示。根据图10所示检测结果可知，经过聚茶多酚纳米材料的处理后，在所采用的浓度下，细胞活性均较高，且随着聚茶多酚纳米材料施加浓度的提升，细胞活性依次升高，与细胞相容性十分良好。
将上述培养的人脐静脉内皮细胞按10万/孔接种于12孔板，在孔板中孵育24小时。孵育完成后，去掉培养基，加入500μL由DMEM培养基配制的含有聚茶多酚纳米粒子与聚石榴皮多酚纳米粒子，进一步补加500μL全组分培养液以及100μL稀释双氧水(浓度为100μmol/L)。而后去掉培养液，加入200μL胰酶消化细胞并加入200μL培养基以终止胰酶消化作用；进一步离心去除上清液，加入1mLPBS溶液重新悬浮，再加入准备好的探针250μL；最终细胞样品经离心处理后重新悬浮于PBS中，并采用流式细胞仪进行定量分析，分析时间分别为24h，得到如图11所示结果，其纵坐标表示活性氧荧光强度。从图中可以看出相比于空白对照，实验组活性氧荧光强度均有所上升，其中未施加材料的对照组强度最高，施加不同浓度的材料，强度均有所下降，且聚茶多酚纳米粒子组下降更多，表明所施加的聚天然多酚纳米材料对于活性氧均有一定程度的抑制，具备一定的抗氧化能力。
⑤对皮肤创口的修复效果
从上述抗氧化实验可以看出，本发明所合成的聚天然多酚纳米材料在化学层面与细胞层面均具有良好的抗氧化效果，且生物相容性较为良好，因此具备进一步探索其在动物层面的具体应用。本发明将聚天然多酚纳米材料用于大鼠的皮肤损伤修复的动物模型之中，本实验由四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准(批准号为WCHSIRB-D-2017-263)，所有实验操作均按照四川大学实验动物保护和使用指南进行。所选用的动物为健康的雌性大鼠，来自成都硕大动物公司，大鼠体重约为200g。
具体操作为，首先对大鼠的背部毛发进行剔除并消毒，在大鼠背部切开两个直径为15毫米的全厚圆形皮肤创面，将1mg/mL的聚天然多酚纳米材料溶液施加于创口表面，并用透明敷料覆盖创口，进行进一步生物学评估。所选用的聚天然多酚为聚茶多酚纳米粒子与聚石榴皮多酚纳米粒子。在此期间，分别于第0、3、5、8、10、13、15天对大鼠创口进行清创处理并施加聚天然多酚材料，采用拍照的方式记录创口变化过程，并分别取第0、5、10、15天的大鼠创口统计创口面积，统计结果见图12所示。从图中可以观察到，对照组与施加了聚天然多酚纳米材料的组在15天的时间内，创口均逐渐缩小，但施加了聚天然多酚纳米材料的大鼠创口修复速度明显更为迅速，在创伤后第15天创口已基本复原，而对照组仍存在着明显的创口，其中施加聚茶多酚纳米粒子的修复速度更为迅速，效果也更为优异，可见所得聚天然多酚纳米材料对皮肤创口的修复有明显的加速过程，对于受创皮肤的快速修复具有良好的效果。
本发明主要在于提供一种具有普适性的天然多酚纳米化方法，上述实施例中，在超声机械力作用下，从天然多酚小分子出发，合成了一系列不同的聚天然多酚纳米材料。所合成的一系列聚天然多酚纳米粒子均具备优异的抗氧化性能与良好的生物相容性，对加速皮肤创口的修复具有良好的效果。本发明方法具有良好的可调节性，可以通过调节工艺参数来对纳米材料尺度进行调控。
本领域的普通技术人员将会意识到，在本发明各方法实施例中，所述各步骤的序号并不能用于限定各步骤的先后顺序，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，对各步骤的先后变化也在本发明的保护范围之内。这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，其特征是，包括：
将天然多酚溶解获得天然多酚溶液，与辣根过氧化物酶混合获得反应溶液，对反应溶液进行超声处理，超声频率为20-50KHz，超声功率为400-600W，且超声处理在1-2s开/0.2-0.6s关的脉冲模式下工作；同时控制反应温度为45-65℃，反应0.5-12小时后，将反应溶液进行离心、洗涤即得聚天然多酚纳米材料。
2.如权利要求1所述的抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，其特征是：
天然多酚和辣根过氧化物酶的重量份分别为3重量和0.02-0.40重量份。
3.如权利要求1所述的抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，其特征是：
所述天然多酚为单宁酸、EGCG、原花青素、葡萄籽多酚、石榴皮多酚、茶多酚、红酒多酚、苹果多酚中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，其特征是：
所述反应溶液的溶剂为水、或为水、乙醇的混合物。
5.如权利要求4所述的抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，其特征是：
当天然多酚为单宁酸、茶多酚、EGCG时，反应溶液的溶剂采用水。
6.如权利要求4所述的抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，其特征是：
当天然多酚为红酒多酚、石榴皮多酚、葡萄籽多酚、原花青素、苹果多酚时，反应溶液的溶剂采用水、乙醇的混合物，且混合物中水的质量百分比为85％，乙醇的质量百分比为15％。
7.如权利要求1所述的抗氧化聚天然多酚纳米材料的制备方法，其特征是：
预先对天然多酚溶液进行2-5分钟的超声处理。
8.权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备的聚天然多酚纳米材料应用于抗氧化剂的用途。
9.权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备的聚天然多酚纳米材料应用于创伤敷料的用途。
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