CN108310448B - 一种流体明胶止血材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种流体明胶止血材料的制备方法,该制备方法通过采用不参与反应的交联剂EDC或TG酶,交联处理后将明胶进行充分水溶胀,然后粉碎成微米级的颗粒,再通过超声‑离心循环清洗操作可以很好地去除明胶交联剂,达到很好的止血材料纯化效果,有效避免刺激性物质的残留和毒性。而且制得的明胶止血材料具有适宜的流动性和良好的止血效果,降解时间可控,可根据止血位置进行选择性设计,且具有很好的生物安全性。
Description
技术领域
本发明涉及止血材料技术领域,更具体地,涉及一种流体明胶止血材料的制备方法。
背景技术
外科手术过程中常常需要对伤口进行止血和封闭,因此止血材料是非常重要的一类生物医用材料,具有重要的研发和应用意义。目前临床常用的止血材料包括止血纱布、止血海绵、止血敷料、止血微球等。止血纱布、止血海绵在止血过程需要通过对出血创面进行物理压迫,同时对于不规则形状创面、深度创面或狭窄创面并不适用,一些出血位置不明确的伤口、弥漫性渗血伤口,固体形态的材料并不能得到很好的应用。近年来微创手术由于其创伤较小而得到了广泛的应用。但是固体止血材料并不能很好的应用于腔镜手术操作中。
流体类止血制品因其可通过注射器施用到靶部位,具有临床易操作性、适于微创、腹腔手术,近年来渐渐进入临床止血应用。现有技术对液体止血材料有一定的研究报道,其在应用上虽然克服了固体止血材料固体形态的不足,但有效成分多以完全溶解的状态呈现在止血材料中,不能对创面形成很好的压迫作用。另外若液体材料的流动性过强,则在使用过程中存在流到除创面外其他组织的风险,一方面减少了创面部分的止血材料的有效使用量,造成了材料的浪费,另一方面存在对其他组织产生危害的风险。
明胶是一种天然的水溶性的生物可降解高分子材料,其结构与生物体组织结构相似,具有良好的生物相容性,广泛应用于止血材料中。在应用明胶的可降解性时,经常对其进行化学修饰,调控其降解速度以适应不同的需要。调控降解速度的一个主要方式就是通过结构的交联,将线性结构的聚合物交联为三维网络结构,在保持其结构的同时,可以控制材料的降解速度。对于低溶胀的明胶材料,常用戊二醛等作为交联剂,在交联完成后交联剂会存在于最终产品中,在明胶材料后续的降解过程逐步释放,带来刺激性影响或致癌性。
因此,提供一种流体明胶止血材料的制备方法,使得制得的明胶止血材料不仅具有良好的止血效果,而且能够有效降低明胶止血材料中的交联剂含量,提高产品的安全性能,具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种流体明胶止血材料的制备方法,制备过程中有效地去除了交联剂,避免了后期的刺激性影响,且得到的流体明胶止血材料具有很好的止血效果、流动性和溶胀可控性。
本发明的另一目的在于提供一种根据该方法制备的流体明胶止血材料。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:
一种流体明胶止血材料的制备方法,包括如下步骤:
S1. 配制明胶水溶液;
S2. 在上述明胶溶液中加入交联剂,所述交联剂为水溶性碳二亚胺(EDC)或谷氨酰胺转氨酶(TG酶),使其进行交联反应;
S3. 将交联处理后的明胶置于水中进行充分溶胀;
S4. 将步骤S3中溶胀后的明胶分割成小块,然后将其粉碎成微米级的明胶颗粒;
S5. 将所述明胶颗粒置于纯水中进行超声-离心循环清洗;
S6. 将步骤S5处理后的明胶进行低温冷冻,待完全冷冻后进行冷冻干燥;
S7. 将冷冻干燥后的明胶进行二次粉碎,得到粉末状明胶;
S8. 将所述粉末状明胶进行研磨和加水预溶,得到流体明胶止血材料。
本发明的制备方法,不仅工艺简单,而且制得的明胶止血材料具有很好的止血效果、流动性和溶胀可控性。另外,明胶交联是调节明胶降解速度和止血性能的一个主要方式,但明胶交联过程中通常采用戊二醛作为交联剂,且交联结束后交联剂通常无法很好的去除,会带来后期的刺激性影响。本方法通过采用不参与反应的交联剂EDC或TG酶,交联处理后将明胶进行充分水溶胀,然后粉碎成微米级的颗粒,再通过超声-离心循环清洗操作可以很好地去除明胶交联剂,达到很好的止血材料纯化效果,有效避免刺激性物质的残留和毒性。
研磨和加水预溶处理让水和明胶粉末充分混合均匀,达到预溶胀状态,预溶胀过程中水分的增加可以使后续使用过程中产品具有可流动性,且体积溶胀范围变小,体积溶胀率仅为10%左右,同时可以保持较好的止血效果。
优选地,步骤S1中,所述明胶水溶液的质量浓度是5%~50%。
优选地,步骤S2中,交联剂的用量是明胶质量的4%~20%。由于交联剂引发交联反应是非常迅速的,一次性加入交联剂容易导致体系内反应交联度不均,因此进一步优选地,所述交联剂是在在搅拌明胶溶液的过程中加入的,明胶溶液的搅拌速度为100r/min~5000r/min,优选1000r/min,交联剂的加入速度为0.1mL/s ~10mL/s,优选2mL/s,这样使体系交联均匀。
优选地,步骤S4中,所述粉碎采用的是水相物料粉碎机。优选地,粉碎后的明胶颗粒≤500μm,优选≤1μm。这样不仅可以为后续的二次粉碎打下基础,而且在这样微小颗粒的状态下再进行超声-离心循环清洗操作,可以更完全地将交联剂除去。
优选地,步骤S5中,离心的转速为10000r/min~20000r/min,单次离心的时间为5min~10min,超声的频率为25KHz~130KHz,单次超声处理的时间为5min~30min。超声处理可以使存在明胶颗粒内部的交联剂溶出到水中,而离心可以排出水分,因此,通过超声-离心循环清洗可以通过很好地将交联剂除去。
优选地,步骤S6中,所述二次粉碎的粉碎速度为10000r/min~ 40000r/min,粉碎时间为10s~ 5min。
优选地,S8中流体明胶止血材料体系明胶质量分数为20%
优选地,所述制备方法还包括对得到的流体明胶止血材料进行预灌装和辐照灭菌,即可得到可应用于创面上的止血产品。
一种由上述制备方法制备的流体明胶止血材料。
本体系的交联过程中将明胶中的氨基和羧基通过交联剂的作用形成酰胺键,因为体系内酰胺键的增加会使材料的降解过程延长,因此降解时间会随着体系内交联剂的增加而延长,本方法制备的流体明胶止血材料通过控制交联剂的用量,降解时间在1~20周可调。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明提供了一种流体明胶止血材料的制备方法,该制备方法通过采用不参与反应的交联剂EDC或TG酶,交联处理后将明胶进行充分水溶胀,然后粉碎成微米级的颗粒,再通过超声-离心循环清洗操作可以很好地去除明胶交联剂,达到很好的止血材料纯化效果,有效避免刺激性物质的残留和毒性。而且制得的明胶止血材料具有适宜的流动性和良好的止血效果,降解时间可控,可根据止血位置进行选择性设计,且具有很好的生物安全性。
附图说明
图1为实施例1的二次粉碎后的粉末状明胶的浸提液培养细胞24小时后的实验结果。
图2为实施例1的二次粉碎后的粉末状明胶的浸提液培养细胞72小时后的实验结果。
图3为实施例1的流体明胶止血材料用于犬肝脏出血的止血效果图。
图4为实施例1的流体明胶止血材料用于大鼠体内止血8周后的降解结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
一种流体明胶止血材料的制备方法,包括如下步骤:
S1. 取一定质量的明胶,加入一定量的水,置于50℃烘箱中待明胶完全溶解,配置成20%的明胶水溶液;
S2. 取水溶性碳二亚胺(EDC)溶于10ml纯化水中(EDC的质量为明胶质量的10%),在上述明胶溶液中边搅拌边加入交联剂,其中搅拌转速为1000r/min,交联剂的加入速度2mL/s,使其进行交联反应;
S3. 取出烧杯中交联的体相明胶材料,置于另一烧杯中,加入纯化水,浸泡使其充分溶胀;
S4. 将步骤S3中明胶材料完全溶胀后,分割成小块,置于水相物料粉碎机中粉碎,粉碎后的明胶为微米级的饱和溶胀的明胶颗粒;
S5. 将所述明胶颗粒置于纯水中进行超声-离心循环清洗,其中离心转速为15000r/min,单次离心的时间为5min,超声的频率为50KHz,单次超声处理的时间为5min;
S6. 将步骤S5处理后的明胶材料过滤淋洗干净后,平铺置于低温冰箱中冷冻,材料完全冷冻后置于冻干机中冻干,冻干后材料为海绵状;
S7. 将冷冻干燥后的明胶进行二次粉碎,得到粉末状明胶,其中粉碎速度为30000r/min,粉碎时间1min;
S8. 将所述粉末状明胶进行研磨和加水预溶,体系明胶质量分数为20%,得到流体明胶止血材料,灌装于注射器中,辐照备用。
实施例2
S1. 取一定质量的明胶,加入一定量的水,置于50℃烘箱中待明胶完全溶解,配置成20%的明胶水溶液;
S2. 取TG酶溶于10ml纯化水中(TG酶的质量为明胶质量的10%),在上述明胶溶液中边搅拌边加入交联剂,其中搅拌转速为1000r/min,交联剂的加入速度2mL/s,使其进行交联反应;
S3. 取出烧杯中交联的体相明胶材料,置于另一烧杯中,加入纯化水,浸泡使其充分溶胀;
S4. 将步骤S3中明胶材料完全溶胀后,分割成小块,置于水相物料粉碎机中进行粉碎,粉碎后的明胶为微米级的饱和溶胀的明胶颗粒;
S5. 将所述明胶颗粒置于纯水中进行超声-离心循环清洗,其中离心转速为15000r/min,单次离心的时间为10min,超声的频率为100KHz,单次超声处理的时间为10min;
S6. 将步骤S5处理后的明胶材料过滤淋洗干净后,平铺置于低温冰箱中冷冻,材料完全冷冻后置于冻干机中冻干,冻干后材料为海绵状;
S7. 将冷冻干燥后的明胶进行二次粉碎,得到粉末状明胶,粉碎速度为30000r/min,粉碎时间1min;
S8. 将所述粉末状明胶进行研磨和加水预溶,体系明胶质量分数为20%,得到流体明胶止血材料,灌装于注射器中,辐照备用。
性能检测
1、交联剂残留量检测
交联剂残留量的检测采用LC-MS/MS检测,LC-MS/MS采用串联质谱,既能得到分子离子峰,又有碎片离子峰,因而可以用来进行材料的定性和定量分析。分别采用实施例1、实施例2中二次粉碎后的明胶粉末进行检测,交联剂残留量如表1所示,二次粉碎后的明胶粉末其交联剂含量在10ppm以下,可以预见本发明的制备方法可以显著产品降低交联剂含量,大大提升产品的安全性。
表1交联剂含量检测结果
序号 | 分析项目 | 受检样品数量/g | 检测方法 | 检测结果mg/kg |
实施例1 | EDC | 2.1157 | LC-MS/MS | 8.3 |
实施例2 | TG酶 | 1.9830 | LC-MS/MS | 6.5 |
2、止血有效性实验
将实验犬麻醉后,打开犬的腹腔,将犬的肝脏暴露,使用手术刀对犬肝脏位置制造直径为5mm的出血点,暴露十秒钟统计出血量,对照组不进行止血,可见出血位置持续出血;实验组在出血部位打入实施例1的流体明胶止血材料进行止血,可观察到使用止血材料后5秒钟内即可有效止血,且无渗血现象,止血效果显著,如图3所示。
3、细胞毒实验
(1)实验设计
实验组:采用完全培养基:DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗(青霉素和链霉素的混合液),添加浸提液,加入细胞悬液,进行细胞培养。
对照组:采用完全培养基:DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗(青霉素和链霉素的混合液),加入细胞悬液,进行细胞培养。对照组中不添加浸提液,其余细胞培养条件与实验组相同。
空白组:采用完全培养基:DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗(青霉素和链霉素的混合液),空白组中不添加浸提液和细胞悬液,于相同时间放置于与实验组和对照组相同的环境中,以作为实验组和对照组测量吸光度值时的参照。
(2)实验方法
通过浸提液接触培养细胞,以L929为实验细胞,对细胞增殖观察,评价实施例1所制备的流体明胶止血材料对体外细胞的毒性作用。
实验的具体过程如下:
1. 用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗(青霉素和链霉素的混合液))按照0.1g/mL的比例浸提二次粉碎后的粉末状明胶,得到100%浸提液,用100%浸提液进行稀释,可得到75%浸提液和25%浸提液。
2. 采用实施例1的二次粉碎后的明胶颗粒进行浸提液的配制,浸提温度为(37±1)℃,浸提时间为(24±2)h。然后采用完全培养基重悬L929细胞,制得浓度为4×104个细胞/mL的细胞悬液。以96孔平板为培养板,其中实验组和对照组为在培养板中加入上述细胞悬液,每孔加入100μL;空白组为在培养板中每孔加入100μL的完全培养基,不加入细胞悬液。
3. 将实验组、对照组和空白组的培养板置于培养箱中预培养24小时(在37℃,5%CO2条件下)。然后往实验组中加入上述浓度梯度的浸提液,每孔加入100μL,对照组和空白组不加浸提液,之后将各培养板置于培养箱中培养24小时、72小时(在37℃,5%CO2条件下)。然后小心吸出孔内的培养液,再向每孔内加入100μL的CCK-8混合液(由90μL的完全培养基+10μL的CCK-8混合制成),再将培养板置于培养箱中孵育2小时。然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
(3)实验结果
图1、图2为细胞毒实验中,实验组、对照组分别减去空白组后的吸光度值(OD值)。从图上可以看出,用浸提液培养后的细胞增殖率与对照组接近,因此,本发明的流体止血材料具有良好的安全性,对细胞生长无毒副作用。
4、体内降解性实验
选用大鼠进行肝脏植入实验,将大鼠肝脏制造出血点后,利用实施例1的流体明胶进行有效止血,移去多余材料,待无渗血或再出血后闭合大鼠腹腔。八周将大鼠处死后解剖,降解结果如图4所示,发现肝脏部位材料完全降解。
Claims (11)
1.一种流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,由如下步骤组成:
S1.配制明胶水溶液;
S2.在上述明胶溶液中加入交联剂,所述交联剂为水溶性碳二亚胺或谷氨酰胺转氨酶,使其进行交联反应;
S3.将交联处理后的明胶置于水中进行充分溶胀;
S4.将步骤S3中溶胀后的明胶分割成小块,然后将其粉碎成微米级的明胶颗粒;
S5.将所述明胶颗粒置于纯水中进行超声-离心循环清洗;
S6.将步骤S5处理后的明胶进行低温冷冻,待完全冷冻后进行冷冻干燥;
S7.将冷冻干燥后的明胶进行二次粉碎,得到粉末状明胶;
S8.将所述粉末状明胶进行研磨和加水预溶,得到流体明胶止血材料。
2.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,步骤S1中,所述明胶水溶液的质量浓度是5%~50%。
3.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,步骤S2中,交联剂的用量是明胶质量的4%~20%。
4.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,步骤S2中,所述交联剂是在在搅拌明胶溶液的过程中加入的,明胶溶液的搅拌速度为100r/min~5000r/min,交联剂的加入速度为0.1mL/s~10mL/s。
5.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,步骤S4中,所述粉碎采用的是水相物料粉碎机。
6.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,步骤S4中,粉碎后的明胶颗粒≤500μm。
7.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,步骤S4中,粉碎后的明胶颗粒≤1μm。
8.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,步骤S5中,离心的转速为10000r/min~20000r/min,单次离心的时间为5min~10min,超声的频率为25kHz~130kHz,单次超声处理的时间为5min~30min。
9.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,步骤S6中,所述二次粉碎的粉碎速度为10000r/min~40000r/min,粉碎时间为10s~5min。
10.如权利要求1所述流体明胶止血材料的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括对得到的流体明胶止血材料进行预灌装和辐照灭菌。
11.一种由权利要求1至10任一项所述制备方法制备的流体明胶止血材料。
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