CN112203509A - 冷冻损伤抑制方法和冷冻损伤预防用组合物 - Google Patents

冷冻损伤抑制方法和冷冻损伤预防用组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供即使在低温下长时间保存脏器等生物材料的情况下也能够抑制冷冻损伤的方法或冷冻损伤预防用组合物。本发明涉及一种生物材料的冷冻损伤抑制方法，其中，包括抑制生物材料的由鞘氨醇‑1‑磷酸(S1P)介导的信号转导系统；以及，本发明涉及一种冷冻损伤预防用组合物，其含有抑制由S1P介导的信号转导系统的物质作为有效成分。

Description

冷冻损伤抑制方法和冷冻损伤预防用组合物
技术领域
本发明涉及抑制生物材料冷冻损伤的方法、冷冻损伤预防用组合物、生物材料的低温保存方法和保存液。
背景技术
目前，由于心脏、肺、肝脏、胰腺、肾脏和小肠等非代偿性的脏器衰竭、恶性肿瘤，除脏器移植以外，预后改善无望的患者数量众多。
在移植医疗最为盛行的北美，每年有5万人的移植等待登记者的脏器，其中实际能够享受移植医疗的低于10％。此外，毎年因非代偿性的脏器损伤而死亡的患者为70万人以上，未进行等待登记而死亡的患者中也推测存在潜在的移植适合者。
供体不足的最大原因无疑是脑死亡供体的绝对性不足，但供体的选择中除组织适合度以外，还要考虑对脏器的获取时间等，因此尽管存在优先顺位高的适合受体，但是在大于保存时间的上限那样的情况下，因脏器状态的恶化等而导致脏器被废弃，保存时间的延长无疑是针对供体不足的有效且不浪费的方法。特别是，心脏、肺等保存时间有时短至数小时，摘除的脏器的废弃率超过70％。
各国进行了脏器保存的研究，标准方法20年以上未发生变化，是使用脏器保护液的低温保存(专利文献1和2)，各脏器的低温保存可耐受的时间为保存时间的上限。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2010-239963号公报
专利文献2：日本特表2010-529053号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
如果能够保存为了脏器移植而摘除的脏器的时间变长，则可将更多患者作为移植对象。因此，要求开发即使长时间保存也不损伤脏器的保存方法。
作为长时间保存脏器这样的生物材料的方法之一，进行低温下的保存，如果低温保存时间超过一定时间，则发生超过保护效果的组织损伤。该组织损伤被称为冷冻损伤或冷藏/复温损伤(以下，也将其简称为“冷冻损伤”)，由于该冷冻损伤，移植中可使用脏器的低温保存时间的上限由脏器确定。
本发明，在一个方式中，提供在低温下长时间保存脏器等生物材料的情况下也能够抑制冷冻损伤的方法、冷冻损伤预防用组合物、生物材料的低温保存方法和保存液方法以及生物材料的冷冻损伤预防用组合物。
用于解决问题的技术方案
本发明，在一个或多个实施方式中，涉及生物材料的冷冻损伤抑制方法或低温保存方法，其包括抑制生物材料的由鞘氨醇-1-磷酸(S1P)介导的信号转导系统。
本发明，在一个或多个实施方式中，涉及冷冻损伤预防用组合物或生物材料保存液，其含有抑制由S1P介导的信号转导系统的物质(S1P信号转导系统抑制物质)作为有效成分。
附图说明
图1是表示实施例1中，在化合物1或2的存在下，评价低温下培养源自人肝癌的细胞株HepG2时的冷冻损伤抑制效果的结果的示例的图表。
图2是表示实施例2中，在化合物1的存在下，评价低温下培养源自人肝癌的细胞株HepG2、人脐带静脉血管内皮细胞株HUEhT-2或Flp-InTM CHO细胞时的冷冻损伤抑制效果的结果的示例的图表。
图3表示实施例3中，改变低温保存的细胞与化合物1接触的时机而评价冷冻损伤抑制效果的结果的示例。
图4是表示实施例4中，低温保存(4℃、24小时)后，移植的大鼠的心脏的存活心肌面积和纤维化面积的示例的图表。
图5是表示实施例5中，在化合物1或3～7的存在下，评价低温下培养源自人肝癌的细胞株HepG2时的冷冻损伤抑制效果的结果的示例的图表。
具体实施方式
本发明在一个方式中，基于以下新的见解，即，S1P受体(S1PR)抑制剂、鞘氨醇激酶(SPHK)抑制剂等S1P信号转导系统抑制物质能够抑制细胞、脏器等低温保存时可能发生的冷冻损伤。
此外，本发明在一个方式中，基于以下新的见解，即，与S1PR抑制剂或SPHK抑制剂接触后或在接触的同时低温保存脏器等生物材料，由此能够抑制低温保存时可能发生的冷冻损伤的同时长时间保存该生物材料。
作为本发明中的“生物材料的由S1P介导的信号转导系统的抑制”，在一个或多个实施方式中，可举出S1PR的功能抑制、S1P与S1PR的相互作用的抑制、S1P的生成抑制、S1PR的生成抑制或S1P的功能抑制等。生物材料的由S1P介导的信号转导系统的抑制，在一个或多个实施方式中，可通过使生物材料与抑制由S1P介导的信号转导系统的物质接触而进行。作为由S1P介导的信号转导系统的抑制物质，在一个或多个实施方式中，可举出S1PR拮抗剂等S1PR抑制物质、S1P生成抑制物质、SPHK抑制物质、S1P与S1PR的相互作用抑制物质或S1P功能的抑制物质等。
本发明中“冷冻损伤”是指因在细胞、脏器等生物材料暴露于低温下而导致细胞受到的损伤。冷冻损伤在一个或多个实施方式中，冷冻损伤引起细胞的存活能力降低、细胞死亡等。本发明中“低温”是指例如不低于0℃的低温，在一个或多个实施方式中，可举出0～4℃。本发明中，作为“冷冻损伤的预防”，在一个或多个实施方式中，包括抑制冷冻损伤、防止冷冻损伤以及减少冷冻损伤等。本发明中，作为“抑制冷冻损伤”，在一个或多个实施方式中，可举出细胞的存活能力降低的抑制、细胞死亡的抑制等。本发明，在一个或多个实施方式中，可优选应用于低温保存时发生冷冻损伤的生物材料、不适合低温保存的生物材料、或者即使能够低温保存也难以长时间低温保存的生物材料。作为本发明中的“长时间”，因保存的生物材料的种类等而不同，在一个或多个实施方式中，是指与以往的低温保存方法中的能够保存的时间相比更长的时间，特别是在非限定的一个或多个实施中，是指以往的低温保存方法中的能够保存的时间的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上的时间。
作为生物材料，在一个或多个实施方式中，可以举出人或除人以外的哺乳类等动物或源自该动物的生物材料。作为生物材料，在一个或多个实施方式中，可举出脏器、组织、器官、个体、细胞、体液、输血制剂和细胞片(cell sheet)等。作为器官和脏器，在一个或多个实施方式中，可举出心脏、血液、皮肤、隔膜、角膜、肝脏、血管、肾脏、脑、眼球、脾脏、卵巢、肺、肠、神经、胎盘、脐带或视网膜等。作为个体，可举出人或除人以外的哺乳类等动物。作为体液，在一个或多个实施方式中，可举出血液和精液等。
[冷冻损伤预防用组合物]
本发明，在一个或多个实施方式中，涉及冷冻损伤预防用组合物(本发明的冷冻损伤预防用组合物)，其含有抑制由S1P介导的信号转导系统的物质作为有效成分。本发明的冷冻损伤预防用组合物，在一个或多个实施方式中，可抑制生物材料的低温保存时可能发生的冷冻损伤。本发明的冷冻损伤预防用组合物，在一个或多个实施方式中，可用于移植中使用的脏器等生物材料的保存液或灌流液。本发明中的冷冻损伤预防，在一个或多个实施方式中，可包括抑制冷冻损伤和防止冷冻损伤。
根据本发明，可抑制因低温保存时的冷冻损伤导致的生物材料的状态的恶化，因此能够以更长时间低温保存，能够更长时间保持生物材料的新鲜度。
[有效成分]
本发明的冷冻损伤预防用组合物含有S1P信号转导系统抑制物质作为有效成分。作为S1P信号转导系统抑制物质，如上所述，在非限定的一个或多个实施方式中，可举出S1PR抑制化合物和SPHK抑制化合物等。
S1PR抑制化合物，在一个或多个实施方式中，是指在体外和体内的至少一者中的公知的S1PR抑制测定体系中，添加该化合物的情况的S1PR的活性与不添加该化合物的对照相比，例如可抑制至60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下或10％以下的化合物。上述测定体系中，添加的物质的量，在一个或多个实施方式中，为0.01-10μM。S1PR抑制化合物，在一个或多个实施方式中，对S1PR的5种受体(S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4和S1PR5)中的至少一者具有抑制活性即可，也可以对5种均具有抑制活性。
SPHK抑制化合物，在一个或多个实施方式中，是指在体外和体内的至少一者中的公知的SPHK抑制测定体系中，添加该化合物的情况的SPHK的活性与不添加该化合物的对照相比，例如可抑制至60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下或10％以下的化合物。上述测定体系中，添加的物质的量，在一个或多个实施方式中，是0.01-10μM。
作为本发明的冷冻损伤预防用组合物的有效成分使用的S1PR抑制化合物，在一个或多个实施方式中，可举出下述式(I)或式(I')表示的化合物。因此，本发明的冷冻损伤预防用组合物，作为其他方式，包含下述式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐作为有效成分。
【化学式1】
Figure BDA0002790520240000061
式(I)和(I')中，
X1是N或CR5，
R1和R2各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基、C1-8烷基氨基磺酰基、硝基或氰基，或者，R1和R2与由a和b标记的原子一起形成取代或未取代的芳香环、或者、取代或未取代的芳杂环，
R3、R4和R5各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基、C1-8烷基氨基磺酰基、硝基或氰基，
Z是
【化学式2】
Figure BDA0002790520240000062
R6为-C(＝O)R10或-CH2R11，R10和R11为取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、取代或未取代的芳杂环基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或取代或未取代的C1-8烷基，或者R12和R13与相邻的氮原子一起形成取代或未取代的含氮杂环基，
R7为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R8为O或NR14，R14为氢原子、取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、或者取代或未取代的芳杂环基，
R9为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
标记波浪线的结合键表示与式(I)或(I')表示的化合物的键合部分。
式(I')和Z中，标记*的碳-氮间的双键表示具有立体异构和几何异构等结构异构体的双键。通过该双键，式(I)和(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐中，作为基于上述碳-氮间的双键的几何异构体，可包括仅(E)、仅(Z)、(E)与(Z)的混合状态、或立体不确定的状态。
作为R1、R2、R3、R4和R5中的卤素原子，在一个或多个实施方式中，可举出氟原子、氯原子、溴原子或碘原子，优选为氟原子、氯原子或溴原子，更优选为氯原子。
作为R1、R2、R3、R4和R5中的C1-8烷基，在一个或多个实施方式中，可举出碳原子数1～8的直链状或支链状烷基、或者碳原子数3～7的环状烷基。作为C1-8烷基，在一个或多个实施方式中，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-丙基戊基、正己基、环戊基或环己基等。
作为R1、R2、R3、R4和R5中的卤素原子取代的C1-8烷基，在一个或多个实施方式中，可举出氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、2-氯-1,1-二甲基乙基等，优选为三氟甲基。
作为R1、R2、R3和R4中的C1-8烷氧基，在一个或多个实施方式中，可举出碳原子数1～8的直链状或支链状的烷氧基、或者碳原子数3～6的环状烷氧基。作为C1-8烷氧基，在一个或多个实施方式中，可举出甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、2-丙基戊氧基、正己氧基、环戊氧基或环己氧基等，优选为甲氧基。
作为R1、R2、R3、R4和R5中的C2-8炔基，在一个或多个实施方式中，可举出具有不饱和三键的碳原子数2～6的直链状、支链状或环状的烃基。作为C2-8炔基，在一个或多个实施方式中，可举出乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基或4-甲基-1-戊炔基等，优选为乙炔基。
作为R1、R2、R3、R4和R5中的C1-8烷基磺酰基，在一个或多个实施方式中，可举出甲磺酰基或乙磺酰基等，优选为甲磺酰基。
作为R1、R2、R3、R4和R5中的C1-8烷基氨基磺酰基，在一个或多个实施方式中，可举出二甲基氨基磺酰基或二乙基氨基磺酰基等。
R1和R2可以与由a和b标记的原子一起形成取代或未取代的芳香环或者取代或未取代的芳杂环。作为芳香环，在一个或多个实施方式中，可举出苯基或萘等基团。作为芳杂环基，在一个或多个实施方式中，可举出包含1个或2个氧、氮或硫原子等的5～7元的芳香环，例如可举出呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基或嘧啶基等。作为芳香环和芳杂环的取代基，在一个或多个实施方式中，可举出卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、或C1-8烷氧基等。
X1为N或CR5，优选为N或CH。
R6为-C(＝O)R10或-CH2R11，优选为-C(＝O)R10。R10和R11为取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、取代或未取代的芳杂环基、或者-NR12R13。
作为R10和R11中的取代或未取代的C2-8烷基，在一个或多个实施方式中，可举出未取代或具有取代基的碳原子数2～8的直链状或支链状的烷基、或者未取代或具有取代基的碳原子数3～7的环状烷基。作为C2-8烷基，在一个或多个实施方式中，可举出乙基、正丙基、异丙基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-丙基戊基、正己基、环戊基或环己基等，优选为正丁基、叔丁基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基。作为取代基，在一个或多个实施方式中，可举出卤素原子或C1-8烷氧基等。
作为R10和R11中的取代或未取代的苯基和取代或未取代的芳杂环基，在一个或多个实施方式中，可举出未取代或在任意位置具有1～3个取代基的苯基、以及未取代或在任意位置具有1～3个的取代基的芳杂环基。作为芳杂环基，在一个或多个实施方式中，表示包含1个或2个氧、氮或硫原子等的5～7元的芳香环，例如可举出呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基等，优选为呋喃基、噻吩基或吡啶基。作为取代基，在一个或多个实施方式中，可举出卤素原子或C1-8烷氧基等。
作为R10和R11中的取代或未取代的C2-8烷氧基，在一个或多个实施方式中，可举出未取代或具有取代基的碳原子数2～8的直链状或支链状的烷氧基、或者未取代或具有取代基的碳原子数3～6的环状烷氧基。作为C2-8烷氧基，在一个或多个实施方式中，可举出乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、2-丙基戊氧基、正己氧基、环戊氧基或环己氧基等，优选为乙氧基。作为取代基，在一个或多个实施方式中，可举出卤素原子或C1-8烷氧基等。
R12和R13中，取代或未取代的C1-8烷基中的C1-8烷基与R1、R2、R3、R4和R5表示的C1-8烷基相同。作为R12和R13，在一个或多个实施方式中，优选为氢原子或叔丁基。
在R12和R13与相邻的氮原子一起形成取代或未取代的含氮杂环基的情况下，作为含氮杂环，在一个或多个实施方式中，可举出5～7元的饱和杂环或不饱和杂环。作为含氮杂环，在一个或多个实施方式中，可举出吡咯环、吡咯烷环、吡唑环、三唑环、哌嗪环、哌啶环等，优选为哌啶环。作为取代基，在一个或多个实施方式中，可举出卤素原子、C1-8烷基、苯基或C1-8烷氧基等。
R7为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基。作为取代基，在一个或多个实施方式中，可举出氢原子、卤素原子、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基等。R7在一个或多个实施方式中，优选为由卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基或乙炔基取代的苯基、苯基、吡啶基、卤素原子取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基，更优选为卤素原子取代的苯基。
R8为O或NR14，R14为氢原子、取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、或者取代或未取代的芳杂环基。R8优选为O。
R9为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基。作为取代基，在一个或多个实施方式中，可举出氢原子、卤素原子、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基等。R9在一个或多个实施方式中，优选为吡啶基或卤素原子取代的吡啶基。
本发明中“取代或未取代的”是指未取代或被取代基取代。取代基的数量没有特别限定，可以为1个，也可以为相同或不同的2个或3个以上的多个。
如上述所示，式(I)或式(I')表示的化合物，在一个或多个实施方式中，可包含具有立体异构的碳-氮间的双键。因此，作为式(I)或式(I')表示的化合物，在一个或多个实施方式中，可举出
【化学式3】
Figure BDA0002790520240000101
上述式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7如上述所示。
式(I)或式(I')表示的化合物，在一个或多个实施方式中，可举出
【化学式4】
Figure BDA0002790520240000111
上述式中，
R1、R2、R3和R4各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、乙基、异丙基、丙基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基，优选为氢原子、氯原子、氟原子、溴原子、三氟甲基、乙炔基或异丙基。
R7为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，优选为由卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基或乙炔基取代的苯基、或者苯基。
R9为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基。
R10为正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的呋喃基、乙氧基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或叔丁基，R12和R13与相邻的氮原子一起形成哌啶环，优选为正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、1-乙基丙基或2,2-二甲基丙基。
R15和R16各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基，优选为甲基。
式(I)或式(I')表示的化合物，在一个或多个实施方式中，可举出
【化学式5】
Figure BDA0002790520240000121
上述式中，
R2、R3和R4各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、乙基、异丙基、丙基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基，优选为氢原子或卤素原子，更优选为氢原子或氯原子。优选R2、R3和R4中的1个为卤素原子，剩余的两个为氢原子。
R10为取代或未取代的C2-8烷基或者取代或未取代的C2-8烷氧基，优选为正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基、正丙基、异丙基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-丙基戊基、正己基，优选为正丁基、叔丁基、异丁基或仲丁基。
R17和R18各自独立为氢原子或卤素原子，优选为卤素原子，更优选为氯原子或氟原子。
作为式(I)或式(I')表示的化合物的一个或多个实施方式，可举出以下化合物。
【化学式6】
Figure BDA0002790520240000131
作为式(I)或式(I')表示的化合物的一个或多个实施方式，可举出以下化合物。
【化学式7】
Figure BDA0002790520240000132
【化学式8】
Figure BDA0002790520240000141
式(I)或式(I')表示的化合物，在存在手性碳原子的情况和/或存在立体异构体的情况下，在一个或多个实施方式中，为各异构体的混合物或分离的异构体。立体异构体的特别非限定的一个或多个实施方式中，可举出顺反异构体。
本发明中“制药上可接受的盐”是指药理上和/或医药上可接受的盐，可举出无机酸盐、有机酸盐、无机碱盐、有机碱盐、酸性氨基酸盐或碱性氨基酸盐等。作为无机酸盐，在一个或多个实施方式中，可举出盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等。作为有机酸盐，在一个或多个实施方式中，可举出乙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、硬脂酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。作为无机碱盐，在一个或多个实施方式中，可举出钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土金属盐、铝盐、铵盐等。作为有机碱盐，在一个或多个实施方式中，可举出二乙胺盐、二乙醇胺盐、葡甲胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐等。作为酸性氨基酸盐，在一个或多个实施方式中，可以举出天冬氨酸盐、谷氨酸盐等。作为碱性氨基酸盐，在一个或多个实施方式中，可举出精氨酸盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐等。
本发明中“化合物的盐”中，可以包括因化合物在大气中放置而可能吸收水分形成的水合物。此外，本发明中“化合物的盐”中也可以包括化合物可能吸收其他某种的溶剂形成的溶剂化物。
本发明的冷冻损伤预防用组合物在一个或多个实施方式中，含有上述抑制化合物作为有效成分，进一步可以包含医药可接受的载体、防腐剂、稀释剂、赋形剂或其他医药可接受的成分。
本发明的冷冻损伤预防用组合物，在一个或多个实施方式中，可以为液体，也可以为固体。在本发明的冷冻损伤预防用组合物为液体的情况下，在一个或多个实施方式中，还可以包含生理食盐水、细胞培养液、缓冲液、输液、脏器等的保存液或灌流液等。作为细胞培养液，在一个或多个实施方式中，可举出DMEM或MEM等。作为缓冲液，在一个或多个实施方式中，可举出磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、TRIS缓冲液或HEPES缓冲液等。作为输液，在一个或多个实施方式中，可举出电解质输液、营养输液、糖质输液、氨基酸输液、葡萄糖液、林格氏液、乙酸林格氏液或乳酸林格氏液等。作为保存液或灌流液，在一个或多个实施方式中，可举出UW液、Bretschneider液、Bretschneider's HTK液、Euro-Collins液、St.Thomas'Hospital液或ET-Kyoto液等。
本发明的冷冻损伤预防用组合物，在一个或多个实施方式中，可作为脏器和输血制剂等这类的生物材料的保存用组合物和保存液使用。
因此，本发明，作为其他方式，涉及生物材料的保存用组合物、保存液或灌流液，其含有S1P信号转导系统抑制化合物作为有效成分。本发明的保存用组合物、保存液或灌流液，在一个或多个实施方式中，可包含式(I)或式(I')表示的化合物或它们的制药上可接受的盐作为有效成分。
作为本发明的保存液或灌流液中的有效成分即S1P信号转导系统抑制化合物的浓度，在非限定的一个或多个实施方式中，是可抑制生物材料的冷冻损伤的浓度，可举出0.001～150μM、0.01～100μM或0.1～100μM。
式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐可抑制冷冻损伤。因此，本发明，作为其他方式，涉及冷冻损伤预防用组合物，其含有式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐作为有效成分。有效成分的含量、冷冻损伤预防用组合物的方式和其他成分等如上述所示。
[生物材料的冷冻损伤抑制方法]
本发明，在一个或多个实施方式中，涉及生物材料的冷冻损伤抑制方法(本发明的冷冻损伤抑制方法)，其包括抑制生物材料的由S1P介导的信号转导系统。根据本发明的冷冻损伤抑制方法，在一个或多个实施方式中，可抑制生物材料的低温保存时可能发生的细胞的存活能力降低、细胞死亡等。生物材料如上述所示。
本发明的冷冻损伤抑制方法，在一个或多个实施方式中，包括将生物材料低温保存。低温保存，在一个或多个实施方式中，包括在不低于0℃的低温下保存，优选包括在0～4℃下保存。
信号转导系统的抑制，在一个或多个实施方式中，包括使生物材料与抑制S1P的信号转导系统的物质接触。抑制S1P的信号转导系统的物质如上述所示，在一个或多个实施方式中，可举出S1PR抑制化合物和SPHK抑制化合物等。作为S1PR抑制化合物，在一个或多个实施方式中，可举出上述式(I)或式(I')表示的化合物。
作为进行信号转导系统的抑制的时机，在一个或多个实施方式中，可举出低温保存开始前、低温保存开始同时或低温保存期间等。
信号转导系统的抑制，在一个或多个实施方式中，可以通过在包含S1P信号转导系统抑制化合物的溶液中，浸渍生物材料而进行，也可以通过将该溶液在生物材料上涂布、添加、滴加或喷雾而进行。本发明的冷冻损伤抑制方法，在没有特别限定的一个或多个实施方式中，包括在包含上述式(I)或式(I')表示的化合物的溶液中浸渍生物材料。该溶液，在一个或多个实施方式中，除有效成分即S1P信号转导系统抑制化合物或式(I)或式(I')表示的化合物以外，可以包含生理食盐水、细胞培养液、缓冲液、输液、脏器等的保存液或灌流液等。
在生物材料为脏器或器官的情况下，本发明的冷冻损伤抑制方法，在一个或多个实施方式中，可以包括进行利用包含式(I)或式(I')表示的化合物的保存液或灌流液的灌流、浸渍、冲洗、注入和它们的组合。
式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐可抑制冷冻损伤。因此，本发明，作为其他方式，涉及生物材料的冷冻损伤抑制方法，其包括使式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐或含有它们的组合物与生物材料接触。生物材料与式(I)或式(I')表示的化合物等的接触，在一个或多个实施方式中，可以通过在包含式(I)或式(I')表示的化合物等的溶液中浸渍生物材料而进行，也可以通过将该溶液在生物材料上涂布、添加、滴加或喷雾而进行。
[生物材料的保存方法]
本发明，在一个或多个实施方式中，涉及生物材料的保存方法(本发明的保存方法)，其包括将与S1P信号转导系统抑制化合物中的至少一者接触的生物材料在低温下保存。根据本发明的保存方法，在一个或多个实施方式中，可在抑制冷冻损伤的同时低温保存生物材料。根据本发明的保存方法，能够以更长时间低温保存，因此可更长时间保持生物材料的新鲜度。本发明的保存方法，在一个或多个实施方式中，可用于移植中使用的脏器等生物材料的保存等。
本发明的保存方法中，生物材料与S1P信号转导系统抑制化合物的接触，从充分抑制冷冻损伤，能够更长时间在低温下保存的观点出发，在一个或多个实施方式中，在低温下的保存前进行，或在低温下的保存开始的同时进行。本发明的保存方法，在一个或多个实施方式中，可以包括在使生物材料与S1P信号转导系统抑制化合物接触的同时在低温下保存。保存温度，在一个或多个实施方式中，不低于0℃的低温即可，可举出0～4℃。生物材料与S1P信号转导系统抑制化合物的接触，在一个或多个实施方式中，可以通过在包含S1P信号转导系统抑制化合物的溶液中浸渍生物材料而进行，也可以通过将该溶液在生物材料上涂布、添加、滴加或喷雾而进行。在生物材料为脏器或器官的情况下，生物材料与S1P信号转导系统抑制化合物的接触，在一个或多个实施方式中，可以通过进行包含式(I)或式(I')表示的化合物的保存液或灌流液的灌流、浸渍、冲洗、注入和它们的组合而进行。
式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐可抑制冷冻损伤。因此，本发明，作为其他方式，涉及生物材料的保存方法，其包括将与式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐或含有它们的组合物接触的生物材料在低温下保存。生物材料与式(I)或式(I')表示的化合物等的接触以及生物材料的保存温度等如上述所示。
即，本发明可涉及以下一个或多个实施方式；
[A1]一种生物材料的冷冻损伤抑制方法，其包括抑制生物材料的由S1P介导的信号转导系统。
[A2]根据[A1]记载的冷冻损伤抑制方法，其中，上述信号转导系统的抑制包括使上述生物材料与抑制S1P的信号转导系统的物质接触。
[A3]根据[A2]记载的冷冻损伤抑制方法，其中，上述抑制S1P的信号转导系统的物质选自S1PR抑制化合物和SPHK抑制化合物。
[A4]根据[A1]～[A3]中任一项记载的冷冻损伤抑制方法，其中，包括低温保存上述生物材料；
上述信号转导系统的抑制包括低温保存前进行，或者，在低温保存开始的同时进行。
[A5]根据[A3]记载的冷冻损伤抑制方法，其中，上述S1PR抑制化合物是下述式(I)表示的化合物、下述式(I')表示的化合物或它们的制药上可接受的盐，
【化学式9】
Figure BDA0002790520240000191
【化学式10】
Figure BDA0002790520240000192
式(I)和(I')中，
X1为N或CR5，
R1和R2各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基，或者，R1和R2与由a和b标记的原子一起形成取代或未取代的芳香环，或者，取代或未取代的芳杂环，
R3、R4和R5各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基，
Z为
【化学式11】
Figure BDA0002790520240000201
R6为-C(＝O)R10或-CH2R11，R10和R11为取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、取代或未取代的芳杂环基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或取代或未取代的C1-8烷基，或者R12和R13与相邻的氮原子一起形成取代或未取代的含氮杂环基，
R7为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R8为O或NR14，R14为氢原子、取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、或者取代或未取代的芳杂环基，
R9为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基。
[A6]根据[A5]记载的冷冻损伤抑制方法，其中，上述式(I)和式(I')表示的化合物为
【化学式12】
Figure BDA0002790520240000202
R1、R2、R3和R4各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、乙基、异丙基、丙基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基，
R7为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R9为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R10为正丁基、叔丁基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的呋喃基、乙氧基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或叔丁基，或者，R12和R13与相邻的氮原子一起形成哌啶环，
R15和R16各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基。
[A7]根据[A5]或[A6]记载的冷冻损伤抑制方法，其中，上述式(I)和(I')表示的化合物为
【化学式13】
Figure BDA0002790520240000211
[A8]根据[A1]～[A7]中任一项记载的冷冻损伤抑制方法，其中，上述生物材料选自脏器、组织、细胞、体液、输血制剂和细胞片。
[A9]一种冷冻损伤预防用组合物，其含有抑制由S1P介导的信号转导系统的物质作为有效成分。
[A10]根据[A9]记载的冷冻损伤预防用组合物，其中，上述物质为下述式(I)表示的化合物、式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐，
【化学式14】
Figure BDA0002790520240000212
【化学式15】
Figure BDA0002790520240000221
式(I)和(I')中，
X1为N或CR5，
R1和R2各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基，或者，R1和R2与由a和b标记的原子一起形成取代或未取代的芳香环，或者，取代或未取代的芳杂环，
R3、R4和R5各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基，
Z为
【化学式16】
Figure BDA0002790520240000222
R6为-C(＝O)R10或-CH2R11，R10和R11为取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、取代或未取代的芳杂环基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或者取代或未取代的C1-8烷基，或者，R12和R13与相邻的氮原子一起形成取代或未取代的含氮杂环基，
R7为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R8为O或NR14，R14为氢原子、取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、或者取代或未取代的芳杂环基，
R9为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基。
[A11]根据[A10]记载的冷冻损伤预防用组合物，其中，上述式(I)和(I')表示的化合物为
【化学式17】
Figure BDA0002790520240000231
R1、R2、R3和R4各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、乙基、异丙基、丙基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基，
R7为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R9为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R10为正丁基、叔丁基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的呋喃基、乙氧基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或叔丁基，或者，R12和R13与相邻的氮原子一起形成哌啶环，
R15和R16各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基。
[A12]一种冷冻损伤预防用组合物，其含有下述化合物作为有效成分。
【化学式18】
Figure BDA0002790520240000241
[A13]一种生物材料的低温保存方法，其包括抑制生物材料的由S1P介导的信号转导系统。
[A14]一种生物材料保存液，其含有抑制由S1P介导的信号转导系统的物质作为有效成分。
[A15]根据[A14]记载的保存液，其中，上述物质为[A9]～[A11]中任一项规定的化合物。
[B1]一种生物材料的冷冻损伤抑制方法，其包括使生物材料与[A9]～[A11]中任一项规定的式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐或含有它们的组合物接触。
[B2]根据[B1]记载的冷冻损伤抑制方法，其中，包括低温保存上述生物材料；
上述接触包括低温保存前进行，或者，在低温保存开始的同时进行。
[B3]根据[B1]或[B2]记载的冷冻损伤抑制方法，其中，上述生物材料选自脏器、组织、细胞、体液、输血制剂和细胞片。
[B4]一种冷冻损伤预防用组合物，其含有[A9]～[A11]中任一项规定的式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐作为有效成分。
[B5]一种生物材料的低温保存方法，其包括使生物材料与[A9]～[A11]中任一项规定的式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐或含有它们的组合物接触。
[B6]一种生物材料保存液，其含有[A9]～[A11]中任一项规定的式(I)或式(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐作为有效成分。
实施例
以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但它们是例示性的，本发明不限定于这些实施例。应予说明，本发明中引用的文献全部作为本发明的一部分而并入。
[制造例]
按照下述方案，合成化合物1和3～7。
【化学式19】
Figure BDA0002790520240000251
合成的化合物1和3～7的图谱数据(1H-NMR和MS)如以下所示。
【表1】
Figure BDA0002790520240000261
下述实施例1～4中，使用化合物1和化合物2。化合物1和2已知作为S1PR拮抗剂。此外，报告化合物1对S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4和S1PR5均具有抑制活性，其选择性依照S1PR3、S1PR1、S1PR4、S1PR5和S1PR2的顺序变高。化合物2可基于公知的方法合成。
化合物1
【化学式20】
Figure BDA0002790520240000262
N-(4-氯苯基)-N'-(4-氯苯基氨基)-3,3-二甲基-2-氧代丁脒(N-(4-Chlorophenyl)-N'-(4-chlorophenylamino)-3,3-dimethyl-2-oxobutanamidine
化合物2
【化学式21】
Figure BDA0002790520240000271
N-(2,6-二氯-4-吡啶基)-2-[1,3-二甲基-4-(1-甲基乙基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基]-肼甲酰胺(N-(2,6-dichloro-4-pyridinyl)-2-[1,3-dimethyl-4-(1-methylethyl)-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-6-yl]-hydrazinecarboxamide)
[实施例1：冷冻损伤抑制效果的评价1]
下述工序中，评价在化合物1或2的存在下，在低温下培养源自人肝癌的细胞株HepG2时的冷冻损伤抑制效果。
以达到80-90％的密度的方式在37℃下培养HepG2细胞之后，替换为预先添加化合物1或2的4℃的培养基(DMEM)，在低温孵育箱内在4℃下培养24小时。在24小时的低温下的培养后再次利用37℃的培养基复温，观察1小时后的基于利用阿尔玛蓝TM(alamarBlueTM)的酶活性的细胞的活力。化合物浓度设为0M(溶媒)至50μM，观察化合物的浓度依赖性。将其结果的示例示于图1。
如图1所示，通过在化合物1或2的存在下低温保存，低温保存时的细胞的存活能力降低，浓度依赖地得到改善，可抑制冷冻损伤。此外，S1PR受体抑制化合物即化合物1和2，除低温保存时以外(例如，常温保存时)，即使对细胞给药也未显示毒性。
在添加有SPHK抑制剂的培养基中，在低温(4℃)下培养5天永生化人脐带静脉血管内皮细胞株HUEhT-21，其结果，与对照(未添加SPHK抑制剂的培养基)中低温培养的情况相比，可抑制恢复至37℃后的细胞的存活能力降低。
[实施例2：冷冻损伤抑制效果的评价2]
下述工序中，评价在化合物1的存在下，在低温下培养源自人肝癌的细胞系HepG2、人脐带静脉血管内皮细胞系HUEhT-2或Flp-InTM CHO细胞时的冷冻损伤抑制效果。
以达到80-90％的密度的方式在37℃下培养细胞之后，替换为预先添加溶媒(Vehicle)或10μM的化合物1的4℃的培养基，在低温孵育箱内在4℃下培养。利用37℃的培养基复温，通过1小时后的利用阿尔玛蓝TM(alamarBlueTM)的酶活性观察细胞的活力，观察低温保存时间与活力的关系。将其结果的示例示于图2。
如图2所示，通过在化合物1的存在下低温保存，在任一细胞株中低温保存时的细胞的存活能力降低均得到改善，可抑制冷冻损伤。特别是，对于HUEhT-2和Flp-InTM CHO，在对照(溶媒)中如果低温保存时间超过3天或10天，则存活率降低至20％，与此相对，通过在化合物1的存在下低温保存，即使低温保存期间为15天，其存活率也超过50％。即，通过在化合物1的存在下低温保存，可确认到能够大幅延长低温保存时间。
[实施例3：冷冻损伤抑制效果的评价3]
下述工序中，改变使低温保存的细胞与化合物1接触的时机，评价冷冻损伤抑制效果。
以达到80-90％的密度的方式在37℃下培养细胞之后，替换为4℃的培养基，在低温孵育箱内在4℃下培养。Pre处理组在低温保存的1小时前至即将低温保存前使用添加10μM化合物1的培养基，Pre+CS处理组在低温保存的1小时前至即将CS(冷储存)期间的复温前使用添加10μM化合物1的培养基，CS处理组在与CS同时作用至即将复温前使用添加10μM化合物1的培养基，REW(复温)在复温至37℃同时使用添加10μM化合物1的培养基。除此之外的时间，利用图3所示组成的培养基(无化合物1)培养。利用37℃的培养基复温，通过1小时后的利用阿尔玛蓝TM(alamarBlueTM)的酶活性观察细胞的活力。将其结果的示例示于图3。
如图3所示，在低温保存后恢复至常温(37℃)的时机，在培养基中添加化合物1的情况下，无法充分抑制冷冻损伤(存活能力降低)，与此相对，在进行低温保存前或与低温保存的开始同时在培养基中添加化合物1，由此可抑制低温保存导致的冷冻损伤(存活能力降低)。
[实施例4：冷冻损伤抑制效果的评价4]
将作为供体的7-8周龄的LEW大鼠在全身麻醉下开胸开腹，露出心脏后，将上腔静脉、下腔静脉结扎，进一步切离肺动脉、主动脉，从主动脉弓部利用溶媒或添加有10μM的化合物1的4℃的UW液灌流，结扎切离肺静脉，摘除心脏。在溶媒或添加有10μM的化合物1的4℃的UW液内浸渍，在4℃下进行24小时的冷冻保存。将作为受体的7-8周龄的LEW大鼠在全身麻醉下开腹而露出腹部大动脉、大静脉时，将冷冻保存的心脏从UW液取出，将供体肺动脉和大动脉分别与受体的腹部大静脉在大动脉端侧吻合，而进行异体性移植，缝合。摘除移植后1周的心脏，利用Masson's trichrome染色，比较存活心肌面积和纤维化面积(各自N＝5)。其结果的示例示于图4。
如图4所示，与溶媒相比，化合物1给予组中存活的心肌多，纤维化少。根据该结果，可以说能够通过在化合物1的存在下进行冷冻保存，可抑制冷冻损伤，24小时冷冻保存后的心脏为更适合于移植的状态。
[实施例5：冷冻损伤抑制效果的评价5]
使用按照上述方案合成的化合物1和3～7，评价在各化合物的存在下在低温下培养源自人肝癌的细胞系HepG2时的冷冻损伤抑制效果。
以达到80-90％的密度的方式在37℃下培养HepG2细胞之后，替换为预先添加化合物1和3～7中任一者的4℃的培养基(DMEM)，在低温孵育箱内在4℃下培养24小时。在24小时的低温下的培养后，再次利用37℃的培养基复温，观察1小时后的基于利用阿尔玛蓝TM(alamarBlueTM)的酶活性的细胞的活力。化合物浓度设为0M(溶媒)至50μM，观察化合物的浓度依赖性。将其结果的一例示于图5。
如图5所示，通过在化合物1和3～7的存在下低温保存，低温保存时的细胞的存活能力降低，浓度依赖地得到改善，可抑制冷冻损伤。
[实施例6：冷冻损伤抑制效果的评价6]
除使用下述化合物8～10之外，与实施例1同样评价冷冻损伤抑制效果。
【化学式22】
Figure BDA0002790520240000301
其结果，与化合物1相比活性略差，但通过在化合物8～10的存在下低温保存，低温保存时的细胞的存活能力降低，浓度依赖地得到改善，可抑制冷冻损伤。

Claims (15)

1.一种生物材料的冷冻损伤抑制方法，其特征在于，包括：
抑制生物材料的由鞘氨醇-1-磷酸(S1P)介导的信号转导系统。
2.根据权利要求1所述的冷冻损伤抑制方法，其中，
所述信号转导系统的抑制包括使所述生物材料与抑制S1P的信号转导系统的物质接触。
3.根据权利要求2所述的冷冻损伤抑制方法，其中，
所述抑制S1P的信号转导系统的物质选自S1P受体(S1PR)抑制化合物和鞘氨醇激酶(SPHK)抑制化合物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的冷冻损伤抑制方法，其中，
所述冷冻损伤抑制方法包括低温保存所述生物材料；
所述信号转导系统的抑制包括在低温保存前进行，或者，在低温保存开始的同时进行。
5.一种生物材料的冷冻损伤抑制方法，其特征在于，包括使下述式(I)表示的化合物、下述式(I')表示的化合物或它们的制药上可接受的盐与生物材料接触，
Figure FDA0002790520230000011
式(I)和式(I')中，
X1为N或CR5，
R1和R2各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基，或者，R1和R2与由a和b标记的原子一起形成取代或未取代的芳香环、或者取代或未取代的芳杂环，
R3、R4和R5各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基，
Z为
Figure FDA0002790520230000021
R6为-C(＝O)R10或-CH2R11，R10和R11为取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、取代或未取代的芳杂环基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或者取代或未取代的C1-8烷基，或者，R12和R13与相邻的氮原子一起形成取代或未取代的含氮杂环基，
R7为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R8为O或NR14，R14为氢原子、取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、或者取代或未取代的芳杂环基，
R9为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基。
6.根据权利要求5所述的冷冻损伤抑制方法，其中，
所述式(I)或式(I')表示的化合物为
Figure FDA0002790520230000022
R1、R2、R3和R4各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、乙基、异丙基、丙基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基，
R7为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R9为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R10为正丁基、叔丁基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的呋喃基、乙氧基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或叔丁基，或者，R12和R13与相邻的氮原子一起形成哌啶环，
R15和R16各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的冷冻损伤抑制方法，其中，
所述S1PR抑制化合物为权利要求5或6规定的式(I)或(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的冷冻损伤抑制方法，其中，
所述生物材料选自脏器、组织、细胞、体液、输血制剂和细胞片。
9.一种冷冻损伤预防用组合物，其特征在于，含有抑制由鞘氨醇-1-磷酸(S1P)介导的信号转导系统的物质作为有效成分。
10.一种冷冻损伤预防用组合物，其特征在于，将下述式(I)表示的化合物、下述式(I')表示的化合物或它们的制药上可接受的盐作为有效成分，
Figure FDA0002790520230000031
式(I)中，
X1为N或CR5，
R1和R2各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基，或者，R1和R2与由a和b标记的原子一起形成取代或未取代的芳香环、或者取代或未取代的芳杂环，
R3、R4和R5各自独立为氢原子、卤素原子、C1-8烷基、卤素原子取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8炔基、C1-8烷基磺酰基或氰基，
Z为
Figure FDA0002790520230000041
R6为-C(＝O)R10或-CH2R11，R10和R11为取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、取代或未取代的芳杂环基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或者取代或未取代的C1-8烷基，或者，R12和R13与相邻的氮原子一起形成取代或未取代的含氮杂环基，
R7为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R8为O或NR14，R14为氢原子、取代或未取代的C2-8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C2-8烷氧基、或者取代或未取代的芳杂环基，
R9为取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、喹啉基或异喹啉基。
11.根据权利要求10所述的冷冻损伤预防用组合物，其中，
所述式(I)或式(I')表示的化合物为
Figure FDA0002790520230000042
R1、R2、R3和R4各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、乙基、异丙基、丙基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基，
R7为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R9为由选自卤素原子、三氟甲基、氰基、甲氧基和乙炔基中的1个或2个以上的取代基取代的苯基、苯基、由1个或2个以上的卤素原子取代的吡啶基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R10为正丁基、叔丁基、1-乙基丙基、2,2-二甲基丙基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的呋喃基、乙氧基、或者-NR12R13，R12和R13各自独立为氢原子或叔丁基，或者，R12和R13与相邻的氮原子一起形成哌啶环，
R15和R16各自独立为氢原子、卤素原子、甲基、三氟甲基、氰基、甲氧基、乙酰基、甲磺酰基或乙炔基。
12.根据权利要求9所述的冷冻损伤预防用组合物，其中，
所述抑制由S1P介导的信号转导系统的物质为权利要求10或11规定的式(I)或(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐。
13.一种生物材料的低温保存方法，其特征在于，包括：
抑制生物材料的由鞘氨醇-1-磷酸(S1P)介导的信号转导系统。
14.一种生物材料保存液，其特征在于，含有抑制由鞘氨醇-1-磷酸(S1P)介导的信号转导系统的物质作为有效成分。
15.一种生物材料保存液，其特征在于，含有权利要求10或11规定的式(I)或(I')表示的化合物或其制药上可接受的盐作为有效成分。
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