CN112195248A - lncRNA DLEU1作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用 - Google Patents

lncRNA DLEU1作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及lncRNA DLEU1作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用。本发明通过生物信息学方法筛选出在胶质瘤组织中高表达的IncRNA DLEU1，进一步分析发现其表达水平与患者生存率及预后密切相关，并在大量临床肿瘤组织样本上得到验证。同时通过细胞实验，发现敲除IncRNA DLEU1可抑制替莫唑胺诱导的自噬，促进细胞凋亡，进而增加胶质瘤细胞U87、U251对替莫唑胺的药物敏感性。本发明的提出将为胶质瘤治疗提供新的诊断、治疗及预后预测靶点，并为改善患者替莫唑胺耐药提供新的分子标志物。

Description

lncRNA DLEU1作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分 子靶点的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及lncRNA DLEU1作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用。
背景技术
胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发恶性肿瘤。据WHO统计，每年超过1100万人口确诊为胶质瘤，胶质瘤患者普遍表现为高复发率、高致残率、高死亡率及低治愈率的特征。目前临床上常用的胶质瘤治疗手段为手术、放疗、化疗及基因治疗等，其中化疗为重要辅助手段。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)能够有效改善胶质瘤患者的生存预后，为对抗恶性胶质瘤的必要首选化疗药物。但仍有部分胶质瘤患者对替莫唑胺治疗表现为原发性或继发性耐药，导致化疗失败。替莫唑胺耐药机制复杂，MGMT介导的DNA修复是目前研究较为充分的耐药发生机制，但临床上部分患者使用MGMT抑制剂后并不能改善替莫唑胺治疗不敏感的问题，这说明MGMT并非介导替莫唑胺耐药的唯一途径。因此，深入探究替莫唑胺耐药发生的机制，以最大程度的发挥替莫唑胺治疗作用，可为胶质瘤患者实行个体化精准用药提供理论依据。
发明内容
本发明专利由中国国家自然科学基金(No.82060680，81860664)以及江西省自然科学基金(NO.20202BABL216080，20192BAB215063)资助。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了lncRNA DLEU1作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，lncRNA DLEU1在制备调节肿瘤对替莫唑胺类药物敏感性的药物中的应用。
本发明还披露了lncRNA DLEU1在非诊断目的的作为肿瘤替莫唑胺耐药检测、治疗和/或预后分子靶点的应用。
本发明还披露了lncRNA DLEU1的表达干扰试剂在制备提高肿瘤对替莫唑胺类药物敏感性的药物中的应用。
进一步地，所述干扰试剂包括lncRNA DLEU1 siRNA，序列为siRNA1-DLEU1：CGTTGGAGGTAAACAAATA，SEQ ID NO.5；或siRNA2-DLEU1：GAGTCACAATGCAGACAAA，SEQ IDNO.6。
进一步地，所述肿瘤包括胶质瘤。
本发明还披露了一种肿瘤对替莫唑胺类药物耐药检测或生存预后检测试剂盒，包括RNA逆转录试剂gDNA Eraser、5×gDNA Era Buffer、RNsae Free dH2O、RT primer Mix、5×primescript Buffer、Primescript RT Enzyme Mix，荧光定量PCR试剂TB green、ddH2O及针对lncRNA DLEU1设计的引物，所述引物序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明运用生物信息学方法，提取TCGA数据库中胶质瘤及正常脑组织的RNA seqraw count数据，筛选得到有差异表达的lncRNA，并进行生存分析。进一步采用GO及KEGG通路分析，并通过RT-qPCR检测我院收集的108例胶质瘤组织及16例脑外伤组织中检测lncRNADLEU1的表达情况，结果显示lncRNA DLEU1在胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织，同时运用Kaplan-Meier生存分析及log-rank检验分析IncRNA DLEU1表达量与胶质瘤患者总生存期的相关性，结果表明lncRNA DLEU1表达较高的患者具有更短的生存期，预后更差(HR＝1.703，95％CI:1.133-2.917，p＝0.0159)，与TCGA分析结果一致。
进一步的，采用MTS实验、克隆形成实验、流式细胞仪检测凋亡实验、划痕实验及Transwell实验，考察lncRNA DLEU1对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，结果显示，沉默lncRNA DLEU1可抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
进一步的，通过MTS实验、Hochest染色及流式细胞仪检测凋亡实验，考察lncRNADLEU1对U87、U251细胞替莫唑胺(TMZ)药物敏感性的影响。结果显示沉默lncRNADLEU1可显著提高胶质瘤细胞对TMZ的药物敏感性。
更进一步的，通过Western-blot实验及检测自噬小体，考察lncRNA DLEU1是否通过诱导自噬影响替莫唑胺耐药。结果显示沉默lncRNA DLEU1可影响自噬标志蛋白表达以及自噬小体数量。
本发明通过检测胶质瘤中lncRNA DLEU1表达水平，制备相应的胶质瘤早期诊断试剂盒、生存预后及替莫唑胺耐药检测试剂盒，该试剂盒中含有定量检测lncRNA DLEU1的RNA转录水平的试剂、定量检测lncRNA DLEU1蛋白表达水平的试剂等。通过检测患者胶质瘤组织中lncRNA DLEU1表达水平，预测患者生存预后以及替莫唑胺耐药情况。
附图说明
图1是TCGA数据库中筛选胶质瘤组织中差异表达的lncRNA DLEU1，结果显示与正常组织相比，胶质瘤组织中有16个基因上调，78个基因下调；
图2是log-rank检验评估以上10个IncRNA与患者预后的关系，结果显示lncRNADLEU1、LOC00132111以及HOTAIR与患者预后密切相关；
图3是GO及KEGG进一步分析以上10个IncRNA的潜在功能，并验证lncRNA DLEU1在胶质瘤组织中的表达情况，以及其表达水平与患者生存的关系，结果显示lncRNA DLEU1在胶质瘤中高表达，其表达水平越高，预后越差；
图4是沉默lncRNA DLEU1对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药的影响。结果显示：lncRNADLEU1被干扰后，胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性显著增加；
图5是证明lncRNA DLEU1通过自噬影响细胞对替莫唑胺的药物敏感性；
图6是lncRNA DLEU1在胶质瘤中介导替莫唑胺药物敏感性的作用机理结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了lncRNA DLEU1作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用，具体如下各实施例所示。本发明中收集的108例胶质瘤组织及16例脑外伤组织样本及相关临床信息获取自江西省肿瘤医院。lncRNA DLEU1干扰片段、Hoechst实验、MTS实验及流式细胞凋亡实验等相关试剂均为市售。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明内容。下列实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照标准条件实施如《分子克隆实验指南》(第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1胶质瘤中差异表达的IncRNA筛选
1、TCGA数据库分析筛选IncRNA
方法：将TCGA数据库中胶质瘤及正常脑组织的RNA seq raw count数据提取并分析，从中筛选出已知长链非编码RNA的表达值，通过绘制聚类图及火山图探究TCGA数据库中胶质瘤组织内差异表达的lncRNA。
结果：与正常脑组织相比，在胶质瘤组织中共鉴定出94条差异表达的lncRNA，其中上调的长链非编码RNA共16条，下调的共78条(图1A-C)。
2、分析lncRNA表达与胶质瘤患者生存率的情况
方法：单变量Cox回归分析胶质瘤组织中差异表达的94个基因表达情况与患者总生存率的关系。
结果：显示有10个IncRNA与生存率密切相关(表1)。
表1单变量Cox回归分析胶质瘤组织中差异表达的10个基因表达情况与患者总生存率的关系
Figure BDA0002775278080000041
3、分析lncRNA表达与胶质瘤患者预后的情况
方法：log-rank检验评估以上10个IncRNA与患者预后的关系。
结果：lncRNA DLEU1、LOC00132111以及HOTAIR与患者预后密切相关(图2)。
4、功能分析
方法：GO及KEGG功能富集分析。
结果：以上10个lncRNA的靶基因与错配修复、黏附连接、胶质瘤、胰岛素抵抗等过程相关(图3A-B)。
5、临床样本验证
方法：采用RT-qPCR法对在我院收集的108例胶质瘤组织及16例脑外伤组织检测lncRNA DLEU1的表达情况。
本实施例公开的一种胶质瘤lncRNA DLEU1诊断检测方法，采取胶质瘤患者肿瘤组织或正常脑组织，按照说明书操作步骤进行提取总RNA，浓度为150-1000ng/μl，将提好的总RNA反转录为cDNA，并将剩余的RNA保存于-80℃。
(1)逆转录反应如下：
①体系1(去除基因组DNA)
Figure BDA0002775278080000051
反应条件：42℃，2min，4℃，+∞
②体系2(逆转录)
Figure BDA0002775278080000052
将反应结束后的体系1直接加入体系2，混匀，反应条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃，+∞
(2)逆转录产物的操作
用于RT-qPCR分析，将以上cDNA混匀，吸取2μl配制反应体系如下：
Figure BDA0002775278080000053
Figure BDA0002775278080000061
反应条件采用两步法PCR标准扩增程序：
第一步：变性 95℃ 30s
第二步：PCR反应 95℃ 5s，60℃ 30s；40个循环
第三步：溶解曲线 95℃ 10s，65℃ 5s
引物浓度调整为10μM，以GAPDH为内参，按照2-ΔCt法计算相对表达量。
其中检测lncRNA DLEU1基因水平拷贝数的引物序列为
F:5′-GCAGUCUGUUCUGAACAUAdTdT-3，SEQ ID NO.1；
R:5′-UAUGUUCAGAACAGACUGCdTdT-3′，SEQ ID NO.2；
GAPDH基因水平拷贝数的引物序列为
F:5′-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，SEQ ID NO.3；
R:5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′，SEQ ID NO.4；
结果：lncRNA DLEU1在胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织(图3C-D)，同时运用Kaplan-Meier生存分析及log-rank检验，分析了lncRNA DLEU1表达量与胶质瘤患者总生存期(OS)的相关性，结果显示，lncRNA DLEU1表达较高的患者具有更短的生存期，预后更差(HR＝1.703，95％CI:1.133-2.917，p＝0.0159)，与TCGA分析结果一致(图3E)。
结论：高表达lncRNA DLEU1的胶质瘤患者预后更差。
实施例2 lncRNA DLEU1对胶质瘤替莫唑胺耐药的影响
方法：采用MTS实验、Hoechst实验及流式细胞仪检测凋亡实验，考察lncRNA DLEU1对U87、U251细胞替莫唑胺(TMZ)药物敏感性的影响。
(1)siRNA转染
①IncRNA DLEU1 siRNA序列
siRNA1-DLEU1：CGTTGGAGGTAAACAAATA，SEQ ID NO.5；
siRNA2-DLEU1：GAGTCACAATGCAGACAAA，SEQ ID NO.6；
②操作步骤
转染前一天取胶质瘤细胞U87、U251种于6孔板中，待细胞生至长融合度达60％时进行转染。弃去旧的细胞培养液，PBS清洗两遍，每孔加入1.5ml含10％FBS的完全培养基。配制转染体系：取3个洁净无酶的1.5ml EP管，各加入250μl Opti-MEM，再分别加入5μlIncRNA DLEU1 siRNA、NC片段，不加干扰片段为Control组，轻轻混匀后静置5min；另取3个1.5ml EP管中各加入250μl Opti-MEM，再分别加入5μl lipo-RNA iMAX，轻轻混匀后静置5min。将两个体系轻轻混匀，静置20min后分别加入各孔中。
(2)加药处理
转染6h后，分别加入含有TMZ浓度为0、200、400、600、800μM的培养基，继续培养。
(3)MTS实验
转染前一天取胶质瘤细胞U87、U251种于96孔板中，每孔3×103个细胞，根据以上操作步骤转染、加药后，继续培养24h、48h、72h、96h，分别于各时间点检测细胞增殖情况。具体操作如下，按MTS：DMEM＝1:9比例配制工作液，混匀后每孔加入100μl工作液。置于细胞培养箱37℃孵育30min，酶标仪于490nm波长处检测吸光度。
(4)Hochest实验
胶质瘤细胞种于6孔板中，转染、加药后，继续培养48h，弃去培养基，PBS洗涤一次，加入0.5ml多聚甲醛于4℃固定20min；PBS洗涤后，加入0.5ml Hochest染色液于室温染色20min，PBS洗涤后，荧光显微镜下观察，拍照。
(5)流式细胞仪检测细胞凋亡
胶质瘤细胞转染、加药后，待细胞生长至80-90％，胰酶消化并收集细胞，转移至1.5ml EP管中，3000rpm离心10min，弃去上清；PBS洗涤后，加入195μl结合液重悬细胞，依次加入5μl Annexin V-FITC及10μl碘化丙啶后，轻轻混匀，室温避光染色20min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
结果：干扰lncRNA DLEU1后细胞增殖能力及生存率明显下降(图4A-C)，即胶质瘤细胞对TMZ的药物敏感性显著提高。
实施例3 lncRNA DLEU1通过自噬介导胶质瘤替莫唑胺耐药
方法：通过以下设组分别处理胶质瘤细胞：以不同浓度TMZ(200，400，800μM)处理胶质瘤细胞、干扰IncRNA DLEU1，干扰IncRNA DLEU1后，以300μM浓度TMZ处理、加入溶酶体抑制剂Baf-A1，采用Western-blot实验检测自噬标志蛋白LC3、P62及ATG7表达，并通过检测自噬小体数量观察细胞自噬流变化。
结果：P62蛋白表达随药物浓度增加而降低，LC3I蛋白向LC3II转化增加(图5A)；干扰lncRNA DLEU1后，P62及ATG7蛋白表达显著降低，LC3I蛋白向LC3II转化减少(图5B)；干扰lncRNA DLEU1后加入300μM替莫唑胺处理，P62蛋白表达显著降低，LC3I蛋白向LC3II转化基本无变化(图5C)。干扰lncRNA DLEU1后加入Baf-A1，LC3II表达显著降低；加入Baf-A1时干扰lncRNA DLEU1可降低LC3II蛋白表达，同时在加入Baf-A1时干扰lncRNA DLEU1可减少TMZ诱导的自噬小体数量(图5D-E)。
总结：本发明通过运用“医学大数据应用研究”的思路，采用生物信息学方法，通过下载肿瘤基因图谱(TCGA)数据库中高级别胶质瘤项目的RNAseqraw count表达值数据，从中筛选差异表达的lncRNA，发现lncRNA DLEU1在胶质瘤组织中显著高表达，且其表达程度与胶质瘤患者生存预后密切相关。进一步通过对临床胶质瘤组织样本分析发现：lncRNADLEU1在胶质瘤组织中的表达显著高于正常脑组织，且胶质瘤患者中高表达lncRNA DLEU1的患者预后更差。此外，沉默lncRNA DLEU1后可增加对TMZ的药物敏感性，该过程可能与TMZ诱导的自噬有关。
综上所述，本发明发现lncRNA DLEU1在胶质瘤生存预后及替莫唑胺耐药过程中具有重要意义。检测胶质瘤病人中lncRNA DLEU1水平是否上调，可作为胶质瘤患者生存预后及替莫唑胺耐药检测的辅助手段。据此可制备相关试剂盒，该试剂盒中含有定量检测lncRNA DLEU1的RNA转录水平的试剂，包括RNA逆转录试剂gDNA Eraser、5×gDNA EraBuffer、RNsae Free dH2O、RT primer Mix、5×primescript Buffer、Primescript RTEnzyme Mix，荧光定量PCR试剂TB green、ddH2O及引物等。通过检测患者胶质瘤组织中lncRNA DLEU1基因表达水平是否改变，从而预测患者生存期及预后。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江西省肿瘤医院（江西省癌症中心）
<120> lncRNA DLEU1作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagucuguu cugaacauad tdt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uauguucaga acagacugcd tdt 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccatcacca tcttccagga g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttgtcatgg atgaccttgg c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgttggaggt aaacaaata 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagtcacaat gcagacaaa 19

Claims (7)

1.lncRNA DLEU1在制备调节肿瘤对替莫唑胺类药物敏感性的药物中的应用。
2.lncRNA DLEU1在作为肿瘤替莫唑胺耐药检测、治疗和/或预后分子靶点的应用。
3.lncRNA DLEU1的表达干扰试剂在制备提高肿瘤对替莫唑胺类药物敏感性的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述干扰试剂包括lncRNA DLEU1 siRNA，序列为siRNA1-DLEU1：CGTTGGAGGTAAACAAATA，SEQ ID NO.5；或siRNA2-DLEU1：GAGTCACAATGCAGACAAA，SEQ ID NO.6。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括胶质瘤。
6.一种肿瘤对替莫唑胺类药物耐药检测或生存预后检测试剂盒，其特征在于：包括RNA逆转录试剂gDNA Eraser、5×gDNA Era Buffer、RNsae Free dH2O、RT primer Mix、5×primescript Buffer、Primescript RT Enzyme Mix，荧光定量PCR试剂TB green、ddH2O及针对lncRNA DLEU1设计的引物，所述引物序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述肿瘤包括胶质瘤。
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