CN112194816B - 一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法，该方法以纤维素气凝胶为基材，由于其具备三维网络结构，低密度，高比表面积和大孔隙率等优点可以为糖蛋白提供更多的结合位点。树枝状大分子聚乙烯亚胺(PEI)具有丰富的官能团且易修饰，通过对其进行改性，可以提高苯硼酸配体的密度，增大对糖蛋白的亲和力。

Description

一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法
技术领域
本发明属于糖蛋白分离技术领域，涉及一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法。
背景技术
蛋白质糖基化在调节各种复杂的生物过程中，如免疫应答和蛋白质折叠等起着至关重要的作用。且糖蛋白的糖链结构和构型的变化往往和疾病的发生发展过程相关，如在癌症、肿瘤等疾病中有很多异常的糖基化蛋白。在生物检测中，糖蛋白被认为是重要的生物标记物和治疗靶点，并被用于医疗诊断中。但由于糖蛋白在复杂生物样品或临床样品中丰度较低，因此进行目标蛋白的分离和富集十分重要。
常见的糖蛋白分离材料包括有机整体材料、无机整体材料、磁性物质材料。其中有机整体材料存在着有机溶剂易溶胀、机械稳定性不足，比表面积低、渗透率低的缺点；无机整体材料通常需要多步制备、过程复杂且pH稳定性差；而磁性物质材料由于具有强磁性、分子间偶极力从而导致其易团聚、分散性差，并且有生物毒性。
纤维素是一种天然亲水性聚合物，具有来源广泛、无毒、生物相容性好而被广泛应用于生物医药领域。气凝胶是一类具有三维网络结构，低密度，高比表面积和大孔隙率的多孔材料。由于其独特的物理结构和特性，已广泛用于分离领域。以纤维素气凝胶为基材，基于硼酸法分离糖蛋白，利用硼酸与顺式二醇的可逆结合特性：碱性条件下，硼酸为四方形sp3结构，可与顺式二醇酯化形成可逆性共价键；酸性条件下，硼酸为三角形sp2结构，与顺式二醇的结合力显著下降。通过调节pH，可有效分离糖蛋白，具有操作简单快捷、成本低廉、环境友好等优点，在分离糖蛋白的应用中受到广泛关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法，通过对纤维素气凝胶进行改性，可以提高苯硼酸配体的密度，增大对糖蛋白的亲和力，分离糖蛋白。
本发明所采用的技术方案是，一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，将NaOH、尿素加入去离子水中，搅拌混合均匀得混合液A，然后将混合液A在-12.5℃进行预冷，得到溶液A；
步骤2，将纤维素加入到步骤1所得的溶液A中，搅拌至纤维素完全溶解，再加入2～5mL环氧氯丙烷，搅拌均匀，得到溶液B；将溶液B倒入模具中，静置24小时，洗涤并冷冻干燥，得到再生纤维素气凝胶；
步骤3，将步骤2所得的再生纤维素气凝胶、高碘酸钠加入去离子水中，搅拌均匀，得到溶液C，溶液C在50～70℃下，避光反应5～7h，反应结束后，再向溶液C中加入3～5mL乙二醇搅拌30～60min，得产物A，将产物A用去离子水、乙醇洗涤，冷冻干燥，得到二醛纤维素气凝胶；
步骤4，将步骤3所得产物二醛纤维素气凝胶加入无水乙醇中，得混合液B，将聚乙烯亚胺、氰基硼氢化钠加入混合液B中，并在50～70℃下反应6h，得产物B，将产物B用乙醇洗涤至中性，冷冻干燥，得聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶；
步骤5，将4-(溴甲基)苯硼酸溶于100～500mL无水乙醇中混合均匀，得混合液C，然后将步骤4所得的聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶、氰化硼氢化钠加入混合液C中，在50℃下反应12～24h，得产物C，将产物C用蒸馏水、乙醇洗涤去除残余反应物，然后真空干燥，得到聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶。
本发明的特点还在于，
步骤1中NaOH用量为6～10g，尿素用量为9～13g，去离子水用量为77～85mL。
步骤2中，纤维素用量为2～5g。
步骤3中，再生纤维素气凝胶与高碘酸钠的摩尔比为1：1～1.5，去离子水的用量为150～500mL。
步骤4中二醛纤维素气凝胶的用量为1～1.5g，无水乙醇的用量为50～200mL，聚乙烯亚胺的用量为2.7～4.5g，氰基硼氢化钠的用量为3～5g。
步骤5中4-(溴甲基)苯硼酸的用量为3～5g，无水乙醇的用量为100～500mL，聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶的用量为1～3g，氰化硼氢化钠的用量为5～8g。
本发明的有益效果是，本发明以纤维素气凝胶为基材，由于其具备三维网络结构，低密度，高比表面积和大孔隙率等优点可以为糖蛋白提供更多的结合位点。树枝状大分子聚乙烯亚胺(PEI)具有丰富的官能团且易修饰，通过对其进行改性，可以提高苯硼酸配体的密度，增大对糖蛋白的亲和力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，称取6～10gNaOH、9～13g尿素加入77～85mL去离子水中，搅拌混合均匀，然后将其在-12.5℃进行预冷，得到溶液A。
步骤2，在剧烈搅拌下，将2～5g纤维素(棉短绒纸浆，DP＝600，α-纤维素含量＞95％)加入到溶液A中，搅拌至纤维素A完全溶解，加入2～5mL环氧氯丙烷，继续搅拌，得到溶液B。最后，将溶液B倒入模具中，静置24小时，洗涤并冷冻干燥，得到再生纤维素气凝胶(R-CA)。
步骤3，取1molR-CA、1～1.5mol高碘酸钠与150～500mL去离子水中，混合搅拌均匀，得到溶液C，将溶液C在50～70℃下、避光反应5～7h。反应结束后，再向其中加入3～5mL乙二醇搅拌30～60min。将产物用去离子水、乙醇洗涤、冷冻干燥，得到二醛纤维素气凝胶(D-CA)。
步骤4，取1～1.5gD-AC于50～200mL无水乙醇中，然后取2.7～4.5g聚乙烯亚胺PEI、3～5g氰化硼氢化钠加入上述反应体系中，并在50～70℃下反应6h。最后，将混合物用大量乙醇洗涤至中性，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶PEI-CA。
步骤5，将3～5gPBA溶于100～500mL无水乙醇中混合均匀，称取1～3gPEI-CA、5～8g氰化硼氢化钠加入其中，50℃，反应12～24h。产物用蒸馏水、乙醇洗涤去除残余反应物，之后真空干燥，得到聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶(PEI-PBA-CA)。
实施例1
步骤1，称取6gNaOH、9g尿素加入85mL去离子水中，搅拌混合均匀，然后将其在-12.5℃进行预冷，得到溶液A。
步骤2，在剧烈搅拌下，将2g棉短绒纸浆加入到溶液A中，搅拌至纤维素完全溶解。加入2mL环氧氯丙烷，继续搅拌，得到溶液B。最后，将溶液B倒入模具中，静置24小时，洗涤并冷冻干燥，得到再生纤维素气凝胶(R-CA)。
步骤3，取1molR-CA、1mol高碘酸钠与150mL去离子水中，混合搅拌均匀，得到溶液C。50℃、避光反应5h。反应结束后，再向其中加入3mL乙二醇搅拌30min。将产物用去离子水、乙醇洗涤、冷冻干燥，得到二醛纤维素气凝胶(D-CA)。
步骤4，取1gD-AC于50mL无水乙醇中。然后，取2.7gPEI、3g氰化硼氢化钠加入上述反应体系中，并在50℃下反应6h。最后，将混合物用大量乙醇洗涤至中性，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶PEI-CA。
步骤5，3gPBA溶于100mL无水乙醇中混合均匀，称取1gPEI-CA、5g氰化硼氢化钠加入其中，50℃，反应12h。产物用蒸馏水、乙醇洗涤去除残余反应物，之后真空干燥，得到聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶(PEI-PBA-CA)。
实施例2
步骤1，称取7gNaOH、12g尿素加入81mL去离子水中，搅拌混合均匀，然后将其在-12.5℃进行预冷，得到溶液A。
步骤2，在剧烈搅拌下，将3g棉短绒纸浆加入到溶液A中，搅拌至纤维素完全溶解。加入2mL环氧氯丙烷，继续搅拌，得到溶液B。最后，将溶液B倒入模具中，静置24小时，洗涤并冷冻干燥，得到再生纤维素气凝胶(R-CA)。
步骤3，取1molR-CA、1.1mol高碘酸钠与200mL去离子水中，混合搅拌均匀，得到溶液C。70℃、避光反应5h。反应结束后，再向其中加入4mL乙二醇搅拌60min。将产物用去离子水、乙醇洗涤、冷冻干燥，得到二醛纤维素气凝胶(D-CA)。
步骤4，取1.5gD-AC于150mL无水乙醇中。然后，取4.0gPEI、5g氰化硼氢化钠加入上述反应体系中，并在70℃下反应6h。最后，将混合物用大量乙醇洗涤至中性，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶PEI-CA。
步骤5，3gPBA溶于300mL无水乙醇中混合均匀，称取3gPEI-CA、8g氰化硼氢化钠加入其中，50℃，反应24h。产物用蒸馏水、乙醇洗涤去除残余反应物，之后真空干燥，得到聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶(PEI-PBA-CA)。
实施例3
步骤1，称取10gNaOH、9g尿素加入81mL去离子水中，搅拌混合均匀，然后将其在-12.5℃进行预冷，得到溶液A。
步骤2，在剧烈搅拌下，将4g棉短绒纸浆加入到溶液A中，搅拌至纤维素完全溶解。加入5mL环氧氯丙烷，继续搅拌，得到溶液B。最后，将溶液B倒入模具中，静置24小时，洗涤并冷冻干燥，得到再生纤维素气凝胶(R-CA)。
步骤3，取1molR-CA、1.5mol高碘酸钠与300mL去离子水中，混合搅拌均匀，得到溶液C。70℃、避光反应7h。反应结束后，再向其中加入5mL乙二醇搅拌60min。将产物用去离子水、乙醇洗涤、冷冻干燥，得到二醛纤维素气凝胶(D-CA)。
步骤4，取1.5gD-AC于200mL无水乙醇中。然后，取2.7gPEI、4.5g氰化硼氢化钠加入上述反应体系中，并在50℃下反应6h。最后，将混合物用大量乙醇洗涤至中性，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶PEI-CA。
步骤5，4gPBA溶于450mL无水乙醇中混合均匀，称取2.5gPEI-CA、6g氰化硼氢化钠加入其中，50℃，反应12h。产物用蒸馏水、乙醇洗涤去除残余反应物，之后真空干燥，得到聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶(PEI-PBA-CA)。
实施例4
步骤1，称取10gNaOH、10g尿素加入80mL去离子水中，搅拌混合均匀，然后将其在-12.5℃进行预冷，得到溶液A。
步骤2，在剧烈搅拌下，将5g棉短绒纸浆加入到溶液A中，搅拌至纤维素完全溶解。加入5mL环氧氯丙烷，继续搅拌，得到溶液B。最后，将溶液B倒入模具中，静置24小时，洗涤并冷冻干燥，得到再生纤维素气凝胶(R-CA)。
步骤3，取1molR-CA、1.3mol高碘酸钠与500mL去离子水中，混合搅拌均匀，得到溶液C。70℃、避光反应7h。反应结束后，再向其中加入5mL乙二醇搅拌30min。将产物用去离子水、乙醇洗涤、冷冻干燥，得到二醛纤维素气凝胶(D-CA)。
步骤4，取1.2gD-AC于100mL无水乙醇中。然后，取3.5gPEI、3.5g氰化硼氢化钠加入上述反应体系中，并在70℃下反应6h。最后，将混合物用大量乙醇洗涤至中性，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶PEI-CA。
步骤5，4.5gPBA溶于100～500mL无水乙醇中混合均匀，称取3gPEI-CA、7.5g氰化硼氢化钠加入其中，50℃，反应24h。产物用蒸馏水、乙醇洗涤去除残余反应物，之后真空干燥，得到聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶(PEI-PBA-CA)。
实施例5
步骤1，称取6gNaOH、13g尿素加入81mL去离子水中，搅拌混合均匀，然后将其在-12.5℃进行预冷，得到溶液A。
步骤2，在剧烈搅拌下，将4g棉短绒纸浆加入到溶液A中，搅拌至纤维素完全溶解。加入3.5mL环氧氯丙烷，继续搅拌，得到溶液B。最后，将溶液B倒入模具中，静置24小时，洗涤并冷冻干燥，得到再生纤维素气凝胶(R-CA)。
步骤3，取1molR-CA、1.1mol高碘酸钠与350mL去离子水中，混合搅拌均匀，得到溶液C。65℃、避光反应7h。反应结束后，再向其中加入5mL乙二醇搅拌60min。将产物用去离子水、乙醇洗涤、冷冻干燥，得到二醛纤维素气凝胶(D-CA)。
步骤4，取1gD-AC于50～200mL无水乙醇中。然后，取4.5gPEI、5g氰化硼氢化钠加入上述反应体系中，并在70℃下反应6h。最后，将混合物用大量乙醇洗涤至中性，冷冻干燥，得到聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶PEI-CA。
步骤5，5gPBA溶于500mL无水乙醇中混合均匀，称取2.5gPEI-CA、6g氰化硼氢化钠加入其中，50℃，反应24h。产物用蒸馏水、乙醇洗涤去除残余反应物，之后真空干燥，得到聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶(PEI-PBA-CA)。
本发明一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法的优点如下：
1.制备聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶过程操作简单、安全环保、材料生物相容性好；
2.使用聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶，可以增强选择性和识别能力，提高材料分离性能；
3.可通过简单调节pH，简单有效分离糖蛋白。碱性条件下，硼酸为四方形sp3结构，可与糖蛋白形成可逆性共价键；酸性条件下，硼酸为三角形sp2结构，发生解离。

Claims (3)

1.一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤1，将NaOH、尿素加入去离子水中，搅拌混合均匀得混合液A，然后将混合液A在-12.5℃进行预冷，得到溶液A；
步骤2，将纤维素加入到步骤1所得的溶液A中，搅拌至纤维素完全溶解，再加入2~5 mL环氧氯丙烷，搅拌均匀，得到溶液B；将溶液B倒入模具中，静置24小时，洗涤并冷冻干燥，得到再生纤维素气凝胶；
步骤2中，纤维素用量为2~5 g；
步骤3，将步骤2所得的再生纤维素气凝胶、高碘酸钠加入去离子水中，搅拌均匀，得到溶液C，溶液C在50~70℃下，避光反应5~7 h，反应结束后，再向溶液C中加入3~5 mL乙二醇搅拌30~60 min，得产物A，将产物A用去离子水、乙醇洗涤，冷冻干燥，得到二醛纤维素气凝胶；
所述步骤3中，再生纤维素气凝胶与高碘酸钠的摩尔比为1：1~1.5，去离子水的用量为150~500 mL；
步骤4，将步骤3所得产物二醛纤维素气凝胶加入无水乙醇中，得混合液B，将聚乙烯亚胺、氰化硼氢化钠加入混合液B中，并在50~70℃下反应6 h，得产物B，将产物B用乙醇洗涤至中性，冷冻干燥，得聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶；
步骤5，将4-(溴甲基)苯硼酸溶于100~500 mL无水乙醇中混合均匀，得混合液C，然后将步骤4所得的聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶、氰化硼氢化钠加入混合液C中，在50℃下反应12~24h，得产物C，将产物C用蒸馏水、乙醇洗涤去除残余反应物，然后真空干燥，得到聚乙烯亚胺/苯硼酸改性纤维素气凝胶；
所述步骤5中4-(溴甲基)苯硼酸的用量为3~5 g，无水乙醇的用量为100~500 mL，聚乙烯亚胺改性纤维素气凝胶的用量为1~3g，氰化硼氢化钠的用量为5~8g。
2.根据权利要求1所述的一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1中NaOH用量为6~10g，尿素用量为9~13 g，去离子水用量为77~85 mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于分离糖蛋白的改性纤维素气凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤4中二醛纤维素气凝胶的用量为1~1.5 g，无水乙醇的用量为50~200 mL，聚乙烯亚胺的用量为2.7~4.5g，氰化硼氢化钠的用量为3~5 g。
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