CN112175078B

CN112175078B - 一种卵泡抑素样蛋白1的中和性抗体及其应用

Info

Publication number: CN112175078B
Application number: CN202011030128.4A
Authority: CN
Inventors: 宁文; 周红刚; 李霄鹤
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2040-09-27
Also published as: CN112175078A

Abstract

本发明涉及一种卵泡抑素样蛋白1的中和性抗体及其应用，所述抗体为鼠源FSTL1中和性抗体2K6。本发明还公开了该抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区。本发明还涉及FSTL1在促进皮肤纤维化疾病中的应用，以及鼠源FSTL1中和性抗体2K6用于治疗、缓解或改善肺纤维化、皮肤纤维化和关节炎疾病或症状中的用途及其制备的药物组合物。研究结果表明上述鼠源FSTL1中和性抗体2K6能够治疗、缓解或改善肺纤维化、皮肤纤维化和关节炎疾病，并且对比本发明研发团队早期研发的治疗肺纤维化的抗体22B6，2K6对小鼠肺纤维化的预防和治疗效果要优于抗体22B6，即2K6实验组对肺纤维化关键指标—羟脯氨酸含量和肺纤维化面积比例的预防和治疗缓解率均高于22B6实验组。

Description

一种卵泡抑素样蛋白1的中和性抗体及其应用

技术领域

本发明涉及卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)促进皮肤纤维化疾病进程的功能，以及作为药物组合物的有效成分的鼠源FSTL1中和性抗体用于治疗、缓解或改善肺纤维化、皮肤纤维化和关节炎疾病或症状中的用途。

背景技术

器官纤维化的本质是组织遭受损伤后的修复反应，以保护组织器官的相对完整性。器官纤维化可发生在包括肺，皮肤，心，肝，肾等多种部位，有着相似的病理特征，是由多种急慢性病变引起的器官组织内纤维结缔组织增多和实质细胞减少的病理变化，可导致器官结构破坏和功能衰退。器官纤维化主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命，在人体各主要器官疾病的发生和发展过程中均起着重要作用。病理性纤维化的临床影响巨大，但治疗方案极为有限，在很大程度上是支持性而非治疗性，了解导致脏器纤维化发展的细胞和分子途径对于确定潜在的治疗靶点至关重要。

肺纤维化是最重要的脏器纤维化，它是许多病因各异的肺间质疾病的终末期临床表现，是以肺泡持续性损伤、成纤维细胞增殖及大量细胞外基质沉积为特征，从而导致肺泡和肺间质出现不同程度的炎症和纤维化，进而导致肺结构破坏和呼吸衰竭的一种疾病。特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是最常见的弥漫性肺纤维化疾病，临床上表现为进行性呼吸困难伴刺激性干咳，病情常持续进展，至今病因不明、发病机制不清、缺乏有效的治疗手段，中位生存期仅2-3年。肺纤维化成因复杂，转化生长因子(TGF-β)是目前已知最重要的一类促纤维化因子，具有诱导纤维母细胞增殖分化成肌纤维母细胞，促进胶原等细胞外基质的合成等作用，是肺纤维化疾病发生发展的总开关。TGF-β及其下游信号在IPF的发病机制中的关键作用，使之成为一个有吸引力的治疗目标。因此，本领域需要发现更多的可干扰TGF-β信号的分子，为治疗IPF等肺纤维化疾病提供潜在的分子靶点和治疗手段。

皮肤纤维化也是一种很常见的器官纤维化，有多种类型和不同的病因，例如外科手术伤口或突发伤口引起的伤口愈合失败，或系统性免疫疾病均可导致局部或大面积皮肤纤维化。轻微局部的皮肤纤维化可能只给患者带来容貌或外形上的困扰，但程度严重的皮肤纤维化则会影响患者的正常生理功能，使患者丧失抵抗外界病原侵袭和伤害的最大屏障，如瘢痕疙瘩，增生性瘢痕以及系统性硬皮病。近些年针对皮肤纤维化的治疗一直局限于外科手术切除，放射治疗或免疫治疗，免疫治疗多使用激素类药物，但激素类药物短期使用复发率较高，长期使用则会给患者带来非常多副作用，包括感染，高血压，高糖血症，骨质疏松，撤药反跳，股骨头无菌坏死，肥胖，精神兴奋，消化性溃疡等等。目前皮肤纤维化药物研究未能取得突破性进展的原因是对不同类型皮肤纤维化的启动因素和病理机制不够了解，无法确切锁定涉及皮肤纤维化病因的关键性细胞因子。目前研究表明TGF-β1是调控皮肤纤维化过程中成纤维细胞活化增生的关键性因子。

卵泡抑素样蛋白1(Follistatin-like1，FSTL1)是最早由Shibanuma M等从小鼠成骨细胞中克隆得到一个可被TGF-β1诱导的基因。该基因编码一种可分泌的小分子糖蛋白(38kD)，已有的研究表明FSTL1作为BMP4的抑制因子在肺的发育过程中起重要作用，此外，FSTL1在肺癌和卵巢癌细胞中被认为是一个可能的肿瘤抑制基因，在类风湿关节炎中是一个免疫调节因子，还可通过促进TGF-β信号活化在肺纤维化疾病中起作用，但FSTL1在皮肤纤维化中的作用还未阐明。

发明内容

本发明首先涉及FSTL1靶点可通过促进TGF-β1/Smad3信号介导的皮肤成纤维细胞的活化，促进皮肤纤维化疾病的进行性发展。在本发明的实施例1中给出了FSTL1在皮肤纤维化疾病进展中具有关键促进作用的研发实验，该实验结果显示Fstl1对于皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化的发病机制至关重要，并且，Fstl1可被皮肤损伤诱导，并通过促进TGF-β1信号激活参与皮肤纤维化疾病进程，Fstl1是驱动皮肤纤维化疾病进展的关键促纤维化因子。

本发明还涉及一种鼠源FSTL1中和性抗体2K6，该抗体可以治疗、缓解或改善皮肤纤维化疾病、肺纤维化疾病和关节炎疾病。该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区包含由序列号2的氨基酸序号26至34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸序号52至58的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号2的氨基酸序号97至106的氨基酸序列构成的CDR3，所述轻链可变区包含由序列号4的氨基酸序号27至38的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号56至58的氨基酸序列构成的CDR2和由序列号4的氨基酸序号95至102的氨基酸序列构成的CDR3。

上述鼠源FSTL1中和性抗体2K6的重链可变结构域(VH)的FR和CDR的序列如下(CDR序列以IMGT规则定义)

上述鼠源FSTL1中和性抗体2K6的轻链可变结构域(VL)的FR和CDR的序列(CDR序列以IMGT规则定义)

上述的鼠源FSTL1中和性抗体或其抗原结合片段，其中，包含由序列号2的氨基酸序号1至117的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区；其抗原结合片段为鼠源FSTL1蛋白氨基酸序号270至279的氨基酸序列：QKGVQTHTEE。

上述鼠源FSTL1中和性抗体2K6选自由下述(a)～(b)组成的组：

(a)鼠源FSTL1中和性抗体，其包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链；以及

(b)鼠源FSTL1中和性抗体，其是通过(a)所述的鼠源FSTL1中和性抗体的翻译后修饰生成的抗体。

上述的鼠源FSTL1中和性抗体2K6，其中，所述鼠源FSTL1中和性抗体选自由下述(a)～(b)组成的组：

(b)鼠源FSTL1中和性抗体，其包含由序列号2的氨基酸序号1至117的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。

在本发明的实施例2、3中分别给出了上述鼠源FSTL1单克隆抗体2K6的特异性和功能性检测，及中和活性检测。

本发明还涉及一种药物组合物，其由上述鼠源FSTL1中和性抗体2K6制备得到。

本发明还涉及上述鼠源FSTL1中和性抗体2K6在制备治疗或调节组织纤维化和关节炎疾病的药物中的应用，特别是对治疗、缓解或改善肺纤维化疾病、皮肤纤维化疾病和关节炎疾病的药物中的应用，优选针对特发性肺纤维化、瘢痕疙瘩、类风湿性关节炎的应用。在本发明的实施例4-10中分别给出了对应的研究实验，结果表明上述鼠源FSTL1中和性抗体2K6能够治疗、缓解或改善肺纤维化、皮肤纤维化和关节炎疾病，并且对比本发明研发团队早期研发的治疗肺纤维化的抗体22B6，2K6对小鼠肺纤维化的预防和治疗效果要优于抗体22B6，即2K6实验组对肺纤维化关键指标—羟脯氨酸含量和肺纤维化面积比例的预防和治疗缓解率均高于22B6实验组。

本发明中名词术语的定义与解释

本说明书中使用的抗体的氨基酸残基序号可以通过指定Kabat编号或EU索引(Kabat等、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第五版、NIHPublication No.91-3242)，按照它们的编号系统来规定。

本研究所使用的小鼠规格均为SPF级，用于鼠源FSTL1中和性抗体治疗肺纤维化和皮肤纤维化实验的C57BL/6J小鼠，以及用于鼠源FSTL1中和性抗体治疗关节炎实验的DBA小鼠，饲养于南开大学动物饲养中心，恒温恒湿，自由饮食。

根据本发明，术语实时荧光定量PCR是指从人以及小鼠肺组织中利用Trizol(Invitrogen)制备总RNA，利用ThermoScript RT-PCR试剂盒(Invitrogen)合成cDNA，使用SYBR Green试剂盒(Roche)检测FSTL1，FSTL1，α-SMA，Colla1的表达。GUSB和β-actin作为内参。各基因引物如下表所示：

表1.实时荧光定量PCR检测基因引物

根据本发明，术语Western Blotting检测是指小鼠右肺组织在含1mM PMSF的62.5mM Tris溶液中匀浆，离心得到肺组织蛋白。细胞用RIPA裂解液裂解获得细胞总蛋白。利用BCA系统(Pierce)测定蛋白浓度。细胞上清蛋白用饱和三氯乙酸(TCA)沉淀，并溶于1×sample buffer；细胞与组织蛋白中加入sample buffer，100度变性，利用不同浓度的SDS-PAGE胶分离蛋白。将蛋白湿转到PVDF膜(Roche)上，牛奶封闭后，一抗4度孵育过夜，含0.1％的TBS溶液洗后，HRP酶标二抗室温孵育2小时。利用ECL系统(Pierce)检测蛋白表达量。用于Western blotting的一抗:FSTL1、type I collagen、α-SMA、β-tubulin、β-actin、His、HA、Follistatin、and Myc(Santa Cruz Biotechnology)；phosphor-Smad3 and total Smad3(Cell Signaling Technology)；and TGF-β1(R&D)。

根据本发明，术语微量热泳动(Microscale thermophoresis)是指遵循染料NT-647-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联赖氨酸残基的操作规程，进行目的蛋白FSTL1和FS的荧光标记，之后选取优质涂层和标准处理的MST毛细管(NanoTemper Technology)，在MonolithNT.115仪器(NanoTemper Technologies，德国)上分析测试FSTL1单克隆抗体2K6和NT647-FSTL1或NT647-FS之间的相互作用，具体如下：在测定缓冲液中系列稀释FSTL1单克隆抗体2K6(0.015-500μM)，并将其与104nM NT647-HSP90β溶液1:1混合，每次稀释的最终体积为20μL。将反应混合物装入标准处理的毛细管中，然后通过MST在20％和80％MST功率下以及在30％的发光二极管(LED)强度下进行分析。

根据本发明，术语Pull-down检测是指5ug FSTL1单克隆抗体与20ul Protein Gagarose四度孵育4h，加入200ng Follistatin,FSTL1,TGF-β1蛋白四度孵育4h，捕获的蛋白溶于2×sample buffer中，100度分离变性，离心取上清进行Western blot检测。其中纯蛋白为阳性对照，未加蛋白为阴性对照。His标记的小鼠FSTL1蛋白与100ng重组人TGF-β1蛋白、以及5ug FSTL1单克隆抗体或对照IgG2b在4℃孵育过夜。His标记的FSTL1蛋白被Ni-NTA琼脂糖凝胶捕获并浓缩。本发明人将小鼠FSTL1的编码序列(序列参见GenBank登录号:NM_007085.4)插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO质粒的Xho I/Nco I酶切位点内(pc-FSTL1质粒)。通过脂质体转染法将TβRII-HA和/或myc-His标记的FSTL1质粒转染到HEK293细胞中，同时在细胞培养基里加10ug/ml FSTL1单克隆抗体或对照IgG2b。而HA标记的TβRII(或TβRI)蛋白被HA琼脂糖凝胶捕获。捕获的蛋白溶于2×sample buffer中，100度分离变性，离心取上清进行Western blot检测。

根据本发明，术语酶联免疫吸附法(ELISA)是指将细胞上清利用商业ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6的表达。

根据本发明，术语博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化动物模型制备是指雄性C57BL/6J(周龄8-10周)小鼠，以10％水合氯醛按0.5ml/100g腹腔(I.P.)注射麻醉小鼠，气管内注射博莱霉素2U/kg。具体实施方式如下：麻醉小鼠后称重记录，将小鼠固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，用手术刀在小鼠颈部垂直划开大约1cm长创口，利用显微镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，然后按2U/kg的计量缓慢注入与其体重相适应体积的博莱霉素生理盐水溶液，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。

根据本发明，术语博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化模型制备是指6-8周龄C57BL/6雄性小鼠以7.5％水合氯醛按0.6毫升/100g腹腔(I.P.)注射麻醉，背部朝上，将背部下方两侧毛发剔除，暴露皮肤，用1ml胰岛素注射器将100μl 0.2U博莱霉素注射入小鼠背部皮肤皮下，两侧各100μl。

根据本发明，术语TGF-β1所诱导的人皮肤外植体纤维化模型制备是指将手术新鲜取下的皮肤组织在超净台剥离去多余脂肪组织，仅余表皮层和真皮层，之后切割为面积1.5cm见方的组织块，用1ml胰岛素注射器将不同浓度的TGF-β1蛋白皮内注射到皮肤组织中，浓度为10ng/ml，体积为100μl，之后将皮肤组织在细胞培养箱内培养两周。培养方法如下：将处理好的皮肤组织平铺在加有DMEM培养基(含10％FBS和0.1％PS)的细胞培养皿中，皮肤表皮层向上，培养基高度不要没过比表皮层，确保表皮层暴露在空气中。

根据本发明，术语II型胶原所诱导的小鼠关节炎模型制备是指在小鼠体内通过两次免疫模拟关节炎模型。初次免疫是将II型胶原溶于0.05M冰醋酸中，使终浓度为3mg/ml，在4度冰箱搅拌过夜；次日，取II型胶原与等体积的的CFA置于冰上用超声仪进行乳化，确保乳化后液滴入水不扩散；乳化好之后用1ml胰岛素注射器在距离小鼠尾根部2-3厘米的尾巴皮内注射II型胶原+CFA，100μl/只鼠，即150μg II型胶原/只鼠。加强免疫是在初次免疫后第21天，将II型胶原溶于0.05M冰醋酸中，使终浓度为4mg/ml，在4度冰箱搅拌过夜；次日，取II型胶原与等体积的的IFA置于冰上用超声仪进行乳化，确保乳化后液滴入水不扩散；乳化好之后用1ml胰岛素注射器在距离小鼠尾根部2-3厘米的尾巴皮内注射II型胶原+IFA，50μl/只鼠，即100μg II型胶原/只鼠(此时小鼠初次免疫注射部位并无红肿，可避开初次免疫部位)。

根据本发明，术语羟脯氨酸含量测定是指每组(5只)雄性小鼠分别在博莱霉素处理14天处死小鼠，取右肺，剔除支气管，放于5ml安瓿瓶，烘干，酸水解，调整其PH到6.5-8.0，过滤残渣，PBS调整其总体积为10ml，取50ul样品，加入350ul去离子水，加入200ul氯胺T(Chloramine T)溶液室温孵育20分钟；加入200ul高氯酸(perchloric acid)室温孵育5分钟；加入200ul对二甲氨基苯甲醛(P-DMAB)65℃孵育20分钟。取200ul至96孔板中测定样品557nm的吸光值，利用标准品读数绘制标准曲线，进而利用标准曲线所得公式求得所测样品羟脯氨酸浓度Cs。按以下公式换算为全部右肺所含羟脯氨酸的量W∶W＝Cs×8(所测样品稀释倍数)×10(样品总体积)。

根据本发明，术语Masson染色组织学分析是指取小鼠左侧肺组织,中性福尔马林固定后石蜡包埋,从肺组织的肺门处开始进行切片,传统Masson染色观察纤维化状况、胶原沉积。步骤如下：二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；无水乙醇，10分钟；无水乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；自来水中片刻；Bouin氏固定液媒染30分钟；酒精苏木素与三氯化铁按1:1混合均匀(现用现配)，染色5分钟；蒸馏水冲洗；1％的盐酸酒精分化；流水冲洗；丽春红酸性品红染色7分钟；蒸馏水冲洗2分钟；加磷钼酸5分钟；吸去磷钼酸加苯胺蓝染色5分钟；加1％冰醋酸洗去苯胺蓝溶液，95％酒精洗3次，每次1分钟；100％乙醇，2分钟；100％乙醇，2分钟；二甲苯I，2分钟；二甲苯II，2分钟；中性树胶封片，通风橱中晾干。应正置透射荧光显微镜(LeicaDFC420C)采集图像数据(200倍放大),在Image-Pro Plus Version6.0(Media Cybernetics,Inc.American)中打开,利用软件选区工具选定全部肺组织区域,利用软件自动计算功能得出所选区域的总像素,然后用同样的方法选取该切片中纤维化的区域利用软件计算出纤维化区域的总像素,纤维化区域总像素Pf与全肺总像素Pw之比即为纤维化所占比例。

根据本发明，术语H&E染色组织学分析是指苏木精伊红(H&E)染色，具体染色步骤如下：二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；无水乙醇，10分钟；无水乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；95％乙醇10分钟；自来水中片刻；蒸馏水中片刻；苏木精染核，25s；自来水反蓝，10分钟；显微镜观察细胞核着色；95％乙醇，2分钟；95％乙醇，2分钟；伊红(0.5％，溶于95％乙醇中)，1s；95％乙醇，2分钟；95％乙醇，2分钟；100％乙醇，2分钟；100％乙醇，2分钟；二甲苯I，2分钟；二甲苯II，2分钟；中性树胶封片，通风橱中晾干。

根据本发明，术语免疫组织化学染色分析是指石蜡切片，常规脱蜡入水，柠檬酸盐缓冲液(PH 6.0)高压修复5分钟，3％H2O2封闭10分钟,5％正常山羊血清室温封闭1小时,加入α-SMA抗体(1:1000)(美国Abcam公司)4℃孵育过夜，次日滴加生物素标记的羊抗鼠/兔IgG 10分钟(福州迈新)，DAB显色，阳性产物成棕褐色，苏木素复染，中性树胶封片。用正常山羊血清作为阴性对照。双盲法采用Image-Pro Plus图像分析系统，进行图像采集。

根据本发明，术语足爪肿胀测量是指将千分尺卡住CIA模型小鼠的足掌，记录具体数值，造模前和取材时各测一次，计算差值。

根据本发明，术语关节炎指数是指从D21天II次免疫开始进行小鼠关节炎指数评分，每三天评分一次，直到取材。每只小鼠每个爪子都进行评分，将四肢评分相加即为一只小鼠的关节炎指数，评分标准如下：0＝无红斑或肿胀；1＝轻微的红斑或有一个趾头的肿胀；2＝红斑或超过一个趾头有肿胀；3＝红斑和踝部或腕部有肿胀；4＝红斑严重以及脚趾和踝部或手指和腕部水肿严重，踝部或腕部不能正常弯曲，小鼠关节炎指数范围是0-16。

附图说明

图1：FSTL1在皮肤纤维化疾病进展中具有关键促进作用。

图2：鼠源FSTL1单克隆抗体2K6特异性和功能性检测。

图3：鼠源FSTL1单克隆抗体2K6中和活性检测。

图4：鼠源FSTL1中和性抗体2K6可预防性缓解博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。

图5：鼠源FSTL1中和性抗体2K6可治疗性缓解博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。

图6：鼠源FSTL1中和性抗体2K6可预防性缓解博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化。

图7：鼠源FSTL1中和性抗体2K6可治疗性缓解博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化。

图8：鼠源FSTL1中和性抗体2K6可预防性缓解TGF-β1所诱导的人皮肤外植体纤维化。

图9：鼠源FSTL1中和性抗体2K6可治疗性缓解TGF-β1所诱导的人皮肤外植体纤维化。

图10：鼠源FSTL1中和性抗体2K6可减轻胶原所诱导的小鼠关节炎。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室指南(纽约，冷泉港实验室出版社，New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.FSTL1在皮肤纤维化疾病进展中具有关键促进作用。

皮肤纤维化主要发生在真皮层，表现为支撑细胞如成纤维细胞增生且表达大量胞外基质蛋白，并伴有炎症因子浸润和细胞因子大量产生。目前研究表明TGF-β1是调控皮肤纤维化过程中成纤维细胞活化增生的关键性因子。本实验室发布的研究结果中已证实FSTL1在肺纤维化发病过程中可通过促进TGF-β1信号通路来促进肌成纤维细胞活化和胞外基质表达。我们推测FSTL1参与皮肤纤维化发生过程，调节成纤维细胞的增殖和活化，细胞外基质的合成和沉积，并利用实验首次研究出FSTL1在皮肤纤维化疾病进程中具有关键促进作用。

首先我们检测了皮肤纤维化患者中的FSTL1表达水平，我们从7个瘢痕疙瘩患者和3个健康人对照中收集了皮肤活检样品，结果发现与对照对象相比，所有疾病样品中FSTL1mRNA和蛋白质表达均显着增加(图1A-B)。同时构建了博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化模型，并观察到博来霉素诱导的损伤刺激了皮肤中Fstl1 mRNA和蛋白质的表达(图1C-D)。因此，以上结果显示Fstl1对于皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化的发病机制至关重要。

此外，我们还使用了Fstl1基因半倍敲除小鼠—Fstl1^+/-小鼠构建了博莱霉素诱导的皮肤纤维化模型，进一步评估Fstl1在皮肤纤维化中的促纤维化作用。图1E显示Fstl1^+/-小鼠皮肤组织中Fstl1 mRNA的水平较正常小鼠降低了47.04％，显示了敲除小鼠中Fstl1基因的敲除效率；而博莱霉素处理之后，正常小鼠皮肤组织中的Fstl1 mRNA水平较PBS对照组明显上调，但博莱霉素处理后的Fstl1^+/-小鼠中Fstl1 mRNA的水平较正常小鼠降低了72.75％。皮肤纤维化模型试验结果显示博莱霉素处理的Fstl1^+/-小鼠表现出明显减轻的皮肤纤维化，真皮厚度较博莱霉素处理的野生型小鼠明显减少(图1F-G)，胶原蛋白表达量明显减少(图1H-I)，α-SMA表达量显著减少，这表明Fstl1^+/-小鼠皮肤中成纤维细胞的积累减少(图1H-I)。

为了进一步评估Fstl1是否通过调控TGF-β1信号参与皮肤成纤维细胞的活化和胶原蛋白生成，我们从小鼠皮肤中分离了原代成纤维细胞，并构建了TGF-β1诱导皮肤成纤维细胞活化的细胞模型。图1J显示在皮肤成纤维细胞中TGF-β1以时间依赖性方式诱导FSTL1的表达和分泌。功能获得性实验表明，重组FSTL1蛋白可促进TGF-β1诱导的成纤维细胞活化和I型胶原蛋白的产生(图1K)。功能丧失性实验使用了从Fstl1^+/-小鼠皮肤分离的成纤维细胞，实验结果表明Fstl1敲除后可抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化、α-SMA表达和I型胶原产生(图1L)。

图1为FSTL1在皮肤纤维化疾病进展中具有关键促进作用。(A-B)通过RT-PCR和Western blot分析测定健康皮肤组织(n＝3)和瘢痕loid皮肤组织(n＝7)中FSTL1的mRNA水平(A)和蛋白质水平(B)。(C-D)通过RT-PCR和Western blot分析测量PBS或博来霉素处理后C57BL/6J小鼠皮肤组织中FSTL1的mRNA水平(C)和蛋白水平(D)(每组n＝5)。(E-1)用PBS或博来霉素处理Fstl1^+/-小鼠和WT小鼠14天(每组n＝5)，并收集皮肤组织用于以下分析：(E)Fstl1的qRT-PCR分析；(F)H&E染色和(G)皮肤厚度数据统计(标尺，100μm)，(H)Col1a1和α-SMA的qRT-PCR分析；(I)Col1和α-SMA的蛋白质印迹分析。(J)在指定的时间点用5ng/mlTGF-β1处理来自C57BL/6J小鼠的原代皮肤成纤维细胞。通过蛋白质印迹确定FSTL1蛋白在条件培养基(上清液[SN])或成纤维细胞(细胞)中的表达。(K)用5ng/ml TGF-β1和100ng/mlFSTL1处理来自C57BL/6J小鼠的原代皮肤成纤维细胞。在TGF-β1处理24小时后，通过蛋白质印迹法测定细胞提取物(Cell)中α-SMA的蛋白表达，培养基(上清液)中Col1的表达。(L)用5ng/ml TGF-β1处理来自Fstl1^+/-小鼠和WT小鼠的原代皮肤成纤维细胞。在TGF-β1处理后30分钟，通过蛋白质印迹分析p-Smad3和Smad3。TGF-β1处理24h后，通过蛋白质印迹法检测细胞提取物中α-SMA和培养基中Col1的蛋白表达水平。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P＜0.001。

以上数据表明Fstl1可被皮肤损伤诱导，并通过促进TGF-β1信号激活参与皮肤纤维化疾病进程，Fstl1是驱动皮肤纤维化疾病进展的关键促纤维化因子。

实施例2.鼠源FSTL1单克隆抗体2K6可与FSTL1蛋白特异性结合，并可拮抗FSTL1与TGF-β1或TGF-β1受体结合。

为了确定2K6单克隆抗体为FSTL1的中和性抗体，我们首先检测了2K6抗体能否与FSTL1蛋白特异性结合。图2A微量热涌动实验结果显示2K6单克隆抗体可以与FSTL1蛋白结合，且结合常数(Kd)为106.8nM，而不能与FSTL1同家族蛋白FS结合；图2B免疫沉淀实验结果所示，2K6单克隆抗体可以与FSTL1蛋白结合，而不能与TGF-β1或FS结合，这说明2K6单克隆抗体与FSTL1的结合极为特异。已有研究证明FSTL1发挥生物功能主要通过促进TGF-β1信号通路活性，具体机制为FSTL1可同时与TGF-β1及TGF-β1二型受体结合，促进二者之间的相互作用，持续激活TGF-β1信号通路，因此我们检测2K6抗体是否可以干预FSTL1生物功能，即拮抗FSTL1与TGF-β1或TGF-β1受体结合。免疫沉淀实验结果显示2K6抗体可有效抑制FSTL1与TGF-β1以及FSTL1与TGF-β1受体的结合。

图2为鼠源FSTL1单克隆抗体2K6特异性和功能性检测。(A)通过MST对2K6与小鼠FSTL1蛋白相互作用的动力学分析。(B)使用FSTL1(顶部)，TGF-β1(中部)或Follistatin(FS；底部)对2K6进行亲和力检测。蛋白G琼脂糖免疫沉淀蛋白-抗体复合物，并进行FSTL1，TGF-β1和FS的蛋白质印迹分析。左泳道是重组蛋白的阳性对照。(C)Pull-down试验验证FSTL1抗体是否干扰FSTL1和TGF-β1的结合。使用Ni-NTA琼脂糖将带有His标记的FSTL1蛋白，TGF-β1蛋白和FSTL1抗体(或对照同种型抗体IgG2b)复合物下拉，然后用抗TGF-β1抗体进行Western印迹分析以确认TGFβ1的存在。用抗His抗体检测到FSTL1的存在。(D)Pull-down试验验证FSTL1抗体是否干扰FSTL1和TGF-β1的II型受体(TβRII)的结合。用Myc-His标记的Fstl1和HA标记的TβRII转染HEK293细胞，然后用FSTL1抗体或对照同型抗体IgG2b处理。用Ni-NTA琼脂糖将Myc-His标记的FSTL1下拉，然后用抗HA抗体进行Western印迹分析以确认TβRII的存在。用抗Myc抗体检测到FSTL1的存在。TCL，总细胞裂解物。

以上结果显示2K6可与FSTL1蛋白特异性结合，并可拮抗FSTL1与TGF-β1或TGF-β1受体结合，是具有中和活性的FSTL1特异性抗体。

实施例3.鼠源FSTL1单克隆抗体2K6可中和FSTL1生物功能。

通过免疫共沉淀实验确定2K6单克隆抗体的特异性后，我们利用两个体外细胞模型检测了FSTL1单克隆抗体2K6的生物活性。之前在关于风湿性关节炎的报道中发现Fstl1能够促进Cos7细胞中IL-6炎症因子的表达，因此我们构建了在Cos7细胞中转染Fstl1质粒的细胞模型，通过ELISA实验检测过表达Fstl1之后Cos7细胞分泌的炎症因子IL-6的表达含量。在Cos7细胞中转染pc-Fstl1质粒及对照pc-DNA3.1质粒24小时之后，外源加入2K6单克隆抗体及对照抗体IgG2b处理48小时，结果发现在单克隆抗体作用下Fstl1促进炎症反应的作用被明显逆转(图3A)。在关于心肌细胞肥大的报道中发现Fstl1能够抑制苯肾上腺素(PE)所诱导的心肌细胞肥厚，2K6单克隆抗体能够明显逆转Fstl1这种抑制作用(图3B)。

图3为鼠源FSTL1单克隆抗体2K6中和活性检测(A)将COS-7细胞用pcDNA3.1或pc-Fstl1质粒转染，然后用1μg/ml 2K6抗体或对照IgG2b处理48小时，并通过ELISA测定上清液中的IL-6。(B)用1μg/ml 2K6抗体或对照IgG2b预处理Sprague-Dawley大鼠的原代心肌细胞1小时，然后用100μM PE和100ng/ml FSTL1处理24h，在光学显微镜下观察形态学变化。标尺，100μm。*，P<0.05；***，P＜0.001。

以上结果表明2K6在不同细胞系，不同系统中都可中和FSTL1的活性，说明2K6是很好的FSTL1中和性抗体。

实施例4.鼠源FSTL1中和性抗体2K6可预防和治疗性缓解博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化且药效优于原有鼠源FSTL1中和性抗体22B6。

博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型在1-7天主要为炎症期，7-14天为早期纤维化进展阶段，14-21天为纤维化中晚期，因此在1-14天加以抗体干预可检测抗体预防性缓解作用，在7-21天加以抗体干预可检测抗体治疗性缓解作用。

雄性C57BL/6J(周龄8-10周)小鼠，经气管注射2U/kg博莱霉素，在博莱霉素处理第5、8、11天时，分别通过腹腔注射50ug FSTL1中和性抗体(2K6)或相对应的亚型(IgG2b)，造模14天后处死取材，检测胶原含量及肺纤维化面积比例(图4A)。博莱霉素(2U/kg)处理C57BL/6J小鼠诱导肺纤维化发生，处理后第5、8、11天经腹腔注射2K6抗体的小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量明显降低(图4B)，这说明2K6抗体确实能够减轻博莱霉素所诱导的胶原含量。对H&E染色组织切片进行纤维化的定量统计，发现注射2K6抗体的小鼠肺纤维化面积明显低于注射IgG2b的小鼠(图4C)。

图4为FSTL1中和性抗体2K6预防性缓解博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。(A)中和性抗体2K6处理小鼠的图示。2U/kg博莱霉素处理C57BL/6J小鼠(每组10只)后，不同时间点(第5、8、11天)经腹腔注射50μg FSTL1中和性抗体(2K6)或相对应的亚型(IgG2b)，博莱霉素处理14天后取样检测；(B)羟脯氨酸检测验证中和性抗体2K6抑制博莱霉素诱导的肺组织中胶原合成；(C)H&E染色的肺组织切片进行纤维化面积百分比统计，验证验证中和性抗体2K6抑制博莱霉素诱导的肺组织纤维化。**，P<0.01；***，P＜0.001。

雄性C57BL/6J(8-10周)小鼠，经气管注射2U/kg博莱霉素，在博莱霉素处理第8、11、14、17天时，分别通过腹腔注射50ug FSTL1中和性抗体(2K6)或相对应的亚型(IgG2b)，造模21天后处死取材，检测胶原含量及肺纤维化面积比例(图5A)。博莱霉素(2U/kg)处理C57BL/6J小鼠诱导肺纤维化发生，处理后第8、11、14、17天经腹腔注射2K6抗体的小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量明显降低(图5B)，同时对H&E染色组织切片进行纤维化的定量统计，发现注射2K6抗体的小鼠肺纤维化面积明显低于注射IgG2b的小鼠(图5C)。

图5为FSTL1中和性抗体2K6治疗性缓解博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。(A)中和性抗体2K6处理小鼠的图示。2U/kg博莱霉素处理C57BL/6J小鼠(每组10只)后，不同时间点(第8、11、14、17天)经腹腔注射50μg FSTL1中和性抗体(2K6)或相对应的亚型(IgG2b)，博莱霉素处理21天后取样检测；(B)羟脯氨酸检测验证中和性抗体2K6抑制博莱霉素诱导的肺组织中胶原合成；(C)H&E染色的肺组织切片进行纤维化面积百分比统计，验证验证中和性抗体2K6抑制博莱霉素诱导的肺组织纤维化。**，P<0.01；***，P＜0.001。

以上体内实验证明了阻断FSTL1活性的中和性抗体2K6在小鼠体内可以预防并治疗博莱霉素诱导的肺纤维化。前期我们通过传统杂交瘤技术制备了一个鼠源FSTL1中和性抗体22B6(参考文献J.Exp.Med.2015.212(2):235-252，专利CN201410326001.5-一种卵泡抑素样蛋白1的单克隆抗体及其应用[ZH])，通过对比同等剂量(50μg)2K6与22B6在预防和治疗博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化药效的实验数据，结果显示2K6对小鼠肺纤维化的预防和治疗效果要优于原有抗体22B6，即2K6实验组对肺纤维化关键指标—羟脯氨酸含量和肺纤维化面积比例的预防和治疗缓解率均高于22B6实验组，具体结果如下表所示：

表2. 2K6与22B6抗肺纤维化药效对比

注：抗体缓解率(％)即为(博莱霉素组平均值－抗体组平均值)÷博莱霉素组平均值×100。

实施例5.鼠源FSTL1中和性抗体2K6可预防和治疗性缓解博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化。

博莱霉素诱导的小鼠皮肤纤维化模型中7天之后为纤维化阶段，因此我们分别从第1天或第7天开始给予小鼠FSTL1中和性抗体，检测抗体预防或治疗小鼠皮肤纤维化的效果。

6-8周龄C57BL/6雄性小鼠麻醉后背部朝上，将背部下方两侧毛发剔除，暴露皮肤，用1ml胰岛素注射器将100μl 0.2U博莱霉素注射入小鼠背部皮肤皮下，两侧各100μl；中和性抗体组将10μg/ml中和性抗体和100μl博莱霉素混合后打入小鼠背部皮下，从D1天开始每天注射一次，直至D14取材；每组小鼠数量为10只(图6A)。皮肤纤维化明显的病理特征是真皮层增厚，FSTL1中和性抗体可显著减弱博莱霉素诱导的小鼠皮肤纤维化：石蜡切片和H&E染色结果显示中和性抗体组小鼠在博莱霉素造模之后皮肤厚度明显小于对照博莱霉素组(图6B)，皮肤厚度统计结果也说明了这一点(图6C)。

图6为FSTL1中和性抗体2K6预防性缓解博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化。(A)博莱霉素诱导的C57BL/6J小鼠皮肤纤维化模型。博莱霉素(20mg)每天皮下注射至小鼠的上背部，连续100天，总体积为100μl，每天以相同的总体积与博莱霉素联合施用FSTL1 nAbs(10μg/ml)(n＝10)。(B)博来霉素处理过的小鼠皮肤的H&E染色(上)和α-SMA免疫组织化学染色(下)切片的代表性图像。标尺，100μm。(C)真皮厚度数据统计。**，P<0.01。

6-8周龄C57BL/6雄性小鼠麻醉后背部朝上，将背部下方两侧毛发剔除，暴露皮肤，用1ml胰岛素注射器将100μl 0.2U博莱霉素注射入小鼠背部皮肤皮下，两侧各100μl；中和性抗体组将10μg/ml中和性抗体和100μl博莱霉素混合后打入小鼠背部皮下，从D7天开始每天注射一次，直至D14取材；每组小鼠数量为10只(图7A)。皮肤纤维化明显的病理特征是真皮层增厚，FSTL1中和性抗体可显著减弱博莱霉素诱导的小鼠皮肤纤维化：石蜡切片和H&E染色结果显示中和性抗体组小鼠在博莱霉素造模之后皮肤厚度明显小于对照博莱霉素组(图7B)，皮肤厚度统计结果也说明了这一点(图7C)。

图7为FSTL1中和性抗体2K6治疗性缓解博莱霉素所诱导的小鼠皮肤纤维化。(A)博莱霉素诱导的C57BL/6J小鼠皮肤纤维化模型。博莱霉素(20mg)每天皮下注射至小鼠的上背部，连续100天，总体积为100μl，从第7天开始每天以相同的总体积与博莱霉素联合施用FSTL1 nAbs(10μg/ml)(n＝10)。(B)博来霉素处理过的小鼠皮肤的H&E染色(上)和α-SMA免疫组织化学染色(下)切片的代表性图像。标尺，100μm。(C)真皮厚度数据统计。***，P＜0.001。

以上体内实验证明了阻断FSTL1活性的中和性抗体2K6在小鼠体内可以预防并治疗博莱霉素诱导的皮肤纤维化。

实施例6.鼠源FSTL1中和性抗体2K6可预防和治疗性缓解TGF-β1所诱导的人皮肤外植体纤维化。

我们已证实抗FSTL1中和性抗体可减弱博莱霉素诱导的小鼠皮肤纤维化，为了进一步研究FSTL1在皮肤纤维化中的作用，我们利用北京武警三院提供的临床皮肤标本建立了人皮肤外植体纤维化模型。因为TGF-β1是已知的促纤维化因子，我们通过皮内注射重组人源TGF-β1蛋白来诱导人皮肤外植体纤维化，每组皮肤外植体组织块的数量为5个。文献显示皮肤外植体模型的周期为7天，因此我们分别在第1天或第3天给予中和性抗体观察抗体对人皮肤外植体模型的预防或治疗效果。

将手术新鲜取下的皮肤组织在超净台剥离去多余脂肪组织，仅余表皮层和真皮层，之后切割为面积1.5cm见方的组织块，用1ml胰岛素注射器将10ng/ml的TGF-β1蛋白皮内注射到皮肤组织中，中和性抗体组将10μg/ml浓度的中和性抗体同10ng/ml的TGF-β1蛋白混合后打入皮下，总体积为100μl，之后将皮肤组织在细胞培养箱内培养一周(图8A)。在注射TGF-β1一周之后，H&E染色结果证实人皮肤组织经TGF-β1诱导后出现真皮层增厚现象，Masson染色显示TGF-β1处理的皮肤组织中胶原沉积明显增多，皮肤厚度统计结果也支持这一结果；H&E和Masson染色结果均显示中和性抗体注射之后，皮肤组织厚度明显小于对照抗体组，且胶原沉积较对照组减少(图8B)，皮肤厚度统计值也印证了同样的结论(图8C)，说明抗FSTL1中和性抗体可预防性缓解TGF-β1诱导的人皮肤外植体纤维化。

图8为FSTL1中和性抗体2K6预防性缓解TGF-β1所诱导的人皮肤外植体纤维化。(A)在TGF-β1诱导的人皮肤纤维化模型中FSTL1中和性抗体的预防模型。将2K6抗体(10μg/ml)与TGF-β1(10ng/ml)一起皮内注射到培养的人皮肤中(n＝5)，并在1周后收集皮肤组织。PBS用作阴性对照。(B)经TGF-β1处理的人皮肤的H&E(上)和Masson三色(下)染色切片的代表性图像。标尺，100μm。(C)真皮厚度统计数据。***，P＜0.001。

将手术新鲜取下的皮肤组织在超净台剥离去多余脂肪组织，仅余表皮层和真皮层，之后切割为面积1.5cm见方的组织块，用1ml胰岛素注射器将10ng/ml的TGF-β1蛋白皮内注射到皮肤组织中，中和性抗体组将10μg/ml浓度的中和性抗体在TGF-β1蛋白处理后第3天打入皮下，之后继续培养皮肤组织至第7天(图8A)。在注射TGF-β1一周之后，H&E染色结果证实人皮肤组织经TGF-β1诱导后出现真皮层增厚现象，Masson染色显示TGF-β1处理的皮肤组织中胶原沉积明显增多，皮肤厚度统计结果也支持这一结果；H&E和Masson染色结果均显示中和性抗体注射之后，皮肤组织厚度明显小于对照抗体组，且胶原沉积较对照组减少(图8B)，皮肤厚度统计值也印证了同样的结论(图8C)，说明抗FSTL1中和性抗体可治疗性缓解TGF-β1诱导的人皮肤外植体纤维化。

图9为FSTL1中和性抗体2K6治疗性缓解TGF-β1所诱导的人皮肤外植体纤维化。(A)在TGF-β1诱导的人皮肤纤维化模型中FSTL1中和性抗体的治疗模型。将TGF-β1(10ng/ml)皮内注射到培养的人皮肤中(n＝5)，2K6抗体(10μg/ml)在TGF-β1注射3天后注射到培养的皮肤组织中，第7天收集皮肤组织。PBS用作阴性对照。(B)经TGF-β1处理的人皮肤的H&E(上)和Masson三色(下)染色切片的代表性图像。标尺，100μm。(C)真皮厚度统计数据。*，P<0.05；**，P<0.01。

以上体内实验证明了阻断FSTL1活性的中和性抗体2K6可预防和治疗性缓解TGF-β1所诱导的人皮肤外植体纤维化。

实施例7.鼠源FSTL1中和性抗体2K6减轻胶原所诱导的小鼠关节炎。

类风湿性关节炎的致病原因和发病机制尚不清楚。已有研究发现FSTL1在类风湿性关节炎中作为一种自身抗原发挥作用，FSTL1可能是炎症疾病如类风湿性关节炎发病过程中的重要细胞因子。为了检测抗FSTL1中和性抗体在关节炎中的作用，我们建立了牛II型胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)模型，并在二次免疫之后连续六周对小鼠腹腔注射中和性抗体和对照IgG(每周两次，50μg每只)，通过观察统计检测小鼠关节炎严重程度(图10A)。实验结果显示，用抗FSTL1中和性抗体屏蔽FSTL1功能后，CIA模型中小鼠小鼠爪子肿胀程度显著减弱(图10B-C)，关节炎指数明显降低(图10D)。此外，类风湿性关节炎的病理特征表现为滑膜增生和炎症细胞浸润。在小鼠关节炎模型造模结束后，将小鼠的膝关节和肘关节取下，通过石腊包埋切片和H&E染色观察关节病理状况。结果如图10E所示，对照抗体组小鼠关节同正常小鼠关节切片对比，明显有炎症细胞浸润，滑膜增厚以及软骨组织和骨组织结构的破坏等现象，而中和性抗体组小鼠的关节炎症程度较低，滑膜增生较少，软骨组织和骨组织结构完整，未有血管翳存在，说明抗FSTL1中和性抗体可保护骨关节，降低其在关节炎发病过程中的损害。

图10为FSTL1中和性抗体2K6减轻胶原所诱导的小鼠关节炎。(A)CIA模型的干预给药方案。在第0天和第21天用II型胶原免疫DBA/1小鼠以诱导CIA。在第21天后每周两次给予2K6中和性抗体及其同型匹配的对照IgG2b(50μg/小鼠/时间点；每组n＝10)，在第60天处死小鼠。(B-C)小鼠爪子肿胀图片和统计。(D)平均关节炎指数。(E)小鼠膝关节和肘关节切片H&E染色。标尺，100μm。***，P＜0.001。

以上实验结果说明FSTL1中和性抗体可以缓解胶原诱导的小鼠关节炎。

基于以上研究成果，卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)在促进皮肤纤维化疾病进程中具有关键功能，且可阻断卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)活性的中和性抗体(2K6)可应用于治疗、缓解或改善肺纤维化、皮肤纤维化和关节炎疾病或症状的药物的制备。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一种卵泡抑素样蛋白1的中和性抗体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 1

gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattgtg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtagtag cactagctac 180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catcccagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga gttctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc acgaatcgac 300

tatgattact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Cys Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 336

<212> DNA

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 3

gatgttttga tgacccaaac tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatcta 300

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 4

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种鼠源FSTL1中和性抗体2K6或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ NO ID:2的氨基酸序号26至34的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQNO ID:2的氨基酸序号52至58的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ NO ID:2的氨基酸序号97至106的氨基酸序列构成的CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ NO ID:4的氨基酸序号27至38的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ NO ID:4的氨基酸序号56至58的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ NO ID:4的氨基酸序号95至102的氨基酸序列构成的CDR3。

2.如权利要求1所述的鼠源FSTL1中和性抗体2K6或其抗原结合片段，其中，包含由SEQNO ID:2的氨基酸序号1至117的氨基酸序列构成的重链可变区和由SEQ NO ID:4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区。

3.如权利要求1或2所述的鼠源FSTL1中和性抗体2K6或其抗原结合片段，其中，所述鼠源FSTL1抗体选自由下述(a)～(b)组成的组：(a)鼠源FSTL1中和性抗体，其包含由SEQ NOID:2所示的氨基酸序列构成的重链和由SEQ NO ID:4所示的氨基酸序列构成的轻链；以及(b)鼠源FSTL1中和性抗体，其是通过(a)所述的FSTL1抗体的翻译后修饰生成的抗体。

4.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物包含权利要求1或2所述的鼠源FSTL1中和性抗体2K6。

5.如权利要求4所述的药物组合物在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。

6.如权利要求4所述的药物组合物在制备治疗皮肤纤维化疾病的药物中的应用。

7.如权利要求4所述的药物组合物在制备治疗关节炎疾病的药物中的应用。