CN112159378A

CN112159378A - 一种吉马烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112159378A
Application number: CN202010880632.7A
Authority: CN
Inventors: 顾琼; 孙喆君; 张毓婷; 徐峻
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN112159378B

Abstract

本发明公开了一种吉马烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用。该吉马烷型倍半萜内酯类化合物，具有如式(Ⅰ)～(Ⅳ)所示结构式：

其中，R₁为H或OH；R₂为OH、OMeacr或OEt；R₃为OAng、OH或OMeacr；R₄为OTig或OAng；R₅为CH₂OH或CHO。本发明提供的吉马烷型倍半萜类化合物对于RANKL诱导的破骨细胞具有明显的抑制分化效果，绝大多数化合物的IC50均在10.0μM以下，且在10μM下不显示细胞毒性，可应用于制备治疗和/或预防骨质疏松的药物，具有较好的应用前景。

Description

一种吉马烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化合物及医药技术领域，特别涉及一种吉马烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

骨质疏松(osteoporosis)是多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病，以绝经期妇女及老年人的原发性骨质疏松最为多见。由于人口老龄化的加剧，骨质疏松已经成为全球性公共健康问题，严重影响了中老年人的生活质量。

骨质疏松的发病机制较为复杂，但最终都导致成骨细胞作用下的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间维持的动态平衡被打破，从而骨吸收作用大于骨形成，致使骨量丢失而发生骨质疏松。RANKL/RANK/OPG和Wnt/β-catenin通路是影响骨代谢的重要通路(董冰子,孙晓方.骨质疏松症治疗新进展:从分子机制到药物靶点[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2018,11(06):620-627)，目前针对骨质疏松的药物多通过作用于这些通路的关键靶点调节骨吸收和骨形成之间的平衡。很多药物尚在临床试验和安全评估甚至基础研究阶段，上市药物大多靶点单一、治疗范围较窄且存在不良反应，寻找高效低毒的抗骨质疏松药物是临床上亟需的。

发明内容

本发明的目的在于克服目前临床上抗骨质疏松药物靶点单一、治疗范围较窄且存在不良反应的缺陷或不足，提供一种吉马烷型倍半萜内酯类化合物。本发明提供的吉马烷型倍半萜类化合物对于RANKL诱导的破骨细胞具有明显的抑制分化效果，绝大多数化合物的IC50均在10.0μM以下，且在10μM下不显示细胞毒性，可应用于制备治疗和/或预防骨质疏松的药物，具有较好的应用前景。

本发明的另一目的在于提供上述吉马烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述吉马烷型倍半萜内酯类化合物在制备预防或治疗骨质疏松的药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种预防和/或治疗骨质疏松的药物。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种吉马烷型倍半萜内酯类化合物，具有如式(Ⅰ)～(Ⅳ)所示结构式：

其中，R₁为H或OH；R₂为OH、OMeacr(甲基丙烯酰氧基)或OEt；R₃为OAng、OH或OMeacr(甲基丙烯酰氧基)；R₄为OTig或OAng；R₅为CH₂OH或CHO。

中药豨莶草作为我国常用中药，有祛风湿、利关节、清热解毒之效，临床用于治疗风湿痹痛，筋骨无力，腰膝酸软，四肢麻痹，半身不遂，风疹湿疮等。收录于《中国药典》2015版第一部。

菊科豨莶属植物豨莶Siegesbeckia orientalis L.、腺梗豨莶Siegesbeckiapubescens M.和毛梗豨莶Siegesbeckia glabrescens M.都作为中药豨莶草的来源植物，文献(Zhang Q R,Zhong Z F,Sang W,et al.Comparative comprehension on the anti-rheumatic Chinese herbal medicine Siegesbeckiae Herba:Combined computationalpredictions and experimental investigations[J].Journal of Ethnopharmacology,2018,228.)报导三者药理活性相近，但化学成分有所差异。腺梗豨莶为双子叶菊科豨莶属植物。分布于我国东北、西南各地。腺梗豨莶所含物质主要为吉马烷型、愈创木烷型倍半萜，海松烷型、贝壳杉烷型二萜。现代药理学研究揭示豨莶属植物中提取的单体化合物具有抗炎、降压、抑制免疫、抗菌抗疟等药理作用。

本发明的发明人在对腺梗豨莶研究时，从腺梗豨莶提取出了数种吉马烷型倍半萜内酯类化合物，这些吉马烷型倍半萜内酯类化合物对于RANKL诱导的破骨细胞具有明显的抑制分化效果，绝大多数化合物的IC₅₀均在10.0μM以下。尤其地，化合物XX-1、XX-8、XX-9、和XX-10抗破骨细胞分化活性的IC₅₀均在1μM以下，对以上4个化合物的药效评价显示其能够阻断下游NF-κB以及NFATc1通路，显著抑制破骨细胞分化。且在10μM下不显示细胞毒性。由此从腺梗豨莶中提取的吉马烷型倍半萜类化合物可应用于制备治疗和/或预防骨质疏松的药物，具有较好的应用前景。

优选地，所述R₁为H，R₂为OEt，R₃为OMeacr；或R₄为OAng；或R₅为CH₂OH或CHO。

上述吉马烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，包括如下步骤：

S1：将腺梗豨莶的地上部分干燥，粉碎，浸提，减压浓缩得粗提物；

S2：将粗提物混悬，萃取，减压浓缩，经色谱柱或葡聚糖凝胶柱洗脱，层析和高效液相色谱分离后，即得所述吉马烷型倍半萜内酯类化合物。

优选地，S1中利用乙醇溶液浸提。

更为优选地，S1中所述乙醇溶液的体积分数为85～95％。

优选地，S1中浸提的次数为3～4次，单次浸提的时间为2～5天。

优选地，S2中利用乙酸乙酯萃取。

优选地，S2中洗脱的洗脱液为二氯甲烷/甲醇混合溶液；洗脱的梯度为：二氯甲烷/甲醇的体积比为0→40min：1:0→100:1，40→80min：100:1→50:1，80→120min：50:1→20:1，120→160min：20:1→10:1。

具体地，所述吉马烷型倍半萜内酯类化合物通过如下过程制备得到：

将腺梗豨莶的干燥地上部分粉碎成小段，用85～95％乙醇水溶液，在室温下浸提3～4次，每次2～5天；将提取液减压浓缩得粗提物浸膏；将浸膏混悬于水中，用乙酸乙酯萃取3～6次，减压浓缩得乙酸乙酯部位，经200～300目的硅胶柱色谱，用二氯甲烷/甲醇按照梯度洗脱；梯度洗脱中二氯甲烷/甲醇的体积比为0→40min：1:0→100:1，40→80min：100:1→50:1，80→120min：50:1→20:1，120→160min：20:1→10:1。再将上述步骤当中得到的馏分依次通过硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱纯化，即得。

上述吉马烷型倍半萜内酯类化合物在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的应用也在本发明的保护范围内。

一种预防和/或治疗骨质疏松的药物，所述药物中含有上述吉马烷型倍半萜类化合物、药学上可接受的载体或辅料中的一种或几种；所述药物中倍半萜类化合物、药学上可接受的载体或辅料的质量分数为0.1～99％。

本发明的预防和/或治疗骨质疏松的药物可以制成现有的各种药物制剂类型。

优选地，所述药物的剂型为注射液、片剂或胶囊。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

本发明提供的吉马烷型倍半萜内酯类化合物对于RANKL诱导的破骨细胞具有明显的抑制分化效果，绝大多数化合物的IC₅₀均在10.0μM以下。尤其地，化合物XX-1、XX-8、XX-9、和XX-10抗破骨细胞分化活性的IC₅₀均在1μM以下，对以上4个化合物的药效评价显示其能够阻断下游NF-κB以及NFATc1通路，显著抑制破骨细胞分化。且在10μM下不显示细胞毒性。由此从腺梗豨莶中提取的吉马烷型倍半萜类化合物可应用于制备治疗和/或预防骨质疏松的药物，具有较好的应用前景。

附图说明

图1分离所得化合物结构XX-1～XX-10；

图2为化合物XX-1,XX-6主要的¹H-¹H COSY

HMBC

和NOESY

相关

图3为化合物XX-1,XX-6的ECD光谱；

图4为化合物XX-1～XX-10对RANKL诱导的破骨细胞抑制结果图；A：XX-1～XX-10对BMM细胞的毒性测定；B,C：XX-1～XX-10在不同浓度下对破骨细胞分化的影响；D：XX-1，XX-8，XX-9，XX-10的TRAcP染色实验结果图；

图5为化合物XX-1，XX-4，XX-6，XX-8，XX-9，XX-10的荧光素酶报告基因实验结果图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

从腺梗豨莶中制备XX-1～XX-10。

腺梗豨莶干燥地上部分(5.0kg)，粉碎成小段，用95％乙醇水溶液，在室温下浸提3次，每次3天；将提取液减压浓缩得粗提物浸膏；将浸膏混悬于水中，用乙酸乙酯萃取5次，减压浓缩得乙酸乙酯部位，经200～300目的硅胶柱色谱，用二氯甲烷/甲醇按照梯度洗脱。梯度洗脱中二氯甲烷/甲醇的体积比依次为0→40min：1:0→100:1，40→80min：100:1→50:1，80→120min：50:1→20:1，120→160min：20:1→10:1。经薄层色谱鉴别之后划分浓缩为5个馏分(A～E)。将馏分C(50g)经反相柱层析，用甲醇/水(30％～100％)洗脱，得化合物XX-4(300mg)。馏分C3经葡聚糖凝胶柱用甲醇洗脱，划分为三个组分C3.1～C3.3，C3.2通过高效液相色谱分离得到化合物XX-1(30mg)，XX-3(20mg)，XX-5(5mg)，XX-6(5mg)。C3.3通过高效液相色谱分离得到化合物XX-7(8mg)，XX-8(12mg)，XX-9(10mg)。C4通过高效液相色谱分离得到化合物XX-2(20mg)，XX-10(30mg)。化合物结构见图1。

10个单体化合物理化性质数据如下：

XX-1，无色胶状，C₂₁H₂₆O₆，EI-MS m/z：397.13[M+Na]⁺；

+7(c 0.1，MeOH)；HRESIMSm/z 397.1623[M+Na]⁺(calcd for C₂₁H₂₆O₆，397.1622)；UV(MeOH)λ_max(logε)195(0.32)，203(1.12)nm；IR(KBr)ν_max 3372，2933，1714，1675，1459，1399，1031cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：9.44(d，J＝2.1Hz，H-14)，6.74(dd，J＝10.0，7.4Hz，H-1)，6.55(dd，J＝8.3，1.7Hz，H-8)，6.21(d，J＝3.5Hz，H-13a)，6.02(brs，H-5a)，5.83(d，J＝3.5Hz，H-13b)，5.55(t，J＝1.2Hz，H-5’)，5.02(t，J＝10.0Hz，H-6)，4.90(dd，J＝10.0，1.5Hz，H-5b)，3.65(dd，J＝8.3，2.2Hz，H-9)，3.37(dq，J＝9.2，7.0Hz，H-1’a)，3.06(dq，J＝9.2，7.0Hz，H-1’b)，2.67(m，H-2a)，2.59(dtd，J＝10.0，3.3，1.7Hz，H-7)，2.41(ddd，J＝12.0，5.9，2.3Hz，H-3a)，2.32(m，H-2b)，2.07(td，J＝12.0，2.3，H-3b)，1.91(brs，H₃-15)，1.91(brs，H₃-6’)，1.01(t，J＝7.0Hz，H₃-2’).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)δ：194.3(C-14)，169.6(C-12)，165.9(C-3')，156.0(C-1)，141.3(C-10)，137.1(C-4)，136.1(C-4’)，134.2(C-11)，127.3(C-5)，125.7(C-5)，122.3(C-13)，75.2(C-6)，70.1(C-8)，64.6(C-1’)，50.9(C-7)，36.9(C-3)，26.5(C-2)，18.5(C-6’)，17.0(C-15)，15.1(C-2’)。

XX-2，无色胶状，C₂₀H₂₄O₇，EI-MS m/z：385.22[M+Na]⁺；¹H NMR(400MHz，MeOD)δ：9.47(d，J＝2.1Hz，H-14)，6.79(dd，J＝10.2，7.4Hz，H-1)，6.58(dd，J＝8.4，1.6Hz，H-8)，6.19(overlap，H-3’a)，6.16(overlap，H-13a)，5.75(d，J＝3.1Hz，H-13b)，5.67(t，J＝1.6Hz，H-3’b)，5.36(t，J＝10.1Hz，H-6)，5.13(t，J＝10.6Hz，H-5)，4.49(dd，J＝13.1，1.1Hz，H-15a)，4.26(d，J＝13.1Hz，H-15b)，4.19(dd，J＝8.4，2.1Hz，H-9)，2.86(m，H-7)，2.82(m，H-3a)，2.68(m，H-2a)，2.56(m，H-2b)，2.05(td，J＝12.7，2.4Hz，H-3b)，1.98(s，Me-4’)；¹³CNMR(100MHz，MeOD)δ：197.1(C-14)，171.3(C-12)，167.9(C-1’)，157.5(C-1)，145.9(C-4)，142.4(C-10)，137.5(C-2’)，136.9(C-11)，129.3(C-5)，126.7(C-3’)，121.3(C-13)，75.7(C-6)，72.8(C-8)，69.8(C-9)，60.6(C-15)，52.3(C-7)，33.1(C-3)，27.8(C-2)，18.6(C-4’)。

XX-3，无色胶状，C₁₉H₂₂O₆，EI-MS m/z：369.18[M+Na]⁺；¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ9.42(s，H-14)，6.73(ddd，J＝9.5，7.5，1.5Hz，H-1)，6.35(d，J＝2.2Hz，H-13a)，6.12(s，H-3’a)，5.65(brs，H-13b)，5.61(brs，H-3’b)，5.35(d，J＝8.4Hz，H-8)，5.21(t，J＝10.0Hz，H-6)，5.12(d，J＝8.4Hz，H-9)，4.88(d，J＝10.0Hz，H-5)，2.95(q，J＝12.2Hz，H-2a)，2.62(m，H-2b)，2.46(m，H-3a)，2.42(m，H-7)，2.08(t，J＝12.2Hz，H-3b)，1.98(s，H₃-15)，1.92(s，H₃-4’)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃):δ194.4(C-14)，169.8(C-12)，167.0(C-1’)，159.6(C-1)，141.6(C-10)，138.5(C-4)，136.0(C-11)，135.9(C-2’)，127.1(C-5)，127.0(C-3’)，120.6(C-13)，74.5(C-6)，73.5(C-9)，68.2(C-8)，51.6(C-7)，37.1(C-3)，27.1(C-2)，18.4(C-15)，17.2(C-4’)。

XX-4，无色胶状，C₂₁H₂₆O₇，EI-MS m/z：413.17[M+Na]⁺；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：9.39(s，H-14)，6.74(dd，J＝10.1，7.4Hz，H-1)，6.46(d，J＝7.2，H-8)，6.13(d，J＝3.4Hz，H-13a)，6.03(s，H-3’a)，5.78(d，J＝3.4Hz，H-13b)，5.51(s，H-3’b)，5.19(t，J＝10.2Hz，H-6)，4.94(d，J＝10.2Hz，H-5)，4.38(d，J＝12.8Hz，H-15a)，4.28(d，J＝12.8Hz，H-15b)，3.90(dd，J＝8.3，2.1Hz，H-9)，3.28(m，H-5’a)，3.03(m，H-5’b)，2.75(m，H-2)，2.65(m，C-3a)，2.60(m，C-7)，2.51(m，C-2b)，1.94(m，H-3b)，1.86(s，H₃-4’)，0.94(t，J＝7.0Hz，H₃-6’).¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ：194.9(C-14)，169.8(C-12)，166.1(C-1’)，156.5(C-1)，141.2(C-10)，140.5(C-4)，135.9(C-2’)，134.2(C-11)，128.5(C-5)，125.9(C-3’)，122.1(C-13)，75.9(C-9)，74.0(C-6)，70.2(C-8)，64.4(C-5’)，60.5(C-15)，50.8(C-7)，32.6(C-3)，27.5(C-2)，18.3(C-4’)，14.9(C-6’)。

XX-5，无色胶状，C₂₂H₂₈O₇，EI-MS m/z：427.20[M+Na]⁺；¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：9.50(s，H-14)，6.76(t，J＝9.8Hz，H-1)，6.62(d，J＝8.4Hz，H-8)，6.27(d，J＝2.9Hz，H-13a)，6.04(q，J＝7.2Hz，H-3’)，5.90(s，H-13b)，5.19(t，J＝10.1Hz，H-6)，5.02(d，J＝10.6Hz，H-5)，4.46(d，J＝12.6Hz，H-15a)，4.35(dd，J＝12.9，4.1Hz，H-15b)，3.93(d，J＝8.3Hz，H-9)，3.37(dq，J＝9.0，7.0，H-6’a)，3.09(dq，J＝9.0，7.0，H-6’b)，2.84(dd，J＝12.5，5.6Hz，H-3a)，2.71(m，H-7)，2.64(d，J＝9.8Hz，H-2a)，2.58(dd，J＝14.4，12.5Hz，H-2b)，2.01(m，H-3b，1.95(d，J＝7.3Hz，H₃-4’)，1.87(s，H₃-5’)，1.05(t，J＝7.0Hz，H₃-7’)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ：194.5(C-14)，169.6(C-12)，166.6(C-1’)，155.8(C-1)，141.6(C-4)，139.9(C-10)，138.2(C-3’)，134.0(C-11)，129.4(C-5)，127.5(C-2’)，122.8(C-13)，76.3(C-9)，74.0(C-6)，69.2(C-8)，64.6(C-6’)，60.9(C-15)，51.1(C-7)，32.7(C-3)，27.6(C-2)，20.7(C-5’)，15.8(C-7’)，15.1(C-4’)。

XX-6，无色胶状，C₂₁H₂₆O₇，EI-MS m/z：427.20[M+Na]⁺；

+7(c 0.1，MeOH)；HRESIMSm/z 397.1623[M+Na]⁺(calcd for C₂₁H₂₆O₆，397.1622)；UV(MeOH)λ_max(logε)195(0.32)，203(1.12)nm；IR(KBr)ν_max 3372，2933，1714，1675，1459，1399，1031cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：6.23(d，J＝3.2Hz，H-13a)，6.09(dd，J＝9.3，1.9Hz，H-8)，6.03(brs，H-3’a)，5.76(t，J＝8.5Hz，H-1)，5.68(d，J＝3.2Hz，H-13b)，5.59(t，J＝1.5Hz，H-3’b)，5.44(d，J＝9.3Hz，H-9)，5.11(t，J＝11.0Hz，H-6)，5.04(d，J＝11.0Hz，H-5)，4.38(d，J＝12.5Hz，C-14a)，4.20(d，J＝12.5Hz，H-14b)，3.32(m，H-7)，2.42(m，H-2a)，2.29(m，C-2b)，2.00(d，J＝1.3Hz，H₃-15)，1.92(s，H₃-6’)，1.90(s，H₃-4’)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：169.8(C-12)，169.8(C-5’)，166.4(C-1’)，139.3(C-4)，136.3(C-10)，135.5(C-2’)，134.8(C-11)，134.5(C-1)，126.9(C-3’)，126.1(C-5)，121.4(C-13)，75.7(C-6)，72.8(C-9)，70.2(C-8)，64.2(C-14)，50.8(C-7)，37.9(C-3)，25.5(C-2)，21.0(C-6’)，18.4(C-4’)，17.0(C-15)。

XX-7，无色胶状，C₂₀H₂₈O₆，EI-MS m/z：387.41[M+Na]⁺；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：6.79(m，H-3’)，6.26(d，J＝1.9Hz，H-13a)，5.68(m，H-13b)，5.33(m，H-8)，4.94(brs，H-6)，4.15(d，J＝4.3Hz，H-14)，3.44(dd，J＝5.4，5.3Hz，H₂-15)，3.15(brs，H-7)，2.72(dd，J＝13.9，10.1Hz，H-9a)，2.59(dd，J＝13.9，5.4Hz，H-9b)，1.88(m，H-4)，1.78(d，J＝1.3Hz，H₃-4’)，1.76(s，H₃-5’)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ167.0(C-12)，167.4(C-1’)，139.0(C-3’)，136.9(C-11)，133.6(C-10)，131.3(C-1)，128.1(C-2’)，123.9(C-13)，79.2(C-6)，76.9(C-8)，68.1(C-15)，67.8(C-14)，42.2(C-7)，40.5(C-4)，31.0(C-5)，30.3(C-9)，26.6(C-2)，14.7(C-4’)，12.0(C-5’)。

XX-8，无色胶状，C₁₉H₂₆O₆，EI-MS m/z：373.32[M+Na]⁺；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：6.28(d，J＝2.0Hz，H-13a)，6.04(s，H-3’)，5.69(d，H-13b)，5.67(m，H-1)，5.39(m，H-8)，4.93(ddd，J＝6.0，4.4，2.0Hz，H-7)，4.15(d，J＝4.3Hz，H₂-14)，3.44(m，H₂-15)，3.16(t，J＝2.2Hz，H-7)，2.74(dd，J＝13.9，10.2Hz，H-9a)，2.60(dd，J＝13.9，5.4Hz，H-9b)，2.30(m，H₂-2)，2.02(m，H-5a)，1.95(dq,J＝7.3,1.6Hz,H₃-5’),1.80(t,J＝1.5Hz,H₃-4’)，1.55(ddd,J＝14.9,9.5,5.3Hz,H-5b)，1.19(m，H-3a)，1.14(m，H-3b)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：170.0(C-12)，167.1(C-1’)，140.1(C-3’)，136.9(C-11)，133.5(C-10)，131.6(C-1)，127.3(C-2’)，123.9(C-13)，79.3(C-6)，76.4(C-8)，68.0(C-15)，67.8(C-14)，42.3(C-4)，40.6(C-5)，31.1(C-9)，30.4(C-3)，26.6(C-2)，20.5(C-5’)，15.9(C-4’)。

XX-9，无色胶状，C₁₉H₂₆O₆，EI-MS m/z：373.32[M+Na]⁺；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：6.28(d，J＝2.0Hz，H-13)，6.04(t，J＝1.2Hz，H-3’a)，5.69(m，H-3)，5.57(t，J＝1.5Hz，H-6)，5.33(m，H-3’b)，4.93(ddd，J＝6.0，4.4，2.0Hz，H-8)，4.15(d，J＝4.3Hz，H₂-15)，3.47(m，H-7)，3.45(m，H-14a)，3.16(t，J＝2.2Hz，H-14b)，2.74(dd，J＝13.9，10.2Hz，H-5a)，2.60(dd，J＝13.9，5.4Hz，H-5b)，2.30(m，H₂-2)，2.06(m，H-9a)，2.02(m，H-1a)，1.95(m，H-10)，1.87(s，H₃-4’)，1.55(m，H-9b)，1.20(m，H-1b)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：169.9(C-12)，166.7(C-1’)，136.8(C-11)，135.7(C-2’)，133.4(C-4)，131.6(C-3)，126.9(C-3’)，124.0(C-13)，79.1(C-8)，77.4(C-6)，68.0(C-14)，67.9(C-15)，42.2(C-10)，40.5(C-9)，30.9(C-5)，30.3(C-1)，26.6(C-2)，18.3(C-4’)。

XX-10，无色胶状，C₁₉H₂₄O₆，EI-MS m/z：371.18[M+Na]⁺；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：9.46(s，H-15)，6.72(t，J＝8.2Hz，H-3)，6.25(d，J＝2.1Hz，H-13a)，5.97(t，J＝1.2Hz，H-3’a)，5.67(d，J＝1.9Hz，H-13b)，5.62(s，H-3’b)，5.47(m，H-6)，4.76(brs，H-8)，3.44(m，H-14)，2.93(dd，J＝14.5，5.5Hz，H-5a)，2.78(brs，H-7)，2.65(m，H₂-2)，2.64(m，H-5)，2.18(m，H-1a)，1.96(m，H-9a)，1.83(s，H₃-4’)，1.41(m，H-9b)，1.38(m，H-1b)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ：194.6(C-15)，169.6(C-12)，166.2(C-1’)，157.5(C-3)，138.7(C-4)，135.6(C-2’)，126.6(C-3’)，124.5(C-13)，79.2(C-8)，75.1(C-6)，67.5(C-14)，42.1(C-10)，40.4(C-9)，30.2(C-1)，27.9(C-2)，27.4(C-5)，18.2(C-4’)。

新化合物的结构解析：

XX-1，无色胶状。高分辨质谱显示其离子峰397.1623[M+Na]+，提示分子式为C₂₁H₂₆O₆，不饱和度为9。红外光谱(IR)给出羟基(3372cm^-1)，醛基(1714cm^-1)以及碳-碳双键(1675cm^-1)的特征吸收峰。其核磁数据与吉马烷型倍半萜内酯化合物(1(10)E,4Z,6α,8β,9α)-9-Ethoxy-6,15-dihydroxy-8-(2-methylacryloxy)-14-oxogermacra-1(10),4,11(13)-trieno-12,6-lactone(化合物XX-4)十分相似，除了XX-1在C-15处缺少了一个羟基。这一点由HMBC谱中H₃-15(δ_H 1.91)与C-3(δ_C 36.9)和C-5(δ_C 127.3)的相关证实，从而确定其平面结构。

化合物XX-1的相对构型由NMR ¹H以及NOESY谱确定，假设H-7为β朝向，那么H-6(δ_H5.02)/H-7(δ_H 2.59),H-7/H-8(δ_H 6.55),H-8/H-9(δ_H 3.65)之间的耦合常数(J_6,7＝10Hz,J_7,8＝1.7Hz,J_8,9＝8.3Hz)显示H-6,H-8和H-9分别为α,β,α朝向，同时这一点也部分由NOESY谱中H-6/H-9证明。此外H-1(δ_H 6.74)/H-14(δ_H 9.44)和H-3(δ_H 2.05)/H₃-15(δ_H 1.91)的NOESY相关也确定了1(10)E,4E的构型。化合物18的绝对构型通过计算CD的方法确证。采用量子化学中含时密度泛函理论(TD-DFT)，使用B3LYP/6-31G(d,p)机组在空气中进行构型优化，再选择PBE1PBE/6-31++G(2d,2P)机组水平，以甲醇为溶剂计算XX-1的ECD。计算结果和实验ECD值使用SpecDis处理转化进行比较，选择与实验值更契合的计算值对应的结构来确定XX-1的绝对构型为6S,7R,8R,9R。从而化合物XX-1的结构确定为(6R,8S,9S)-9-Ethoxy-6-hydroxy-8-methacryloxy-14-oxogermacra-1(10)E,4E,11(13)-triene-12,6-lactone。

XX-6，无色胶状。高分辨质谱显示其离子峰413.1570[M+Na]⁺，提示分子式为C₂₁H₂₆O₇，不饱和度为9。一维NMR谱显示XX-6的结构和XX-1相似，同时包含一个吉马烷型倍半萜内酯骨架，但较XX-1而言多出一个羰基(δ_C 169.80)和一个羟基(δ_C 64.21)，缺少一个醛基。通过HMBC谱中H-9(δ_H 5.44)和C-1’(δ_C 169.80)确定羰基位于1’位，C-14(δ_C 64.21)和H-1(δ_H5.76)与H-9(δ_H 5.44)的相关也确证了C-14上有羟基取代。由于化合物XX-6和XX-1的一维NMR谱与NOESY谱的相似程度，二者的相对构型基本相同，除了XX-6中H-5/H-15的NOESY相关所指示的4Z构型。化合物XX-6的绝对构型通过和上文相同的计算其ECD的方法确证。确定XX-6的绝对构型为6R，7S，8S，9S。从而化合物XX-6的结构确定为(1(10)E,4Z)-8S-(methacryloxy)-9S-(acetyloxy)-6R,14-dihydroxy-germacra-1(10),4,11(13)-triene-12,6-lactone。

化合物XX-1，XX-6的碳氢远程相关HMBC和氢氢远程相关COSY以及NOESY相关如图2，ECD光谱如图3。

化合物XX-1～XX-10的结构如图1所示。

实施例2

化合物抗骨质疏松活性测定。

一、细胞培养

本实验所用的共用到两种细胞：小鼠原代骨髓巨噬细胞(Bone Marrow Macrophage,BMM)和RAW264.7单核巨噬细胞。

(1)BMM细胞的分离培养：取8周龄的雌性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死后浸泡于75％乙醇消毒10min，后转移至超净工作台中解剖分离双后肢的胫骨和股骨，剪去多余的肌肉组织，使用含1％双抗的α-MEM培养基浸泡5min。剪开骨骼两端关节，置于含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1％双抗的α-MEM完全培养基中。用1mL注射器吹出骨髓细胞，用直径为40μM的细胞过滤器过滤骨髓细胞。将细胞悬液转移至离心管，1000rpm离心10min，去除上清。用含有10％FBS和25ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)的α-MEM培养液中重悬细胞，接种至直径为10cm的培养皿中。待细胞贴壁24小时后，弃去上清中未贴壁的细胞，使用新的α-MEM完全培养基将培养皿底部细胞吹打脱落，转移至离心管中，1000rpm离心10min，收集离心管底部的BMM细胞进行铺板。

(2)RAW264.7细胞的培养与传代：RAW264.7细胞为本实验室保存使用。复苏细胞后，培养于含1％双抗、10％FBS的α-MEM培养基中。当细胞生长至融合度为90％左右时，进行传代，吸除原有培养基，用培养基将细胞轻轻吹下，以1:4比例进行传代。所有细胞均置于5％CO₂的37℃恒温培养箱。

二、细胞毒性评价(CCK8法)

(1)将BMM细胞悬液调整为50000个/mL，接种于96孔细胞板中，每孔100μL，细胞密度为5000个/孔；细胞贴壁后，继续培养12h。

(2)将旧培养基更换成化合物终浓度为10μmol/L的含药培养基；设置3个复孔，设置对照组和调零孔(无细胞)，继续培养48h。

(3)弃去旧培养基，更换成100μL无血清培养基；避光操作，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于培养箱中孵育2小时。

(4)取出培养板，于450nm波长下测量吸光度值，根据各孔的吸光度计算细胞活力，计算方法如下：

三、破骨细胞分化及TRAcP染色实验

(2)用完全培养基配置待测化合物，将旧培养基更换成化合物终浓度为0.03、0.1、0.3、1、3、10μmol/L的含药培养基；设置3个复孔，设置对照组和调零孔(无细胞)。模型组和给药组用50ng/mL的RANKL刺激破骨细胞(OC)的分化，每隔一天更换一次培养基，直至4～5天后在显微镜下观察到模型组分化形成明显的OC。

(3)进行TRAcP染色。

a)固定：弃去96孔板中培养基，每孔加入35μL的4％多聚甲醛，室温固定细胞2小时。

b)洗板：弃去多聚甲醛，用100μL的ddH₂O洗涤三次。

c)染色：每孔加入35μL的TRAcP染液，于37℃下孵育1小时。

d)观察：显微镜下随机选择5个视野/每孔，计数成熟破骨细胞数。光学显微镜下被染为紫红色且细胞核数大于3的视作破骨细胞。

四、荧光素酶报告基因实验

(1)分别将p-NF-κB-TA-Luc和p-NFAT-TA-Luc稳定转染的Raw264.7细胞悬液的密度调整为500 000/mL，接种于96孔细胞板中，每孔100μL，细胞密度为50 000个/孔；细胞贴壁后，继续培养12h。

(2)诱导加药：用完全培养基配置待测化合物，将旧培养基更换成化合物终浓度为3和10μmol/L的含药培养基；每组设置3个复孔，对照组不用RANK处理，模型组和给药组用50ng/mL的RANKL刺激Raw264.7细胞8小时(检测NF-κB转录活性)和12小时(检测NFATc1转录活性)。

(3)检测：按照

单萤光素酶报告基因检测系统(Promega)说明书进行：配制1×Passive Lysis Buffer(PLB)细胞裂解液、Luciferase Assay ReagentⅡ(LARⅡ)检测液。弃去培养基，加入细胞裂解液1X Passive Lysis Buffer(20μL/孔)，放置在摇床上快摇20min。取10μL裂解后的样品于不透光的384孔白板中。设置检测间隔为500ms，以裂解样品与荧光素报告基因底物1：1的比例加入荧光素报告基因底物10μL，立即放置于多功能酶标仪检测其化学发光值，每次检测8个样品，统一每次操作的时间间隔。所得荧光值是NF-κB或NFAT载体转录翻译后所产生的萤光。根据所得数值，计算均值，重复实验三次，进行统计分析。

五、统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0进行数据分析，统计结果用均值(mean)±标准差(SD)表示，采用单因素方差分析比较组间差异(Bonferroni检验)。当p<0.05或<0.01被认为具有统计学意义。

10个化合物的抑制率如图4所示。

图1所示化合物在10μM下对于破骨细胞BMM几乎都有显著的抑制分化活性，在3μM下对于破骨细胞BMM大多也有明显的抑制作用。进一步的活性评价表明绝大多数化合物的IC₅₀均在10.0μM以下。尤其地，化合物XX-1，XX-8，XX-9和XX-10抗破骨细胞分化活性的IC₅₀均在1μM以下，分别为0.51,0.80,0.50,和0.83μM。荧光素酶报告基因实验显示化合物XX-1，XX-4，XX-6，XX-8，XX-9在10μM浓度下能够显著抑制NF-κB和NFATc1激活，如图5所示，从而揭示这些化合物是通过抑制NF-κB和NFATc1的转录活性从而调节破骨细胞分化。

实施例3

按实施例1的方法先制得式(Ⅰ)，(Ⅱ)，(Ⅲ)，(Ⅳ)，按常规加注射用水和吐温80，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例4

按实施例1的方法先制得式(Ⅰ)，(Ⅱ)，(Ⅲ)，(Ⅳ)，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤。再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例5

按实施例1的方法先制得式(Ⅰ)，(Ⅱ)，(Ⅲ)，(Ⅳ)，按其与赋形剂(例如淀粉浆)重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例6

按实施例1的方法先制得式(Ⅰ)，(Ⅱ)，(Ⅲ)，(Ⅳ)，按其与赋形剂(例如聚乙二醇400)重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

实施例7

按实施例1的方法先制得式(Ⅰ)，(Ⅱ)，(Ⅲ)，(Ⅳ)，按其与赋形剂(例如吐温80)重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种吉马烷型倍半萜内酯类化合物，其特征在于，具有如式(I)～(Ⅳ)所示结构式：

其中，R₁为H或OH；R₂为OH、OMeacr或OEt；R₃为OAng、OH或OMeacr；R₄为OTig或OAng；R₅为CH₂OH或CHO。

2.权利要求1所述吉马烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S1中利用乙醇溶液浸提。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，S1中所述乙醇溶液的体积分数为85～95％。

5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S1中浸提的次数为3～4次，单次浸提的时间为2～5天。

6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S2中利用乙酸乙酯萃取。

7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S2中洗脱的洗脱液为二氯甲烷/甲醇混合溶液；洗脱的梯度为：二氯甲烷/甲醇的体积比为0→40min：1:0→100:1，40→80min：100:1→50:1，80→120min：50:1→20:1，120→160min：20:1→10:1。

8.权利要求1所述吉马烷型倍半萜内酯类化合物在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的应用。

9.一种预防和/或治疗骨质疏松的药物，其特征在于，所述药物中含有权利要求1所述吉马烷型倍半萜类化合物、药学上可接受的载体或辅料中的一种或几种；所述药物中倍半萜类化合物、药学上可接受的载体或辅料的质量分数为0.1～99％。

10.根据权利要求9所述药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射液、片剂或胶囊。