CN112154914A - 利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法 - Google Patents

利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法 Download PDF

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李林轩
秦双双
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缪剑华
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Abstract

本发明公开了一种利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的0.5～4倍量；步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。步骤二中，培养的条件为：温度为22～28℃，光照时间为12h/d，光照强度为2500～3000Lux，培养时间为40～50d。步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。本发明通过在培养基中引入外源钙离子可有效提高山豆根组培苗中的生物碱的含量。

Description

利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法
技术领域
本发明涉及山豆根培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法。
背景技术
山豆根是广西著名的道地药材和常用大宗中药，又称广根豆，为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根茎，具有清热解毒、消肿利咽的功效，用于火毒蕴结、乳蛾喉痹、咽喉肿痛、齿龈肿痛，口舌生疮，是治疗肝炎、咽喉肿痛、抗肿瘤、痔疮、暗疮、皮肤病等近30种中成药产品的主要原料。根据《中国药典》(2015年版)标准，山豆根含苦参碱和氧化苦参碱的总量不得少于0.70％。山豆根中生物碱是主要活性成分，也是其药效的物质基础，但是，目前山豆根组培苗中生物碱含量低，影响山豆根的利用率。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，其通过在培养基中引入外源钙离子可有效提高山豆根组培苗中的生物碱的含量。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的0.5～4倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
优选的是，步骤二中，培养的条件为：温度为22～28℃，光照时间为12h/d，光照强度为2500～3000Lux，培养时间为40～50d。
优选的是，步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
优选的是，步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
优选的是，萘乙酸的浓度为0.5～1.5mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.1～0.5mg·L-1，蔗糖的浓度为15～25g·L－1，琼脂粉的浓度为3～5g·L－1，活性炭的浓度为0.3～0.7g·L－1。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明通过在培养基中引入外源钙离子可有效提高山豆根组培苗中的生物碱的含量。
第二、本发明培养山豆根组培苗的方法中，外源钙离子浓度在2.99-5.98mmol/L之间，可有效提高山豆根组培苗折干率，其体内活性氧能够协调一致，外源钙离子浓度为5.98mmol/L时，山豆根组培苗全株苦参碱和氧化苦参碱含量最高。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的0.5倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
步骤二中，培养的条件为：温度为22℃，光照时间为12h/d，光照强度为2500Lux，培养时间为40d。
步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
萘乙酸的浓度为0.5mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.1mg·L-1，蔗糖的浓度为1g·L－1，琼脂粉的浓度为3g·L－1，活性炭的浓度为0.3g·L－1。
<实施例2>
利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的4倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
步骤二中，培养的条件为：温度为28℃，光照时间为12h/d，光照强度为3000Lux，培养时间为50d。
步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
萘乙酸的浓度为1.5mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.5mg·L-1，蔗糖的浓度为25g·L－1，琼脂粉的浓度为5g·L－1，活性炭的浓度为0.7g·L－1。
<实施例3>
利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的0.5倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
步骤二中，培养的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2750Lux，培养时间为40～50d。
步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
萘乙酸的浓度为1.0mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.3mg·L-1，蔗糖的浓度为20g·L－1，琼脂粉的浓度为4g·L－1，活性炭的浓度为0.5g·L－1。
<实施例4>
利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的1倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
步骤二中，培养的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2750Lux，培养时间为40～50d。
步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
萘乙酸的浓度为1.0mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.3mg·L-1，蔗糖的浓度为20g·L－1，琼脂粉的浓度为4g·L－1，活性炭的浓度为0.5g·L－1。
<实施例5>
利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的2倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
步骤二中，培养的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2750Lux，培养时间为40～50d。
步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
萘乙酸的浓度为1.0mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.3mg·L-1，蔗糖的浓度为20g·L－1，琼脂粉的浓度为4g·L－1，活性炭的浓度为0.5g·L－1。
<实施例6>
利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的3倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
步骤二中，培养的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2750Lux，培养时间为40～50d。
步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
萘乙酸的浓度为1.0mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.3mg·L-1，蔗糖的浓度为20g·L－1，琼脂粉的浓度为4g·L－1，活性炭的浓度为0.5g·L－1。
<实施例7>
利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的4倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
步骤二中，培养的条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2750Lux，培养时间为40～50d。
步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
萘乙酸的浓度为1.0mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.3mg·L-1，蔗糖的浓度为20g·L－1，琼脂粉的浓度为4g·L－1，活性炭的浓度为0.5g·L－1。
实施例1～实施例7中，1/2MS培养基中钙离子(1/2MS培养基本身所含有的钙离子浓度)浓度为2.99mmol·L-1，实施例1～实施例3中的外源钙离子浓度为CCa＝1.495mmol·L-1，实施例4中的外源钙离子浓度为2.99mmol·L-1，实施例5中的外源钙离子浓度为CCa＝5.98mmol·L-1，实施例6中的外源钙离子浓度为CCa＝8.97mmol·L-1，实施例7中的外源钙离子浓度为CCa＝11.96mmol·L-1。
<对比例1>
采用实施例3的方法培养山豆根组培苗，其中，不同的是步骤一中未加入外源钙离子，即：向1/2MS培养基中加入萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基。
<实验表征>
1、山豆根组培苗的性状
取由实施例3～7、对比例1所获取的六组山豆根组培苗，计算每组山豆根组培苗中的山豆根组培苗的平均主根长、折干率、及每组山豆根组培苗的成活率，其中，每组山豆根组培苗的平均主根长(mm/株)＝每组山豆根组培苗中主根总长/每组山豆根组培苗的总株数，折干率(％)＝(每组山豆根组培苗的植株总干重/每组山豆根组培苗的植株总鲜重)×100％，结果如表1所示；
表1山豆根组培苗的生长性状
组别 平均根长(mm/株) 成活率(％) 折干率(％)
实施例3 6.25 100 13.84
实施例4 5.81 100 16.88
实施例5 4.18 100 18.03
实施例6 2.61 100 19.72
实施例7 2.49 100 21.30
对比例1 9.07 100 17.36
对比实施例3～7、对比例1的结果可知，第一、增加外源钙离子山豆根组培苗的存活率认为100％，第二、随着外源钙离子浓度的增加，山豆根组培苗的平均主根长低于对比例1，其中，实施例7所获取的山豆根组培苗的平均根长最短，第三、与对比例1相比，实施例7的山豆根组培苗的折干率为21.30％，明显高于对比例1，增加外源钙离子能够有效提高山豆根组培苗的折干率。
2、山豆根生理化指标
取由实施例3～7、对比例1所获取的六组山豆根组培苗，并检测每组山豆根组培苗中的可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素、MDA的含量及POD酶活性、SOD酶活性、CAT酶活性，其中，溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素、MDA(丙二醛)的含量如表2所示，POD酶活性、SOD酶活性、CAT酶活性如表3所示；
表2山豆根组培苗中可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素、MDA的含量
Figure BDA0002715784680000061
Figure BDA0002715784680000071
通过表2对比分析实施例3～7、对比例1可知，第一、随着外源钙离子浓度的增加，山豆根组培苗中可溶性糖含量呈现先升高后降低的趋势，实施例3中可溶性糖含量最高，比对比例1提高了10.0％，增加到5.81％；第二、随着外源钙离子浓度增加，山豆根组培苗中可溶性蛋白含量呈现先升高后降低的趋势，实施例5中可溶性蛋白含量最高，比对比例1提高了24.6％，增加到93.60μg/g/FW。对比例1中可溶性蛋白含量最低为75.11μg/g/FW；第三、随着外源钙离子浓度增加，叶绿素含量呈现先升高后降低的趋势，实施例4中叶绿素含量显著高于其他处理，是对比例1的2.6倍，增加到0.18mg/g。与对比例1相比，实施例5～7中叶绿素含量明显高出85.7％、114.2％和85.7％；第四、随着外源钙离子浓度增加实施例6、实施例7中MDA的含量明显低于对比例1，分别降低28.1％、25.0％。
表3山豆根组培苗中POD活性、SOD活性、CAT活性
组别 POD活性(U/gFW/min) SOD活(U/gFW/min) CAT活性(U/gFW/min)
实施例3 17680.43±29.72ab 853.85±97.22a 241.80±21.23bc
实施例4 17255.82±219.34b 853.13±13.00a 299.71±35.83a
实施例5 10298.92±276.29c 748.6±38.46b 311.60±27.39a
实施例6 8353.89±125.15d 798.44±9.86ab 267.81±9.23ab
实施例7 8230.73±185.54d 846.56±28.94a 195.77±39.84c
对比例1 17728.40±435.01a 823.93±33.68ab 239.80±16.05bc
通过表3对比分析实施例3～7、对比例1可知，与对比例1相比，随着外源钙离子浓度的增加，CAT酶活性先增加后降低，实施例5中CAT酶活性最强，比对比例1高30％，达到311.60U/gFW/min。
3、山豆根组培苗中内源激素的测定
取由实施例3～7、对比例1所获取的六组山豆根组培苗，并检测每组山豆根组培苗中ABA(脱落酸)、BR(油菜素内酯)、GA3(赤霉素)、JA-ME(茉莉酸甲酯)、Z(玉米素)的平均含量，表4所示；
表4山豆根组培苗中内源激素的含量
Figure BDA0002715784680000081
通过表4对比分析实施例3～7、对比例1可知，第一、在实施例7中，ABA含明显高于对比例1，相比于对比例1提高了6.3％，增加到0.84μg/g；第二、实施例3～7中BR的含量明显高于对比例1，其中，在实施例7的BR含量相比于对比例1提高了66.7％，增加到0.30ng/g；第三、实施例3中GA3含量相比于对比例1提高了20.2％，增加到35166.81pg/g；第四、实施例4、实施例5中JA-ME含量最高，相比于比于对比例1处理提高了0.8％，增加到5.99pmol/g；第五、实施例3～7中Z的含量明显高于对比例1,其中，实施例3中Z含量相比于对比例1提高了14.7％，增加到9.31pmol/g。
4、山豆根组培苗中生物碱含量
取由实施例3～7、对比例1所获取的六组山豆根组培苗，并检测每组山豆根组培苗中苦参碱、氧化苦参碱的平均含量，检测项包括每组山豆根组培苗中平均每株山豆根组培苗的全株、茎叶、根中的苦参碱及氧化苦参碱的平均含量，结果如表5所示；
表5山豆根组培苗中生物碱含量
Figure BDA0002715784680000091
通过表5对比分析实施例3～7、对比例1可知，实施例3～7中山豆根组培苗中苦参碱和氧化苦参碱的含量明显高于对比例1，具体分析为：第一、从全株检测结果可以看出实施例3～7及对比例1中，由实施例5所获取的山豆根组培苗中苦参碱的平均含量最高，是对比例1中所获取的山豆根组培苗苦参碱平均含量的3.1倍，由实施例5所获取的山豆根组培苗中氧化苦参碱的平均含量最高，是对比例1中所获取的山豆根组培苗氧化苦参碱平均含量的3.1倍；第二、从茎叶测定结果可以看出实施例3～7及对比例1中，由实施例7所获取的山豆根组培苗中苦参碱的平均含量最高为6.31mg/g，相比于对比例1中所获取的山豆根组培苗苦参碱平均含量的提高了94.2％，由实施例7所获取的山豆根组培苗中氧化苦参碱的平均含量最高为15.21mg/g，相比于对比例1中所获取的山豆根组培苗氧化苦参碱平均含量的提高了63.7％；第三、从根部检测结果可以看出实施例3～7及对比例1中，由实施例7所获取的山豆根组培苗中苦参碱的平均含量最高为0.66mg/g，是对比例1中所获取的山豆根组培苗苦参碱平均含量的2.4倍，由实施例7所获取的山豆根组培苗中氧化苦参碱的平均含量最高为1.74mg/g，是对比例1中所获取的山豆根组培苗氧化苦参碱平均含量的10.2倍。
随着外源钙离子浓度的增加，山豆根组培苗的折干率先减小后逐渐增加。随着外源钙离子浓度的增加，山豆根组培苗的可溶性糖平均含量、可溶性蛋白平均含量以及叶绿素平均含量呈先增加后降低的趋势。低外源钙离子浓度(实施例3和实施例4)处理促使山豆根组培苗中内活性氧增多，以减轻钙胁迫对自身的危害。当外源钙离子浓度为实施例5中外源钙离子浓度时全株苦参碱和氧化苦参碱含量最高，当外源钙离子浓度为实施例7中外源钙离子浓度时，山豆根组培苗中茎叶、根中的苦参碱和氧化苦参碱含量最高，说明搞外源钙离子浓度能够促进山豆根组培苗中苦参碱和氧化苦参碱含量的积累。综合考虑山豆根组培苗生长性状、生理化指标、内源激素以及生物碱含量变化，可知外源钙离子浓度为实施例4和实施例5的外源钙离子浓度之间(2.99-5.98mmol/L)时之间较为适宜。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (5)

1.利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、向1/2MS培养基中加入外源钙离子、萘乙酸、吲哚乙酸，得到第一培养基，其中，外源钙离子浓度为1/2MS培养基中钙离子浓度的0.5～4倍量；
步骤二、将山豆根无菌苗接种于第一培养基中培养，得到山豆根组培苗。
2.如权利要求1所述的利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，其特征在于，步骤二中，培养的条件为：温度为22～28℃，光照时间为12h/d，光照强度为2500～3000Lux，培养时间为40～50d。
3.如权利要求1所述的利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，其特征在于，步骤一中，外源钙离子来源于氯化钙。
4.如权利要求1所述的利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，其特征在于，步骤一中，第一培养基还包括蔗糖、琼脂粉、活性炭。
5.如权利要求4所述的利用钙离子提高山豆根组培苗生物碱含量的方法，其特征在于，萘乙酸的浓度为0.5～1.5mg·L-1，吲哚乙酸的浓度为0.1～0.5mg·L-1，蔗糖的浓度为15～25g·L－1，琼脂粉的浓度为3～5g·L－1，活性炭的浓度为0.3～0.7g·L－1。
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