CN111602657B

CN111602657B - 壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用及其方法

Info

Publication number: CN111602657B
Application number: CN202010393262.4A
Authority: CN
Inventors: 张慧娟; 蒋明
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2040-05-11
Also published as: CN111602657A

Abstract

本发明公开了壬二酸在拟南芥对灰霉病诱导抗性的应用及其方法，属于化合物诱导植物抗性领域；本发明中，壬二酸水溶液对培育四周龄的拟南芥进行灌根或者页面喷施处理两天之后，接种灰霉菌，结果表明，用壬二酸处理的拟南芥幼苗显示出对灰霉菌的抵抗力明显增加；壬二酸诱导拟南芥对灰霉病产生抗性具有水溶性好、使用量小、安全、绿色、廉价易得等优点。

Description

壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用及其方法

技术领域

本发明属于化合物诱导植物抗性领域，涉及一种化合物在植物诱导抗性中的应用及其方法，具体说涉及壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用及其方法。

背景技术

壬二酸，又称杜鹃花酸，外观为白色至微黄色单斜棱晶、针状结晶或粉末，其中等长度的碳链外加两个羧基，使壬二酸具有广泛的应用范围。壬二酸是工业中非常有用的化合物，用于增塑剂，合成润滑剂和聚合物，如尼龙69和尼龙9等。它还可用于水溶性涂料以及介电和传热助剂。壬二酸也具有抗菌性，可用作食品防腐剂。在漱口品中使用有利于龋齿的防治，在香皂中使用可避免皂体表面的开裂，同时对皮肤有较好的渗透性，膏霜类化妆品中使用可增加皮肤的吸收功能。

人们在深入研究植物的生长与发育时，曾经将玉米、番茄、豌豆、水稻、大麦、矮牵牛和金鱼草等植物作为模式模式基因系统来研究，但其结果都不尽人意。直至2000年拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物，其生长周期短，基因组简单，是研究植物生理生化、植物分子生物学的理想材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”，它在粮食增产、农作物耐逆、环境保护等领域做出了重要贡献。其作为模式植物栽培时，为了使植株正常生长，培养出有代表性的群体以及潜在的新突变体在早期筛选过程中不致因病虫害侵袭而使表型丢失，必须注意病虫害防治，其中一种最常见的病菌是灰霉菌，其呈现于拟南芥植株表面时，叶随之腐烂，有时可能伴随物质的降解。

如果直接运用化学农药杀灭灰霉菌会造成环境污染，农药残留及抗药性等问题。由于温室和大棚种植技术的推广普及，作物灰霉病害严重，已成为蔬菜、花卉和林业苗培育基地生产的主要限制因素。植物的诱导抗性具有广谱、持久的特性。利用诱导剂诱导植物自身产生系统获得抗病性（Systemic Acquired Resistance,SAR）逐渐成为植物病害防治的发展方向。

已有研究表明，多种植物激活剂可以诱导植物产生抗性以抵抗病原菌的入侵。例如BTH(苯并噻二唑)、噻菌灵(PBZ)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸（SA）等，其能诱导植物内的防御机制，起到抗病防病的作用。然而，这些植物激活剂(例如BTH)存在水溶性差，使用量大，影响植物生长，毒性大，价格昂贵等缺陷。

因此，在拟南芥栽培过程中利用化学诱导剂诱导其对灰霉菌产生抗性时，急需寻找一种具有水溶性好、使用量小、安全、绿色、价格便宜等优点的诱导剂。这不仅对于拟南芥作为模式植株时的自身栽培和大量繁殖具有重大意义，而且对于诱导其他农作物对灰霉菌产生抗性时，对化学诱导剂的选择也有很强的参考价值。

发明内容

本发明的目的是针对目前拟南芥防治灰霉菌成本高、污染环境、诱导剂水溶性差的问题，提供了壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用及其方法。壬二酸诱导拟南芥对灰霉病产生抗性具有水溶性好、使用量小、毒性小、安全、绿色、廉价易得等优点。

为了达到上述发明目的，本发明提供了壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用。

作为优选的技术方案，上述的壬二酸的应用浓度为0.5-1.2mM。

作为优选的技术方案，上述的壬二酸的应用浓度为1mM。

作为优选的技术方案，上述的拟南芥为4周龄的拟南芥植株。

作为优选的技术方案，上述的壬二酸溶液的溶剂为水。

为了达到上述发明目的，本发明还提供了一种壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一：培育拟南芥植株；

步骤二：配置0.5-1.2mM的壬二酸溶液，将配置好的壬二酸溶液对步骤一中的拟南芥植株进行灌根处理或者叶面喷施；

步骤三：将经过步骤二处理的拟南芥植株接种灰霉菌。

作为优选的技术方案，上述步骤二中进行处理的拟南芥为步骤一中培育了4周龄的拟南芥植株。

作为优选的技术方案，上述步骤二中配置壬二酸溶液使用的溶剂为水。

作为优选的技术方案，上述步骤三是将经过步骤二处理两天的拟南芥植株接种灰霉菌。

本发明的有益效果在于：1.本发明中将壬二酸溶液在接种灰霉菌之前对拟南芥植株进行灌根处理或者叶面喷施，能快速上调活性氧的积累并调控植物抗病相关基因的表达和体内抗性相关酶的活性，能明显提高拟南芥对灰霉菌的抗性。

2.本发明中壬二酸的水溶性好、低毒、廉价易得，其诱导拟南芥对灰霉病产生抗性的用量少，不产生二次污染。

附图说明

图1是实施例三中预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株在接种了灰霉菌4天后与对照植株叶片上病斑数量对比图。

图2是实施例四中预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株在接种了灰霉菌48小时后与对照植株体内灰霉菌的数量对比图。

图3是实施例六中预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株与对照植株体内抗病相关基因的表达情况对比图。

图4是实施例七中预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株与对照植株体内累积的活性氧含量对比图。

图5是实施例七中预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株与对照植株体内活性氧清除能力对比图。

图6是实施例七中预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株与对照植株体内累积的过氧化氢浓度对比图。

图7是实施例八中预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株与对照植株体内过氧化氢酶的活性对比图。

图8是实施例八中预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株与对照植株体内超氧化物歧化酶的活性对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明说明书和权利要求书中所引用的各术语含义如下所述，其他未尽说明术语均为本领域通用术语，除非另有说明。

48 hpi：感染后48小时（48 hour post infection）。

植物材料：拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型 (Columbia,Col)。

菌种：灰霉菌（Botrytis cinerea）BO5.10菌株，由美国普渡大学的TesfayeMengiste提供。

DAB、NBT药品购置于Sigama公司，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）相关的试剂购买于Takara公司，壬二酸购置于上海甄准生物科技有限公司，相关的酶活性测定试剂盒购置于南京建成公司。其他常规的试剂购买于北京鼎国生物技术有限责任公司。

实施例一：拟南芥植株的的培育

将野生型拟南芥（Col-0）的种子悬浮于0.1%琼脂糖溶液中，于4℃下低温春化2-4天，播种于混合营养土中（蛭石：草木灰：珍珠岩=6:2:1），施肥料，肥料与水按质量体积比l:1000稀释，覆膜2-3天以利出苗。培养温度保持在22-24℃，相对湿度为80%，光照强度约为85μmol·s^-1·m^-2，光照时间为16小时。其它水份、虫害和栽培管理按常规。将4周龄的拟南芥植株用于实验处理。

实施例二：壬二酸的处理

配置1mM的壬二酸水溶液。用1mM的壬二酸水溶液对拟南芥植株进行灌根处理。相同体积的水对拟南芥植株进行灌根处理作为对照组，2天后，进行灰霉菌的接种。

实施例三：将实施例二处理得到的拟南芥接种灰霉菌用2×V8固体培养基(36%V8果汁，0.2%CaCO₃，2%琼脂)培养灰霉菌，培养温度为20-25℃。待皿内长满孢子后，将菌丝块放入重悬液（麦芽糖4%，胰蛋白胨1%）中剧烈涡旋以释放孢子，用纱布过滤分离出孢子，并用血球计数板调节其孢子浓度为2×10⁵孢子/mL。接种时，将孢子悬浮液均匀地喷洒到接种苗上，直至大部分叶片上都布满细小雾滴为止。将接种苗置于24℃，光周期为12小时光照/12小时黑暗，光照强度为200μE·m^-2S^-1，覆膜高度保湿4天后观察发病情况。相同体积的重悬液喷洒于拟南芥对照组植株上，作为对照（MOCK）。

如附图1所示，实施例三预先用1mM的壬二酸水溶液处理两天的拟南芥植株在接种了灰霉菌4天后，与对照植株相比，叶片上出现的病斑数量较少。

实施例四：灰霉菌生长量测定

以Botrytis的Actin基因表达水平为指标，采用qRT-PCR测定接种后植株中Botrytis生长量的变化情况。B.cinerea ActinA引物为：

BcActin-qRT-1F：5’-CGTCACTACCTTCAACTCCATC-3’；

BcActin-qRT-1R：5’-CGTCACTACCTCAACTCCATC-3’。

以拟南芥Actin基因表达水平作为内参，引物为：

AtActin-qRT-1F：5’-GGCGATGAAGCTCAATCCAAACG-3’；

AtActin-qRT-1R：5’-GGCACGACCAGCAAGATCAAGACG-3’；

qRT-PCR的具体操作方法参照实施例六。

如附图2所示，实施例四预先用1mM的壬二酸水溶液处理两天的拟南芥植株在接种了灰霉菌48小时之后测定接种后植株中灰霉菌生长量，相比对照植株，其体内灰霉菌的数量较少。这些都表明预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株与对照相组比，对灰霉菌的抗性增加。

实施例五：总RNA的提取

总RNA的提取采用TRIzol的方法，取叶片在液氮中充分研磨，研磨要迅速，最好不要超过1分钟；然后将研磨好的粉末装入离心管中；每使用1mLTRIzol加0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；4^oC，10000rpm离心10-15分钟；把水相转移到新管中并加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30分钟；4^oC，10000rpm离心10分钟，去上清；加入1mL75%乙醇洗涤沉淀（每使用1mLTRNzol至少用1mL75%乙醇对沉淀进行洗涤)；4^oC，5000rpm离心3分钟，倒出液体；室温放置晾干，根据实验需要，加入30-100L的RNase-free水，溶解RNA。

实施例六：荧光实时定量PCR（qRT-PCR）

提取的总RNA样品，按照Takara反转录试剂盒说明先去除RNA中DNA的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cDNA。qRT-PCR反应采用SYBR Green I作为反应荧光染料，以拟南芥Actin基因作为内参基因，进行反应。反应在CFX96^TMReal-time System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)仪器中进行。

所用的引物如下：

AtPR1-qRT-F：5’-CGTCTTTGTAGCTCTTGTAGGTG-3’；

AtPR1-qRT-R：5’-TAGATTCTCGTAATCTCAGCTCT-3’；

AtPR3-qRT-F：5’-CGTTGTGGCTCTTTACAAACAACAAAAC-3’；

AtPR3-qRT-R：5’-GAAATTAACTTCATACTTAGACTGTCGAT-3’；

AtPR5-qRT-F：5’-ATGGCAAATATCTCCAGTATTCACA-3’；

AtPR5-qRT-R：5’-ATGTCGGGGCAAGCCGCGTTGAGG-3’；

AtPDF1.2-qRT-F：5’-GCTAAGTTTGCTTCCATCATCACCCTT-3’；

AtPDF1.2-qRT-R：5’-AACATGGGACGTAACAGATACACTTGTG-3’。

如附图3所示，将1mM的壬二酸水溶液预先对拟南芥植株进行灌根处理，2天后接种灰霉菌，检测体内抗病相关基因的表达情况。预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株，在接种灰霉菌后，AtPR3和在AtPDF1.2的表达量与对照植株相比，显著增加，而AtPR5的表达量与对照组植株比，显著降低，AtPR1的表达量与对照组植株比无差异。表明了壬二酸水溶液诱导拟南芥对灰霉病的抗性，可能是通过对抗病相关基因表达的调控来实现的。

实施例七：DAB和NBT染色检测活性氧的产生

采用DAB染色法和NBT染色法分别检测壬二酸水溶液处理的拟南芥植株和对照植株在接种灰霉菌前后，植株体内过氧化氢和超氧阴离子的积累情况。

具体操作如下：拟南芥植株预先用1mM的壬二酸水溶液或水进行灌根处理，2天后分别接种灰霉菌。24小时后，分别摘取叶片并浸没在含有1mg/mLDAB（Sigma-Aldrich）（pH3.8）溶液中，黑暗条件下放置3小时或者浸没于1mg/mLNBT（1mg/mLNBT溶于含10mMNaN₃的10mM磷酸缓冲液中,pH7.8）中，黑暗条件下放置至少1小时，然后在95%的酒精中沸水洗脱叶片中的叶绿素至无色，接着保存在50%的乙醇中保存，并拍照。

如附图4所示，预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株，与对照植株相比，积累了较多的活性氧。

实施例八：活性氧清除能力（ROS scavenging capacity）、过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢浓度的测定

拟南芥植株预先用1mM的壬二酸水溶液或水进行灌根处理，2天后分别接种灰霉菌，24小时后，选取叶片，分别用活性氧、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢检测试剂盒，进行活性氧清除能力、过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶和过氧化氢浓度的测定。

如附图5所示，预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株，与对照植株相比，体内的活性氧的清除能力的降低。选取其中的一种典型的活性氧-过氧化氢来进行定量的测定，结果如附图6所示，预先用1mM的壬二酸水溶液处理的拟南芥植株，与对照植株相比，体内过氧化氢累积的量较多。这些都表明了预先用1mM的壬二酸水溶液处理植株会诱导植株体内活性氧的积累。

如附图7所示和附图8所示，与对照植株相比，预先用1mM的壬二酸水溶液进行灌根处理的拟南芥植株在灰霉菌接种后，过氧化氢酶的活性没有任何的变化，而超氧化物歧化酶的活性显著增加。

实施例九：

实施例九将上述实施例一至实施例八中所使用的1mM的壬二酸水溶液替换为0.5mM的壬二酸水溶液进行实验操作，其他步骤和实验条件不变，实验结果表明0.5mM的壬二酸水溶液诱导拟南芥对灰霉病抗性也达到很好的效果。

实施例十：

实施例十将上述实施例一至实施例八中所使用的1mM的壬二酸水溶液替换为1.2mM的壬二酸水溶液进行实验操作，其他步骤和实验条件不变，实验结果表明1.2mM的壬二酸水溶液诱导拟南芥对灰霉病抗性也达到很好的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用，其特征在于，所述壬二酸的应用浓度为0.5-1 .2mM，所述的拟南芥为4周龄的拟南芥植株。

2.根据权利要求1所述的壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用，其特征在于，所述壬二酸的应用浓度为1mM。

3.根据权利要求1所述的壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用，其特征在于，所述的壬二酸配置为溶剂为水的溶液。

4.一种壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一：培育拟南芥植株；

步骤二：配置0 .5-1 .2mM的壬二酸溶液，将配置好的壬二酸溶液对步骤一中的拟南芥植株进行灌根处理或者叶面喷施；

步骤三：将经过步骤二处理的拟南芥植株接种灰霉菌；

所述步骤二中进行处理的拟南芥为步骤一中培育了4周龄的拟南芥植株；

所述步骤三是将经过步骤二处理两天的拟南芥植株接种灰霉菌。

5.根据权利要求4所述一种壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的方法，其特征在于，步骤二中配置壬二酸溶液使用的溶剂为水。