CN112153988A - 免疫缀合物 - Google Patents

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大卫·Y·杰克逊
布莱恩·萨菲纳
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Abstract

本发明提供了一种免疫缀合物，其包含(a)抗体构建体，其包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域，和(b)1‑8个佐剂核心，其中每个佐剂核心通过接头与抗体构建体共价结合，其中每个佐剂核心包含具有侧基氮原子的2‑氨基氮部分和接头与佐剂核心的连接点，并且其中所述侧基氮原子与所述接头的连接点之间的距离大于约
Figure DDA0002776786170000011
本发明还提供了用所述免疫缀合物治疗癌症的方法。

Description

免疫缀合物
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2018年5月17日提交的美国临时专利申请号62/673,015和2018年8月29日提交的美国临时专利申请号62/724,259的权益，这两个临时专利申请通过引用全文并入本文。
电子递交材料通过引用并入
通过引用全文并入本文的是与此同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，并鉴定如下：一个在2019年5月17日创建的名为“743565_ST25.TXT”的102,498字节的ASCII(文本)文件。
发明背景
现已充分认识到，肿瘤生长需要获得促进免疫逃避的突变。即使如此，肿瘤发生导致突变抗原或新抗原的积累，这些抗原在离体刺激后容易被宿主免疫系统识别。正在开始阐明为什么免疫系统不能识别新抗原以及免疫系统如何不能识别新抗原。Carmi等人的开创性研究(Nature，521：99-104(2015))已经表明，可以通过经由抗体-肿瘤免疫复合物将新抗原递送至活化的树突状细胞来克服免疫忽略。在这些研究中，通过瘤内注射同时递送肿瘤结合抗体和树突状细胞佐剂导致稳健的抗肿瘤免疫。需要用于递送抗体和树突状细胞佐剂的新的组合物和方法，以便达到不可接近的肿瘤并扩大癌症患者和其它受试者的治疗选择。本发明解决了这种和其它需要。
发明内容
在第一方面，本发明提供了免疫缀合物，其包含(a)抗体构建体，其包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域，和(b)1-8个佐剂核心，其中每个佐剂核心通过接头与所述抗体构建体共价结合，其中每个佐剂核心包含具有侧基氮原子的2-氨基氮部分和所述接头与所述佐剂核心的连接点，并且其中所述侧基氮原子与所述接头的连接点之间的距离大于约
Figure BDA0002776786150000021
在另一方面，本发明提供了免疫缀合物，其包含(a)抗体构建体，其包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域，和(b)1-8个佐剂核心，其中每个佐剂核心通过接头与抗体构建体共价结合，其中每个佐剂核心包含具有侧基氮原子的2-氨基氮部分和所述接头与所述佐剂核心的连接点，其中当与包含天冬氨酸残基、丝氨酸残基和精氨酸残基的Toll样受体的结合结构域结合时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA0002776786150000024
并且接头与佐剂核心的连接点距(1)丝氨酸残基的侧链的氧原子和/或(2)精氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA0002776786150000025
至约
Figure BDA0002776786150000026
在另一方面，本发明提供了包含多种本发明的免疫缀合物的组合物。
在另一方面，本发明提供了治疗和预防癌症的方法，包括将治疗有效量的本发明的免疫缀合物或包含本发明的免疫缀合物的组合物施用于有需要的受试者。
附图的简要说明
图1是关于TLR的结合结构域的示例性佐剂部分的描述，其中A、B和C代表佐剂核心，“HBA”是TLR的结合结构域内的氢键接受氨基酸，“HP”是TLR的结合结构域内的氢袋，“RH”是佐剂核心上的疏水性取代基，“P”是接头与佐剂核心的连接点，
Figure BDA0002776786150000022
表示从2-氨基氮部分到疏水性取代基的距离，并且
Figure BDA0002776786150000023
表示从2-氨基氮部分到接头的连接点的距离。
图2A是显示在使用HCC1954人导管癌肿瘤细胞系的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过流式细胞术测量共刺激分子CD40(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)的中值荧光强度，并显示曲妥珠单抗(虚线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(点线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)。
图2B是显示在使用HCC1954人导管癌肿瘤细胞系的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过流式细胞术测量共刺激分子CD86(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)的中值荧光强度，并显示曲妥珠单抗(点线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(虚线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)。
图2C是显示在使用HCC1954人导管癌肿瘤细胞的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过细胞因子珠阵列(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)测量针对曲妥珠单抗(点线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(虚线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)的TNFα分泌。
图2D是显示在使用JIMT-1人导管癌肿瘤细胞系的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过流式细胞术测量共刺激分子CD40(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)的中值荧光强度，并显示曲妥珠单抗(点线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(虚线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)。
图2E是显示在使用JIMT-1人导管癌肿瘤细胞系的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过流式细胞术测量共刺激分子CD86(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)的中值荧光强度，并显示曲妥珠单抗(点线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(虚线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)。
图2F是显示在使用JIMT-1人导管癌肿瘤细胞的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过细胞因子珠阵列(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)测量针对曲妥珠单抗(点线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(虚线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)的TNFα分泌。
图2G是显示在使用COLO 205人结肠腺癌细胞系的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过流式细胞术测量共刺激分子CD40(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)的中值荧光强度，并显示曲妥珠单抗(点线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(虚线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)。
图2H是显示在使用COLO 205人结肠腺癌细胞系的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过流式细胞术测量共刺激分子CD86(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)的中值荧光强度，并显示曲妥珠单抗(点线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(虚线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)。
图2I是显示在使用COLO 205人结肠腺癌细胞系的骨髓APC肿瘤共培养物中，免疫缀合物A对骨髓活化的影响的图。通过细胞因子珠阵列(在活CD45+CD11c+HLA-DR+上门控的细胞)测量针对曲妥珠单抗(点线，圆圈)，曲妥珠单抗+化合物7(虚线，三角形)和免疫缀合物A(实线，正方形)的TNFα分泌。
图3A是显示免疫缀合物B引起骨髓分化的图，如CD14下调所示的。
图3B是显示免疫缀合物B引起骨髓活化的图，如CD40上调所示的。
图3C是显示免疫缀合物B引起骨髓活化的图，如CD86上调所示的。
图3D是显示与免疫缀合物B孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图4A是显示免疫缀合物C引起骨髓分化的图，如CD14下调所示的。
图4B是显示免疫缀合物C引起骨髓活化的图，如CD40上调所示的。
图4C是显示免疫缀合物C引起骨髓活化的图，如CD86上调所示的。
图4D是显示与免疫缀合物C孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图5A是显示免疫缀合物D引起骨髓分化的图，如CD14下调所示的。
图5B是显示免疫缀合物D引起骨髓活化的图，如CD40上调所示的。
图5C是显示免疫缀合物D引起骨髓活化的图，如CD86上调所示的。
图5D是显示与免疫缀合物D孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图6A是显示免疫缀合物E引起骨髓分化的图，如CD14下调所示的。
图6B是显示免疫缀合物E引起骨髓活化的图，如CD40上调所示的。
图6C是显示免疫缀合物E引起骨髓活化的图，如CD86上调所示的。
图6D是显示与免疫缀合物E孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图6E是显示与免疫缀合物E孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图7A是显示免疫缀合物F引起骨髓分化的图，如CD14下调所示的。
图7B是显示免疫缀合物F引起骨髓活化的图，如CD40上调所示的。
图7C是显示免疫缀合物F引起骨髓活化的图，如CD86上调所示的。
图7D是显示与免疫缀合物F孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图8A是显示免疫缀合物G引起骨髓分化的图，如CD14下调所示。
图8B是显示免疫缀合物G引起骨髓活化的图，如CD40上调所示的。
图8C是显示免疫缀合物G引起骨髓活化的图，如CD86上调所示的。
图8D是显示与免疫缀合物G孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图9是显示与免疫缀合物H孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图10A是显示免疫缀合物I引起骨髓分化的图，如CD14下调所示的。
图10B是显示免疫缀合物I引起骨髓活化的图，如CD40上调所示的。
图10C是显示免疫缀合物I引起骨髓活化的图，如CD86上调所示的。
图10D是显示与免疫缀合物I孵育18小时后，骨髓细胞分泌TNFα的图。
图11A是显示免疫缀合物J引起骨髓活化的图，如CD40上调所示的。
图11B是显示免疫缀合物J引起骨髓活化的图，如CD86上调所示的。
图11C是显示免疫缀合物J引起骨髓活化的图，如CD123上调所示的。
图12是说明2-氨基氮部分的侧基氮对于维持佐剂活性的重要性的一组两个图，如表达人TLR7和人TLR8的HEK293报告细胞所证明的。
图13是说明2-氨基氮部分的侧基氮对于维持免疫缀合物的活性的重要性的一组两个图，如通过共刺激分子CD40和CD86的上调所测量的。
图14是说明2-氨基氮部分的侧基氮对于诱导树突状细胞分化的重要性的一组三个图，如通过CD14、CD16和CD123表达所测量的。
发明的详细描述
总则
共价连接的抗体-佐剂免疫缀合物(即其中抗体与接头共价结合，所述接头与佐剂共价结合)，与非共价连接的抗体-佐剂免疫缀合物相比，在引起免疫活化方面在定量和定性上更有效。此外，根据本发明连接的抗体-佐剂免疫缀合物比其它已知的免疫缀合物有效得多。佐剂-抗体缀合物的全身性施用允许同时靶向原发性肿瘤和相关转移，而不需要瘤内注射和手术切除。
本文所述的免疫缀合物的有效性可以根据佐剂部分与其受体结合的能力来考虑。本发明的免疫缀合物由于一个或多个以下特征而具有增加的佐剂活性：(i)佐剂包含保持未取代的2-氨基氮部分，(ii)接头与佐剂核心的连接点位于相对于2-氨基氮部分允许其受体的结合结构域中的必要对准的位置，和(iii)佐剂部分可进一步包含具有至少1个碳原子(例如，至少2个碳原子，至少3个碳原子，至少4个碳原子，或至少6个碳原子)的疏水性取代基。
定义
如本文所用，术语“免疫缀合物”是指与本文所述的非天然存在的化学部分共价结合的抗体构建体或抗体。术语“免疫缀合物”和“抗体-佐剂免疫缀合物”在本文中可互换使用。
如本文所用，短语“抗体构建体”是指包含抗原结合结构域和Fc结构域的多肽。抗体构建体可以包含抗体或为抗体。
如本文所用，短语“抗原结合结构域”是指特异性结合特定抗原的蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体决定簇)，例如，抗原结合蛋白的包含与抗原相互作用并在抗原结合蛋白上赋予其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的那部分。
如本文所用，短语“Fc结构域”是指抗体的片段可结晶区或尾区。Fc结构域与细胞表面上的Fc受体相互作用。
如本文所用，短语“靶向结合结构域”是指特异性结合与免疫缀合物的抗原结合结构域结合的抗原不同的第二抗原的蛋白质或蛋白质的一部分。靶向结合结构域可以在Fc结构域的C末端与抗体构建体缀合。
如本文所用，术语“抗体”是指包含特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的抗原结合区(包括互补决定区(CDR))的多肽。识别的免疫球蛋白基因包括k、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及许多免疫球蛋白可变区基因。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N-末端限定了约100-110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。轻链被分类为k或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
IgG抗体是由四条肽链组成的约150kDa的大分子。IgG抗体含有两个相同的γ类约50kDa的重链和两个相同的约25kDa的轻链，形成四聚体四级结构。通过二硫键两条重链彼此连接并与各轻链连接。所得四聚体具有两个相同的半体，它们一起形成Y形。叉的每一端含有相同的抗原结合位点。在人中有四个IgG亚类(IgG1、2、3和4)，按它们在血清中的丰度顺序命名(IgG1是最丰富的)。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和力方面是最关键的。
二聚体IgA抗体为约320kDa。IgA具有两个亚类(IgA1和IgA2)并且可以作为单体以及二聚体形式产生。IgA二聚体形式(分泌型或sIgA)是最丰富的。
抗体可例如作为完整的免疫球蛋白或作为通过用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体以产生F(ab)’2，即Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和的条件下还原以断裂铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本上是具有部分铰链区的Fab(参见，例如，Fundamental Immunology(Paul编辑，第7版，2012))。尽管在完整抗体的消化方面定义了各种抗体片段，但是这种片段可以通过化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用，术语抗体还包括通过修饰全抗体产生的抗体片段，使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见例如McCafferty等人，Nature，348,552-554(1990))。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性即可。本文所用的“抗体片段”及其所有语法变体定义为包含完整抗体的抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分，其中该部分不含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即，CH2、CH3和CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2和Fv片段；二体；任何抗体片段，其是具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的多肽(本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子；(2)仅含有一个轻链可变区的单链多肽，或其含有轻链可变区的三个CDR的片段，而没有相关的重链部分；(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或其含有重链可变区的三个CDR的片段，而没有相关的轻链部分；(4)包含来自非人类物种的单个Ig结构域或其它特异性单结构域结合模块的纳米体；以及(5)由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一条或多条重链的抗体片段中，重链可以含有在完整抗体的非Fc区中发现的任何恒定结构域序列(例如，IgG同种型中的CH1)，和/或可以含有在完整抗体中发现的任何铰链区序列，和/或可以含有与重链的铰链区序列或恒定区序列融合或位于其中的亮氨酸拉链序列。
如本文所用，涉及生物产物的术语“生物相似的”是指生物产物与参考产物高度相似，尽管在临床上无活性的组分中存在微小差异，并且在生物产物和参考产物之间在产物的安全性，纯度和效力方面没有临床上有意义的差异。
如本文所用，术语“表位”是指结合抗体的抗原结合位点(也称为抗体决定簇)的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“佐剂”是指能够在暴露于佐剂的受试者中引起免疫应答的物质。
如本文所用，短语“佐剂部分”是指与如本文所述的抗体共价结合的佐剂。佐剂部分可在与抗体结合时或在对受试者施用免疫缀合物后从抗体切割(例如酶促切割)后引起免疫应答。
如本文所用，短语“模式识别受体”和术语“PRR”是指一类保守哺乳动物蛋白的任何成员，其识别病原体相关分子模式(PAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)，并在先天免疫中充当关键信号传导元件。模式识别受体被分成膜结合的PRR，细胞质的PRR和分泌的PRR。膜结合的PRR的实例包括Toll样受体(TLR)和C-型凝集素受体(CLR)。细胞质的PRR的实例包括NOD样受体(NLR)和Rig-I样受体(RLR)。
如本文所用，短语“Toll样受体”和术语“TLR”是指高度保守的哺乳动物蛋白家族的任何成员，其识别病原体相关分子模式并且在先天免疫中充当关键信号传导元件。TLR多肽共享特征结构，其包括具有富含亮氨酸重复的细胞外结构域，跨膜结构域和参与TLR信号传导的细胞内结构域。
短语“Toll样受体1”和术语“TLR1”是指与可公开获得的TLR1序列，例如，人TLR1多肽的GenBank登录号AAY85643，或鼠TLR1多肽的GenBank登录号AAG37302，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体2”和术语“TLR2”是指与可公开获得的TLR2序列，例如，人TLR2多肽的GenBank登录号AAY85648，或鼠TLR2多肽的GenBank登录号AAD49335，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体3”和术语“TLR3”是指与可公开获得的TLR3序列，例如，人TLR3多肽的GenBank登录号AAC34134，或鼠TLR3多肽的GenBank登录号AAK26117，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体4”和术语“TLR4”是指与可公开获得的TLR4序列，例如，人TLR4多肽的GenBank登录号AAY82270，或鼠TLR4多肽的GenBank登录号AAD29272，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体5”和术语“TLR5”是指与可公开获得的TLR5序列，例如，人TLR5多肽的GenBank登录号ACM69034，或鼠TLR5多肽的GenBank登录号AAF65625，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体6”和术语“TLR6”是指与可公开获得的TLR6序列，例如，人TLR6多肽的GenBank登录号ABY67133，或鼠TLR6多肽的GenBank登录号AAG38563，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体7”和术语“TLR7”是指与可公开获得的TLR7序列，例如，人TLR7多肽的GenBank登录号AAZ99026，或鼠TLR7多肽的GenBank登录号AAK62676，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体8”和术语“TLR8”是指与可公开获得的TLR8序列，例如，人TLR8多肽的GenBank登录号AAZ95441，或鼠TLR8多肽的GenBank登录号AAK62677，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体7/8”和术语“TLR7/8”是指既是TLR7激动剂又是TLR8激动剂的核酸或多肽。
短语“Toll样受体9”和术语“TLR9”是指与可公开获得的TLR9序列，例如，人TLR9多肽的GenBank登录号AAF78037，或鼠TLR9多肽的GenBank登录号AAK28488，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体10”和术语“TLR10”是指与可公开获得的TLR10序列，例如，人TLR10多肽的GenBank登录号AAK26744，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
短语“Toll样受体11”和术语“TLR11”是指与可公开获得的TLR11序列，例如，鼠TLR11多肽的GenBank登录号AAS83531，共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸或多肽。
“TLR激动剂”是直接或间接结合TLR(例如TLR7和/或TLR8)以诱导TLR信号传导的物质。TLR信号传导中的任何可检测的差异可指示激动剂刺激或活化TLR。信号传导差异可表现为，例如，靶基因表达的变化，信号转导成分的磷酸化的变化，下游元件如NK-κB的细胞内定位的变化，某些成分(如IRAK)与其它蛋白质或细胞内结构的关联的变化，或成分如激酶(如MAPK)的生化活性的变化。
如本文所用，术语“氨基酸”是指可并入肽、多肽或蛋白质中的任何单体单元。氨基酸包括天然存在的α-氨基酸及其立体异构体，以及非天然(非天然存在的)氨基酸及其立体异构体。给定氨基酸的“立体异构体”是指具有相同分子式和分子内键但键和原子的三维排列不同(例如，L-氨基酸和相应的D-氨基酸)的异构体。
天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)及其组合。
非天然(非天然存在的)氨基酸包括但不限于L-或D-构型中以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物，氨基酸模拟物，合成氨基酸，N-取代的甘氨酸和的N-甲基氨基酸。例如，“氨基酸类似物”可以是非天然氨基酸，其具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢，羧基，氨基键合的碳)，但具有修饰的侧链基团或修饰的肽主链，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以通过通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点分子的活性的任何调节剂。免疫检查点抑制剂可包括但不限于免疫检查点分子结合蛋白、小分子抑制剂、抗体、抗体衍生物(包括Fc融合体、Fab片段和scFv)、抗体-药物缀合物、反义寡核苷酸、siRNA、适体、肽和肽模拟物。
用于将连接部分连接到蛋白质和其它材料的有用的键包括但不限于酰胺，胺，酯，氨基甲酸酯，脲，硫醚，硫代氨基甲酸酯，硫代碳酸酯和硫脲。“二价”连接部分含有用于连接两个官能团的两个连接点；多价连接部分可以具有用于连接其它官能团的附加连接点。例如，二价连接部分包括二价聚合物部分，如二价聚(乙二醇)，二价聚(丙二醇)和二价聚(乙烯醇)。
如本文所用，当术语“任选地存在”用于指化学结构(例如，“X”或“Y”)时，如果该化学结构不存在，则最初形成该化学结构的键直接形成相邻原子。
如本文所用，术语“接头”是指化合物或材料中共价结合两个或更多个部分的官能团。例如，接头可用于将佐剂核心共价结合到免疫缀合物中的抗体构建体。
如本文所用，术语“间隔基”是指化合物或材料中共价结合两个或更多个部分的官能团。例如，间隔基可以将佐剂部分共价结合到免疫缀合物中的抗体构建体。
如本文所用，术语“烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链饱和脂肪族基团。烷基可以包括任何数目的碳，例如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如，C1-6烷基包括但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，异戊基，己基等。烷基也可以指具有多达30个碳原子的烷基，例如但不限于庚基，辛基，壬基，癸基等。烷基可以是取代的或未取代的。“取代的烷基”基团可以被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，氧代(＝O)，烷基氨基，酰氨基，酰基，硝基，氰基和烷氧基的基团取代。术语“亚烷基”是指二价烷基基团。
如本文所用，术语“杂烷基”是指如本文所述的烷基基团，其中一个或多个碳原子任选地且独立地被选自N、O和S的杂原子替代。术语“杂亚烷基”是指二价杂烷基基团。
如本文所用，术语“环烷基”是指含有3至12个环原子或所示原子数的饱和或部分不饱和、单环、稠合双环或桥连多环环组件。环烷基可以包括任何数目的碳，例如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11和C3-12。饱和单环碳环包括例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环辛基。饱和双环和多环碳环包括，例如，降冰片烷，[2.2.2]双环辛烷，十氢化萘和金刚烷。环烷基基团也可以是部分不饱和的，在环中具有一个或多个双键或三键。部分不饱和的代表性碳环基团包括但不限于环丁烯，环戊烯，环己烯，环己二烯(1,3-异构体和1,4-异构体)，环庚烯，环庚二烯，环辛烯，环辛二烯(1,3-异构体、1,4-异构体和1,5-异构体)，降冰片烯和降冰片二烯。
不饱和碳环基团还包括芳基基团。术语“芳基”是指具有任何合适数目的环原子和任何合适数目的环的芳环系。芳基可包括任何合适数目的环原子，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，以及6至10、6至12或6至14个环成员。芳基可以是单环的、稠合的以形成双环或三环基团，或通过键连接以形成联芳基基团。代表性的芳基基团包括苯基，萘基和联苯基。其它芳基基团包括具有亚甲基连接基团的苄基。一些芳基基团具有6至12个环成员，例如苯基，萘基或联苯基。其它芳基基团具有6至10个环成员，例如苯基或萘基。芳基基团可以是取代的或未取代的。“取代的芳基”可以被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，氧代(＝O)，烷基氨基，酰氨基，酰基，硝基，氰基，烷基和烷氧基的基团取代。
“二价”环烷基是指具有用于共价连接分子或材料中的两个部分的两个连接点的碳环基团。环烷基基团可以是取代的或未取代的。“取代的环烷基”基团可以被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基、烷基和烷氧基的基团取代。
如本文所用，术语“杂环”是指杂环烷基基团和杂芳基基团。“杂芳基”本身或作为另一取代基的一部分，是指含有5至16个环原子的单环或稠合的双环或三环芳环组件，其中1至5个环原子是杂原子，例如N、O或S。另外的杂原子也可以是有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子可以被氧化以形成部分，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂芳基基团可包括任何数目的环原子，例如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11或3至12个环成员。杂芳基基团中可包括任何合适数目的杂原子，例如1、2、3、4或5个，或1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4或3至5个。杂芳基基团可包括诸如吡咯，吡啶，咪唑，吡唑，三唑，四唑，吡嗪，嘧啶，哒嗪，三嗪(1,2,3-异构体、1,2,4-异构体和1,3,5-异构体)，噻吩，呋喃，噻唑，异噻唑，恶唑和异恶唑的基团。杂芳基基团还可以与芳环系统(例如苯环)稠合，以形成成员，包括但不限于苯并吡咯类(例如吲哚和异吲哚)、苯并吡啶类(例如喹啉和异喹啉)、苯并吡嗪(喹喔啉)、苯并嘧啶(喹唑啉)、苯并哒嗪类(例如酞嗪和噌啉)，苯并噻吩和苯并呋喃。其它杂芳基基团包括通过键连接的杂芳基环，例如联吡啶。杂芳基基团可以是取代的或未取代的。“取代的杂芳基”基团可以被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基、烷基和烷氧基的基团取代。
杂芳基基团可以通过环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-吡咯、2-吡咯和3-吡咯，吡啶包括2-吡啶、3-吡啶和4-吡啶，咪唑包括1-咪唑、2-咪唑4-咪唑和5-咪唑，吡唑包括1-吡唑、3-吡唑、4-吡唑和5-吡唑，三唑包括1-三唑、4-三唑和5-三唑，四唑包括1-三唑和5-四唑，嘧啶包括2-嘧啶、4-嘧啶、5-嘧啶和6-嘧啶，哒嗪包括3-哒嗪和4-哒嗪，1,2,3-三嗪包括4-三嗪和5-三嗪，1,2,4-三嗪包括3-三嗪、5-三嗪和6-三嗪，1,3,5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-噻吩和3-噻吩，呋喃包括2-呋喃和3-呋喃，噻唑包括2-噻唑、4-噻唑和5-噻唑，异噻唑包括3-异噻唑、4-异噻唑和5-异噻唑，噁唑包括2-噁唑、4-噁唑和5-噁唑，异噁唑包括3-异噁唑、4-异噁唑和5-异噁唑，吲哚包括1-吲哚、2-吲哚和3-吲哚，异吲哚包括1-异吲哚和2-异吲哚，喹啉包括2-喹啉、3-喹啉和4-喹啉，异喹啉包括1-异喹啉、3-异喹啉和4-异喹啉，喹唑啉包括2-喹唑啉和4-喹唑啉，噌啉包括3-噌啉和4-噌啉，苯并噻吩包括2-苯并噻吩和3-苯并噻吩，以及苯并呋喃包括2-苯并呋喃和3-苯并呋喃。
“杂环烷基”本身或作为另一取代基的一部分，是指具有3至12个环成员和1至4个N、O和S杂原子的饱和环系。另外的杂原子也可以是有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子可以被氧化以形成部分，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂环烷基基团可包括任何数目的环原子，例如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11或3至12个环成员。杂环烷基基团中可以包括任何合适数目的杂原子，例如1、2、3或4个，或1至2、1至3、1至4、2至3、2至4、或3至4个。杂环烷基基团可包括诸如以下的基团：氮丙啶，氮杂环丁烷，吡咯烷，哌啶，氮杂环庚烷，氮杂环辛烷，奎宁环，吡唑烷，咪唑烷，哌嗪(1,2-异构体、1,3-异构体和1,4-异构体)，环氧乙烷，氧杂环丁烷，四氢呋喃，恶烷(四氢吡喃)，氧杂环庚烷，硫杂环庚烷，硫杂环戊烷(四氢噻吩)，硫烷(四氢噻喃)，唑烷，异唑烷，噻唑烷，异噻唑烷，二氧戊环，二硫戊环，吗啉，硫代吗啉，二噁烷或二噻烷。杂环烷基基团还可以与芳环系或非芳环系稠合以形成包括但不限于二氢吲哚的成员。杂环烷基基团可以是未取代的或取代的。“取代的杂环烷基”基团可以被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基、烷基和烷氧基的基团取代。
杂环烷基基团可以通过环上的任何位置连接。例如，氮丙啶可以是1-氮丙啶或2-氮丙啶，氮杂环丁烷可以是1-氮杂环丁烷或2-氮杂环丁烷，吡咯烷可以是1-吡咯烷、2-吡咯烷或3-吡咯烷，哌啶可以是1-哌啶、2-哌啶、3-哌啶或4-哌啶，吡唑烷可以是1-吡唑烷、2-吡唑烷、3-吡唑烷或4-吡唑烷，咪唑烷可以是1-咪唑烷、2-咪唑烷、3-咪唑烷或4-咪唑烷，哌嗪可以是1-哌嗪、2-哌嗪、3-哌嗪或4-哌啶，四氢呋喃可以是1-四氢呋喃或2-四氢呋喃，恶唑烷可以是2-恶唑烷、3-恶唑烷、4-恶唑烷或5-恶唑烷，异恶唑烷可以是2-异恶唑烷、3-异恶唑烷、4-异恶唑烷或5-异恶唑烷，噻唑烷可以是2-噻唑烷、3-噻唑烷、4-噻唑烷或5-噻唑烷，异噻唑烷可以是2-异噻唑烷、3-异噻唑烷、4-异噻唑烷或5-异噻唑烷，以及吗啉可以是2-吗啉、3-吗啉或4-吗啉。
如本文所用，术语“卤代”和“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。
如本文所用，术语“羰基”本身或作为另一取代基的一部分，是指-C(O)-，即，与氧双键键合并与具有羰基的部分中的两个其它基团结合的碳原子。
如本文所用，术语“氨基”是指部分-NR3，其中每个R基团是H或烷基。氨基部分可以被离子化以形成相应的铵阳离子。
如本文所用，术语“羟基”是指部分-OH。
如本文所用，术语“氰基”是指与氮原子三键键合的碳原子(即，部分-C≡N)。
如本文所用，术语“羧基”是指部分-C(O)OH。羧基部分可以被离子化以形成相应的羧酸根阴离子。
如本文所用，术语“酰氨基”是指部分-NRC(O)R或-C(O)NR2，其中每个R基团是H或烷基。
如本文所用，术语“硝基”是指部分-NO2。
如本文所用，术语“氧代”是指与化合物双键键合的氧原子(即，O＝)。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指治疗或改善损伤、病理、病况或症状(例如，认知损伤)的任何成功标记，包括任何客观或主观参数，例如消除；缓解；减少症状或使症状，损伤，病理或病况对患者更耐受；症状进展率降低；降低症状或病况的频率或持续时间；或者，在一些情况下，防止症状的发生。症状的治疗或改善可基于任何客观或主观参数；包括例如身体检查的结果。
如本文所用，术语“癌症”是指包括实体癌、淋巴瘤和白血病的病症。不同类型的癌症的实例包括但不限于肺癌(例如，非小细胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(liver cancer)(即，肝癌(hepatocarcinoma))、肾癌(即，肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、胸膜癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胆管癌、胃肠类癌瘤、食道癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃癌、中枢神经系统癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、绒毛膜癌、头颈癌、血癌、成骨肉瘤、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核细胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病和多发性骨髓瘤。
如本文所用，短语“有效量”和“治疗有效量”是指由于其施用产生了治疗效果的物质如免疫缀合物的剂量。具体剂量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basisof Therapeutics,第11版,2006,Brunton编辑,McGraw-Hill；以及Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第2版,2005,Hendrickson编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，例如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，受试者是人。
如本文所用，术语“施用”是指肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、瘤内、病灶内、鼻内或皮下施用、口服施用、作为栓剂施用、局部接触、鞘内施用，或向受试者植入缓释装置，例如微渗透泵。
如本文用于修饰数值的术语“约”和“周围”指示围绕该明确值的相对近的范围。如果“X”是值，则“约X”或“X周围”将表示0.9X至1.1X，例如0.95X至1.05X或0.99X至1.01X的值。任何提及的“约X”或“X周围”具体地至少指示值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”和“X周围”旨在教导和提供对例如“0.98X”的权利要求限制的书面描述支持。
如本文所用，短语“接头与佐剂核心的连接点”是指存在于接头所结合的佐剂核心中的碳原子或氮原子。
如本文所用，短语“疏水性取代基与佐剂核心的连接点”是指存在于接头所结合的佐剂核心中的碳原子或氮原子。
抗体佐剂缀合物
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物具有式免疫缀合物A：
Figure BDA0002776786150000191
其中P表示接头与佐剂核心的连接点，佐剂核心包含2-氨基氮部分，且n为1至8的整数。佐剂核心是任选取代的，使得佐剂核心周围的取代模式不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。
式免疫缀合物A的免疫缀合物也可以由式免疫缀合物B限定：
Figure BDA0002776786150000192
其中佐剂部分包含2-氨基氮部分和连接间隔基的合成柄，并且n是1至8的整数。佐剂部分是任选取代的，使得佐剂部分周围的取代模式不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。
因此，佐剂部分可以具有式佐剂部分A：
Figure BDA0002776786150000201
并且接头可以具有式接头A：
合成柄 间隔基
接头A，
其中P表示接头与佐剂核心的连接点，并且佐剂核心包含2-氨基氮部分。佐剂核心是任选取代的，使得佐剂核心周围的取代模式不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。如本文所用，短语“合成柄”是指化学取代基，其是佐剂部分的一部分并且通过间隔基和合成柄将抗体连接到佐剂核心。因此，当抗体通过间隔基和合成柄连接至佐剂核心时，合成柄和间隔基变成接头，使得接头在连接点“P”处结合至佐剂核心。然而，当考虑佐剂活性时，合成柄被认为是佐剂部分的一部分。因此，佐剂部分包含佐剂核心，连接点和合成柄。
因此，在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物具有式免疫缀合物C：
Figure BDA0002776786150000202
其中合成柄和间隔基构成接头，P表示接头与佐剂核心的连接点，佐剂核心和合成柄构成佐剂部分，佐剂核心包含2-氨基氮部分，并且n为1至8的整数。佐剂核心是任选取代的，使得佐剂核心周围的取代模式不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。
佐剂部分是引起免疫应答的化合物。在本发明的一些免疫缀合物中，佐剂部分是TLR激动剂。TLR激动剂包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11或其任何组合(例如TLR7/8激动剂)。任何能够活化TLR的佐剂都可以用于本发明的免疫缀合物。TLR是I型跨膜蛋白，其负责脊椎动物中的先天免疫应答的起始。TLR识别来自细菌，病毒和真菌的各种病原体相关分子模式，并作为针对侵入病原体的第一道防线。由于它们在脊椎动物内启动的细胞表达和信号传导途径的不同，TLR引起重叠但不同的生物应答。一旦接合(例如，通过天然刺激或合成TLR激动剂)，TLR启动信号转导级联，导致NF-κB经由衔接蛋白髓样分化初级应答基因88(MyD88)的活化和IL-1受体相关激酶(IRAK)的募集。然后IRAK的磷酸化导致TNF-受体相关因子(TRAF)6(TRAF6)的募集，这导致NF-κB抑制剂I-κB的磷酸化。结果，NF-κB进入细胞核并启动其启动子含有NF-κB结合位点的基因，例如细胞因子的转录。TLR信号传导的其它调节模式包括含TIR结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)依赖性诱导TRAF6和经由TRIF和TRAF3活化MyD88非依赖性途径，导致干扰素应答因子(IRF)3(IRF3)的磷酸化。类似地，MyD88依赖性途径还激活若干IRF家族成员，包括IRF5和IRF7，而TRIF依赖性途径还激活NF-κB途径。
在某些实施方案中，佐剂部分是TLR7和/或TLR8激动剂。任何能够活化TLR7和/或TLR8的佐剂都可以用于本发明的免疫缀合物。TLR7激动剂和TLR8激动剂的实例描述于例如Vacchelli等人.(OncoImmunology,2(8):e25238(2013)，在此通过引用全文并入本文)和Carson等人.(美国专利申请公开2013/0165455，在此通过引用全文并入本文)。TLR7和TLR8均在单核细胞和树突状细胞中表达。在人类中，TLR7也在浆细胞样树突状细胞(pDC)和B细胞中表达。TLR8主要在骨髓来源的细胞，即单核细胞，粒细胞和骨髓树突状细胞中表达。TLR7和TLR8能够检测细胞内“外来”单链RNA的存在，作为应答病毒侵入的手段。用TLR8激动剂处理表达TLR8的细胞可导致产生高水平的IL-12、IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6和其它炎性细胞因子。类似地，用TLR7激动剂刺激表达TLR7的细胞(例如pDC)可导致产生高水平的IFN-α和其它炎性细胞因子。TLR7/TLR8接合和由此产生的细胞因子可活化树突状细胞和其它抗原呈递细胞，从而驱动导致肿瘤破坏的各种先天和获得性免疫应答机制。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物具有式免疫缀合物A1或免疫缀合物A2：
Figure BDA0002776786150000221
其中佐剂核心由稠环A、B和C表示，并且其中A存在，B和C任选地存在，并且A、B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子(例如，氮、氧和/或硫)，并且是任选取代的，P表示接头与B环或C环的连接点，并且n是1至8的整数。佐剂核心是任选取代的，使得佐剂核心周围的取代模式不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。在某些实施方案中，接头与B环或C环的连接点出现在佐剂核心相对于2-氨基氮部分的相对面。如本文所用，术语“相对面”是指免疫缀合物A1和免疫缀合物A2的佐剂核心的凹面和末端。不希望受任何特定理论的束缚，据信接头与佐剂核心的连接点在佐剂核心相对于2-氨基氮部分的相对面允许接头的有利空间和/或电子相互作用，并且维持2-氨基氮部分的活性。在某些实施方案中，存在环A、B和C。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物具有式免疫缀合物C1或免疫缀合物C2：
Figure BDA0002776786150000231
其中佐剂核心由稠环A、B和C表示，并且其中A存在，B和C任选地存在，并且A、B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子(例如，氮、氧和/或硫)，并且是任选取代的，合成柄和间隔基构成接头，P表示接头与B环或C环的连接点，佐剂核心和合成柄构成佐剂部分，n是1-8的整数。佐剂核心是任选取代的，使得佐剂核心周围的取代模式不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。在优选的实施方案中，接头在B环或C环处与佐剂核心的连接点出现在佐剂核心相对于2-氨基氮部分的相对面。
在一些实施方案中，B环和C环不存在。在这样的实施方案中，接头与佐剂核心的连接点可以在A环上，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。佐剂核心是任选取代的，使得佐剂核心周围的取代模式不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物具有下式：
Figure BDA0002776786150000241
Figure BDA0002776786150000251
其中佐剂核心由稠环A、B和C表示，并且其中A存在，B和C任选地存在，并且A、B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子(例如，氮、氧和/或硫)，并且是任选取代的，P表示接头与B环或C环的连接点，并且n是1至8的整数。佐剂核心是任选取代的，使得佐剂核心周围的取代模式不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。
在一些实施方案中，A环和C环被认为是在Toll样受体的结合结构域的疏水性口袋中。在这样的实施方案中，接头的连接点在B环上。在本发明的某些方面，A环和/或C环还包含取代基，所述取代基在A环和/或C环与疏水性口袋之间提供额外的相互作用。在一些实施方案中，提供额外相互作用的取代基是具有至少1个碳原子(例如，至少2个碳原子、至少3个碳原子、至少4个碳原子或至少6个碳原子)的疏水性取代基。通常，在A环和/或C环与疏水性口袋之间提供额外相互作用的取代基出现在佐剂核心相对于2-氨基氮部分的同一面。如本文所用，短语“同一面”是指免疫缀合物A1和免疫缀合物A2的佐剂核心的凸面。
不希望受任何特定理论的束缚，据信佐剂活性随着以下各项中的每一项或多项而增加：(i)2-氨基氮部分保持未取代，(ii)接头的连接点在B环或C环处，且偶尔在A环但仅在B环和C环不存在时，且(iii)A环和/或C环进一步包含具有至少1个碳原子(例如，至少2个碳原子、至少3个碳原子、至少4个碳原子或至少6个碳原子)的取代基。然而，重要的是A环和/或C环的取代基的取代基不大到导致不利的空间和/或电子相互作用。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含具有佐剂核心的佐剂部分，所述佐剂核心包含具有侧基氮原子的2-氨基氮部分，其中当结合包含天冬氨酸残基的TLR8的结合结构域时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA0002776786150000252
(例如，小于约
Figure BDA0002776786150000253
小于约
Figure BDA0002776786150000254
小于约
Figure BDA0002776786150000255
小于约
Figure BDA0002776786150000256
小于约
Figure BDA0002776786150000257
小于约
Figure BDA0002776786150000258
小于约
Figure BDA0002776786150000259
小于约
Figure BDA00027767861500002510
小于约
Figure BDA00027767861500002511
小于约
Figure BDA00027767861500002512
小于约
Figure BDA00027767861500002513
小于约
Figure BDA00027767861500002514
小于约
Figure BDA00027767861500002515
小于约
Figure BDA00027767861500002516
小于约
Figure BDA00027767861500002517
Figure BDA0002776786150000261
小于约
Figure BDA0002776786150000262
小于约
Figure BDA0002776786150000263
小于约
Figure BDA0002776786150000264
小于约
Figure BDA0002776786150000265
或小于约
Figure BDA0002776786150000266
)。通常，天冬氨酸残基是Asp543或Asp545。在某些实施方案中，天冬氨酸残基是Asp543。在优选的实施方案中，2-氨基氮部分的侧基氮原子距天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA0002776786150000267
不希望受任何特定理论的束缚，据信2-氨基氮部分的侧基氮原子与天冬氨酸残基(例如，Asp543)的酸性侧链形成氢键和/或盐桥。据信氢键和/或盐桥对于维持佐剂部分的活性是至关重要的。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含具有佐剂核心的佐剂部分，所述佐剂核心包含具有侧基氮原子的2-氨基氮部分，其中当结合包含天冬氨酸残基的TLR7的结合结构域时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA0002776786150000268
(例如，小于约
Figure BDA0002776786150000269
小于约
Figure BDA00027767861500002610
小于约
Figure BDA00027767861500002611
小于约
Figure BDA00027767861500002612
小于约
Figure BDA00027767861500002613
小于约
Figure BDA00027767861500002614
小于约
Figure BDA00027767861500002615
小于约
Figure BDA00027767861500002616
小于约
Figure BDA00027767861500002617
小于约
Figure BDA00027767861500002618
小于约
Figure BDA00027767861500002619
小于约
Figure BDA00027767861500002620
小于约
Figure BDA00027767861500002621
小于约
Figure BDA00027767861500002622
小于约
Figure BDA00027767861500002623
Figure BDA00027767861500002624
小于约
Figure BDA00027767861500002625
小于约
Figure BDA00027767861500002626
小于约
Figure BDA00027767861500002627
小于约
Figure BDA00027767861500002628
或小于约
Figure BDA00027767861500002629
)。通常，天冬氨酸残基是Asp548或Asp555。在某些实施方案中，天冬氨酸残基是Asp555。在优选的实施方案中，2-氨基氮部分的侧基氮原子距天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA00027767861500002630
不希望受任何特定理论的束缚，据信2-氨基氮部分的侧基氮原子与天冬氨酸残基(例如，Asp555)的酸性侧链形成氢键和/或盐桥。据信氢键和/或盐桥对于维持佐剂部分的活性是至关重要的。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含具有佐剂核心的佐剂部分，所述佐剂核心包含接头与所述佐剂核心的连接点，其中当结合包含精氨酸和丝氨酸残基的TLR8的结合结构域时，所述接头与所述佐剂核心的连接点距丝氨酸残基的侧链的氧原子约
Figure BDA00027767861500002631
至约
Figure BDA00027767861500002632
(例如，约
Figure BDA00027767861500002633
至约
Figure BDA00027767861500002634
约
Figure BDA00027767861500002635
至约
Figure BDA00027767861500002636
约
Figure BDA00027767861500002637
至约
Figure BDA00027767861500002638
或约
Figure BDA00027767861500002639
至约
Figure BDA00027767861500002640
)和/或所述接头与所述佐剂核心的连接点距精氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA00027767861500002641
至约
Figure BDA00027767861500002642
(例如，约
Figure BDA00027767861500002643
至约
Figure BDA00027767861500002644
约
Figure BDA00027767861500002645
至约
Figure BDA00027767861500002646
约
Figure BDA00027767861500002647
至约
Figure BDA00027767861500002648
或约
Figure BDA00027767861500002649
至约
Figure BDA00027767861500002650
)。在某些实施方案中，丝氨酸残基是Ser352，精氨酸残基是Arg429。在优选的实施方案中，接头与佐剂核心的连接点距丝氨酸残基的侧链的氧原子小于约
Figure BDA0002776786150000271
并且接头与佐剂核心的连接点距精氨酸残基的侧链的氮原子小于约
Figure BDA0002776786150000272
不希望受任何特定理论的束缚，据信接头与佐剂核心的连接点必须接近TLR8的结合结构域的开口，以避免接头与结合结构域之间的空间和/或电子相互作用。因此，接头与佐剂核心的连接点必须接近结合结构域的开口(例如Ser352和Arg429)。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含具有佐剂核心的佐剂部分，所述佐剂核心包含接头与所述佐剂核心的连接点，其中当结合包含赖氨酸和缬氨酸残基的TLR7的结合结构域时，所述接头与所述佐剂核心的连接点距缬氨酸残基的侧链的次甲基碳原子约
Figure BDA0002776786150000273
至约
Figure BDA0002776786150000274
(例如，约
Figure BDA0002776786150000275
至约
Figure BDA0002776786150000276
约
Figure BDA0002776786150000277
至约
Figure BDA0002776786150000278
约
Figure BDA0002776786150000279
至约
Figure BDA00027767861500002710
或约
Figure BDA00027767861500002711
至约
Figure BDA00027767861500002712
)和/或所述接头与所述佐剂核心的连接点距赖氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA00027767861500002713
至约
Figure BDA00027767861500002714
(例如，约
Figure BDA00027767861500002715
至约
Figure BDA00027767861500002716
约
Figure BDA00027767861500002717
至约
Figure BDA00027767861500002718
约
Figure BDA00027767861500002719
至约
Figure BDA00027767861500002720
或约
Figure BDA00027767861500002721
至约
Figure BDA00027767861500002722
)。在某些实施方案中，缬氨酸残基是Val355，赖氨酸残基是Lys432。在优选的实施方案中，接头与佐剂核心的连接点距缬氨酸残基的侧链的次甲基碳原子约
Figure BDA00027767861500002723
至约
Figure BDA00027767861500002724
并且接头与佐剂核心的连接点距赖氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA00027767861500002725
至约
Figure BDA00027767861500002726
不希望受任何特定理论的束缚，据信接头与佐剂核心的连接点必须接近TLR7的结合结构域的开口，以避免接头与结合结构域之间的空间和/或电子相互作用。因此，接头与佐剂核心的连接点必须接近结合结构域的开口(例如，Val355和Lys432)。
在优选的实施方案中，当结合包含天冬氨酸、精氨酸和丝氨酸残基的TLR8的结合结构域时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA00027767861500002727
并且接头与佐剂核心的连接点距丝氨酸残基的侧链的氧原子约
Figure BDA00027767861500002728
至约
Figure BDA00027767861500002729
和/或接头与佐剂核心的连接点距精氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA00027767861500002730
至约
Figure BDA00027767861500002731
在某些实施方案中，丝氨酸残基是Ser352，精氨酸残基是Arg429，并且天冬氨酸残基是Asp543。
在优选的实施方案中，当结合包含天冬氨酸、赖氨酸和缬氨酸残基的TLR7的结合结构域时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA00027767861500002732
并且接头与佐剂核心的连接点距缬氨酸残基的侧链的次甲基碳原子约
Figure BDA00027767861500002733
至约
Figure BDA00027767861500002734
和/或接头与佐剂核心的连接点距赖氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA0002776786150000281
至约
Figure BDA0002776786150000282
在某些实施方案中，缬氨酸残基是Val355，赖氨酸残基是Lys432，并且天冬氨酸残基是Asp555。
不希望受任何特定理论的束缚，据信佐剂核心必须在特定位置连接以促进佐剂部分在TLR的结合结构域中的取向，使得2-氨基氮部分的侧基氮原子在结合口袋中维持氢键和/或盐桥。据信，当接头与佐剂核心的连接点不接近结合结构域的开口时，迫使佐剂部分移位，从而破坏2-氨基氮部分的氢键和/或盐桥。参见例如实施例1和2。
原子之间的距离可以通过任何合适的手段测量。在一些实施方案中，原子之间的距离可以理论上使用对于Mac OS X增强的PyMol v1.8.0.1，
Figure BDA0002776786150000283
SchrodingerLLC来测量。在一些实施方案中，原子之间的距离可以从分子、络合物或蛋白质的晶体结构测量。
抗体
本发明的免疫缀合物包含抗体构建体，其包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域。在一些实施方案中，抗体构建体还包含靶向结合结构域。在某些实施方案中，抗体构建体是抗体。在某些实施方案中，抗体构建体是融合蛋白。
免疫缀合物中的抗体可以是同种异体抗体(allogeneic antibody)。短语“同种异体抗体”和术语“同种抗体(alloantibody)”是指不来自所讨论的个体(例如，具有肿瘤并寻求治疗的个体)，但来自相同物种，或来自不同物种，但已被工程化以减少、减轻或避免识别为异种抗体(例如，非自身)的抗体。例如，“同种异体抗体”可以是人源化抗体。本领域技术人员对于如何工程化非人抗体以避免识别为异种抗体是已知的。除非另有具体说明，本文所用的“抗体”和“同种异体抗体”是指免疫球蛋白G(IgG)或免疫球蛋白A(IgA)。
如果人个体的癌细胞与不是由同一个人产生的抗体接触(例如，抗体是由第二个人个体产生的，抗体是由另一个物种如小鼠产生的，抗体是由另一个物种产生的人源化抗体等)，则认为抗体是同种异体的(相对于第一个个体)。识别人抗原(例如，癌症特异性抗原，富集在癌细胞中和/或富集在癌细胞上的抗原等)的人源化小鼠单克隆抗体被认为是“同种抗体”(同种异体抗体)。
在一些实施方案中，抗体是多克隆同种异体IgG抗体。在一些实施方案中，抗体存在于具有多种结合特异性的多克隆IgG抗体的混合物中。在一些实施方案中，混合物的抗体特异性结合不同的靶分子，并且在一些情况下，混合物的抗体特异性结合相同靶分子的不同表位。因此，抗体的混合物在一些情况下可包括一种以上本发明的免疫缀合物(例如，佐剂部分可共价结合混合物的抗体，例如，多克隆IgG抗体的混合物，从而产生本发明的抗体-佐剂缀合物的混合物)。抗体的混合物可以从2个或更多个个体(例如，3个或更多个个体、4个或更多个个体、5个或更多个个体、6个或更多个个体、7个或更多个个体、8个或更多个个体、9个或更多个个体、10个或更多个个体等)汇集。在一些情况下，汇集的血清用作同种抗体的来源，其中血清可以来自任何数量的个体，其中没有一个是第一个个体(例如，血清可以从2个或更多个个体、3个或更多个个体、4个或更多个个体、5个或更多个个体、6个或更多个个体、7个或更多个个体、8个或更多个个体、9个或更多个个体、10个或更多个个体等)汇集。在一些情况下，在使用前从血清中分离或纯化抗体。可以在汇集来自不同个体的抗体之前或之后进行纯化。
在免疫缀合物中的抗体包含来自血清的IgG的一些情况下，一些(例如，大于0％但小于50％)、一半、大部分(大于50％但小于100％)或甚至所有抗体(即，来自血清的IgG)的靶抗原将是未知的。然而，混合物中至少一种抗体将识别目标靶抗原的机会很高，因为这种混合物含有对多种靶抗原特异的多种抗体。
在一些实施方案中，抗体是多克隆同种异体IgA抗体。在一些实施方案中，抗体存在于具有多种结合特异性的多克隆IgA抗体的混合物中。在一些情况下，混合物的抗体特异性结合不同的靶分子，并且在一些情况下，混合物的抗体特异性结合相同靶分子的不同表位。因此，抗体的混合物在一些情况下可包括一种以上本发明的免疫缀合物(例如，佐剂部分可共价结合混合物的抗体，例如，多克隆IgA抗体的混合物，从而产生本发明的抗体-佐剂缀合物的混合物)。抗体的混合物可以从2个或更多个个体(例如，3个或更多个个体、4个或更多个个体、5个或更多个个体、6个或更多个个体、7个或更多个个体、8个或更多个个体、9个或更多个个体、0个或更多个个体等)汇集。在一些情况下，汇集的血清用作同种抗体的来源，其中血清可以来自任何数量的个体，其中没有一个是第一个个体(例如，血清可以从2个或更多个个体、3个或更多个个体、4个或更多个个体、5个或更多个个体、6个或更多个个体、7个或更多个个体、8个或更多个个体、9个或更多个个体、，10个或更多个个体等)汇集。在一些情况下，在使用前从血清中分离或纯化抗体。可以在汇集来自不同个体的抗体之前或之后进行纯化。
在免疫缀合物中的抗体包含来自血清的IgA的一些情况下，一些(例如，大于0％但小于50％)、一半、大部分(大于50％但小于100％)或甚至所有抗体(即，来自血清的IgA)的靶抗原将是未知的。然而，混合物中至少一种抗体将识别目标靶抗原的机会很高，因为这种混合物含有对多种靶抗原特异的多种抗体。
在一些情况下，免疫缀合物中的抗体包括静脉内免疫球蛋白(IVIG)和/或来自(例如，富集于，纯化自，例如，亲和纯化自)IVIG的抗体。IVIG是一种血液产品，其含有从来自许多(例如，有时超过1,000至60,000个)正常和健康的血液供体的血浆汇集的IgG(免疫球蛋白G)(例如，在一些情况下，没有任何其它蛋白质)。IVIG是可商购的。IVIG含有高百分比的天然人单体IVIG，并且具有低IgA含量。当静脉内施用时，IVIG改善了几种疾病状况。因此，美国食品和药品管理局(FDA)已批准IVIG用于多种疾病，包括(1)川崎病；(2)免疫介导的血小板减少症；(3)原发性免疫缺陷；(4)造血干细胞移植(20岁以上)；(5)慢性B细胞淋巴细胞白血病；和(6)儿科HIV 1型感染。在2004年，FDA批准了用于肾移植受体的Cedars-SinaiIVIG方案，使得这些受体可以接受来自任何健康供体的活供体肾脏，而不管血型(ABO不相容)或组织匹配。IVIG的这些和其它方面描述于例如美国专利申请公开2010/0150942；2004/0101909；2013/0177574；2013/0108619；和2013/0011388；其全部内容通过引用并入本文中。
在一些情况下，抗体是确定亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)的单克隆抗体。如果使用抗体的组合，抗体可以来自相同的亚类或来自不同的亚类。例如，抗体可以是IgG1抗体。不同亚类以不同相对比例的各种组合可由本领域技术人员获得。在一些情况下，特定的亚类或不同亚类的特定组合在癌症治疗或肿瘤尺寸减小方面可以是特别有效的。因此，本发明的一些实施方案提供了免疫缀合物，其中抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是人源化的。
在一些实施方案中，抗体能结合癌细胞的抗原。例如，抗体可以结合以至少10；100；1,000；10,000；100,000；1,000,000；2.5×106；5×106；或1×107个或更多个拷贝的量存在于癌细胞表面上的靶抗原。
在一些实施方案中，抗体以比非癌细胞上的相应抗原更高的亲和力结合癌症或免疫细胞上的抗原。例如，与识别非癌细胞或非免疫细胞上的相应野生型抗原相比，抗体可以优先识别在癌细胞或免疫细胞上发现的含有多态性的抗原。在一些情况下，抗体以比非癌细胞或非免疫细胞更大的亲合力结合癌细胞或免疫细胞。例如，癌细胞或免疫细胞可以表达更高密度的抗原，从而提供多价抗体与癌细胞或免疫细胞的更高亲和性结合。
在一些情况下，抗体不显著结合非癌抗原(例如，抗体以比靶癌抗原低至少10；100；1,000；10,000；100,000；或1,000,000倍的亲和力(较高的Kd)结合一种或多种非癌抗原。在一些情况下，抗体所结合的靶癌抗原富集在癌细胞上。例如，靶癌抗原可以以比相应的非癌细胞高至少2、5、10；100；1,000；10,000；100,000；或1,000,000倍的水平存在于癌细胞的表面上。在一些情况下，相应的非癌细胞是具有相同组织或来源的细胞，其不是过度增殖的或在其他方面不是癌性的。通常，与癌细胞的抗原(靶抗原)特异性结合的受试者IgG抗体相对于其它可用抗原优先结合该特定抗原。然而，相对于其它细胞，靶抗原不需要对癌细胞特异或甚至在癌细胞中富集(例如，靶抗原可以由其它细胞表达)。因此，在短语“特异性结合癌细胞抗原的抗体”中，术语“特异性”是指抗体的特异性，而不是指抗原在该特定细胞类型中的独特性。
在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体含有修饰的Fc区，其中所述修饰调节Fc区与一种或多种Fc受体的结合。
在一些实施方案中，抗体在Fc区中含有一个或多个修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)，其导致与缺乏Fc区突变的天然抗体相比，与一种或多种Fc受体(例如，FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIIA(CD16a)和/或FcγRIIIB(CD16b))的调节的结合(例如，增加的结合或减少的结合)。在一些实施方案中，抗体在Fc区中含有一个或多个修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)，其降低抗体的Fc区与FcγRIIB的结合。在一些实施方案中，抗体在抗体的Fc区中含有一个或多个修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)，与缺乏Fc区突变的天然抗体相比，所述修饰减少抗体与FcγRIIB的结合，同时维持与FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和/或FcγIIIA(CD16a)的相同结合或增加的结合。在一些实施方案中，抗体在Fc区中含有一个或多个修饰，其增加抗体的Fc区与FcγRIIB的结合。在一些实施方案中，所述修饰基本上减少或消除了抗体效应子功能。
在一些实施方案中，调节的结合由抗体的Fc区相对于抗体的天然Fc区的突变提供。突变可以在CH2结构域，CH3结构域或其组合中。“天然Fc区”与“野生型Fc区”同义，并包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同或与天然抗体中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区，天然序列人IgG2 Fc区，天然序列人IgG3 Fc区和天然序列人IgG4 Fc区，及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的各种同种型(参见，例如，Jefferis等人，mAbs，1(4)：332-338(2009))。
在一些实施方案中，导致与一种或多种Fc受体调节结合的Fc区中的突变可包括一个或多个以下突变：SD(S239D)、SDIE(S239D/I332E)、SE(S267E)、SELF(S267E/L328F)、SDIE(S239D/I332E)、SDIEAL(S239D/I332E/A330L)、GA(G236A)、ALIE(A330L/I332E)、GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)、V9(G237D/P238D/P271G/A330R)，和/或在以下氨基酸处的一个或多个突变：E233、G237、P238、H268、P271、L328和A330。用于调节Fc受体结合的另外的Fc区修饰描述在例如美国专利申请公开2016/0145350和美国专利7,416,726和5,624,821中，其通过引用全文并入本文。
在一些实施方案中，抗体的Fc区被修饰成与天然未修饰的Fc区相比具有改变的Fc区糖基化模式。
人免疫球蛋白在每条重链的Cγ2结构域中的Asn297残基处糖基化。这种N-连接的寡糖由核心七糖N-乙酰葡糖胺4甘露糖3(GlcNAc4Man3)组成。已知用内切糖苷酶或PNGaseF除去七糖会导致抗体Fc区中的构象变化，这可显著降低对活化FcγR的抗体-结合亲和力并导致效应子功能降低。核心七糖通常用半乳糖，等分GlcNAc，岩藻糖或唾液酸修饰，这不同地影响Fc与活化和抑制FcγR的结合。另外，已经证明α2,6-唾液酸化增强体内抗炎活性，而去岩藻糖基化导致改善的FcγRIIIa结合和抗体-依赖性细胞毒性和抗体-依赖性吞噬作用的10倍增加。因此，特异性糖基化模式可用于控制炎性效应子功能。
在一些实施方案中，改变糖基化模式的修饰是突变。例如，在Asn297处进行取代。在一些实施方案中，Asn297突变为谷氨酰胺(N297Q)。用于用调节FcγR调节的信号传导的抗体控制免疫应答的方法描述于例如美国专利7,416,726和美国专利申请公开2007/0014795和2008/0286819中，其在此通过引用全文并入本文中。
在一些实施方案中，抗体被修饰以包含具有非天然存在的糖基化模式的工程化Fab区。例如，可以对杂交瘤进行基因工程改造，以分泌具有能够增强FcRγIIIa结合和效应子功能的特定突变的无岩藻糖基化的mAb，去唾液酸化的mAb或去糖基化的Fc。在一些实施方案中，抗体被工程改造为无岩藻糖基化的。
在一些实施方案中，抗体的整个Fc区与不同的Fc区交换，使得抗体的Fab区与非天然Fc区缀合。例如，通常包含IgG1 Fc区的阿特珠单抗的Fab区可以与IgG2、IgG3、IgG4或IgA缀合，或者通常包含IgG4 Fc区的纳武单抗的Fab区可以与IgG1、IgG2、IgG3、IgA1或IgG2缀合。在一些实施方案中，具有非天然Fc结构域的Fc修饰的抗体还包含一个或多个氨基酸修饰，例如IgG4 Fc内的S228P突变，其调节所述Fc结构域的稳定性。在一些实施方案中，具有非天然Fc结构域的Fc修饰的抗体还包含本文所述的一个或多个调节Fc与FcR结合的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，与天然未修饰的抗体相比，调节Fc区与FcR结合的修饰不改变抗体的Fab区与其抗原的结合。在其它实施方案中，与天然未修饰的抗体相比，调节Fc区与FcR结合的修饰也增加了抗体的Fab区与其抗原的结合。
在一些实施方案中，Fc区通过附着或包含能够结合TGFβ1的转化生长因子β1(TGFβ1)受体或其片段而被修饰。例如，该受体可以是TGFβ受体II(TGFβRII)(参见美国专利9,676,863，其全文并入本文)。在一些实施方案中，TGFβ受体是人TGFβ受体。在一些实施方案中，Fc区(例如，IgG)具有与TGFβ受体(例如，TGFβRII)胞外结构域(ECD；例如，美国专利9,676,863的SEQ ID NO:9的氨基酸24-159)的C末端融合。“Fc接头”可用于将IgG连接到TGFβR胞外结构域，例如G4S4G Fc接头。Fc接头可以是短的、柔性肽，其允许分子的适当的三维折叠，同时维持与靶标的结合特异性。在一些实施方案中，TGFβ受体的N-末端融合至Fc区(具有或不具有Fc接头)。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链的C-末端与TGFβ受体(具有或不具有Fc接头)融合。在一些实施方案中，抗体重链的C-末端赖氨酸残基突变为丙氨酸。在一些实施方案中，抗体包括SEQ ID NO:168。
靶标
在一些实施方案中，抗原结合结构域或抗体能够结合一种或多种选自以下的靶标或抗原(例如，特异性结合选自以下的靶标)：5T4、ABL、ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADORA2A、AFP、蛋白聚糖(Aggrecan)、AGR2、AICDA、AIF1、AIGI、AKAP1、AKAP2、ALCAM、ALK、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOCl、AR、芳香酶、ASPH、ATX、AX1、AXL、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、B4GALNT1、B7、B7.1、B7.2、B7-H1、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAD、BAFF、BAG1、BAI1、BCR、BCL2、BCL6、BCMA、BDNF、BLNK、BLR1(MDR15)、BIyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDFIO)、BMP4、BMP6、BMP8、BMP10、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(网蛋白)、BRCA1、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CA6、CA9、CANT1、CAPRIN-1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(1-309)、CCLI1(嗜酸细胞活化趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MEP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIPIb)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8或CDw198(CMKBR8/TERI/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD13、CD164、CD19、CDH6、CDIC、CD2、CD20、CD21、CD200、CD22、CD23、CD24、CD27、CD28、CD29、CD3、CD33、CD35、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD47、CD52、CD56、CD69、CD70、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD97、CD99、CD117、CD125、CD137、CD147、CD179b、CD223、CD279、CD152、CD274、CDH1(E-钙粘蛋白)、CDH1O、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH2O、CDH3、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDH17、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEA、CEACAM5、CEACAM6、CEBPB、CERI、CFC1B、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST1O、CIK、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN6、CLDN7(紧密连接蛋白-7)、CLDN18、CLEC5A、CLEC6A、CLEC11A、CLEC14A、CLN3、CLU(丛生蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、C-MET、COL18A1、COLIA1、COL4A3、COL6A1、CR2、Cripto、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTAG1B(NY-ESO-1)、CTLA4、CTL8、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYD1)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL1O(IP-IO)、CXCLI1(1-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYC1、CYSLTR1、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DLK1、DNCL1、DPP4、E2F1、Engel、Edge、Fennel、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、Enola、ENO2、ENO3、EpCAM、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-A1、EPHRIN-A2、EPHRINA3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-B1、EPHRIN-B2、EPHRIN-B3、EPHB4、EPG、ERBB2(HER-2)、ERBB3、ERBB4、EREG、ERK8、雌激素受体、Earl、ESR2、F3(TF)、FADD、FAP、法尼基转移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FIGF(VEGFD)、FIL1(EPSILON)、FBL1(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纤连蛋白)、FLT1、FLT-3、FOLR1、FOS、FOSL1(FRA-1)、FR-α、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GD3、GDF5、GFI1、GFRA1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPC1、GPC3、GPNB、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC1O(C1O)、GRP、GSN(凝胶溶素)、GSTP1、GUCY2C、HAVCR1、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、Hedgehog、HER3、HGF、HIF1A、HIP1、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-E、HM74、HMOXI、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGFIR、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、DL-1、ILIO、ILIORA、ILIORB、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、IL-IRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA、(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2、(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、ILIA、ILIB、ILIF10、ILIF5、IL1F6、ILIF7、IL1F8、DL1F9、ILIHYI、ILIR1、IL1R2、ILIRAP、ILIRAPLI、ILIRAPL2、ILIRL1、IL1RL2、ILIRN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、1L4、IL6ST(糖蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(α6整合蛋白)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(β4整合蛋白)、JAG1、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KIT、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、L1CAM、LAG3、LAMA5、LAMP1、LEP(leptin)、Lewis Y抗原(“LeY”)、LILRB1、Lingo-p75、Lingo-Troy、LGALS3BP、LRRC15、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、LY75、LYPD3、MACMARCKS、MAG或OMgp、MAGEA3、MAGEA6、MAP2K7(c-Jun)、MCP-1、MDK、MIB1、肝素结合细胞因子、MIF、MISRII、MJP-2、MLSN、MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(metallothionectin-UI)、mTOR、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MUC16、MYC、MYD88、NCK2、NCR3LG1、神经蛋白聚糖、NFKBI、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgRNogo66、(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NMEI(NM23A)、NOTCH、NOTCH1、NOTCH3、NOX5、NPPB、NROB1、NROB2、NRID1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR112、NR113、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、NY-ESO1、ODZI、OPRDI、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、P-钙粘蛋白、PCA3、PCD1、PD-L1、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMI、L1-CAM、peg-天冬酰胺酶、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷酸酶蛋白聚糖、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDCI、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRAME、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PSMA、PTAFR、PTEN、PTHR2、PTGS2(COX-2)、PTN、PVRIG、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配体、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFI1O(ZNF144)、Ron、ROBO2、ROR1、RXR、S100A2、SCGB 1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞激活细胞因子)、SDF2、SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(乳腺丝抑蛋白)、SERPINEI(PAI-I)、SERPINFI、SHIP-1、SHIP-2、SHB1、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLAMF7、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLC44A4、SLC34A2、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Spr1)、ST6GAL1、ST8SIA1、STAB1、STATE、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCP1O、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、THIL、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFI1A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF1O(TRAIL)、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF12A、TNFRSF17、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFRSF14(HVEM)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll样受体、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREM1、TREM2、TROP2、TRPC6、TSLP、TWEAK、酪氨酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL C5、VLA-4、WT1、Wnt-1、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Ib)、XCRI(GPR5/CCXCR1)、YY1、ZFPM2、CLEC4C(BDCA-2、DLEC、CD303、CDH6、CLECSF7)、CLEC4D(MCL、CLECSF8)、CLEC4E(Mincle)、CLEC6A(Dectin-2)、CLEC5A(MDL-1、CLECSF5)、CLEC1B(CLEC-2)、CLEC9A(DNGR-1)、CLEC7A(Dectin-1)、CLEC11A、PDGFRa、SLAMF7、GP6(GPVI)、LILRA1(CD85I)、LILRA2(CD85H、ILT1)、LILRA4(CD85G、ILT7)、LILRA5(CD85F、ILT11)、LILRA6(CD85b、ILT8)、LILRB1、NCR1(CD335、LY94、NKp46)、NCR3(CD335、LY94、NKp46)、NCR3(CD337、NKp30)、OSCAR、TARM1、CD30、CD300C、CD300E、CD300LB(CD300B)、CD300LD(CD300D)、KIR2DL4(CD158D)、KIR2DS、KLRC2(CD159C、NKG2C)、KLRK1(CD314、NKG2D)、NCR2(CD336、NKp44)、PILRB、SIGLEC1(CD169、SN)、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC7、SIGLEC8、SIGLEC9、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC14、SIGLEC15(CD33L3)、SIGLEC16、SIRPA、SIRPB1(CD172B)、TREM1(CD354)、TREM2、KLRF1(NKp80)、17-1A、SLAM7、MSLN、CTAG1B/NY-ESO-1、MAGEA3/A6、ATP5I(Q06185)、OAT(P29758)、AIFM1(Q9Z0X1)、AOFA(Q64133)、MTDC(P18155)、CMC1(Q8BH59)、PREP(Q8K411)、YMEL1(O88967)、LPPRC(Q6PB66)、LONM(Q8CGK3)、ACON(Q99KI0)、ODO1(Q60597)、IDHP(P54071)、ALDH2(P47738)、ATPB(P56480)、AATM(P05202)、TMM93(Q9CQW0)、ERGI3(Q9CQE7)、RTN4(Q99P72)、CL041(Q8BQR4)、ERLN2(Q8BFZ9)、TERA(Q01853)、DAD1(P61804)、CALX(P35564)、CALU(O35887)、VAPA(Q9WV55)、MOGS(Q80UM7)、GANAB(Q8BHN3)、ERO1A(Q8R180)、UGGG1(Q6P5E4)、P4HA1(Q60715)、HYEP(Q9D379)、CALR(P14211)、AT2A2(O55143)、PDIA4(P08003)、PDIA1(P09103)、PDIA3(P27773)、PDIA6(Q922R8)、CLH(Q68FD5)、PPIB(P24369)、TCPG(P80318)、MOT4(P57787)、NICA(P57716)、BASI(P18572)、VAPA(Q9WV55)、ENV2(P11370)、VAT1(Q62465)、4F2(P10852)、ENOA(P17182)、ILK(O55222)、GPNMB(Q99P91)、ENV1(P10404)、ERO1A(Q8R180)、CLH(Q68FD5)、DSG1A(Q61495)、AT1A1(Q8VDN2)、HYOU1(Q9JKR6)、TRAP1(Q9CQN1)、GRP75(P38647)、ENPL(P08113)、CH60(P63038)和CH10(Q64433)。在前面的列表中，登录号显示在括号中。
在一些实施方案中，抗体选自抗PD-L1抗体、抗HER2抗体、抗EGFR抗体和抗CEA抗体。
本发明的一个实施方案提供了抗体构建体或抗原结合结构域，其特异性识别并结合PD-L1(SEQ ID NO:1)。抗体构建体或抗原结合结构域可以包含抗PD-L1抗体的抗原结合结构域的一个或多个可变区(例如两个可变区)，每个可变区包含CDR1、CDR2和CDR3。
本发明的一个实施方案提供了包含阿特珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQID NO:2-4，(ii)所有SEQ ID NO:5-7，或(iii)所有SEQ ID NO:2-7。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:2-7。
在本发明的一个实施方案中，包含阿特珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含阿特珠单抗的框架区。在这方面，包含阿特珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ IDNO:9的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:10的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQ ID NO:11的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:12的氨基酸序列(第二可变区的FR1)、SEQ ID NO:13的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:14的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:15的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:2-4和8-11，(ii)所有SEQ ID NO:5-7和12-15；或(iii)所有的SEQ ID NO:2-7和8-15。
本发明的一个实施方案提供了包含阿特珠单抗的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:44。第二可变区可包含SEQID NO:45。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:44和45两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:44-45两者。
本发明的一个实施方案提供了包含德瓦鲁单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQID NO:23的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQ ID NO:18-20，(ii)所有SEQ ID NO:21-23，或(iii)所有SEQ ID NO:18-23。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:18-23。
在本发明的一个实施方案中，包含德瓦鲁单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含德瓦鲁单抗的框架区。在这方面，包含德瓦鲁单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ IDNO:25的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:26的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQ ID NO:27的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:28的氨基酸序列(第二可变区的FR1)、SEQ ID NO:29的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:30的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:31的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:18-20和24-26，(ii)所有SEQ ID NO:21-23和27-31；或(iii)所有SEQ ID NO:18-21和24-31。
本发明的一个实施方案提供了包含德瓦鲁单抗的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:46。第二可变区可包含SEQID NO:47。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:46和47两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:46-47两者。
本发明的一个实施方案提供了包含阿维单抗(avelumab)的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可以包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQ ID NO:30-32，(ii)所有SEQ ID NO:33-35，或(iii)所有SEQ ID NO:30-35。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:30-35。
在本发明的一个实施方案中，包含阿维单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含阿维单抗的框架区。在这方面，包含阿维单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ ID NO:37的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:38的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQID NO:39的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:40的氨基酸序列(第二可变区的FR1)、SEQ ID NO:41的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:42的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:43的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:30-32和36-39，(ii)所有SEQ ID NO:33-35和40-43；或(iii)所有SEQ ID NO:30-35和36-43。
本发明的一个实施方案提供了包含阿维单抗的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:48。第二可变区可包含SEQ IDNO:49。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:48和49两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:48-49两者。
本发明的一个实施方案提供了特异性识别并结合HER2(SEQ ID NO:50)的抗体构建体或抗原结合结构域。抗体构建体或抗原结合结构域可以包含抗HER2抗体的抗原结合结构域的一个或多个可变区(例如，两个可变区)，每个可变区包含CDR1、CDR2和CDR3。
本发明的一个实施方案提供了包含曲妥珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可以包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ IDNO:52的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQID NO:56的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQ ID NO:51-53，(ii)所有SEQ ID NO:54-56，或(iii)所有SEQ ID NO:51-56。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:51-56。
在本发明的一个实施方案中，包含曲妥珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含曲妥珠单抗的框架区。在这方面，包含曲妥珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ IDNO:58的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:59的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQ ID NO:60的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:61的氨基酸序列(第二可变区的FR1)、SEQ ID NO:62的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:63的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:64的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:51-53和57-60，(ii)所有SEQ ID NO:54-56和61-64；或(iii)所有的SEQ ID NO:57-59和65-68。
本发明的一个实施方案提供了包含曲妥珠单抗的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:65。第二可变区可包含SEQID NO:66。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:65和66两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:65-66两者。
本发明的一个实施方案提供了包含帕妥珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可以包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQID NO:72的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQ ID NO:67-69，(ii)所有SEQ ID NO:70-72，或(iii)所有SEQ ID NO:67-72。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:67-72。
在本发明的一个实施方案中，包含帕妥珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含帕妥珠单抗的框架区。在这方面，包含帕妥珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ IDNO:74的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:75的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQ ID NO:76的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:77的氨基酸序列(第二可变区的FR1)、SEQ ID NO:78的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:79的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:80的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:67-69和73-76，(ii)所有SEQ ID NO:70-72和77-80；或(iii)所有的SEQ ID NO:67-72和73-80。
本发明的一个实施方案提供了包含帕妥珠单抗的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:81。第二可变区可包含SEQID NO:82。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:81和82两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:81-82两者。
本发明的一个实施方案提供了特异性识别并结合CEA(SEQ ID NO:83)的抗体构建体或抗原结合结构域。抗体构建体或抗原结合结构域可以包含抗CEA抗体的抗原结合结构域的一个或多个可变区(例如，两个可变区)，每个可变区包含CDR1、CDR2和CDR3。
本发明的一个实施方案提供了包含拉贝珠单抗(labetuzumab)的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQ ID NO:84-86，(ii)所有SEQ ID NO:87-89，或(iii)所有SEQ IDNO:84-89。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:84-89。
在本发明的一个实施方案中，包含拉贝珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含拉贝珠单抗的框架区。在这方面，包含拉贝珠单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ IDNO:91的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:92的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQ ID NO:93的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:94的氨基酸序列(第二可变区的FR1)、SEQ ID NO:95的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:96的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:97的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:84-86和90-93，(ii)所有SEQ ID NO:87-89和94-97；或(iii)所有的SEQ ID NO:84--89和90-97。
本发明的一个实施方案提供了包含拉贝珠单抗的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:98。第二可变区可包含SEQID NO:99。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:98和99两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:98-99两者。
本发明的一个实施方案提供了包含PR1A3的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQID NO:105的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQ ID NO:100-102，(ii)所有SEQ ID NO:103-105，或(iii)所有SEQ ID NO:100-105。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:100-105。
在本发明的一个实施方案中，包含PR1A3的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含PR1A3的框架区。在这方面，包含PR1A3的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ ID NO:107的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:108的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQ ID NO:109的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:110的氨基酸序列(第二可变区的FR1)、SEQ ID NO:111的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:112的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:113的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:100-102和106-109，(ii)所有SEQ ID NO:103-105和110-113；或(iii)所有SEQ ID NO:100-103和106-113。
本发明的一个实施方案提供了包含PR1A3的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:114。第二可变区可包含SEQ IDNO:115。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:114和115两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:114-115两者。
本发明的一个实施方案提供了包含MFE-23的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQID NO:121的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQ ID NO:116-118，(ii)所有SEQ ID NO:119-121，或(iii)所有SEQ ID NO:116-121。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:116-121。
在本发明的一个实施方案中，包含MFE-23的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含MFE-23的框架区。在这方面，包含MFE-23的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ ID NO:123的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:124的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQ IDNO:125的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:126的氨基酸序列(第二可变区的FR1)、SEQ ID NO:127的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:128的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:129的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:116-118和122-125，(ii)所有SEQ ID NO:119-121和126-129；或(iii)所有SEQ ID NO:116-121和122-129。
本发明的一个实施方案提供了包含MFE-23的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:130。第二可变区可包含SEQ IDNO:131。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:130和131两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:130-131两者。
本发明的一个实施方案提供了包含SM3E的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQID NO:137的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体可包含(i)所有SEQ ID NO:132-134，(ii)所有SEQ ID NO:135-137，或(iii)所有SEQ ID NO:132-137。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:132-137。
在本发明的一个实施方案中，包含SM3E的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SM3E的框架区。在这方面，包含SM3E的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域还包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列(第一可变区的框架区(“FR”)1)、SEQ ID NO:139的氨基酸序列(第一可变区的FR2)、SEQ ID NO:140的氨基酸序列(第一可变区的FR3)、SEQ ID NO:141的氨基酸序列(第一可变区的FR4)、SEQ ID NO:142的氨基酸序列(第二可变区的FR1),SEQID NO:143的氨基酸序列(第二可变区的FR2)、SEQ ID NO:144的氨基酸序列(第二可变区的FR3)和SEQ ID NO:145的氨基酸序列(第二可变区的FR4)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:132-134和138-53，(ii)所有SEQ ID NO:135-137和142-144；或(iii)所有SEQ ID NO:132-137和138-144。
本发明的一个实施方案提供了包含SM3E的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:146。第二可变区可包含SEQ IDNO:147。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:146和147两者。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:146-147两者。
本发明的一个实施方案提供了包含抗EGFR抗体西妥昔单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可以包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:148的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:150的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:148-150，(ii)所有SEQ ID NO:151-153，或(iii)所有SEQ ID NO:148-153。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:148-153。
本发明的一个实施方案提供了包含抗EGFR抗体帕尼单抗的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体可以包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:159的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:154-156，(ii)所有SEQ ID NO:157-159，或(iii)所有SEQ ID NO:154-159。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:154-159。
本发明的一个实施方案提供了包含抗EGFR抗体耐昔妥珠单抗(necitumumab)的CDR区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可以包含第一可变区和第二可变区，所述第一可变区包含含有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR1(第一可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDR2(第一可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3(第一可变区的CDR3)，所述第二可变区包含含有SEQID NO:163的氨基酸序列的CDR1(第二可变区的CDR1)、含有SEQ ID NO:164的氨基酸序列的CDR2(第二可变区的CDR2)和含有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR3(第二可变区的CDR3)。在这方面，抗体构建体或抗原结合结构域可包含(i)所有SEQ ID NO:160-162，(ii)所有SEQ ID NO:163-165，或(iii)所有SEQ ID NO:160-165。优选地，抗体构建体或抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:160-165。
本发明的一个实施方案提供了包含抗EGFR抗体西妥昔单抗的一个或两个可变区的抗体构建体或抗原结合结构域。在这方面，第一可变区可包含SEQ ID NO:166。第二可变区可包含SEQ ID NO:167。因此，在本发明的一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:166、SEQID NO:167或SEQ ID NO:166和167两者。优选地，抗体包含SEQ ID NO:166-167两者。
除抗体外，可替代的蛋白质支架可用作免疫缀合物的一部分。短语“可替代的蛋白质支架”是指非免疫球蛋白来源的蛋白质或肽。这种蛋白质和肽通常适于工程化，并且可以被设计成赋予针对给定抗原的单特异性，双特异性或多特异性。可替代的蛋白质支架的工程化可以使用几种方法进行。可以使用环移植方法，其中将已知特异性的序列移植到支架的可变环上。序列随机化和诱变可用于开发突变体文库，其可使用各种展示平台(例如噬菌体展示)进行筛选以鉴定新的结合物。位点特异性诱变也可用作类似方法的一部分。可替代的蛋白质支架以各种大小存在，范围从具有最小二级结构的小肽到具有相似尺寸的大蛋白质到全尺寸抗体。支架的实例包括但不限于胱氨酸打结的微蛋白(也称为结蛋白)，环胱氨酸打结的微蛋白(也称为环肽)、高亲合性多聚体(avimer)、亲合体(affibody)、人纤连蛋白的第十III型结构域、DARPins(设计的锚蛋白重复序列)和抗运载蛋白(anticalin)(也称为脂质运载蛋白)。具有已知特异性的天然存在的配体也可以被工程化以赋予针对给定靶标的新的特异性。可经工程改造的天然存在的配体的实例包括EGF配体和VEGF配体。根据所需的结合策略和特异性，工程蛋白可以作为单体蛋白或作为多聚体产生。蛋白质工程策略可用于将可替代的蛋白质支架与Fc结构域融合。
在一些实施方案中，抗体能结合FcRγ-偶联受体。在一些实施方案中，FcRγ-偶联受体选自GP6(GPVI)、LILRA1(CD85I)、LILRA2(CD85H、ILT1)、LILRA4(CD85G、ILT7)、LILRA5(CD85F、ILT11)、LILRA6(CD85b、ILT8)、LILRB1、NCR1(CD335、LY94、NKp46)、NCR3(CD335、LY94、NKp46)、NCR3(CD337、NKp30)、OSCAR和TARM1。
在一些实施方案中，抗体能结合DAP12-偶联受体。在一些实施方案中，所述DAP12-偶联受体选自CD300C、CD300E、CD300LB(CD300B)、CD300LD(CD300D)、KIR2DL4(CD158D)、KIR2DS、KLRC2(CD159C、NKG2C)、KLRK1(CD314、NKG2D)、NCR2(CD336、NKp44)、PILRB、SIGLEC1(CD169、SN)、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC7、SIGLEC8、SIGLEC9、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC14、SIGLEC15(CD33L3)、SIGLEC16、SIRPB1(CD172B)、TREM1(CD354)和TREM2。
在一些实施方案中，抗体能结合携带hemITAM的受体。在一些实施方案中，携带hemITAM的受体是KLRF1(NKp80)。
在一些实施方案中，抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标：CLEC4C(BDCA-2、DLEC、CD303、CLECSF7)、CLEC4D(MCL、CLECSF8)、CLEC4E(Mincle)、CLEC6A(Dectin-2)、CLEC5A(MDL-1、CLECSF5)、CLEC1B(CLEC-2)、CLEC9A(DNGR-1)和CLEC7A(Dectin-1)。在一些实施方案中，抗体能够结合CLEC6A(Dectin-2)或CLEC5A。在一些实施方案中，抗体能够结合CLEC6A(Dectin-2)。
在一些实施方案中，抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标(例如，特异性结合选自以下的靶标)：ATP5I(Q06185)、OAT(P29758)、AIFM1(Q9Z0X1)、AOFA(Q64133)、MTDC(P18155)、CMC1(Q8BH59)、PREP(Q8K411)、YMEL1(O88967)、LPPRC(Q6PB66)、LONM(Q8CGK3)、ACON(Q99KI0)、ODO1(Q60597)、IDHP(P54071)、ALDH2(P47738)、ATPB(P56480)、AATM(P05202)、TMM93(Q9CQW0)、ERGI3(Q9CQE7)、RTN4(Q99P72)、CL041(Q8BQR4)、ERLN2(Q8BFZ9)、TERA(Q01853)、DAD1(P61804)、CALX(P35564)、CALU(O35887)、VAPA(Q9WV55)、MOGS(Q80UM7)、GANAB(Q8BHN3)、ERO1A(Q8R180)、UGGG1(Q6P5E4)、P4HA1(Q60715)、HYEP(Q9D379)、CALR(P14211)、AT2A2(O55143)、PDIA4(P08003)、PDIA1(P09103)、PDIA3(P27773)、PDIA6(Q922R8)、CLH(Q68FD5)、PPIB(P24369)、TCPG(P80318)、MOT4(P57787)、NICA(P57716)、BASI(P18572)、VAPA(Q9WV55)、ENV2(P11370)、VAT1(Q62465)、4F2(P10852)、ENOA(P17182)、ILK(O55222)、GPNMB(Q99P91)、ENV1(P10404)、ERO1A(Q8R180)、CLH(Q68FD5)、DSG1A(Q61495)、AT1A1(Q8VDN2)、HYOU1(Q9JKR6)、TRAP1(Q9CQN1)、GRP75(P38647)、ENPL(P08113)、CH60(P63038)和CH10(Q64433)。在前面的列表中，登录号显示在括号中。
在一些实施方案中，抗体能结合选自以下的抗原：CCR8、CDH1、CD19、CD20、CD29、CD30、CD38、CD40、CD47、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR、HER2、SLAMF7和gp75。在一些实施方案中，抗原选自CCR8、CD19、CD20、CD47、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR和HER2。在一些实施方案中，抗体能结合选自Tn抗原和Thomsen-Friedenreich抗原的抗原。
在一些实施方案中，抗体或Fc融合蛋白选自：阿巴伏单抗、阿巴西普(也称为ORENCIATM)、阿昔单抗(也称为REOPROTM，c7E3 Fab)、阿达木单抗(也称为HUMIRATM)、阿德木单抗、阿仑单抗(也称为CAMPATHTM，MabCampath或Campath-1H)、阿妥莫单抗、阿非莫单抗、马安莫单抗、anetumumab、anrukizumab、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、阿特利珠单抗、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗(也称为SIMULECTTM)、巴维昔单抗、贝妥莫单抗(也称为LYMPHOSCANTM)、贝利单抗(也称为LYMPHO-STAT-BTM)、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐单抗(也称为AVASTINTM)、比西单抗、溴烯比妥、比伐妥珠单抗、坎帕斯、康纳单抗(也称为ACZ885)、莫坎妥珠单抗、卡罗单抗(也称为PROSTASCINTTM)、卡妥索单抗(也称为REMOVABTM)、西利珠单抗(也称为CIMZIATM)、赛妥珠单抗、西妥昔单抗(也称为ERBITUXTM)、克立昔单抗、达西珠单抗、达昔单抗、达克珠单抗(也称为ZENAPAXTM)、地诺单抗(也称为AMG162)、地莫单抗、阿托度单抗、多利昔珠单抗(dorlixizumab)、duntumumab、durimulumab、durmulumab、依美昔单抗、依库丽单抗(也称为SOLIRISTM)、埃巴单抗、依决洛单抗(也称为Mab17-1A，PANOREXTM)、依法利珠单抗(也称为RAPTIVATM)、依芬古单抗(也称为MYCOGRABTM)、elotuxumab、伊斯利莫、培戈赖莫单抗、西依匹莫单抗、西艾匹莫单抗、epitumomab、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄马索单抗(也称为REXOMUNTM)、依那西普(也称为ENBRELTM)、伊瑞西珠(也称为etaratuzumab，VITAXINTM，ABEGRINTM)、艾韦单抗、法索单抗(也称为NEUTROSPECTM)、法拉莫单抗、泛维珠单抗、冯特利珠单抗(也称为HUZAFTM)、加利昔单抗、gantenerumab、加维莫单抗(也称为ABXCBLTM)、吉妥单抗(也称为MYLOTARGTM)、戈利木单抗(也称为CNTO 148)、戈利昔单抗、伊巴利珠单抗(也称为TNX-355)、替伊莫单抗(也称为ZEVALINTM)、伊戈伏单抗、英西单抗、英夫利昔单抗(也称为REMICADETM)、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗、易普利姆玛(也称为MDX-010，MDX-101)、伊妥木单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、来马索单抗、lebrilizumab、乐地单抗、来沙木单抗(也称为HGS-ETR2，ETR2-ST01)、lexitumumab、利韦单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗(也称为HGSETR1，TRM-1)、马司莫单抗、马妥珠单抗(也称为EMD72000)、美泊利单抗(也称为BOSATRIATM)、美替木单抗、马妥珠单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫罗木单抗、莫维珠单抗(也称为NUMAXTM)、莫罗单抗(也称为OKT3)、他那可单抗、伊那莫单抗、那他珠单抗(也称为TYSABRITM，ANTEGRENTM)、奈巴库单抗、奈瑞莫单抗、尼妥珠单抗(也称为THERACIM hR3TM，THERA-CIM-hR3TM，THERALOCTM)、巯诺莫单抗(也称为VERLUMATM)、obintunzumab、ocrelizumab、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗(也称为XOLAIRTM)、奥戈伏单抗(也称为OVAREXTM)、奥昔珠单抗、帕吉昔单抗、帕利珠单抗(也称为SYNAGISTM)、帕尼单抗(也称为ABX-EGF，VECTIBIXTM)、帕考珠单抗、pemtumomab(也称为THERAGYNTM)、帕妥珠单抗(也称为2C4，OMNITARGTM)、培克珠单抗、平妥莫单抗、普立昔单抗、普托木单抗、兰尼单抗(也称为LUCENTISTM)、瑞西巴库、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗(也称为RITUXANTM，MabTHERATM)、罗维珠单抗、芦利珠单抗、沙妥莫单抗、司韦单抗、西罗珠单抗、希普利珠单抗(也称为MEDI-507)、索土珠单抗、司他莫鲁(也称为MYO-029)、硫索单抗(也称为LEUKOSCANTM)、替他珠单抗、他度珠单抗、他利珠单抗、帕他普莫单抗、替非珠单抗(也称为AUREXISTM)、阿替莫单抗、替奈昔单抗、替利珠单抗、替西木单抗、托珠单抗(也称为ACTEMRATM)、托利珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗(也称为HERCEPTINTM)、替西木单抗(也称为CP-675,206)、西莫白介素单抗、妥韦单抗、乌珠单抗、优特克单抗(也称为CNTO1275)、伐利昔单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西珠单抗(也称为NUVIONTM)、伏洛昔单抗(也称为M200)、伏妥莫单抗(也称为HUMASPECTTM)、扎鲁珠单抗、扎木单抗(也称为HuMAX-CD4)、齐拉木单抗、阿佐莫单抗、达雷木单抗、奥拉木单抗、本妥昔单抗、阿帕西普(afibercept)、阿巴西普、贝拉西普、阿柏西普、依那西普、咯咪珀咯、SBT-040(美国2017/0158772中所列的序列)。在一些实施方案中，抗体选自奥拉单抗、奥珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗、贝伐单抗、达拉木单抗、依那西普、派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、伊匹木单抗。帕尼单抗，扎鲁珠单抗，尼妥珠单抗，马妥珠单抗和依洛珠单抗。在某些实施方案中，抗体是曲妥珠单抗。
检查点抑制剂
预期任何合适的免疫检查点抑制剂与本文公开的免疫缀合物一起使用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂降低一种或多种免疫检查点蛋白的表达或活性。在另一个实施方案中，免疫检查点抑制剂降低一种或多种免疫检查点蛋白与其配体之间的相互作用。降低免疫检查点分子的表达和/或活性的抑制性核酸也可用于本文公开的方法中。
大多数检查点抗体被设计成不具有效应子功能，因为它们不试图杀死细胞，而是阻断信号传导。本发明的免疫缀合物可以添加回激活骨髓免疫所需的“效应子功能”。因此，对于大多数检查点抗体抑制剂，这种发现将是关键的。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR，也称为TNFRSF18)、可诱导T细胞共刺激(ICOS，也称为CD278)、CD96、脊髓灰质炎病毒受体相关2(PVRL2，也称为CD112R，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为B7-H3和CD274)、程序性细胞死亡配体2(PD-L2，也称为B7-DC和CD273)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3，也称为CD223)、B7-H4、杀伤免疫球蛋白受体(KIR)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，也称为OX40和CD134)及其配体OX40L(CD252)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO-1)、吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO-2)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA，也称为CD272)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、腺苷A2A受体(A2Ar)和T细胞活化的V结构域Ig抑制子(VISTA蛋白)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA4、PD-1或PD-L1的抑制剂。
在一些实施方案中，抗体选自伊匹木单抗(也称为YERVOYTM)、派姆单抗(也称为KEYTRUDATM)、纳武单抗(也称为OPDIVOTM)、阿特珠单抗(也称为TECENTRIGTM)、阿维单抗(avelumab)(也称为BAVENCIOTM)和德瓦鲁单抗(也称为IMFINZITM)。在一些实施方案中，抗体选自伊匹木单抗(也称为YERVOYTM)、派姆单抗(也称为KEYTRUDATM)、纳武单抗(也称为OPDIVOTM)和阿特珠单抗(也称为TECENTRIGTM)。
间隔基
缀合物中的佐剂部分和佐剂核心可以使用用于蛋白质修饰的各种化学反应共价结合至抗体，并且上述接头或间隔基由蛋白质官能团(即，氨基酸侧链)与具有反应性接头基团的试剂的反应产生。多种这样的试剂是本领域已知的。此类试剂的实例包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯和N-羟基磺基琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)酯(胺反应性)；碳二亚胺(胺和羧基反应性)；羟甲基膦(胺反应性)；马来酰亚胺(硫醇反应性)；卤代乙酰胺，例如N-碘乙酰胺(硫醇反应性)；芳基叠氮化物(伯胺反应性)；氟化芳基叠氮化物(经由碳-氢(C-H)插入的反应性)；五氟苯基(PFP)酯(胺反应性)；四氟苯基(TFP)酯(胺反应性)；亚氨酸酯(胺反应性)；异氰酸酯(羟基反应性)；乙烯基砜(硫醇，胺和羟基反应性)；吡啶基二硫化物(硫醇反应性)；和二苯甲酮衍生物(通过C-H键插入的反应性)。其它试剂包括但不限于在Hermanson,Bioconjugate Techniques，第2版，Academic Press,2008中描述的那些。
接头可以具有任何合适的长度，使得当接头与抗体构建体和佐剂核心共价结合时，维持抗体构建体和佐剂部分的功能。接头的长度可以为约
Figure BDA0002776786150000571
或更大，例如约
Figure BDA0002776786150000572
或更大、约
Figure BDA0002776786150000573
或更大、约
Figure BDA0002776786150000574
或更大、约
Figure BDA0002776786150000575
或更大、约
Figure BDA0002776786150000576
或更大、约
Figure BDA0002776786150000577
或更大、约
Figure BDA0002776786150000578
或更大、或约
Figure BDA0002776786150000579
或更大。或者，或除此之外，接头的长度可以为约
Figure BDA00027767861500005710
或更小，例如约
Figure BDA00027767861500005711
或更小、约
Figure BDA00027767861500005712
或更小、约
Figure BDA00027767861500005713
或更小、约
Figure BDA00027767861500005714
或更小、约
Figure BDA00027767861500005715
或更小、约
Figure BDA00027767861500005716
或更小、约
Figure BDA00027767861500005717
或更小、约
Figure BDA00027767861500005718
或更小、约
Figure BDA00027767861500005719
或更小、约
Figure BDA00027767861500005720
或更小、约
Figure BDA00027767861500005721
或更小、或约
Figure BDA00027767861500005722
或更小。因此，接头可以具有由任何两个前述端点界定的长度。接头的长度可以为约
Figure BDA00027767861500005723
至约
Figure BDA00027767861500005724
例如，约
Figure BDA00027767861500005725
至约
Figure BDA00027767861500005726
约
Figure BDA00027767861500005727
至约
Figure BDA00027767861500005728
约
Figure BDA00027767861500005729
至约
Figure BDA00027767861500005730
约
Figure BDA00027767861500005731
至约
Figure BDA00027767861500005732
约
Figure BDA00027767861500005733
至约
Figure BDA00027767861500005734
约
Figure BDA00027767861500005735
至约
Figure BDA00027767861500005736
约
Figure BDA00027767861500005737
至约
Figure BDA00027767861500005738
约
Figure BDA00027767861500005739
至约
Figure BDA00027767861500005740
约
Figure BDA00027767861500005741
至约
Figure BDA00027767861500005742
约
Figure BDA00027767861500005743
至约
Figure BDA00027767861500005744
约
Figure BDA00027767861500005745
至约
Figure BDA00027767861500005746
约
Figure BDA00027767861500005747
Figure BDA00027767861500005748
至约
Figure BDA00027767861500005749
约
Figure BDA00027767861500005750
至约
Figure BDA00027767861500005751
约
Figure BDA00027767861500005752
至约
Figure BDA00027767861500005753
约
Figure BDA00027767861500005754
至约
Figure BDA00027767861500005755
约
Figure BDA00027767861500005756
至约
Figure BDA00027767861500005757
约
Figure BDA00027767861500005758
至约
Figure BDA00027767861500005759
约
Figure BDA00027767861500005760
至约
Figure BDA00027767861500005761
约
Figure BDA00027767861500005762
至约
Figure BDA00027767861500005763
约
Figure BDA00027767861500005764
至约
Figure BDA00027767861500005765
约
Figure BDA00027767861500005766
至约
Figure BDA00027767861500005767
约
Figure BDA00027767861500005768
至约
Figure BDA00027767861500005769
约
Figure BDA00027767861500005770
至约
Figure BDA00027767861500005771
约
Figure BDA00027767861500005772
至约
Figure BDA00027767861500005773
或约
Figure BDA00027767861500005774
至约
Figure BDA00027767861500005775
在某些实施方案中，接头的长度为约
Figure BDA00027767861500005776
至约
Figure BDA00027767861500005777
间隔基可以具有任何合适的长度，使得当间隔基与抗体构建体和佐剂部分共价结合时，维持抗体构建体和佐剂部分的功能。间隔基的长度可以为约
Figure BDA00027767861500005778
或更大，例如约
Figure BDA00027767861500005779
或更大、约
Figure BDA00027767861500005780
或更大、约
Figure BDA00027767861500005781
或更大、约
Figure BDA00027767861500005782
或更大、约
Figure BDA00027767861500005783
或更大、约
Figure BDA00027767861500005784
或更大、约
Figure BDA00027767861500005785
或更大、或约
Figure BDA00027767861500005786
或更大。或者，或除此之外，间隔基的长度可以为约
Figure BDA00027767861500005787
或更小，例如约
Figure BDA00027767861500005788
或更小、约
Figure BDA00027767861500005789
或更小、约
Figure BDA00027767861500005790
或更小、约
Figure BDA00027767861500005791
或更小、约
Figure BDA00027767861500005792
或更小、约
Figure BDA00027767861500005793
或更小、约
Figure BDA00027767861500005794
或更小、约
Figure BDA00027767861500005795
或更小、约
Figure BDA00027767861500005796
或更小、或约
Figure BDA00027767861500005797
或更小。因此，间隔基可以具有由任何两个前述端点界定的长度。间隔基的长度可以为约
Figure BDA00027767861500005798
至约
Figure BDA00027767861500005799
例如约
Figure BDA000277678615000057100
至约
Figure BDA000277678615000057101
约
Figure BDA000277678615000057102
至约
Figure BDA000277678615000057103
约
Figure BDA000277678615000057104
至约
Figure BDA000277678615000057105
约
Figure BDA000277678615000057106
至约
Figure BDA000277678615000057107
约
Figure BDA000277678615000057108
Figure BDA0002776786150000581
至约
Figure BDA0002776786150000582
约
Figure BDA0002776786150000583
至约
Figure BDA0002776786150000584
约
Figure BDA0002776786150000585
至约
Figure BDA0002776786150000586
约
Figure BDA0002776786150000587
至约
Figure BDA0002776786150000588
约
Figure BDA0002776786150000589
至约
Figure BDA00027767861500005810
约
Figure BDA00027767861500005811
至约
Figure BDA00027767861500005812
约
Figure BDA00027767861500005813
至约
Figure BDA00027767861500005814
约
Figure BDA00027767861500005815
至约
Figure BDA00027767861500005816
约
Figure BDA00027767861500005817
至约
Figure BDA00027767861500005818
约
Figure BDA00027767861500005819
至约
Figure BDA00027767861500005820
约
Figure BDA00027767861500005821
至约
Figure BDA00027767861500005822
约
Figure BDA00027767861500005823
至约
Figure BDA00027767861500005824
Figure BDA00027767861500005825
约
Figure BDA00027767861500005826
至约
Figure BDA00027767861500005827
约
Figure BDA00027767861500005828
至约
Figure BDA00027767861500005829
约
Figure BDA00027767861500005830
至约
Figure BDA00027767861500005831
约
Figure BDA00027767861500005832
至约
Figure BDA00027767861500005833
或约
Figure BDA00027767861500005834
至约
Figure BDA00027767861500005835
在某些实施方案中，间隔基的长度为约
Figure BDA00027767861500005836
至约
Figure BDA00027767861500005837
在一些实施方案中，接头在生理条件下是不可切割的。如本文所用，术语“生理条件”是指20-40摄氏度的温度范围，大气压力(即1atm)，约6至约8的pH，以及一种或多种生理酶，蛋白酶，酸和碱。
在一些实施方案中，接头在生理条件下是可切割的。例如，可以通过酶促过程或代谢过程切割接头。
间隔基可以是任何合适的有机二价连接部分，从而可以获得所需长度的间隔基和/或接头。
在一些实施方案中，间隔基是包含乙二醇基团或甘氨酸残基的二价连接部分。间隔基优选经由酰胺键、C-N单键、C-O单键或C-C单键与佐剂部分结合，并且经由酰胺键或C-N单键与抗体结合。在一些实施方案中，间隔基与佐剂部分的氮基团和抗体的氮基团结合。在此类实施方案中，间隔基经由酰胺键、C-N单键或其组合与相邻氮基团结合。
在一些实施方案中，间隔基包含聚(乙二醇)基团。在某些实施方案中，间隔基包含至少2个乙二醇基团(例如，至少3个乙二醇基团、至少4个乙二醇基团、至少5个乙二醇基团、至少6个乙二醇基团、至少7个乙二醇基团、至少8个乙二醇基团、至少9个乙二醇基团、至少10个乙二醇基团、至少11个乙二醇基团、至少12个乙二醇基团、至少13个乙二醇基团、至少14个乙二醇基团、至少15个乙二醇基团、至少16个乙二醇基团、至少17个乙二醇基团、至少18个乙二醇基团、至少19个乙二醇基团、至少20个乙二醇基团、至少21个乙二醇基团、至少22个乙二醇基团、至少23个乙二醇基团、至少24个乙二醇基团或至少25个乙二醇基团)。在某些实施方案中，间隔基包含二(乙二醇)基团、三(乙二醇)基团或四(乙二醇)基团、5个乙二醇基团、6个乙二醇基团、8个乙二醇基团、12个乙二醇基团、24个乙二醇基团或25个乙二醇基团。
在一些实施方案中，间隔基包含甘氨酸残基。在某些实施方案中，间隔基包含至少2个甘氨酸残基(例如，至少3个甘氨酸残基、至少4个甘氨酸残基、至少5个甘氨酸残基、至少6个甘氨酸残基、至少7个甘氨酸残基、至少8个甘氨酸残基、至少9个甘氨酸残基、至少10个甘氨酸残基、至少11个甘氨酸残基、至少12个甘氨酸残基、至少13个甘氨酸残基、至少14个甘氨酸残基、至少15个甘氨酸残基、至少16个甘氨酸残基、至少17个甘氨酸残基、至少18个甘氨酸残基、至少19个甘氨酸残基、至少20个甘氨酸残基、至少21个甘氨酸残基、至少22个甘氨酸残基、至少23个甘氨酸残基、至少24个甘氨酸残基或至少25个甘氨酸残基)。在某些实施方案中，间隔基包含2个甘氨酸残基、3个甘氨酸残基、4个甘氨酸残基、5个甘氨酸残基、6个甘氨酸残基、8个甘氨酸残基、12个甘氨酸残基、24个甘氨酸残基或25个甘氨酸残基。
在一些实施方案中，间隔基还包含二价亚环己基。
在一些实施方案中，间隔基选自：
其中R任选地存在并且为包含1至8个碳单元的直链或支链、环状或线状、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基或杂芳基链；a为1至40的整数；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c为1至25的整数；G1是CH2、C＝O或键，G2是CH2、C＝O或键，虚线
Figure BDA0002776786150000591
表示与佐剂部分的连接点；并且波浪线
Figure BDA0002776786150000592
表示与抗体的连接点。在某些实施方案中，a是2至25的整数。在某些实施方案中，c是2至8的整数。
佐剂
通常，佐剂部分具有式I的佐剂核心结构：
Figure BDA0002776786150000593
其中B和C任选地存在，并且A、B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子(例如氮、氧和/或硫)，并且是任选取代的。式I的核心结构内的双键和杂原子(即，芳环周围的其它原子)不受特别限制，只要A环具有式I中所示的2-氨基氮部分。因此，如本文所用，短语“佐剂核心”是指包含2-氨基氮部分的一组稠环(即，1、2或3个环)。在优选的实施方案中，A环表示含有4、5或6个碳原子和至少一个氮原子(例如，一个氮原子、两个氮原子或三个氮原子)的环状芳环或非芳环。对佐剂核心周围的取代不受特别限制，只要2-氨基氮部分保持未取代即可。不希望受任何特定理论的束缚，据信2-氨基氮部分对于维持佐剂的活性是重要的。
在一些实施方案中，佐剂部分具有式I的佐剂核心结构，其中存在B环。在一些实施方案中，佐剂部分具有式I的佐剂核心结构，其中存在C环。在某些实施方案中，佐剂部分具有式I的佐剂核心结构，其中存在B环和C环。
在某些实施方案中，佐剂部分具有式IA的佐剂核心：
Figure BDA0002776786150000601
其中，Ar表示环是芳族的，任选地包含其它氮原子并且是任选取代的，B和C任选地存在，并且B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子(例如，氮、氧和/或硫)，并且是任选取代的。式IA的核心结构内的核心结构内的双键和杂原子(即，环周围的其它原子)不受特别限制，只要保持环具有用虚线椭圆形标记的2-氨基氮部分即可。
在某些实施方案中，佐剂部分具有式IB的佐剂核心：
Figure BDA0002776786150000611
其中B和C任选地存在，并且B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子(例如氮、氧和/或硫)，并且是任选取代的。式IB的核心结构内的核心结构内的双键和杂原子(即，环周围的其它原子)不受特别限制，只要保持环具有用虚线椭圆形标记的2-氨基氮部分即可。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含具有佐剂核心的佐剂部分，所述佐剂核心包含具有侧基氮原子的2-氨基氮部分和接头与佐剂核心的连接点，其中所述侧基氮原子与接头的连接点之间的距离大于约
Figure BDA0002776786150000612
(例如大于约
Figure BDA0002776786150000613
大于约
Figure BDA0002776786150000614
大于约
Figure BDA0002776786150000615
或大于约
Figure BDA0002776786150000616
)。在某些实施方案中，侧基氮原子与接头的连接点之间的距离大于约
Figure BDA0002776786150000617
不希望受任何特定理论的束缚，据信2-氨基氮部分的侧基氮原子与Toll样受体的结合结构域的与结合结构域的开口相对的一侧上的氨基酸形成氢键和/或盐桥。因此，2-氨基氮部分的侧基氮原子和接头与佐剂核心的连接点通常在佐剂部分的相对侧。图1显示了与TLR的结合结构域有关的示例性佐剂部分，其中
Figure BDA0002776786150000618
表示从2-氨基氮部分到接头的连接点的距离。
在一些实施方案中，佐剂部分进一步包含具有至少1个碳原子(例如，至少2个碳原子、至少3个碳原子、至少4个碳原子或至少6个碳原子)的疏水性取代基(“RH”)。疏水性取代基可以是任何合适的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基或以上的组合，只要疏水性取代基不含有-NH2、-OH或-SH取代基。此外，重要的是疏水性取代基不是太大以致于导致不利的空间和/或电子相互作用。因此，疏水性取代基将具有少于8个非氢原子(例如，碳、氧、氮、硫等)。
通常，当存在疏水性取代基时，疏水性取代基将具有疏水性取代基与佐剂核心的连接点，该连接点与2-氨基氮部分的侧基氮原子的距离小于约
Figure BDA0002776786150000621
(例如，小于约
Figure BDA0002776786150000622
小于约
Figure BDA0002776786150000623
小于约
Figure BDA0002776786150000624
或小于约
Figure BDA0002776786150000625
)。在某些实施方案中，侧基氮原子与疏水性取代基与佐剂核心的连接点之间的距离小于约
Figure BDA0002776786150000626
不希望受任何特定理论的束缚，据信2-氨基氮部分的侧基氮原子与Toll样受体的结合结构域的紧邻疏水性口袋区的一侧的氨基酸形成氢键和/或盐桥。因此，2-氨基氮部分的侧基氮原子和疏水性取代基与佐剂核心的连接点通常非常接近。图1显示了与TLR的结合结构域有关的示例性佐剂部分，其中
Figure BDA0002776786150000627
表示从2-氨基氮部分到疏水性取代基的距离。
佐剂核心在允许佐剂部分保持其佐剂活性的位置处与接头连接。因此，接头不能连接到2-氨基氮部分，因为该化学部分必须保持未取代。此外，佐剂部分具有一个或多个疏水性口袋区(“RH”)，其中接头不能连接到佐剂核心。如本文所用，短语“疏水性口袋区”是指通过受体结合结构域的理论建模确定的位于疏水性口袋中和/或干扰佐剂部分的相应受体的结合结构域的氨基酸残基的佐剂部分的区域。不希望受任何特定理论的束缚，据信在称为RH的位置处连接的接头导致不利的空间和/或电子相互作用，从而降低佐剂的活性。因此，佐剂核心必须在特定位置(“RC”)连接于接头以维持佐剂的活性。
在一些实施方案中，佐剂部分具有式AdjA：
Figure BDA0002776786150000628
其中
每个J独立地为C、CH、CH2、N、NH、O或S,
E为C、CH或N，
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000629
或者
Figure BDA00027767861500006210
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150000631
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150000632
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000633
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链的、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000634
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000635
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000636
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
如本文所用，术语“二价”是指能够在化学部分的相同或不同位置结合两个相同或不同的其它原子的所述化学部分，即使其它原子中的一个是氢。例如，二价基团具有两个相同或不同的连接点，其可以结合碳、氮、氧或氢，如V、W、X、Y和Z所定义。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000641
其中
A为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000642
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000643
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000644
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000645
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000646
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000651
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些情况下，佐剂部分不具有下式：
Figure BDA0002776786150000652
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000653
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000654
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000655
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000661
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000662
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000663
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000664
其中
A为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000665
T1和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000666
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000667
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000671
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000672
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000673
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分不具有下式：
Figure BDA0002776786150000674
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000675
T1和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000676
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000681
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000682
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000683
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点
虚线
Figure BDA0002776786150000684
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在某些实施方案中，所述佐剂部分不具有下式：
Figure BDA0002776786150000685
在一些实施方案中，佐剂部分具有式AdjB：
Figure BDA0002776786150000686
其中
每个J独立地为C、CH、CH2、N、NH、O或S，
A为CH或N，
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000687
或者
Figure BDA0002776786150000688
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150000689
RH任选地存在具有下式：
Figure BDA0002776786150000691
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000692
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000693
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000694
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000695
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000696
Figure BDA0002776786150000701
其中
A为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000702
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000703
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000704
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000705
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000706
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000711
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些情况下，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000712
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000713
其中
A为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000714
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000721
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000722
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000723
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000724
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000725
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些实施方案中，佐剂部分不具有下式：
Figure BDA0002776786150000726
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000731
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000732
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000733
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000734
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000735
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000736
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在一些实施方案中，佐剂部分具有式AdjC：
Figure BDA0002776786150000741
其中
每个E独立地为C、CH或N,
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000742
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150000743
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150000744
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000745
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000746
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000751
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000752
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000753
T1、T2、T3和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000754
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000761
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000762
表示Q、T1、T2、T3和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000763
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000764
Figure BDA0002776786150000771
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000772
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000773
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000774
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000775
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000776
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000781
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000782
T1和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000783
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000791
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000792
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000793
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些实施方案中，佐剂部分具有式AdjD：
Figure BDA0002776786150000794
其中
A为CH或N，
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000795
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150000796
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150000797
其中
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000801
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000802
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000803
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000804
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000805
T1和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000806
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000811
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000812
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000813
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些情况下，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000814
在某些实施方案中，佐剂部分不具有下式：
Figure BDA0002776786150000815
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000816
T1和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000821
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000822
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000823
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000824
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000825
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000826
T1和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000831
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000832
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000833
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000834
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些实施方案中，佐剂部分具有式AdjE：
Figure BDA0002776786150000835
其中
每个E独立地为C、CH或N,
A为CH或N，
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000841
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150000842
每个RH任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000843
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000844
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000845
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000846
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000851
其中
A为CH或N，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000852
T1、T2和每个RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000853
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000854
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000855
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000861
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000862
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000863
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150000864
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000865
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000866
表示Q和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000871
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在优选的实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000872
其中
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150000873
V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
W任选地存在且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000874
表示RH的连接点，
虚线
Figure BDA0002776786150000875
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
更优选地，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000881
其中
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
Y任选地存在且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
虚线
Figure BDA0002776786150000882
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在一些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000891
其中
Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
虚线
Figure BDA0002776786150000892
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000893
Figure BDA0002776786150000901
其中
A为CH或N，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000902
T1、T2和每个RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000903
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000911
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000912
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000913
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000914
其中
A为CH或N，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000921
T1和每个RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000922
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000923
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000924
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000925
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000926
其中
A为CH或N，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000931
每个RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000932
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000933
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150000934
表示Q和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000935
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些实施方案中，佐剂部分具有式AdjF：
Figure BDA0002776786150000936
其中
每个J独立地为C、CH、CH2、N、NH、O或S，
E为C、CH或N，
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000941
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150000942
每个RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000943
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000944
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个
Figure BDA0002776786150000945
独立地表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000946
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000947
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000951
其中
每个A独立地为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000952
T1、T2和每个RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000953
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000954
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个
Figure BDA0002776786150000955
独立地表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000956
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000961
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000962
其中
每个A独立地为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000963
T1、T2和每个RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000964
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000965
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个
Figure BDA0002776786150000971
独立地表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000972
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000973
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些实施方案中，佐剂部分具有式AdjG：
Figure BDA0002776786150000974
其中
每个J独立地为C、CH、CH2、N、NH、O或S，
每个E独立地为C、CH或N，
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000975
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150000976
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150000977
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000981
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000982
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000983
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000984
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150000985
其中
A为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150000991
T1、T2、T3和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150000992
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150000993
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150000994
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150000995
表示Q、T1、T2、T3和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150000996
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001001
其中
A为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001002
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001003
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001011
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150001012
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150001013
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001014
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在一些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001015
其中
A为CH或N，
J为CH、CH2、N、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001021
T1和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001022
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001023
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基；和
Figure BDA0002776786150001024
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150001025
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001026
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001031
其中
A为CH或N，
J为CH2、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001032
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001033
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001034
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150001035
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001041
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001042
其中
J为CH2、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001043
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150001044
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001051
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150001052
表示Q和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001053
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001054
其中
J为CH2、NH、O或S，
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001055
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150001061
V任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
X任选地存在并且为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团连接或稠合，其中连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
Y任选地存在并且为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001062
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150001063
表示Q和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001064
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在优选的实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001065
Figure BDA0002776786150001071
其中
J为CH2、NH、O或S，
V任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
X任选地存在并且为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团连接或稠合，其中连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
Z任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
条件是至少X或Z存在，
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个n独立地为0至4的整数，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001072
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
更优选地，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001073
其中
V任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
X任选地存在并且为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团连接或稠合，其中连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
Z任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
条件是至少X或Z存在，
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个n独立地为0至4的整数
虚线
Figure BDA0002776786150001081
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在一些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001082
其中
V任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
R是氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个n独立地为0至4的整数
虚线
Figure BDA0002776786150001083
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在一些实施方案中，佐剂部分不具有下式：
Figure BDA0002776786150001091
其中
E为C、CH或N，
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001092
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150001093
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150001094
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001095
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150001096
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150001101
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001102
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在一些实施方案中，佐剂部分具有式AdjH：
Figure BDA0002776786150001103
其中
A为CH或N，
每个E独立地为C、CH或N,
每个RC任选地存在并且独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001104
除了存在至少一个RC并且具有下式：
Figure BDA0002776786150001105
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150001106
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001111
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150001112
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150001113
表示RC和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001114
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是RC所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001115
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001116
T1、T2、T3和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001117
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001121
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150001122
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150001123
表示Q、T1、T2、T3和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001124
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001125
Figure BDA0002776786150001131
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001132
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001133
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001134
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150001141
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150001142
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001143
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001144
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001145
T1、T2和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001146
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001151
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150001152
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150001153
表示Q、T1、T2和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001154
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001155
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001156
T1和RH独立地具有下式：
Figure BDA0002776786150001157
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001161
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
Figure BDA0002776786150001162
表示单键或双键，
波浪线
Figure BDA0002776786150001163
表示Q、T1和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001164
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001165
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001171
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150001172
每个V任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个X任选地存在并且独立地为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团被连接或稠合，其中所连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
每个Y任选地存在并且独立地为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001173
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150001174
表示Q和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001175
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在某些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001181
其中
Q具有下式：
Figure BDA0002776786150001182
RH具有下式：
Figure BDA0002776786150001183
V任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
每个W任选地存在并且独立地为直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
X任选地存在并且为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团连接或稠合，其中连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
Y任选地存在并且为-CO-或直链或支链的、饱和或不饱和的二价C1-C8烷基，
每个Z任选地存在并且独立地为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
U任选地存在并且为
Figure BDA0002776786150001191
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
波浪线
Figure BDA0002776786150001192
表示Q和RH的连接点，
点(“●”)表示U的连接点，以及
虚线
Figure BDA0002776786150001193
表示佐剂部分与间隔基的连接点。因此，接头与佐剂核心的连接点(“P”)是Q所结合的佐剂核心中的原子。
在优选的实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001194
其中
V任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
X任选地存在并且为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团连接或稠合，其中连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
Z任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
条件是至少X或Z存在，
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个n独立地为0至4的整数
虚线
Figure BDA0002776786150001201
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
更优选地，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001202
其中
V任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
X任选地存在并且为一个、两个、三个或四个二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，并且当存在一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团时，所述一个以上二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团连接或稠合，其中连接的二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团通过键或-CO-连接，
Z任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-或-NR-，
条件是至少X或Z存在，
每个R独立地为氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个n独立地为0至4的整数
虚线
Figure BDA0002776786150001203
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在一些实施方案中，佐剂部分具有下式：
Figure BDA0002776786150001211
其中
V任选地存在并且为-O-、-S-、-NH-、-NR-或-CO-，
R是氢、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、腈、-COOH或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C4烷基，
每个n独立地为0至4的整数
虚线
Figure BDA0002776786150001212
表示佐剂部分与间隔基的连接点。
在本发明的某些实施方案中，式AdjA-AdjH中的一个或多个芳族氢原子可以被卤素原子(例如，氟、氯、溴、碘或其组合)取代。
在一些实施方案中、X为一个或多个选自以下的二价基团：苯、萘、吡咯、吲哚、异吲哚、吲嗪、呋喃、苯并呋喃、苯并噻吩、噻吩、吡啶、吖啶、萘啶、喹诺酮、异喹啉、异噁唑、噁唑、苯并噁唑、异噻唑、噻唑、苯并噻唑、咪唑、噻二唑、四唑、三唑、噁二唑、苯并咪唑、嘌呤、吡唑、吡嗪、蝶啶、喹喔啉、酞嗪、喹唑啉、三嗪、吩嗪、噌啉、嘧啶、哒嗪、环己烷、十氢化萘、吡咯烷、八氢吲哚、八氢异吲哚、四氢呋喃、八氢苯并呋喃、八氢苯并噻吩、四氢噻吩、哌啶、十四氢吖啶、萘啶、十氢喹啉、十氢异喹啉、异唑烷、唑烷、八氢苯并恶唑、异噻唑烷、噻唑烷、八氢苯并噻唑、咪唑烷、1,2,3-噻唑烷、四唑烷、1,2,3-三唑烷、1,2,3-恶唑烷、八氢苯并咪唑、八氢嘌呤、吡唑烷、哌嗪、十氢蝶啶(dechydropteridine)、十氢喹喔啉、十氢酞嗪(dechydrophthalazine)、十氢喹嗪(dechydroquinazine)、1,3,5-三嗪、十四氢吩嗪、十氢噌啉、六氢嘧啶或六氢哒嗪。在一些实施方案中、X的一个或多个二价基团是稠合的。在一些实施方式中、X的一个或多个二价基团通过键或-CO-连接。
在某些实施方案中，X具有下式：
Figure BDA0002776786150001221
其中上述结构中的任何一个可以双向使用。
在某些实施方案中，佐剂部分不是S-27609、CL307、UC-IV150、咪喹莫特(imiquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)、莫托莫德(motolimod)、VTS-1463GS-9620、GSK2245035、TMX-101、TMX-201、TMX-202、艾托立宾(isatoribine)、AZD8848、MEDI9197、3M-051、3M-852、3M-052、3M-854A、S-34240、KU34B或CL663、ORN02、ORN06、CL075、CL097、CL264或洛索立宾(loxoribine)。
在某些实施方案中，佐剂(“Adj”)是：
表1
Figure BDA0002776786150001231
Figure BDA0002776786150001241
Figure BDA0002776786150001251
Figure BDA0002776786150001261
Figure BDA0002776786150001271
Figure BDA0002776786150001281
Figure BDA0002776786150001291
Figure BDA0002776786150001301
Figure BDA0002776786150001311
Figure BDA0002776786150001321
Figure BDA0002776786150001331
Figure BDA0002776786150001341
Figure BDA0002776786150001351
Figure BDA0002776786150001361
Figure BDA0002776786150001371
Figure BDA0002776786150001381
Figure BDA0002776786150001391
Figure BDA0002776786150001401
Figure BDA0002776786150001411
Figure BDA0002776786150001421
Figure BDA0002776786150001431
Figure BDA0002776786150001441
Figure BDA0002776786150001451
Figure BDA0002776786150001461
Figure BDA0002776786150001471
Figure BDA0002776786150001481
Figure BDA0002776786150001491
Figure BDA0002776786150001501
Figure BDA0002776786150001511
Figure BDA0002776786150001521
Figure BDA0002776786150001531
Figure BDA0002776786150001541
Figure BDA0002776786150001551
Figure BDA0002776786150001561
Figure BDA0002776786150001571
Figure BDA0002776786150001581
Figure BDA0002776786150001591
Figure BDA0002776786150001601
Figure BDA0002776786150001611
Figure BDA0002776786150001621
Figure BDA0002776786150001631
Figure BDA0002776786150001641
Figure BDA0002776786150001651
Figure BDA0002776786150001661
Figure BDA0002776786150001671
Figure BDA0002776786150001681
Figure BDA0002776786150001691
Figure BDA0002776786150001701
其中虚线
Figure BDA0002776786150001702
表示佐剂与间隔基的连接点。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的佐剂部分所定义的佐剂，其中虚线
Figure BDA0002776786150001703
表示佐剂部分与氢的连接点。不希望受任何特定理论的束缚，据信如果佐剂部分作为本文所述免疫缀合物的一部分具有活性，则佐剂部分也将具有作为佐剂的活性。或者，佐剂部分作为本文所述免疫缀合物的一部分可以不具有活性而是具有作为佐剂的活性。因此，佐剂可用作独立的治疗剂或用在组合疗法中。例如，佐剂可用于靶向Toll样受体(例如，TLR7和/或TLR8)的疗法中。
在一些实施方案中，包含佐剂部分的本发明的免疫缀合物(其中所述佐剂部分包含在位置RC处连接于接头的佐剂核心)，具有的佐剂活性大于除了佐剂核心在2-氨基氮部分的侧基氨基基团连接于接头之外的相同免疫缀合物在其它方面相同的条件下的佐剂活性的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、或至少约100倍。如本文所用，“佐剂活性”是免疫缀合物的佐剂部分(即，包含佐剂核心和合成手柄)结合其受体的能力的定度量量。
使用HEK293细胞测定佐剂活性，所述HEK293细胞与在与NF-κB和AP-1结合位点融合的IFN-β最小启动子的控制下的人TLR7或TLR8或鼠TLR7和可诱导分泌的胚胎碱性磷酸酶报道基因共转染。随后在碱性磷酸酶底物的存在下，将细胞与所示佐剂的每一种的2倍连续稀释液在37℃下孵育12小时。通过分光光度法(OD650nm)测量活性。
在一些实施方案中，包含佐剂部分的本发明的免疫缀合物(其中所述佐剂部分包含在位置RC处连接于接头的佐剂核心)，具有的佐剂活性大于除了佐剂核心在位置RH处连接于接头之外的相同免疫缀合物在其它方面相同的条件下的佐剂活性的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、或至少约100倍。
在一些实施方案中，包含佐剂部分的本发明的免疫缀合物(其中所述佐剂部分含有在位置RC处连接于接头的佐剂核心)，具有的佐剂活性是在不存在抗体和接头的情况下，在其它方面相同的条件下的所述佐剂部分的佐剂活性的至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
在一些实施方案中，包含佐剂部分的本发明的免疫缀合物(其中所述佐剂部分含有在位置RC处连接于接头的佐剂核心)，具有的免疫缀合物活性大于除了佐剂核心在2-氨基氮部分的侧基氨基基团连接于接头之外的相同免疫缀合物在其它方面相同的条件下的免疫缀合物活性的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、或至少约100倍。本文所用的“免疫缀合物活性”是免疫缀合物引起先天免疫应答的能力的定量度量。
使用人抗原呈递细胞(APC)测定免疫缀合物活性，所述人抗原呈递细胞(APC)，使用含有抗CD14、CD16、CD40、CD86、CD123和HLA-DR的单克隆抗体的RosetteSep HumanMonocyte Enrichment Cocktail(Stem Cell Technologies)，通过密度梯度离心从获自健康血液供体(Stanford Blood Center)的人外周血单核细胞阴性选择。随后使用含有抗CD14、CD16、CD40、CD86、CD123和HLA-DR的单克隆抗体的EasySep Human MonocyteEnrichment Kit，在没有CD16消耗的情况下，经阴性选择将未成熟APC纯化至>97％纯度。将2×105个APC与或不与6.5×105个自体或同种异体CFSE-标记的肿瘤细胞在含有IMDM培养基(Gibco)的96孔板(Corning)中孵育，所述IMDM培养基补充有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mML-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、50μM 2-ME和在所示情况下的各种浓度的抗体。18小时后通过流式细胞术分析细胞和无细胞上清液。
在一些实施方案中，包含佐剂部分的本发明的免疫缀合物(其中所述佐剂部分含有在位置RC处连接于接头的佐剂核心)，具有的免疫缀合物活性大于除了佐剂核心在位置RH处连接于接头之外的相同免疫缀合物在其它方面相同的条件下的免疫缀合物活性的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、或至少约100倍。
在一些实施方案中，包含佐剂部分的本发明的免疫缀合物(其中所述佐剂部分含有在位置RC处连接于接头的佐剂核心)，具有的免疫缀合物活性是包含不存在连接的佐剂部分和抗体的混合物，在其它方面相同的条件下的免疫缀合物活性的至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。
在一些实施方案中，本发明提供下式的免疫缀合物：
Figure BDA0002776786150001731
Figure BDA0002776786150001741
Figure BDA0002776786150001751
或其药学上可接受的盐，其中下标r是1至10的整数，并且“Ab”是本文所述的抗体构建体。在某些实施方案中，下标r是1至4的整数(即，1、2、3或4)。
免疫缀合物的配制和施用
在相关方面，本发明提供了一种组合物，其包含多种如上所述的免疫缀合物。在一些实施方案中，每个免疫缀合物的佐剂部分的平均数目的范围为约1至约8。每个免疫缀合物的佐剂部分的平均数目的范围可以为例如约1至约8，或约1至约6，或约1至约4。每个免疫缀合物的佐剂部分的平均数目可以为约0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0或4.2。在一些实施方案中，每个免疫缀合物的佐剂部分的平均数目为约4。在一些实施方案中，每个免疫缀合物的佐剂部分的平均数目为约2。在一些情况下，抗体与单一佐剂部分共价结合。在一些情况下，抗体通过接头与2个或更多个佐剂部分(例如，3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个佐剂部分)共价结合。在一些情况下，抗体通过接头与1-8个佐剂部分(例如，1-5、1-3、2-8、2-5、2-3或3-8个佐剂部分)共价结合。在一些情况下，抗体与2-8个佐剂部分(例如，2-5、2-3或3-8个佐剂部分)共价结合。在抗体与一个以上的佐剂部分共价结合的一些情况下，所连接的佐剂部分可以相同或不同。例如，在一些情况下，两个或更多个佐剂部分可以是相同的(例如，相同佐剂部分的两个不同分子可以各自在抗体上的不同位点连接到抗体)。在一些情况下，抗体与2个或更多个不同的佐剂部分(例如，3个或更多个，4个或更多个，或5个或更多个不同的佐剂部分)共价结合。例如，当产生本发明的免疫缀合物时，可以将一种或多种抗体与包括两种或更多种(例如，3种或更多种，4种或更多种，或5种或更多种)不同的佐剂-接头化合物的混合物组合，使得一种或多种抗体中的氨基酸侧链与佐剂-接头化合物反应，从而产生一种或多种免疫缀合物，所述免疫缀合物各自与两种或更多种不同的佐剂部分共价结合。
在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。例如，本发明的免疫缀合物可以配制用于肠胃外施用，例如静脉内(IV)施用或施用到体腔或器官的内腔中。或者，免疫缀合物可以肿瘤内注射。用于注射的制剂通常包含溶解在药学上可接受的载体中的免疫缀合物的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水和林格氏溶液，等渗氯化钠。此外，无菌不挥发性油可以常规地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸同样可用于注射剂的制备。这些溶液是无菌的并且通常没有不希望的物质。这些制剂可以通过常规的，熟知的灭菌技术进行灭菌。制剂可以含有近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂，例如乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等。这些制剂中免疫缀合物的浓度可以广泛变化，并且将主要基于流体体积，粘度，体重等，根据所选择的具体施用模式和患者的需要来选择。在某些实施方案中，注射用溶液制剂中免疫缀合物的浓度范围为约0.1％(w/w)至约10％(w/w)。
另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法。所述方法包括将治疗有效量的免疫缀合物(例如，作为如上所述的组合物)施用于有需要的受试者。例如，所述方法可包括施用免疫缀合物以向受试者提供约100ng/kg至约50mg/kg的剂量。免疫缀合物剂量的范围可以为约5mg/kg至约50mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg、或约100μg/kg至约1mg/kg。免疫缀合物剂量可以为约100、200、300、400或500μg/kg。免疫缀合物剂量可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。免疫缀合物剂量也可以在这些范围之外，这取决于特定的缀合物以及所治疗的癌症的类型和严重程度。施用频率的范围可以为每周单剂量至多剂量，或更频繁。在一些实施方案中，免疫缀合物每月约一次至每周约五次施用。在一些实施方案中，免疫缀合物每周施用一次。
另一方面，本发明提供了预防癌症的方法。该方法包括将治疗有效量的免疫缀合物(例如，作为如上所述的组合物)施用于受试者。在某些实施方案中，受试者对要预防的某种癌症是易感的。例如，所述方法可包括施用免疫缀合物以向受试者提供约100ng/kg至约50mg/kg的剂量。免疫缀合物剂量的范围可以为约5mg/kg至约50mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg、或约100μg/kg至约1mg/kg。免疫缀合物剂量可以为约100、200、300、400或500μg/kg。免疫缀合物剂量可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。免疫缀合物剂量也可以在这些范围之外，这取决于特定的缀合物以及所治疗的癌症的类型和严重程度。施用频率的范围可以为每周单剂量至多剂量，或更频繁。在一些实施方案中，免疫缀合物每月约一次至每周约五次施用。在一些实施方案中，免疫缀合物每周施用一次。
本发明的一些实施方案提供了如上所述的用于治疗癌症的方法，其中所述癌症是头颈癌。头颈癌(以及头颈鳞状细胞癌)是指以口腔，咽和喉，唾液腺，鼻旁窦和鼻腔以及颈上部的淋巴结的鳞状细胞癌为特征的多种癌症。头颈癌在美国占所有癌症的约3-5％。这些癌症在男性和50岁以上的人群中更常见。烟草(包括无烟烟草)和酒精使用是头颈癌，特别是口腔，口咽，下咽和喉的那些癌症的最重要的风险因素。85％的头颈癌与烟草使用有关。在本发明的方法中，免疫缀合物可用于靶向多种恶性细胞。例如，免疫缀合物可用于靶向唇，口腔，咽，喉，鼻腔或鼻旁窦的鳞状上皮细胞。免疫缀合物可用于靶向粘液表皮样癌细胞，腺样囊性癌细胞，腺癌细胞，小细胞未分化癌细胞，成神经细胞瘤细胞，霍奇金淋巴瘤细胞和非霍奇金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，用于治疗头颈癌的方法包括施用含有能够结合EGFR(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗和扎鲁珠单抗)、PD-1(例如，派姆单抗)和/或MUC1的抗体的免疫缀合物。
本发明的一些实施方案提供了如上所述的用于治疗癌症的方法，其中所述癌症是乳腺癌。乳腺癌可以源自乳房中的不同区域，并且已经表征了多种不同类型的乳腺癌。例如，本发明的免疫缀合物可用于治疗导管原位癌；侵袭性导管癌(例如，乳腺的小管癌；髓样癌；粘液癌；乳头状癌；或筛状癌)；小叶原位癌；侵袭性小叶癌；炎性乳腺癌；以及其它形式的乳腺癌。在一些实施方案中，用于治疗乳腺癌的方法包括施用含有能够结合HER2(例如曲妥单抗、马吉昔单抗)、糖蛋白NMB(例如格列木单抗)和/或MUC1的抗体的免疫缀合物。
在一些实施方案中，癌症对由TLR7和/或TLR8诱导的抗炎反应是敏感的。
本文描述的本发明主题的方面(包括实施方案)可以单独或与一个或多个其它方面或实施方案组合是有益的。在不限制前述描述的情况下，下文提供编号为1-35的本公开的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，每个单独编号的方面可以使用或与前面或后面的单独编号的方面中的任何一个组合。这旨在为所有这些方面的组合提供支持，并且不限于下文明确提供的方面的组合：
1.免疫缀合物，其包含：
(a)抗体构建体，其包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域，和
(b)1-8个佐剂核心，其中每个佐剂核心通过接头与所述抗体构建体共价结合，其中每个佐剂核心包含具有侧基氮原子的2-氨基氮部分和所述接头与所述佐剂核心的连接点，并且其中所述侧基氮原子与所述接头的连接点之间的距离大于约
Figure BDA0002776786150001782
2.如方面1所述的免疫缀合物，其中所述侧基氮原子与所述接头的连接点之间的距离大于约
Figure BDA0002776786150001783
3.如方面2所述的免疫缀合物，其中所述侧基氮原子与所述接头的连接点之间的距离大于约
Figure BDA0002776786150001784
4.如方面1-3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure BDA0002776786150001781
Figure BDA0002776786150001791
其中所述佐剂核心由稠环A、B和C表示，并且其中A和B存在，C任选地存在，A、B和C独立地表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与B环的连接点，并且n是1至8的整数。
5.如方面4所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure BDA0002776786150001792
其中所述佐剂核心由稠环Ar、B和C表示，并且其中Ar和B存在，C任选地存在，Ar表示含有2-氨基氮部分的芳环，任选包含另外的氮原子并且是任选取代的，B和C独立地表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与B环的连接点，并且n是1至8的整数。
6.如方面4所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure BDA0002776786150001793
其中B存在并且C任选地存在，并且B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与B环的连接点，并且n是1至8的整数。
7.如方面1-3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure BDA0002776786150001801
其中所述佐剂核心由稠环A、B和C表示，并且其中A、B和C存在并且独立地表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与C环的连接点，并且n是1至8的整数。
8.如方面1-3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure BDA0002776786150001802
其中所述佐剂核心由稠环Ar、B和C表示，并且其中Ar和C存在，B任选地存在，Ar表示含有2-氨基氮部分的芳环，任选地包含另外的氮原子并且是任选取代的，B和C独立地表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与C环的连接点，并且n是1至8的整数。
9.如方面1-3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure BDA0002776786150001811
其中C存在并且B任选地存在，并且B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与C环的连接点，并且n是1至8的整数。
10.如方面1-9中任一项所述的免疫缀合物，其中当与包含天冬氨酸残基的TLR8的结合结构域结合时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA0002776786150001812
11.如方面10所述的免疫缀合物，其中所述天冬氨酸残基是Asp543。
12.如方面10或11所述的免疫缀合物，其中所述2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA0002776786150001813
13.如方面1-12任一项所述的免疫缀合物，其中当与包含天冬氨酸残基的TLR7的结合结构域结合时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA0002776786150001814
14.如方面13所述的免疫缀合物，其中所述天冬氨酸残基是Asp555。
15.如方面13或14所述的免疫缀合物，其中所述2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure BDA0002776786150001821
16.如方面1-16中任一项所述的免疫缀合物，其中当与包含精氨酸和丝氨酸残基的TLR8的结合结构域结合时，所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述丝氨酸残基的侧链的氧原子约
Figure BDA0002776786150001822
至约
Figure BDA0002776786150001823
和/或所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述精氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA0002776786150001824
至约
Figure BDA0002776786150001825
17.如方面16所述的免疫缀合物，其中所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述丝氨酸残基的侧链的氧原子约
Figure BDA0002776786150001826
至约
Figure BDA0002776786150001827
所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述精氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA0002776786150001828
至约
Figure BDA0002776786150001829
18.如方面16或17所述的免疫缀合物，其中所述丝氨酸残基是Ser352，并且所述精氨酸残基是Arg429。
19.如方面1-18中任一项所述的免疫缀合物，其中当与包含赖氨酸和缬氨酸残基的TLR7的结合结构域结合时，所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述缬氨酸残基的侧链的次甲基碳原子约
Figure BDA00027767861500018210
至约
Figure BDA00027767861500018211
和/或所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述赖氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA00027767861500018212
至约
Figure BDA00027767861500018213
20.如方面19所述的免疫缀合物，其中所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述缬氨酸残基的侧链的次甲基碳原子约
Figure BDA00027767861500018214
至约
Figure BDA00027767861500018215
并且所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述赖氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure BDA00027767861500018216
至约
Figure BDA00027767861500018217
21.如方面19或20所述的免疫缀合物，其中所述缬氨酸残基是Val355，并且所述赖氨酸残基是Lys432。
22.如方面1-21中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体构建体还包含靶向结合结构域。
23.如方面1-22中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体构建体是抗体。
24.如方面1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合癌细胞的抗原。
25.如方面1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合选自以下的抗原：CDH1、CD19、CD20、CD29、CD30、CD40、CD47、EpCAM、SLAMF7、PDGFRa、gp75、MSLN、CA6、CA9、CDH6、CTAG1B/NY-ESO-1、LAMP1、LeY、MAGEA3/A6、P-钙粘蛋白、BCMA、CD38、HLA-DR、ROR1、WT1、GFRA1、FR-α、L1-CAM、LRRC15、MUC1、MUC16、PSMA、SLC34A2、TROP2、GPC3、CCR8和VEGF。
26.如方面1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合HER2。
27.如方面1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合EGFR。
28.如方面1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合PD-L1。
29.如方面1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合CEA。
30.如方面23-29中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体是IgG1抗体。
31.如方面23-29中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体选自奥拉单抗、奥珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗、贝伐单抗、达拉木单抗、依那西普、派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、伊匹木单抗、帕尼单抗、扎鲁珠单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗和依洛珠单抗。
32.组合物，其包含多种方面1-29中任一项所述的免疫缀合物。
33.治疗癌症的方法，其包括将治疗有效量的方面1-31中任一项所述的免疫缀合物或方面32所述的组合物施用于有需要的受试者。
34.预防癌症的方法，其包括将治疗有效量的方面1-31中任一项所述的免疫缀合物或方面32所述的组合物施用于有需要的受试者。
35.如方面33或34所述的方法，其中所述癌症对TLR7和/或TLR8诱导的抗炎反应是敏感的。
实施例
以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例1：化合物2的合成
Figure BDA0002776786150001841
将2,2-二甲基-1,3-二噁烷-4,6-二酮(41.89g，290.66mmol，1当量)和4-溴苯胺(50g，290.66mmol，1当量)的混合物(纯)在80℃下搅拌12小时。然后，通过真空除去少量剩余的丙酮。在80℃下将伊顿试剂(415.15g，1.74mol，273.12mL，6当量)添加至混合物持续12小时。向该混合物中添加水(1000mL)，同时剧烈搅拌。过滤沉淀，用H2O洗涤，风干，得到固体。将固体从乙醇中重结晶，得到6-溴喹啉-2,4-二醇(26g，108.31mmol，37.26％收率)，为灰白色固体。1H NMR(二甲亚砜(DMSO)-d6,400MHz)δ11.53(s,1H),11.33(s,1H),7.85(d,J＝2.4Hz,1H),7.75(dd,J＝8.0Hz,4.0Hz,1H),7.18-7.24(m,1H),5.75(s,1H)。
实施例2：化合物3的合成
Figure BDA0002776786150001842
在15℃下向硝酸HNO3(13.65g,216.62mmol,9.75mL,2当量)在AcOH(500mL)的溶液中缓慢添加6-溴喹啉-2,4-二醇(26g,108.31mmol,1当量)。将混合物在80℃下搅拌3小时。将混合物冷却并通过添加水(1000mL)淬灭。通过过滤分离产物，并用水(100mL×3)洗涤，干燥，得到所需产物。获得呈黄色固体的粗产物6-溴-3-硝基-喹啉-2,4-二醇(30g,105.24mmol,97.17％收率)，且不经进一步纯化即用于下一步骤。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.92(s,1H),8.13(s,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,1H)。
实施例3：化合物4的合成
Figure BDA0002776786150001851
在15℃下向6-溴-3-硝基-喹啉-2,4-二醇(30g,105.24mmol,1当量)在POCl3(484.12g,3.16mol,293.41mL,30当量)的混合物中缓慢添加N,N-二异丙基乙胺(40.81g,315.73mmol,55.00mL,3当量)。将混合物在100℃下搅拌16小时。将混合物在真空中浓缩。将残余物倒入冰水(2000mL)中，过滤并用H2O(500mL×3)洗涤，干燥，得到呈黄色固体的6-溴-2,4-二氯-3-硝基-喹啉(30g，93.18mmol，88.54％收率)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.48(d,J＝2.0Hz,1H),8.25(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),8.10(d,J＝8.8Hz,1H)。
实施例4：化合物5的合成
Figure BDA0002776786150001852
在室温下向6-溴-2,4-二氯-3-硝基-喹啉(5.6g,17.4mmol,1当量)和固体K2CO3(3.6g，26mmol，1.5当量)在DMF(100mL)的溶液中添加纯2,4-二甲氧基苄胺(3.5g,20.1mmol,1.2当量)。将混合物搅拌15min，添加水(300mL)，并将混合物再搅拌5min。将所得固体过滤，然后溶解在乙酸乙酯(100mL)中。将溶液用水(100mL)，盐水(100mL)洗涤，分离，干燥(Na2SO4)，然后过滤并真空浓缩。将棕色固体用1:1己烷/乙醚(150mL)研磨并过滤，得到6-溴-2-氯-4-[(2,4-二甲氧基苄基)氨基]-3-硝基喹啉(6.9g,15.3mmol,88％)，为黄色固体。该化合物无需进一步纯化即可使用。
实施例5：化合物6的合成
Figure BDA0002776786150001861
在0℃下向6-溴-2-氯-4-[(2,4-二甲氧基苄基)氨基]-3-硝基喹啉(6.9g,15.3mmol,88％)的甲醇(200mL)溶液中添加NiCl2.6H2O(0.36g,1.5mmol,0.1当量)。添加硼氢化钠(粒料，1.42g，38mmol，2.5当量)，并将反应在0℃下搅拌1h，然后温热至室温，并再搅拌15min。添加冰醋酸(5mL)，直到获得～5的pH。真空蒸发溶剂，将粗固体再溶解在乙酸乙酯(150mL)中，然后通过硅藻土床过滤以去除黑色不溶性物质。真空除去乙酸乙酯。将深棕色固体用乙醚(75mL)研磨，然后过滤，得到3-氨基-6-溴-2-氯-4-(2,4-二甲氧基苄基)氨基喹啉(5.81g，13.7mmol，90％)，为褐色固体。该化合物无需进一步纯化即可使用。
实施例6：化合物7的合成
Figure BDA0002776786150001862
在室温下向搅拌的3-氨基-6-溴-2-氯-4-(2,4-二甲氧基苄基)氨基喹啉(5.75g，13.6mmol，1当量)在含有三乙胺(2.1g，2.8mL，20mmol，1.5当量)的二氯甲烷(100mL)的溶液中添加纯戊酰氯(2.0mL，2.0g，16mmol，1.2当量)。将混合物用水(150mL)，盐水(150mL)洗涤，分离，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将固体用乙醚研磨，过滤并在真空下干燥。获得N-(6-溴-2-氯-4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)喹啉-3-基)戊酰胺，为棕色固体(5.8g,11.4mmol,84％)。该化合物无需进一步纯化即可使用。
实施例7：化合物8的合成
Figure BDA0002776786150001871
在100mL烧杯中，将N-(6-溴-2-氯-4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)喹啉-3-基)戊酰胺(5.8g,11.4mmol,1当量)和2-氯苯甲酸(0.90g，5.7mmol，0.5当量)在50mL甲苯中煮沸2小时。每次体积达到25mL时添加甲苯至50mL。添加2,4-二甲氧基苄基胺(9.5g，57mmol，5当量)，并将反应在120℃下保持2小时。将反应冷却至室温，添加水(80mL)，然后添加乙酸(3.5mL)。倾析上清液，用水(80mL)洗涤粗产物。湿固体用甲醇(100mL)研磨，得到8-溴-2-丁基-N,1-双(2,4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(4.80g，7.7mmol，68％)，为灰白色固体。该化合物无需进一步纯化即可使用。
实施例8：化合物9的合成
Figure BDA0002776786150001872
将8-溴-2-丁基-N,1-双(2,4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(0.31g,0.5mmol,1当量)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.19g，1mmol，2当量)的混合物在甲苯(2mL)中合并，然后用氩气脱气。添加Pd2dba3(45mg，0.05mmol，0.1当量)、四氟硼酸三叔丁基膦(29mg,0.10mmol,0.2当量)和叔丁醇钠(144mg,1.5mmol,3当量)。将混合物在加盖的小瓶中在110℃加热30min。将混合物冷却，然后在乙酸乙酯(50mL)和水(50mL)之间分配。有机层用盐水(50mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。在硅胶(20g)上纯化粗产物，用50％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到呈灰白色固体的4-(2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.28g，0.39mmol，78％)。LC/MS[M+H]725.40(计算的)；LC/MS[M+H]725.67(观察的)。
实施例9：化合物10的合成
Figure BDA0002776786150001881
将4-(2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.28g,0.39mmol,1当量)溶解在TFA(3mL)中并加热至回流达5min。真空除去TFA，将粗产物溶于乙腈，过滤，然后浓缩，得到2-丁基-8-(哌嗪-1-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺的TFA盐(0.16g，0.37mmol，95％)，为灰白色固体。LC/MS[M+H]325.21(计算的)；LC/MS[M+H]325.51(观察的)。
实施例10：化合物11的合成
Figure BDA0002776786150001882
在80℃下向草酰氯(127mg，86μL，1mmol，2当量)在DCM(1mL)的溶液中滴加DMSO(156mg，142μL，2mmol，4当量)在DCM(1mL)中的溶液。将混合物在80℃下搅拌15min。向该混合物中添加羟基-PEG10-叔丁基酯(602mg，0.5mmol，1当量)在DCM(1mL)中的溶液。搅拌15min后，添加Et3N(303mg，418μL)，将混合物在80℃下搅拌15min，然后从冷浴中取出，在30min内温热至20℃。在20℃下，向2-丁基-8-(哌嗪-1-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺的TFA盐和三乙酰氧基硼氢化钠(212mg，1mmol，2当量)在DMF(3mL)的悬浮液中缓慢添加先前的混合物。将合并的混合物在20℃下搅拌45min。减压除去溶剂，向剩余物中添加3mL 10％的Na2CO3，剧烈搅拌15min。添加水(20mL)，将粗产物萃取到DCM(25mL)中。将有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将粗物质通过快速色谱，使用2-15％MeOH/DCM+1％Et3N的梯度洗脱来纯化，得到1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-叔丁基酯，收率56％。LC/MS[M+H]893.55(计算的)；LC/MS[M+H]893.79(观察的)。
实施例11：化合物12的合成
Figure BDA0002776786150001891
将1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-叔丁基酯溶解于二噁烷和3N HCl(5mL)的1∶1混合物中，然后加热至60℃持续90min。除去溶剂，将残余物与乙腈(5mL)共沸4次。所得1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-酸HCl盐不经进一步纯化而使用。
实施例12：化合物13的合成
Figure BDA0002776786150001901
向1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-酸HCl盐(0.13mmol，1当量)中添加2,3,5,6-四氟苯酚(66mg，0.4mmol，3当量)和二异丙基碳二亚胺(51mg，62μL，0.4mmol，3当量)溶解在乙腈(3mL)中的混合物，并将混合物在20℃下搅拌16小时。将混合物用水(12mL)稀释并通过反相色谱，使用30-80％乙腈/水+0.1％TFA的梯度洗脱剂，在10min内纯化。将合并的级分在减压下浓缩，并将玻璃状膜与乙腈共沸4次(20mL)，得到1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-2,3,5,6-四氟苯基酯，收率54％。LC/MS[M+H]985.49(计算的)；LC/MS[M+H]985.71(观察的)。
实施例13：化合物15的合成
Figure BDA0002776786150001902
在0℃在N2下向6-溴-1H-吲哚(5.00g，25.50mmol，1当量)和吡啶(2.62g，33.16mmol，2.68mL，1.3当量)在Et2O(80mL)的混合物中缓慢添加2-氯-2-氧代-乙酸乙酯(4.18g，30.61mmol，3.43mL，1.2当量)。将混合物在0℃下搅拌2小时。沉淀出黄色固体。将混合物过滤并将滤饼用H2O洗涤。将粗产物用H2O在20℃研磨20min，得到2-(6-溴-1H-吲哚-3-基)-2-氧代-乙酸乙酯(5.4g，18.24mmol，71.50％收率)，为黄色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ12.46(s,1H),8.46(d,J＝3.6Hz,1H),8.10(d,J＝8.8Hz,1H),7.75(s,1H),7.43(d,J＝8.8Hz,1H),4.36(q,J＝7.2Hz,2H),1.33(t,J＝7.2Hz,3H)。J＝7.2Hz,3H)。
实施例14：化合物16的合成
Figure BDA0002776786150001911
在25℃在N2下向2-(6-溴-1H-吲哚-3-基)-2-氧代-乙酸乙酯(5.4g，18.24mmol，1当量)和丁基肼(3.41g，27.35mmol，1.5当量，HCl)在EtOH(60mL)的混合物中添加AcOH(10.95g，182.36mmol，10.43mL，10当量)。将混合物在90℃下搅拌16小时。LCMS显示反应完成。将混合物在真空中浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(柱高度：250mm，直径：100mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝5/1，1/2)，得到7-溴-2-丁基-吡唑并[3,4-c]喹啉-4-醇(3g，9.37mmol，51.38％收率)，为棕色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ11.40(s,1H),8.72(s,1H),7.81(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(s,1H),7.34(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.37(t,J＝6.8Hz,2H),1.91-1.84(m,2H),1.32-1.25(m,2H),0.91(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例15：化合物17的合成
Figure BDA0002776786150001912
在25℃下，向7-溴-2-丁基-吡唑并[3,4-c]喹啉-4-醇(2.8g，8.74mmol，1当量)在POCl3(13.41g，87.45mmol，8.13mL，10当量)的混合物中一次性添加PCl5(910.52mg，4.37mmol，0.5当量)。LCMS显示反应完成。将混合物浓缩。将残余物倒入冰水(100mL)中并用CH2Cl2(30mL)稀释并用饱和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(柱高度：250mm，直径：100mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝10/1,3/1)，得到7-溴-2-丁基-4-氯-吡唑并[3,4-c]喹啉(2.6g，7.68mmol，87.80％收率)，为黄色油状物。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.30(s,1H),8.22(d,J＝2.0Hz,1H),7.85(d,J＝8.4Hz,1H),7.68(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.53(t,J＝7.2Hz,2H),2.08-2.04(m,2H),1.46-1.37(m,2H),0.10(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例16：化合物18的合成
Figure BDA0002776786150001921
将7-溴-2-丁基-4-氯-吡唑并[3,4-c]喹啉(2.6g，7.68mmol，1当量)和2,4-二甲氧基苯基)甲胺(6.42g，38.39mmol，5.78mL，5当量)的混合物在120℃下搅拌4小时。LCMS显示反应完成。将混合物溶解在EtOAc/H2O(10mL/10mL)中，用aq.HCl(4M)调节pH＝3。过滤水相，得到7-溴-2-丁基-N-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基]吡唑并[3,4-c]喹啉-4-胺(2.9g，6.18mmol，80.47％收率)，为黄色固体，其不经进一步纯化即用于下一步骤。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ9.03(s,1H),8.34(s,1H),8.04(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),6.61(d,J＝2.4Hz,1H),6.51(d,J＝8.4Hz,1H),4.89(d,J＝4.2Hz,2H),4.49(t,J＝6.8Hz,2H),3.75(m,6H),1.96-1.89(m,2H),1.35-1.27(m,2H),0.91(t,J＝7.2Hz,3H。
实施例17：化合物19的合成
Figure BDA0002776786150001931
在25℃在N2下向7-溴-2-丁基-N-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基]吡唑并[3,4-c]喹啉-4-胺(0.45g，958.73μmol，1当量)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(535.69mg，2.88mmol，3当量)在DMF(10mL)的混合物中一次性添加Pd2(dba)3(43.90mg，47.94μmol，0.05当量)、Cs2CO3(624.74mg，1.92mmol，2当量)和RuPhos(44.74mg，95.87μmol，0.1当量)。将混合物在140℃下搅拌2小时。LCMS显示反应完成。将混合物冷却至25℃并倒入冰水(30mL)中并搅拌1min。用乙酸乙酯(10mL×3)萃取水相。将合并的有机相用盐水(10mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。将残余物通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯＝10/1,1/1)纯化，得到呈黄色油状物的4-[2-丁基-4-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基氨基]吡唑并[3,4-c]喹啉-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.45g,783.00μmol,81.67％收率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.95(s,1H),7.67(d,J＝8.8Hz,1H),7.40(d,J＝8.0Hz,1H),7.28(d,J＝2.4Hz,1H),6.91(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),6.45(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),5.98(s,1H),4.87(d,J＝4.4Hz,2H),4.33(t,J＝7.6Hz,2H),3.86(s,3H),3.80(s,3H),3.64-3.61(m,4H),3.26-3.23(m,4H),1.99-1.92(m,2H),1.51(s,9H),1.40-1.34(m,2H),0.96(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例18：化合物20的合成
Figure BDA0002776786150001941
在25℃向4-[2-丁基-4-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基氨基]吡唑并[3,4-c]喹啉-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.2g,348.00μmol,1当量)在DCM(20mL)的混合物中一次性添加TFA(1.98g,17.40mmol,1.29mL,50当量)。LCMS和HPLC显示反应完成。将混合物浓缩并通过制备型HPLC(柱：Nano-micro KROMASILTM(Sigma-Aldrich)C18 100*30mm 5um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％:20％-55％,10min)纯化，得到2-丁基-7-哌嗪-1-基-吡唑并[3,4-c]喹啉-4-胺(0.088g,200.71μmol,57.67％收率，TFA)，为灰白色固体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ9.01(s,2H),8.88(s,1H),7.96(d,J＝8.8Hz,1H),7.23(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.11(d,J＝2.4Hz,1H),4.49(t,J＝7.2Hz,2H),3.45-3.44(m,4H),3.35-3.29(m,4H),1.98-1.90(m,2H),1.36-1.27(m,2H),0.93(t,J＝7.2Hz,3H)。LCMS(ESI)：C18H24N6的计算质量为324.21，m/z发现325.3[M+H]+。
实施例19：化合物21的合成
Figure BDA0002776786150001942
使用实施例10中所述的程序，将2-丁基-7-(哌嗪-1-基)-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-4-胺转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-叔丁基酯，65％收率。LC/MS[M+H]893.56(计算的)；LC/MS[M+H]893.82(观察的)。
实施例20：化合物22的合成
Figure BDA0002776786150001951
使用实施例11中所述的程序，将1-(4-(4-氨基-2-丁基-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-叔丁基酯转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-酸，92％收率。该化合物无需进一步纯化即可使用。
实施例21：化合物23的合成
Figure BDA0002776786150001952
使用实施例12中所述的程序，将1-(4-(4-氨基-2-丁基-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-酸转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-2,3,5,6-四氟苯基酯，46％收率。LC/MS[M+H]985.49(计算的)；LC/MS[M+H]985.73(观察的)。
实施例22：化合物25的合成
Figure BDA0002776786150001961
使用实施例13-21中所述的途径，将5-溴-1H-吲哚转化成1-(4-(4-氨基-2-丁基-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-2,3,5,6-四氟苯基酯。LC/MS[M+H]985.49(计算的)；LC/MS[M+H]985.73(观察的)。
实施例23：化合物27的合成
Figure BDA0002776786150001962
根据实施例2中所述的程序将7-溴喹啉-4-醇(9.66g,43.11mmol,1当量)转化成7-溴-3-硝基喹啉-4-醇(7.46g，27.7mmol，64％)。LC/MS[M+H]268.96/270.95(计算的)；LC/MS[M+H]268.99/271.02(观察的)。
实施例24：化合物28的合成
Figure BDA0002776786150001963
根据实施例3中所述的程序将7-溴-3-硝基喹啉-4-醇(7.46g,27.7mmol,1当量)转化为7-溴-4-氯-3-硝基喹啉(6.88g，23.9mmol，86％)。LC/MS[M+H]286.92/288.92(计算的)；LC/MS[M+H]286.98/288.97(观察的)。
实施例25：化合物29的合成
Figure BDA0002776786150001971
在20℃下将7-溴-4-氯-3-硝基喹啉(2.86g,10mmol,1当量)添加到(2,4-二甲氧基苯基)甲胺(100mmol,10当量)中。将混合物在120℃下搅拌3小时。将混合物用水(200mL)稀释并用EtOAc(100ml×3)萃取。将有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过快速硅胶色谱(Teledyne Isco,10g,SEPAFLASHTM硅胶快速柱，0至约50％乙酸乙酯/石油醚梯度以100mL/min洗脱)纯化，得到7-溴-N-(2,4-二甲氧基苄基)-3-硝基喹啉-4-胺(4.2g,10.0mmol,100％)。LC/MS[M+H]418.04/420.04(计算的)；LC/MS[M+H]418.19/420.16(观察的)。
实施例26：化合物30的合成
Figure BDA0002776786150001972
将7-溴-N-(2,4-二甲氧基苄基)-3-硝基喹啉-4-胺(4.2g,10.0mmol,1当量)悬浮于乙腈(24ml)中。添加水(4ml)，然后添加氯化镍(II)六水合物(0.48g,2mmol,0.2当量)。将硼氢化钠(1.52g,40.2mmol,4当量)添加到绿色悬浮液中，并将放热反应搅拌30min。将反应混合物过滤，浓缩，并通过快速色谱纯化，得到7-溴-N-4-(2,4-二甲氧基苄基)喹啉-3,4-二胺(2.15g，5.5mmol，55％)。LC/MS[M+H]388.07/390.06(计算的)；LC/MS[M+H]388.22/390.21(观察的)。
实施例27：化合物31的合成
Figure BDA0002776786150001981
将7-溴-N-4-(2,4-二甲氧基苄基)喹啉-3,4-二胺(2.15g,5.53mmol,1当量)溶解在乙腈(25ml)中。向搅拌的溶液中添加原戊酸三乙酯(2.57ml,11.1mmol,2当量)。然后添加碘(0.140g,0.55mmol,0.1当量)。将反应在室温下搅拌直至通过LCMS观察不到起始材料。将反应混合物浓缩，在二氯甲烷中稀释，通过快速色谱纯化，得到7-溴-2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉(2.43g，5.3mmol，97％)。LC/MS[M+H]454.11/456.11(计算的)；LC/MS[M+H]454.28/456.23(观察的)。
实施例28：化合物32的合成
Figure BDA0002776786150001982
将7-溴-2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉(2.7g,5.94mmol,1当量)溶解在15ml DCM中。向搅拌的反应中添加4-氯过氧苯甲酸(4.39g,17.83mmol,3当量)。将反应在室温下搅拌并通过LCMS监测。在起始材料消耗后，用10％碳酸钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，浓缩，并通过快速色谱纯化，得到7-溴-2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉5-氧化物(0.88g，1.87mmol，31％)。LC/MS[M+H]470.11/472.11(计算的)；LC/MS[M+H]470.27/472.25(观察的)。
实施例29：化合物33的合成
Figure BDA0002776786150001991
将7-溴-2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉5-氧化物(0.88g,1.87mmol,1当量)溶解在二氯甲烷(20ml)中并在冰上冷却。将磷酰氯(0.21ml,2.2mmol,1.2当量)逐滴添加到快速搅拌的溶液中，然后添加N,N-二甲基甲酰胺(0.072ml,0.94mmol,0.5当量)。5min后，将反应温热至环境温度并通过LCMS监测。在起始材料消耗后，用冰和10％碳酸钠水溶液的混合物洗涤溶液。分离有机层和水层，水层用二氯甲烷(15ml)萃取。将合并的有机级分用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到7-溴-2-丁基-4-氯-1-(2.4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉，为棕色泡沫(1.02g，2.09mmol，100％)。LC/MS[M+H]488.07/490.07(计算的)；LC/MS[M+H]488.22/490.21(观察的)。
实施例30：化合物34的合成
Figure BDA0002776786150001992
在120℃下将7-溴-2-丁基-4-氯-1-(2,4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉(1g,2mmol,1当量)和(2,4-二甲氧基苯基)甲胺(20mmol,10当量)的混合物搅拌2小时。向混合物中添加2M HCl以调节至pH～4，并用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。将合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝20/1至0:1)纯化，得到7-溴-2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-N-(2,4-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(0.694g，1.12mmol，57％)。LC/MS[M+H]619.19/621.32(计算的)；LC/MS[M+H]619.37/621.32(观察的)。
实施例31：化合物35的合成
Figure BDA0002776786150002001
将7-溴-2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-N-(2,4-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(0.154g,0.25mmol,1当量)和Pd(PPH3)4(28.7mg,0.0025mmol,0.1当量)在干燥的双氮下合并。在干燥二氮下添加氰基丁基溴化锌(2.5ml，0.5M，在THF中，1.24mmol，5当量)，并将反应加热至75℃。30min后，添加另一份氰基丁基溴化锌(2.5ml，0.5M，在THF中，1.24mmol，5当量)，将反应再搅拌90min。将溶液浓缩成浆液，并将粗物质通过快速色谱纯化，得到所需5-(2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-4-((2,4-二甲氧基苯基)氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)戊腈以及2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-N-(2,4-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺和残留溶剂的混合物，将其作为粗混合物(0.288g)。LC/MS[M+H]622.34(计算的)；LC/MS[M+H]622.96(观察的)。
实施例32：化合物36的合成
Figure BDA0002776786150002011
将5-(2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-4-((2,4-二甲氧基苯基)氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)戊腈(0.69g,1.1mmol,1当量)溶解在甲醇(20ml)中并在冰上冷却。将氯化镍(II)六水合物(0.053g,0.22mmol,0.2当量)和Boc酸酐(0.51ml,2.22mmol,2当量)添加到搅拌的混合物中。将硼氢化钠(1g,26.4mmol,23.8当量)在1小时内缓慢分批添加。将反应温热并使其在环境温度下静置1小时，然后浓缩。将粗物质溶解在乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠洗涤。将有机级分用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，然后通过快速色谱纯化，得到(5-(2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-4-((2,4-二甲氧基苯基)氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(0.265g，0.37mmol，33％)。LC/MS[M+H]726.42(计算的)；LC/MS[M+H]726.64(观察的)。
实施例33：化合物37的合成
Figure BDA0002776786150002012
在25℃在N2下向(5-(2-丁基-1-(2,4-二甲氧基苄基)-4-((2,4-二甲氧基苯基)氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(94.3mg,0.13mmol,1当量)在THF(20mL)的溶液中分批添加LiAlH4(0.65mmol，5当量)。将混合物在60℃下搅拌3小时。在0℃下向混合物添加饱和Na2SO4水溶液(2mL)并用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到2-丁基-N,1-双(3,4-二甲基苄基)-7-(5-(甲基氨基)戊基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺。LC/MS[M+H]640.39(计算的)；LC/MS[M+H]640.55(观察的)。
实施例34：化合物38的合成
Figure BDA0002776786150002021
在25℃下，向2-丁基-N,1-双(3,4-二甲基苄基)-7-(5-(甲基氨基)戊基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(348.57μmol，1当量)在DCM(20mL)的溶液中一次性添加TFA(24.56mmol，70.45当量)。将混合物在40℃下搅拌12小时。将混合物在45℃减压浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱：LUNATMC18 100×30 5u(Phenomenex,Inc.)；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％:5％-25％,10min)纯化，得到2-丁基-7-(5-(甲基氨基)戊基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺。LC/MS[M+H]340.25(计算的)；LC/MS[M+H]340.36(观察的)。
实施例35：化合物39的合成
Figure BDA0002776786150002022
使用实施例10中所述的程序，将2-丁基-7-(5-(甲基氨基)戊基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(50mg,0.15mmol,1当量)转化为39-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧杂-34-氮杂三十九烷酸叔丁酯。LC/MS[M+H]908.60(计算的)；LC/MS[M+H]908.75(观察的)。
实施例36：化合物40的合成
Figure BDA0002776786150002031
使用实施例11中所述的程序，将39-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧杂-34-氮杂三十九烷酸叔丁酯转化为39-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧杂-34-氮杂三十九烷酸(45mg，0.15mmol，33％，来自化合物38)。LC/MS[M+H]852.53(计算的)；LC/MS[M+H]852.75(观察的)。
实施例37：化合物41的合成
Figure BDA0002776786150002032
根据实施例12中所述的程序，将39-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧杂-34-氮杂三十九烷酸(45mg，0.053mmol，1当量)转化为39-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧杂-34-氮杂三十九烷酸2,3,5,6-四氟苯基酯(28.5mg,0.053mmol,54％)。LC/MS[M+H]1000.53(计算的)；LC/MS[M+H]1000.72(观察的)。
实施例38：化合物43的合成
Figure BDA0002776786150002041
使用实施例23-37中所述的途径，将5-溴喹啉-4-醇转化成39-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-9-基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧杂-34-氮杂三十九烷酸2,3,5,6-四氟苯基酯。LC/MS[M+H]1000.53(计算的)；LC/MS[M+H]1000.94(观察的)。
实施例39：化合物44的合成
Figure BDA0002776786150002042
使用实施例31-37中所述的途径，将化合物8转化成39-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧杂-34-氮杂三十九烷酸2,3,5,6-四氟苯基酯。LC/MS[M+H]1000.53(计算的)；LC/MS[M+H]1000.92(观察的)。
实施例40：化合物45的合成
Figure BDA0002776786150002051
根据实施例8-10中所述的程序，将7-溴-2-丁基-N,1-双(2,4-二甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-叔丁基酯。LC/MS[M+H]893.56(计算的)；LC/MS[M+H]893.79。
实施例41：化合物46的合成
Figure BDA0002776786150002052
根据实施例11中所述的程序，将1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-叔丁基酯转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-酸。LC/MS[M+H]837.49(计算的)；LC/MS[M+H]837.84(观察的)。
实施例42：化合物47的合成
Figure BDA0002776786150002053
根据实施例12中所述的程序，将1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-酸转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-7-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧杂三十三烷-33-2,3,5,6-四氟苯基酯。LC/MS[M+H]985.49(计算的)；[M+H]985.71(观察的)。
实施例43：化合物48的合成
Figure BDA0002776786150002061
根据实施例10中所述的程序，将2-丁基-8-(哌嗪-1-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-叔丁基酯。LC/MS[M+H]717.45(计算的)；LC/MS[M+H]717.75(观察的)。
实施例44：化合物49的合成
Figure BDA0002776786150002062
根据实施例11中所述的程序，将1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-叔丁基酯转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸。LC/MS[M+H]661.39(计算的)；LC/MS[M+H]661.60(观察的)。
实施例45：化合物50的合成
Figure BDA0002776786150002071
根据实施例12中所述的程序，将1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-2,3,5,6-四氟苯基酯。LC/MS[M+H]809.39(计算的)；LC/MS[M+H]809.62(观察的)。
实施例46：化合物51的合成
Figure BDA0002776786150002072
根据实施例10所述的程序，将2-丁基-8-(哌嗪-1-基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-叔丁基酯。LC/MS[M+H]981.61(计算的)；LC/MS[M+H]981.86(观察的)。
实施例47：化合物52的合成
Figure BDA0002776786150002081
根据实施例11所述的程序，将1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-叔丁基酯转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸，该化合物无需进一步纯化即可使用。
实施例48：化合物53的合成
Figure BDA0002776786150002082
根据实施例12所述的程序，将1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸转化为1-(4-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-8-基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-2,3,5,6-四氟苯基酯。LC/MS[M+H]1073.54(计算的)；LC/MS[M+H]1073.81(观察的)。
实施例49：化合物55的合成
Figure BDA0002776786150002091
在N2下向7-溴-2-丙基噻唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(根据WO2006/93514制备)(320mg,1mmol,1当量)中添加4-氰基丁基溴化锌(0.5M，在THF中，20mL,5当量)。添加四(三苯基膦)钯(115mg，0.1mmol，0.1当量)，并将混合物在60℃下搅拌90min。将混合物冷却至室温并添加固体碳酸氢钠(1.0g,11.9mmol,11.9当量)。向该搅拌的悬浮液中添加水(0.8mL)并将该悬浮液剧烈搅拌20min。将悬浮液通过Celite塞过滤，并将固体滤饼用二氯甲烷(25mL)洗涤。滤液用二氯甲烷(60mL)稀释，有机物用饱和碳酸氢钠溶液(60mL)洗涤，然后用盐水(60mL)洗涤。将粗产物通过快速色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，浓缩后得到5-(4-氨基-2-丙基噻唑并[4,5-c]喹啉-7-基)戊腈(268mg，0.82mmol，82％)，为黄色固体。LC/MS:[M+H]计算的为325.14；[M+H]观察的为325.26。
实施例50：化合物56的合成
Figure BDA0002776786150002092
在N2下，向无水THF(9mL)中的5-(4-氨基-2-丙基噻唑并[4,5-c]喹啉-7-基)戊腈)(260mg，0.79mmol，1当量)分批添加固体氢化锂铝(117mg，3.2mmol，4当量)。在气体逸出停止后，将混合物在60℃下搅拌30min。将混合物冷却至室温并添加固体碳酸氢钠(1.0g,11.9mmol,14.8当量)。向该搅拌的悬浮液中添加水(0.3mL)并将该悬浮液剧烈搅拌20min。将悬浮液通过Celite塞过滤，并将固体滤饼用二氯甲烷(25mL)洗涤。将滤液用二氯甲烷(30mL)稀释，蒸发溶剂。将粗产物通过快速色谱(甲醇/二氯甲烷)纯化，浓缩后得到7-(5-氨基戊基)-2-丙基噻唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(220mg，0.67mmol，82％)，为黄色固体。LC/MS：[M+H]计算的为329.17；[M+H]观察的为329.31。
实施例51：化合物58的合成
Figure BDA0002776786150002101
向4,7,10,13,16,19-六氧杂二十烷二酸(286mg,0.75mmol,1.1当量)在乙腈(3mL)的溶液中添加二异丙基碳二亚胺(283mg,2.25mmol,3.3当量)和N-羟基琥珀酰亚胺-3-磺酸钠在乙腈(3mL)中的混合物。将混合物超声处理1min并在50℃加热10min。所得粗1,1'-(4,7,10,13,16,19-六氧杂二十二烷二酰双(氧基))双(2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸)无需进一步纯化即可使用。
实施例52：化合物59的合成
Figure BDA0002776786150002102
将在前述反应中获得的乙腈(6mL)中的粗1,1'-(4,7,10,13,16,19-六氧杂二十二烷二酰双(氧基))双(2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸)添加至7-(5-氨基戊基)-2-丙基噻唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(220mg,0.67mmol,1当量)并将反应在室温下搅拌1h。蒸发溶剂，粗产物通过反相C18色谱纯化(乙腈/水+0.1％TFA)，得到28-(4-氨基-2-丙基噻唑并[4,5-c]喹啉-7-基)-22-氧代-4,7,10,13,16,19-六氧杂-23-氮杂二十八烷酸磺基-NHS酯(146mg，0.17mmol，25％)，在蒸发溶剂后为淡黄色薄膜。LC/MS：[M+H]计算的为870.32；[M+H]观察的为870.53。
实施例53：免疫缀合物A的合成
Figure BDA0002776786150002111
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物A。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与7摩尔当量的化合物13快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物A与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(WatersCorporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定佐剂-抗体比率(DAR)。免疫缀合物A的DAR为2.5。
实施例54：免疫缀合物B的合成
Figure BDA0002776786150002121
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物B。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与7.4摩尔当量的化合物44快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物B与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物B的DAR为2.56。
实施例55：免疫缀合物C的合成
Figure BDA0002776786150002131
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物C。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与7.5摩尔当量的化合物25快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物C与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物C的DAR为2.65。
实施例56：免疫缀合物D的合成
Figure BDA0002776786150002141
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物D。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与8.5摩尔当量的化合物47快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物D与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物D的DAR为2.26。
实施例57：免疫缀合物E的合成
Figure BDA0002776786150002151
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物E。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与8摩尔当量的化合物43快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物E与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物E的DAR为2.8。
实施例58：免疫缀合物F的合成
Figure BDA0002776786150002161
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物F。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与7.8摩尔当量的化合物23快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物F与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物F的DAR为2.39。
实施例59：免疫缀合物G的合成
Figure BDA0002776786150002171
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物G。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与8.5摩尔当量的化合物50快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物G与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物G的DAR为2.37。
实施例60：免疫缀合物H的合成
Figure BDA0002776786150002181
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物H。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与6摩尔当量的化合物41快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物H与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物H的DAR为1.98。
实施例61：免疫缀合物I的合成
Figure BDA0002776786150002191
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物I。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与6摩尔当量的化合物53快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物I与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物I的DAR为2.15。
实施例62：免疫缀合物J的合成
Figure BDA0002776786150002201
本实施例证实用曲妥珠单抗作为抗体构建体(Tras)合成免疫缀合物J。
使用G-25SEPHADEXTM脱盐柱(Sigma-Aldrich)，将曲妥珠单抗经缓冲液交换到pH8.3的含有100mM硼酸，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将每种洗脱液调节至6mg/ml并无菌过滤。将6mg/ml的曲妥珠单抗预热至30℃，并与6摩尔当量的化合物59快速混合。使反应在30℃下进行16小时，通过在pH7.2的PBS中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行，将免疫缀合物J与反应物分离。通过使用连接到XEVOTMG2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITYTM UPLC H-级(Waters Corporation)上的C4反相柱，进行液相色谱质谱分析，来测定DAR。免疫缀合物J的DAR为2.07。
实施例63：体外免疫缀合物活性的评估
本实施例表明免疫缀合物A-J在引起骨髓活化方面是有效的，因此可用于治疗癌症。
人抗原呈递细胞的分离.人髓样抗原呈递细胞(APC)通过密度梯度离心从获自健康血液供体(Stanford Blood Center,Palo Alto,California)的人外周血中负选择，所述密度梯度离心使用含有抗CD14、CD16、CD40、CD86、CD123和HLA-DR的单克隆抗体的ROSETTESEPTM人单核细胞富集Cocktail(Stem Cell Technologies,Van Couver,Canada)。随后使用含有抗CD14、CD16、CD40、CD86、CD123和HLA-DR的单克隆抗体的EASYSEPTM人单核细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)，在没有CD16消耗的情况下，通过阴性选择将未成熟APC纯化至>97％纯度。
肿瘤细胞的制备.使用三种肿瘤细胞系：HCC1954、JIMT-1和COLO 205。HCC1954(美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,Virginia)来自初级IIA期，3级浸润性导管癌，没有淋巴结转移。HCC1954对于上皮细胞特异性标志物上皮糖蛋白2和细胞角蛋白19是阳性的，并且对于雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)的表达是阴性的。HCC1954以相对“高”水平的过表达过表达HER2(通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测定的)。JIMT-1(DSMZ,Braunschweig，Germany)来自患有导管乳腺癌(3级浸润性，IIB期)的女性在术后放射后的胸腔积液。JIMT-1以被认为是过表达的“中等”水平过表达HER2，但对抑制HER2的药物(例如曲妥珠单抗)不敏感。COLO 205(ATCC)来自患有结肠癌的人的腹水。COLO 205表达癌胚抗原(CEA)、角蛋白、白细胞介素10(IL-10)，并且被认为以相对“低”的过表达水平过表达HER2。
将来自各细胞系的肿瘤细胞分别以1至10×106个细胞/mL重悬浮于含有0.1％胎牛血清(FBS)的PBS中。随后将细胞与2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)一起孵育以产生1μM的最终浓度。2min后通过添加10mL含有10％FBS的完全培养基淬灭反应并用完全培养基洗涤两次。将细胞固定在2％多聚甲醛中，并用PBS洗涤三次，或者在使用前使其存活。
APC-肿瘤共培养物.将2×105个APC与(例如图2A-2I)或不与(例如图3A-11C)CFSE-标记的肿瘤细胞在5:1至10:1的效应器与靶(肿瘤)细胞比率下在96孔板(Corning,Corning,NY)中孵育，所述96孔板含有补充了10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸，并且在所示的情况下，本发明的各种浓度的未缀合的HER2抗体和免疫缀合物A(如根据上述实施例制备的)的伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM)(Thermo Fisher Scientific)。18小时后通过流式细胞术或ELISA分析细胞和无细胞上清液。
该测定的结果显示在附图中，例如，用于HCC1954细胞系上的免疫缀合物A的图2A(CD40)和图2B(CD86)，用于JIMT-1细胞系上的免疫缀合物A的图2D(CD40)和图2E(CD86)，以及用于COLO 205细胞系上的免疫缀合物A的图2G(CD40)和图2H(CD86)。
尽管T细胞刺激分子如CD40和CD86的表达对于有效的T细胞活化是必需的，APC也通过促炎细胞因子的分泌影响随后的免疫应答的性质。因此，研究了免疫缀合物在刺激后在人APC中引起细胞因子分泌的能力。数据表明免疫缀合物刺激的细胞分泌高水平的TNFα。参见免疫缀合物A与HCC1954细胞系共培养的图2C，免疫缀合物A与JIMT-1细胞系共培养的图2F，以及免疫缀合物A与COLO 205细胞系共培养的图2I。
在图3A-11C(没有共培养)中提供了免疫缀合物B-J的类似数据。
实施例64：免疫缀合物K与免疫缀合物L的比较
本实施例显示由包含佐剂部分的免疫缀合物证实的免疫缀合物活性的增加，所述佐剂部分进一步包含具有至少1个碳原子的疏水性取代基。
Figure BDA0002776786150002221
为了测定DAR，将免疫缀合物K和L酸化(在水，0.2％甲酸中稀释5倍或更多)，并注射到Waters BEH-C4反相柱(产品号186004495)上，并使用1-90％乙腈，0.1％甲酸的线性梯度分离，该柱连接到Waters Aquity H-级UPLC上。C4柱洗脱液通过电喷雾电离在WatersXevo G2-XS飞行时间(TOF)质谱仪上连续分析。为了测定缀合物的DAR，首先需要鉴定总离子流色谱图(TIC)中的时间窗，其对应于来自C4柱的抗体缀合物的洗脱窗。一旦选择，使用Waters MassLynxv 4.1软件将在给定时间窗内代表质量/电荷(m/z)种类的几个共洗脱家族(每种蛋白质种类一个家族)的所观察到的离子解卷积为存在的每种DAR种类的精确质量。然后使用等式1组合每个DAR种类的峰强度：
Figure BDA0002776786150002231
其中iDAR等于给定DAR种类的观察到的峰强度(观察到的离子)，并且观察到的种类的总数为五(四个DAR种类+未标记的抗体)。可以根据存在的种类的数量的需要来调整该等式。该等式用于在LC-MS分析之前已经去糖基化的抗体缀合物。为了分析糖基化抗体，每个DAR种类可以由解卷积的时间窗内的多个峰表示。在这种情况下，iDARn＝[n×(iDARngly1+iDARngly2+iDARngly3)]，其中n是DAR种类，观察到的糖基化变体的数目例如是3。
使用本文所述的佐剂活性和免疫缀合物活性程序分析以曲妥珠单抗为抗体且DAR为2的免疫缀合物K和以曲妥珠单抗为抗体且DAR为2的免疫缀合物L。
免疫缀合物K与免疫缀合物L相比增加了体外活性，如骨髓活化所证明的。因此，进一步包含具有至少1个碳原子的疏水性取代基的佐剂部分增强了免疫缀合物的活性。
实施例65：免疫缀合物K与免疫缀合物M的比较
本实施例显示了由相对于2-氨基部分的不同位置连接的两种免疫缀合物所显示的接头连接点位置的重要性。
Figure BDA0002776786150002241
根据实施例64中提供的程序测定免疫缀合物K和M的DAR。
使用本文所述的佐剂活性和免疫缀合物活性程序分析以曲妥珠单抗为抗体且DAR为2的免疫缀合物K和以曲妥珠单抗为抗体且DAR为2的免疫缀合物M。
免疫缀合物K与免疫缀合物M相比增加了体外活性，如骨髓活化所证明的。因此，具有远离2-氨基部分的接头连接点的佐剂部分可以增强免疫缀合物的活性，从而证明了接头连接点的重要性。
实施例66：免疫缀合物K与免疫缀合物N的比较
本实施例显示包含佐剂部分的免疫缀合物的协同效应，所述佐剂部分进一步包含具有至少1个碳原子的疏水性取代基和优选的接头连接点，如骨髓活化所证明的。
Figure BDA0002776786150002242
Figure BDA0002776786150002251
根据实施例64中提供的程序测定免疫缀合物K和N的DAR。
使用本文所述的佐剂活性和免疫缀合物活性程序分析以曲妥珠单抗为抗体且DAR为2的免疫缀合物K和以曲妥珠单抗为抗体且DAR为2的DAR的免疫缀合物N。
免疫缀合物K与免疫缀合物N相比增加了体外活性，如骨髓活化所证明的。相对于免疫缀合物N，免疫缀合物K的活性增加大于相对于免疫缀合物L和M所获得的益处之和(参见实施例64和65)。因此，本实施例证明了包含佐剂部分的免疫缀合物的协同作用，所述佐剂部分进一步包含具有至少1个碳原子的疏水性取代基和优选的接头连接点，如骨髓活化所证明的。
实施例67：佐剂1与佐剂2的比较
本实施例显示2-氨基氮部分的侧基氮对于维持佐剂活性的重要性，如表达人TLR7或人TLR8的HEK293报告细胞所证明的。
Figure BDA0002776786150002252
佐剂1和2的活性使用HEK293报告分析测量，其中测量NF-kB活性。测定的细节如下。
表达人TLR7或人TLR8的HEK293报告细胞购自Invivogen(San Diego,CA)，并遵循供应商方案进行细胞增殖和实验。在补充有10％胎牛血清(FBS)、Zeocin和Blasticidin的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)中，使细胞在5％CO2下生长至80-85％汇合。然后将细胞以4×104个细胞/孔接种在96孔平板中，其中存在含有HEK检测培养基和图12所示量的佐剂1或佐剂2的底物。使用酶标仪在620-655nm测量活性。结果如图12所示。
图12显示与佐剂1相比，佐剂2在TLR7和TLR8报告细胞中都是完全无活性的。该结果表明2-氨基氮部分的侧基氮是维持佐剂对TLR7和/或TLR8的活性所必需的。
实施例68：免疫缀合物O与免疫缀合物P的比较
本实施例显示2-氨基氮部分的侧基氮对于维持免疫缀合物的活性的重要性，如免疫缀合物活性和树突状细胞分化所证明的。
Figure BDA0002776786150002261
根据实施例64中提供的程序测定免疫缀合物O和P的DAR。
使用本文所述的佐剂活性和免疫缀合物活性程序分析以利妥昔单抗为抗体且DAR为1.9的免疫缀合物O和以利妥昔单抗为抗体且DAR为2.2的免疫缀合物P，并且结果在图13和14中给出。
图13显示免疫缀合物P中TLR活性的消除(参见实施例67)导致活化的完全停止，如通过共刺激分子CD40和CD86的上调所测量的。图13进一步显示免疫缀合物P导致的共刺激分子CD40和CD86的上调与抗体对照相当，并且与免疫缀合物O相比显著降低。这些结果证明2-氨基氮部分的侧基氮对于维持免疫缀合物活性是必需的，如通过共刺激分子CD40和CD86的上调所测量的。
图14显示免疫缀合物P中TLR活性的消除(参见实施例67)导致树突状细胞分化的完全停止，如通过CD14、CD16和CD123表达所测量的。当用免疫缀合物O处理时，在单核细胞上发现的CD14和CD16两种标志物都被下调。相反，在用免疫缀合物O处理后，在炎性骨髓来源的树突状细胞上表达的标志物CD123被上调。然而，当用免疫缀合物P处理时，结果与抗体对照相当，不产生树突状细胞分化，如通过CD14、CD16和CD123表达所测量的。这些结果表明2-氨基氮部分的侧基氮是诱导树突状细胞分化所必需的，如通过CD14、CD16和CD123表达所测量的。
本文引用的所有参考文献，包括出版物，专利申请和专利，通过引用并入本文，其程度如同每篇参考文献被单独和具体地指出通过引用并入并且在本文被整体阐述一样。
在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个”和“一种”和“所述”和“至少一种(个)”和类似的指代的使用应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。使用术语“至少一个”之后接着一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个”)应被解释为意指选自所列项目的一个项目(A或B)或所列项目中的两个或更多个的任何组合(A和B)，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指出，本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独的数值的速记方法，并且每个单独的数值被并入本说明书中，如同其在本文中被单独地记载一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并且除非另有声明，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的要素对本发明的实践是必要的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了前面的描述之后，那些优选实施方案的变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。发明人期望本领域技术人员适当地采用这种变化，并且发明人旨在以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求书中所述主题的所有修改和等同物。此外，本发明包括上述要素在其所有可能变化中的任何组合，除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾。
序列表
<110> 博尔特生物治疗药物有限公司(BOLT BIOTHERAPEUTICS, INC.)
莱兰斯坦福初级大学评议会(THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORDJUNIOR UNIVERSITY)
<120> 免疫缀合物
<130> 743565
<150> US 62/724,259
<151> 2018-08-29
<150> US 62/673,015
<151> 2018-05-17
<160> 168
<170> PatentIn version 3.5
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Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
20 25 30
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
50 55 60
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
65 70 75 80
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
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Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
165 170 175
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Gly
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Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
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1 5 10 15
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100 105 110
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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<220>
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<211> 32
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<220>
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Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
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<220>
<221>
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<400> 43
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
20 25 30
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
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115 120 125
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210
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
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Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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<221>
<222>
<223> 合成的
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
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Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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<210> 48
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
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<223> 合成的
<400> 48
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Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
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165 170 175
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 49
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
Gly Lys
450
<210> 50
<211> 1255
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
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Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
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Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
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Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
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Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
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Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
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485 490 495
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Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
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Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
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Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
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Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
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<212> PRT
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Asp Thr Tyr Ile His
1 5
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
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<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 68
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1 5
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 69
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 23
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
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<400> 76
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
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Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
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<212> PRT
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<400> 78
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 79
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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450
<210> 81
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
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210
<210> 82
<211> 448
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
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100 105 110
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
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305 310 315 320
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 83
<211> 141
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala
1 5 10
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
Trp Thr Ser Thr Arg His Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser
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<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
Thr Tyr Trp Met Ser
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<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
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Asp
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr
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<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
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1 5 10 15
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
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<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Asp Phe Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 32
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr
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50 55 60
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 108
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 110
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Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 121
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
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<210> 124
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
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<211> 30
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
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<211> 32
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
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<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
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Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
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<213> 智人(Homo sapiens)
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1 5
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<400> 134
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 136
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 142
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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<400> 143
Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly
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<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 144
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 145
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 146
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 147
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 5
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
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<211> 16
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 149
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<210> 150
<211> 11
<212> PRT
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<221>
<222>
<223> 合成的
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
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<212> PRT
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 152
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<211> 9
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<221>
<222>
<223> 合成的
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
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<220>
<221>
<222>
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<221>
<222>
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 157
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<212> PRT
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<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
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Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
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Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 160
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr
1 5
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 161
Tyr Tyr Ser Gly Ser
1 5
<210> 162
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 162
Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 163
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 164
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 165
His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 166
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 166
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 167
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 167
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 168
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 168
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
465 470 475 480
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
485 490 495
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
500 505 510
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
515 520 525
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
530 535 540
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
545 550 555 560
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
565 570 575
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
580 585 590
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
595 600 605

Claims (35)

1.免疫缀合物，其包含：
(a)抗体构建体，其包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域，和
(b)1-8个佐剂核心，其中每个佐剂核心通过接头与所述抗体构建体共价结合，其中每个佐剂核心包含具有侧基氮原子的2-氨基氮部分和所述接头与所述佐剂核心的连接点，并且其中所述侧基氮原子与所述接头的连接点之间的距离大于约
Figure FDA0002776786140000011
2.如权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述侧基氮原子与所述接头的连接点之间的距离大于约
Figure FDA0002776786140000012
3.如权利要求2所述的免疫缀合物，其中所述侧基氮原子与所述接头的连接点之间的距离大于约
Figure FDA0002776786140000013
4.如权利要求1-3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure FDA0002776786140000014
其中所述佐剂核心由稠环A、B和C表示，并且其中A和B存在，C任选地存在，A、B和C独立地表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与B环的连接点，并且n是1至8的整数。
5.如权利要求4所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure FDA0002776786140000021
其中所述佐剂核心由稠环Ar、B和C表示，并且其中Ar和B存在，C任选地存在，Ar表示含有2-氨基氮部分的芳环，任选包含另外的氮原子并且是任选取代的，B和C独立地表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与B环的连接点，并且n是1至8的整数。
6.如权利要求4所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure FDA0002776786140000022
其中B存在并且C任选地存在，并且B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与B环的连接点，并且n是1至8的整数。
7.如权利要求1-3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure FDA0002776786140000031
其中所述佐剂核心由稠环A、B和C表示，并且其中A、B和C存在并且独立地表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与C环的连接点，并且n是1至8的整数。
8.如权利要求1-3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure FDA0002776786140000032
其中所述佐剂核心由稠环Ar、B和C表示，并且其中Ar和C存在，B任选地存在，Ar表示含有2-氨基氮部分的芳环，任选地包含另外的氮原子并且是任选取代的，B和C独立地表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与C环的连接点，并且n是1至8的整数。
9.如权利要求1-3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有下式：
Figure FDA0002776786140000041
其中C存在并且B任选地存在，并且B和C表示5元、6元、7元、8元或9元环，任选地包含双键，任选地除2-氨基氮部分之外还包含杂原子，并且是任选取代的，P表示接头与C环的连接点，并且n是1至8的整数。
10.如权利要求1-9中任一项所述的免疫缀合物，其中当与包含天冬氨酸残基的TLR8的结合结构域结合时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure FDA0002776786140000042
11.如权利要求10所述的免疫缀合物，其中所述天冬氨酸残基是Asp543。
12.如权利要求10或11所述的免疫缀合物，其中所述2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure FDA0002776786140000043
13.如权利要求1-12任一项所述的免疫缀合物，其中当与包含天冬氨酸残基的TLR7的结合结构域结合时，2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure FDA0002776786140000044
14.如权利要求13所述的免疫缀合物，其中所述天冬氨酸残基是Asp555。
15.如权利要求13或14所述的免疫缀合物，其中所述2-氨基氮部分的侧基氮原子距所述天冬氨酸残基的酸性侧链的羰基氧小于约
Figure FDA0002776786140000045
16.如权利要求1-16中任一项所述的免疫缀合物，其中当与包含精氨酸和丝氨酸残基的TLR8的结合结构域结合时，所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述丝氨酸残基的侧链的氧原子约
Figure FDA0002776786140000046
至约
Figure FDA0002776786140000047
和/或所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述精氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure FDA0002776786140000051
至约
Figure FDA0002776786140000052
17.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述丝氨酸残基的侧链的氧原子约
Figure FDA0002776786140000053
至约
Figure FDA0002776786140000054
所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述精氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure FDA0002776786140000055
至约
Figure FDA0002776786140000056
18.如权利要求16或17所述的免疫缀合物，其中所述丝氨酸残基是Ser352，并且所述精氨酸残基是Arg429。
19.如权利要求1-18中任一项所述的免疫缀合物，其中当与包含赖氨酸和缬氨酸残基的TLR7的结合结构域结合时，所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述缬氨酸残基的侧链的次甲基碳原子约
Figure FDA0002776786140000057
至约
Figure FDA0002776786140000058
和/或所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述赖氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure FDA0002776786140000059
至约
Figure FDA00027767861400000510
20.如权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述缬氨酸残基的侧链的次甲基碳原子约
Figure FDA00027767861400000511
至约
Figure FDA00027767861400000512
并且所述接头与所述佐剂核心的连接点距所述赖氨酸残基的侧链的氮原子约
Figure FDA00027767861400000513
至约
Figure FDA00027767861400000514
21.如权利要求19或20所述的免疫缀合物，其中所述缬氨酸残基是Val355，并且所述赖氨酸残基是Lys432。
22.如权利要求1-21中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体构建体还包含靶向结合结构域。
23.如权利要求1-22中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体构建体是抗体。
24.如权利要求1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合癌细胞的抗原。
25.如权利要求1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合选自以下的抗原：CDH1、CD19、CD20、CD29、CD30、CD40、CD47、EpCAM、SLAMF7、PDGFRa、gp75、MSLN、CA6、CA9、CDH6、CTAG1B/NY-ESO-1、LAMP1、LeY、MAGEA3/A6、P-钙粘蛋白、BCMA、CD38、HLA-DR、ROR1、WT1、GFRA1、FR-α、L1-CAM、LRRC15、MUC1、MUC16、PSMA、SLC34A2、TROP2、GPC3、CCR8和VEGF。
26.如权利要求1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合HER2。
27.如权利要求1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合EGFR。
28.如权利要求1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合PD-L1。
29.如权利要求1-23中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域能结合CEA。
30.如权利要求23-29中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体是IgG1抗体。
31.如权利要求23-29中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体选自奥拉单抗、奥珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗、贝伐单抗、达拉木单抗、依那西普、派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、伊匹木单抗、帕尼单抗、扎鲁珠单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗和依洛珠单抗。
32.组合物，其包含多种权利要求1-29中任一项所述的免疫缀合物。
33.治疗癌症的方法，其包括将治疗有效量的权利要求1-31中任一项所述的免疫缀合物或权利要求32所述的组合物施用于有需要的受试者。
34.预防癌症的方法，其包括将治疗有效量的权利要求1-31中任一项所述的免疫缀合物或权利要求32所述的组合物施用于有需要的受试者。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述癌症对TLR7和/或TLR8诱导的抗炎反应是敏感的。
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