CN112143655B - 一种阳春砂苗枯病病原菌的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阳春砂苗枯病病原菌，具体为Phoam sp.ZO‑Laiwu，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020287，保藏日期为2020年7月21日，分类学命名为茎点霉属。本发明阳春砂苗枯病病原菌Phoam sp.ZO‑Laiwu有利于对阳春砂苗期苗木枯死现象进行防治，提高阳春砂苗的成活率，进一步对防治砂仁苗枯病进行研究，进而提高砂仁产量。

Description

一种阳春砂苗枯病病原菌的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及菌株筛选技术领域，更具体的说是涉及一种阳春砂苗枯病病原菌的菌株及其应用。
背景技术
阳春砂(Amomum villosum Lour.)为姜科(Zingiberaceae)豆蔻属(AmomumL)多年生草本植物，是中国四大南药之一。阳春砂为药食两用药材，以干燥成熟果实入药和食用，味辛性温，归脾、胃、肾经，有温脾开胃、止呕止泻、理气安胎之功效。砂仁果实呈椭圆形或卵圆形，有着不明显的三棱连接着三个突起的面，将砂仁果实分成三部分，长1.5-2厘米，直径1-1.5厘米，果实表面呈棕褐色，有柔软的刺状突起，顶端有花被残基，基部带有果梗；果皮软而薄，有特殊的香气；种子包裹成团，具三钝棱，中有白色隔膜，将种子团分成3瓣，每瓣有种子5-26粒，种子为不规则多面体，直径2-3毫米，表面棕红色或暗褐色，有细皱纹，外被淡棕色膜质假种皮，质硬，胚乳灰白色。阳春砂株高1.5-3米，茎散生；根茎匍匐地面，节上附着褐色膜质鳞片；叶舌半圆形，长3-5毫米；叶鞘上有略凹陷的方格状网纹。
阳春砂原产于广东省阳春县，于1963年从广东省阳春县(现为阳春市)引入阳春砂仁进行引种栽培。随后在西双版纳开始进行扩大种植，在德宏、普洱、红河、文山、临沧等地均有种植，西双版纳州有着适合阳春砂生长的自然条件以及适应西双版纳地势的栽培模式，成为云南省阳春砂的主要产区。当地阳春砂种植模式有南亚热带沟谷林-阳春砂种植模式、北热带橡胶树-杂木林-阳春砂种植模式、较高海拔凉爽潮湿地-阳春砂三种植模式。据调查统计，截止至2007年末，全州砂仁种植面积已超过6000公顷，产量约718吨，产量已占全国砂仁产量的60％以上，是我国重要的砂仁种植基地。
随着砂仁种植面积的不断扩大，砂仁病害也愈发严重。阳春砂苗枯病是阳春砂苗期的主要病害，该病菌可引起植株叶片的大量干枯甚至死亡。阳春砂苗期侵染的病原菌在砂仁长大后发病，会影响阳春砂的品质与产量，给农民带来巨大的经济损失。
目前，在生产上防治阳春砂苗枯病主要靠抑制植物枯萎病这一类的化学杀菌剂，由于市面上防治枯萎病的杀菌剂较多，在防治阳春砂苗枯病时使用的杀菌剂没有得到统一，因此，需要对常用的杀菌剂进行对阳春砂苗枯病病原菌的室内毒力测定，筛选出抑制效果更好的杀菌剂，更好的适应农业生产需要。但是，现关于阳春砂苗枯病病原菌鉴定及生物学特性的研究很少。
因此，如何提供一种有利于防治阳春砂苗期苗木枯死现象的阳春砂苗枯病病原菌是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种阳春砂苗枯病病原菌的菌株及其应用，以解决现有技术中的不足。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种阳春砂苗枯病病原菌，具体为茎点霉属(Phoma sp.)srmy12，保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，电话：027-68754052，保藏编号为CCTCC NO：M2020287，保藏日期为2020年7月21日，分类学命名为茎点霉属。
本发明的有益效果为：本发明阳春砂苗枯病病原菌茎点霉属(Phoma sp.)srmy12有利于防治阳春砂苗期苗木枯死现象，提高阳春砂苗的成活率，进一步对防治砂仁苗枯病进行研究，进而提高砂仁产量。
本发明阳春砂苗枯病病原菌菌株的形态特征和生物学特性：菌丝为白色絮状，后出现黑色斑点；最适生长温度为25℃，最适pH值为3；最适碳氮源分别为葡萄糖和蛋白胨；致死温度为65℃。
进一步，本发明茎点霉属(Phoma sp.)srmy12的16srRNA序列为：TTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAACGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAAGAGTGTAAAAAATTCACTTCTGGACGCTGACGTTGTGAGTGCGATGCGCGAGATGTACTGCGCTCCGAAATCAATACGCCGGCTGCCAATTGTTTTGAGGCGAGTCTACGCGCGGAGGCGAGACAAACACCCAACACCAAGCAGAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAACTATTAAAGTTTTTTCAGACGCTGATTGCAACTGCAAGTGGTTTTGAAGTGTCCTGACGGCGGGCGGACCCGCCGAGGAAACGAAGGTGCTCAAAAGACATGGGTAAGAGATGGCAGGCAAAGCCCGCAACTCTAGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCA，如SEQ ID NO.1所示。
本发明还请求保护阳春砂苗枯病病原菌在指导防治阳春砂苗枯病并提高阳春砂育苗成活率中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明采用组织分离法对云南省西双版纳州景洪市和勐腊县四公里菜队阳春砂苗圃地采集的发病叶片进行病原菌分离，通过柯赫氏法则验证、病原菌形态学特征观察、DNA提取PCR扩增以及ITS基因测序分析，对病原菌进行分离鉴定，利用活体接种法测定病原菌致病性，并对病原菌生物学特性进行研究，为苗枯病原菌的研究奠定一定的基础，从而为防治阳春砂苗期苗枯病提供理论支持。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1茎点霉属(Phoma sp.)srmy12的分离、纯化
经调查发现，云南省西双版纳州各个阳春砂育苗基地均有苗枯病的发生，苗枯病从阳春砂苗的下部叶片开始，在发病初期，叶片正面出现水浸状圆形或不规则型黄色病斑，病斑逐渐扩大呈长椭圆形或条形枯斑，严重时导致叶片枯死，直至苗木死亡。
本发明材料采集于云南省西双版纳州景洪市和勐腊县四公里菜队地区种植阳春砂苗叶片枯黄部分。采用组织分离法，取病健交界处2mm×2mm组织块经75％酒精消毒30s，0.1％升汞消毒1min，无菌水漂洗3次，置于PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼胶20g，水1000mL)进行培养，分离纯化，并对病原菌进行鉴定保存。
实施例2茎点霉属(Phoma sp.)srmy12的致病性测定
根据科赫、史密斯提出的微生物致病性确定条件对供试菌株进行致病性测定。将供试菌株置于PDA培养基培养，待菌落长至培养皿一半时，沿菌落边缘取直径0.5cm菌饼；取健康阳春砂苗，用无菌针头刺伤叶片，将菌饼接种至刺伤部位，以PDA培养基块作对照，未刺伤叶片与刺伤叶片做对照。采用湿润的脱脂棉进行保湿，置每个处理重复3次，拍照记录并观察发病情况。并对发病叶片进行再分离、纯化，与原始病原菌做比较。
结果表明：病原菌菌丝块针刺砂仁苗叶片接种部位9天后开始发病，未针刺接种部位于12天开始发病。对接种发病后的病叶进行再分离、纯化，获得与原始菌株形态相似的病原菌，根据科赫、史密斯提出的法则，确定病原菌为阳春砂苗枯病的病原菌。
实施例3茎点霉属(Phoma sp.)srmy12的鉴定
1、病原菌生态学鉴定
将病原菌接种在PDA培养基与燕麦片琼胶培养基(燕麦片30g，琼胶20g，水1000ml)上，25℃恒温培养箱分别黑暗培养10天和7天后，观察并拍照。记录病原菌菌落形态、颜色，作为病原菌生态学鉴定的依据。
结果表明：菌株在PDA培养基上生长时，菌饼初期白色，菌丝为白色絮状，后出现黑色斑点。
2、病原菌多基因序列分析
刮取PDA培养基上病原菌菌丝0.1g，按照真菌基因组Omega试剂盒(上海玉博生物科技有限公司)方法提取基因组DNA，保存于4℃备用。利用真菌ITS(internaltranscribedspacer)引物对ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行扩增，反应体系为50μL：上下游引物各2uL，真菌DNA模板2uL，2×Taq PCR MasterMix25uL，ddH2O补充至50uL。ITS基因扩增反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min。用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增产物送往中国农业大学进行测序。
病原菌的PCR扩增产物电泳结果表明：病原菌的扩增条带都清晰、明亮，没有明显的非特异性杂带，符合预期的扩增结果。
测序和同源性序列比对分析结果表明：病原菌为茎点霉属(Phoma sp.)srmy12。
实施例4茎点霉属(Phoma sp.)srmy12的生物学特性研究
1、温度、pH对病原菌菌丝生长的影响
取直径为0.5cm的病原菌菌饼接种至PDA培养基中心，分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃恒温培养箱中培养，每个处理重复5次；用浓度为5mol/L的HCL和NaOH溶液将PDA培养基pH调成3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，制成培养基平板，取直径0.5cm病原菌菌饼接种于不同pH培养基，置于25℃恒温培养箱中培养，每个处理重复5次。恒温培养7天后观察菌落形态并采用十字交叉法测量菌落直径。
结果如表1和表2所示。
表1温度对病原菌菌丝生长的影响
温度(℃) 10 15 20 25 30
平均菌落直径(cm) 0.48 2.96 3.44 3.74 3.44
表2 pH对病原菌菌丝生长的影响
pH值 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
平均菌落直径(cm) 3.92 3.71 3.78 3.78 3.76 3.78 3.8 3.52 3.42 3.36
由表1可知，病原菌在在15-30℃生长较快，在25℃时长势最好，平均菌落直径为3.74cm。
由表2可知，病原菌在pH值3-12均能生长，在pH值为3时菌落直径最大，平均菌落直径为3.92cm。
2、碳源、氮源对病原菌菌丝生长的影响
以CzapeK培养基(KNO3 2.00g，KCL 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1.00g，MgSO4·7H2O0.50g，蔗糖30.00g，蒸馏水1000mL)作为基础培养基，以添加蔗糖、山梨醇、半乳糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉，配置含不同碳源培养基，以不含碳源培养基为对照；以添加半胱氨酸、牛肉浸膏、甘氨酸、酵母浸膏、蛋白胨、硝酸钾，配置含不同氮源培养基，以不含氮源培养基为对照。取直径为0.5cm的病原菌菌饼，分别接种于含不同碳源和氮源的培养基，置于25℃恒温培养箱培养，每个处理重复5次。恒温培养7天后观察菌落形态并用十字交叉法测量菌落直径。
结果如表3和表4所示。
表3碳源对病原菌菌丝生长的影响
Figure GDA0003476540900000071
表4氮源对病原菌菌丝生长的影响
Figure GDA0003476540900000072
由表3可知，病原菌在葡萄糖培养基生长最快，平均菌落直径为2.84cm，该病原菌菌丝在各个碳源培养基中都为白色，且菌丝都稀薄。对照组病原菌菌丝能生长。
由表4可知，病原菌在蛋白胨培养基中生长最快，平均菌落直径为4.03cm，菌落为白色絮状，除酵母浸膏培养基中菌落为黄白色外，其他培养基菌落均成白色絮状。对照组病原菌可以观察到白色絮状菌丝，菌饼为黑色。
3、菌丝体致死温度的测定
将1mL无菌水置于2mL离心管中，取0.5cm病原菌菌饼分别放入离心管中摇匀，分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃恒温水浴锅处理10min；50℃恒温水浴锅处理30min。冰浴快速冷却后分别接种于PDA培养基上，以未处理菌丝体为对照，每个处理重复5次。在25℃恒温培养箱培养4天，观察病原菌生长情况。
结果表明：病原菌菌饼在50℃、55℃、60℃水浴处理10min，25℃培养4天均能生长，但65℃、70℃水浴处理后无法生长，说明病原菌菌丝的致死温度为65℃。
实施例5阳春砂苗枯病病原菌茎点霉属(Phoma sp.)srmy12在指导防治阳春砂苗枯病并提高阳春砂育苗成活率中的应用(茎点霉属毒力实验)
1、毒力实验试剂(厂家、剂型、浓度梯度和单位)
50％多菌灵原药(江苏蓝丰生物化工有限公司)；
70％烯酰·霜脲氰原药(江苏明德立达作物科技有限公司)；
75％百菌清原药(先正达(苏州)作物保护有限公司；
68％精甲霜·锰锌原药(先正达(苏州)作物保护有限公司；
50％霜脲·嘧菌酯原药(山东滨农科技科技有限公司)；
50％异菌脲原药(江苏蓝丰生物化工有限公司)；
58％甲霜灵·锰锌原药(济南中基作物科学有限公司)；
2％春雷霉素原药(江门市植保有限公司)；
30％唑醚·巫唑醇原药(江苏明德立达作物科技有限公司)；
10％苯醚甲环唑(世高)水分散粒剂(先正达南通作物保护有限公司)；
250克/升嘧菌酯(阿米西达)悬浮剂(先正达南通作物保护有限公司)；
70％噁霉灵可湿性粉剂(青岛海纳生物科技有限公司)；
80％代森锰锌可湿性粉剂(济南泰禾化工有限公司)。
表5毒力实验试剂剂型、浓度梯度和单位
Figure GDA0003476540900000081
Figure GDA0003476540900000091
2、茎点霉属毒力实验结果
供试的13种杀菌剂对SRMK1-1病原菌菌丝生长毒力测定结果如表6-18所示。
表6多菌灵防治茎点酶属(phoma sp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000092
表7烯酰·霜脲氰防治茎点酶属(phoma sp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000093
表8百菌清防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000094
表9精甲霜·锰锌防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000101
表10霜脲·嘧菌酯防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000102
表11异菌脲防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000103
表12甲霜灵·锰锌防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000104
表13春雷霉素防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000105
Figure GDA0003476540900000111
表14唑醚·戊唑醇防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000112
表15世高防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000113
表16阿米西达防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000114
表17噁霉灵防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000115
表18代森锰锌防治茎点酶属(phomasp.)毒力效果
Figure GDA0003476540900000121
由表6-18可知，唑醚·戊唑醇、世高、霜脲·嘧菌酯、多菌灵、阿米西达抑菌效果较好，百菌清、异菌脲、甲霜灵·锰锌、精甲霜·锰锌抑菌效果较差，春雷霉素、甲霜灵·锰锌、烯酰·霜脲氰、噁霉灵抑制效果不明显，代森锰锌对茎点酶属几乎没有抑制作用。
唑醚·戊唑醇、世高、霜脲·嘧菌酯、多菌灵、阿米西达药剂浓度与抑制率成正相关，其中，唑醚·戊唑醇抑制率为84.5972％-100％，世高抑制率为77.0712％-100％，霜脲·嘧菌酯抑制率为57.5704％-100％，多菌灵抑制率为47.3493％-100％，阿米西达抑制率为45.9556％-100％。百菌清抑制率为48.1231％，异菌脲抑制率为47.7846％，烯酰·霜脲氰抑制率为47.2171％，精甲霜·锰锌抑制率为43.1077％，春雷霉素抑制率为21.5783％，噁霉灵抑制率为19.2969％，甲霜灵·锰锌抑制率为15.7128％，代森锰锌不适合用于茎点酶属菌种的防治。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院药用植物研究所云南分所
<120> 一种阳春砂苗枯病病原菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttcctccgc ttattgatat gcttaagttc aacgggtatc cctacctgat ccgaggtcaa 60
gagtgtaaaa aattcacttc tggacgctga cgttgtgagt gcgatgcgcg agatgtactg 120
cgctccgaaa tcaatacgcc ggctgccaat tgttttgagg cgagtctacg cgcggaggcg 180
agacaaacac ccaacaccaa gcagagcttg agggtacaaa tgacgctcga acaggcatgc 240
cccatggaat accaaggggc gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg 300
caattcacac tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgccagaa ccaagagatc 360
cgttgttgaa agttgtaact attaaagttt tttcagacgc tgattgcaac tgcaagtggt 420
tttgaagtgt cctgacggcg ggcggacccg ccgaggaaac gaaggtgctc aaaagacatg 480
ggtaagagat ggcaggcaaa gcccgcaact ctaggtaatg atccttccgc aggttcacct 540
acggaaacct tgttacgact tttacttcca 570

Claims (2)

1.一种阳春砂苗枯病病原菌，其特征在于，所述阳春砂苗枯病病原菌为茎点霉属(Phoma sp.)srmy12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020287，保藏日期为2020年7月21日。
2.一种如权利要求1所述的阳春砂苗枯病病原菌在指导防治阳春砂苗枯病并提高阳春砂育苗成活率中的应用。
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