CN112138000A

CN112138000A - Kobophenol B在制备抗病毒药物中的应用

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Publication number: CN112138000A
Application number: CN202011075206.2A
Authority: CN
Inventors: 孟红; 高川; 于宗渊; 陈明华; 司书毅
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2040-10-09
Also published as: CN112138000B

Abstract

本发明公开了Kobophenol B在制备抗病毒药物中的应用，所述病毒选自HIV‑1、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型或/和人类巨细胞病毒。本发明还公开了一种抗病毒药物，其有效成分为Kobophenol B。本发明首次从白颖苔草中分离得到Kobophenol B这一单体成分，并首次发现了Kobophenol B具有抗病毒活性，同时实验数据证明单体Kobophenol B抗病毒指数(TI)优于以往报道的白颖苔草粗提取物。尤为重要的是本发明研究阐述了Kobophenol B抗病毒谱，为临床用治疗病毒性疾病明确了用药范围。

Description

Kobophenol B在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及Kobophenol B在制备抗病毒药物中的应用，属于抗病毒药物技术领域。

背景技术

病毒性疾病严重威胁人类生命和健康。目前世界上已经有40多种抗病毒药物投放临床，但仍然不能遏制病毒的肆虐，寻找新的抗病毒药物，仍然是医患人群的共同期盼。

众所周知，报道一种植物或者一种植物的组分具有抗病毒活性，与报道一种单体化合物具有抗病毒活性的临床意义不同。临床上使用一种草或一种组分制作的药物成分非常复杂，服用药物或注射药物的同时，带给患者体内诸多不明的成分，而一种单体将提供给患者明确的成分、明确的体内代谢动力学过程、明确的治疗效果、明确可控的毒副作用。尤为重要的是，通过对化学结构的分析，还有可能对合成更高活性、更低毒性、更高生物利用度的新的抗病毒化合物提供线索，这对于一种植物或一个组分来讲都是做不到的。因此，单体化合物抗病毒活性的报道具有极为重要的应用价值和学术价值。

发现一种天然化合物具有抗病毒活性的报道众多，但描述其抗病毒谱的报道却极为少见，正是这样，导致了许多天然产物为来源的抗病毒药物说明书存在缺陷，即：说明书注明药物具有抗病毒效果，或对某种病毒具有疗效，却很少提及对更多的病毒是否存在疗效，这也是国内许多抗病毒药物国际化困难的原因之一。目前临床上辅助检测方法趋于完善，准确诊断病毒病原的方法已经普及，无论是血清学方法还是基因扩增方法，均可确诊病毒的科属性、种属性甚至型属性。不同的病毒结构不同，复制过程和方式不同，它们的生命周期中使用的病毒特有的酶类也各有不同，对不同的抗病毒药物的敏感性也各有不同，因此尽可能多的了解药物对不同病毒的抗病毒活性，对于指导临床制定抗病毒治疗方案、包括选用药物或联合用药处方选定意义重大，有助于临床及时有效地实施治疗，有助于避免错误选药或滥用药物，从而避免无效治疗带来的损失。这也正是本发明报道抗病毒谱的优势所在。

白颖苔草，学名：Carex duriuscula C.A.Mey.subsp.rigescens(Franch.)S.Y.Liang et Y.C.Tang，是莎草科薹草属植物，根状茎细长、匍匐。秆高5-20厘米，纤细，平滑，基部叶鞘灰褐色，细裂成纤维状。叶短于秆，宽1-1.5毫米。叶片平张。苞片鳞片状。穗状花序卵形或球形，长0.5-1.5厘米，宽0.5-1厘米。小坚果稍疏松地包于果囊中，近圆形或宽椭圆形，长1.5-2毫米，宽1.5-1.7毫米；花柱基部膨大，柱头2个。花果期4-6月。

高川曾申请过4项涉及白颖苔草粗提取物抗病毒用途的中国发明专利，分别是：①CN 101327282 A，公开了白颖苔草在制备抗甲型流感病毒的药物中的应用；②CN101850043 A，公开了白颖苔草在制备抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用，公开了白颖苔草治疗HSV-1、HSV2、HCMV、FLu-A、FLu-B感染性疾病的作用；③CN 101837086 A，公开了白颖苔草在制备抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的药物中的应用；④CN 101524451 A，公开了白颖苔草在制备抗HIV的药物中的应用。

Kobophenol B是苔草属植物中广泛存在的一种天然化学成分，日本学者首先分离到Kobophenol B单体化合物并报道具有抗肿瘤活性。目前尚未见Kobophenol B抗病毒活性的资料报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了Kobophenol B的新用途——在制备抗病毒药物中的应用。本发明在现有研究的基础上,首次发现了Kobophenol B具有抗病毒活性，同时实验数据证明单体Kobophenol B抗病毒指数(TI)优于以往报道的白颖苔草粗提取物。尤为重要的是本发明研究阐述了Kobophenol B抗病毒谱，为临床用治疗病毒性疾病明确了用药范围。

本发明是通过以下技术方案实现的：

Kobophenol B，其结构式如下所示：

所述Kobophenol B在制备抗病毒药物中的应用。

进一步地，Kobophenol B在制备抗HIV-1的药物中的应用。

进一步地，Kobophenol B在制备抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用。

进一步地，Kobophenol B在制备抗甲型流感病毒的药物中的应用。

进一步地，Kobophenol B在制备抗乙型流感病毒的药物中的应用。

进一步地，Kobophenol B在制备抗单纯疱疹病毒1型或/和2型的药物中的应用。

进一步地，Kobophenol B在制备抗人类巨细胞病毒的药物中的应用。

具体应用时，可将Kobophenol B制作成口服、注射、外用或滴眼用药的制剂。

本研究发现，从白颖苔草中提纯的Kobophenol B的抗病毒谱与其粗提物相似，但纯化的化合物细胞毒性更低、抗病毒指数更高，分别叙述如下：

有效抗病毒谱：

(1)Kobophenol B对逆转录科病毒科的人类免疫缺陷病毒-1(HumanImmunodeficiency Virus，HIV-1)蛋白酶有抑制活性(体外酶法)；对HIV逆转录酶有抑制活性(体外酶法)；

(2)Kobophenol B对副粘病毒科的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus,RSV)有抑制细胞病变(cytopathic effect,CPE)发生的作用；

(3)Kobophenol B对正粘病毒科的甲型和乙型流感病毒(Influenza virus A,FluA；Influenza virus B，Flu B)有抑制CPE发生的作用、对NS具有抑制活性(体外酶法)；

(4)Kobophenol B对疱疹病毒科的单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)1和2型、人类巨细胞病毒(Human Cytomegaoviyns，HCMV)有抑制CPE发生的作用。

无效抗病毒谱：

(1)Kobophenol B对腺病毒AD3、AD5无CPE抑制作用；

(2)Kobophenol B对呼肠孤科轮状病毒SA11、Wa、NCDV株无CPE抑制作用；

(3)Kobophenol B对小RNA病毒科肠道病毒属中的71型(Enterovirus 71，EV71)、柯萨基病毒(Coxsackie，COX)A16、COX B1、COX B2、COX B3、COX B5、COX B6、脊髓灰质炎疫苗株有微弱抑制CPE发生的作用；

(4)未测得对DHBV DNA聚合酶的抑制活性；

(5)未测得对HCV蛋白酶抑制活性。

研究表明，Kobophenol B经过纯化，抑毒活性得到显著提高：体外酶法检测发现Kobophenol B对逆转录科病毒科的人类免疫缺陷病毒-1(Human ImmunodeficiencyVirus，HIV-1)蛋白酶有抑制活性，粗提物HIV-1蛋白酶半数有效量(EC₅₀)为4.70μg/mL，而单体为0.90μg/mL，单体较粗提物对HIV蛋白酶的EC₅₀提高5.22倍；粗提物对Flu A N的EC₅₀为136.4μg/mL，而单体为60.3μg/mL、活性提高2.26倍；粗提物对RSV、Flu A、Flu B、HSV-1、HSV-2、HCMV的TI分别为1725.7、412.2、824.4、1031.0、952.1、275.1，Kobophenol B分别为6258.5、954.9、954.9、5820.9、2851.6、819.4，纯化的单体比粗提物TI分别提高3.63、2.32、0.01、5.65、2.99、2.98倍，详见表1和表2。

表1 Kobophenol B纯化前后抑制病毒CPE活性的比较

表2 Kobophenol B纯化前、后病毒酶抑制活性的比较

本发明首次首次发现了Kobophenol B具有抗病毒活性，同时实验数据证明单体Kobophenol B抗病毒指数(TI)优于以往报道的白颖苔草粗提取物。尤为重要的是本发明研究阐述了Kobophenol B抗病毒谱，为临床用治疗病毒性疾病明确了用药范围。

另一方面，本发明提供了一种抗病毒药物，其有效成分为Kobophenol B。

进一步地，所述病毒为HIV-1、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型或/和人类巨细胞病毒。

进一步地，所述抗病毒药物中还包含药学上可接受的载体、助剂或/和赋形剂。

药学上可接受的载体、助剂或赋形剂包括任何及所有溶剂、稀释剂或其它液体赋形剂、分散剂或助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，只要其适于所需的特定剂型。Remington's Pharmaceutical Sciences，第十六版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公开了在药学上可接受的组合物中所用的各种载体以及用于制备它们的已知技术。应理解，不会与本发明的酚类化合物不相容(如产生任何不希望的生物作用或以有害的方式与药学上可接受的组合物中的任何其它组分另外相互作用)的任何常规载体介质的使用在本发明的范围之内。如本文使用的，术语“副作用”包括预防或治疗时所不期望的和相反的作用。副作用通常是不期望的，其可能是有害的或不舒服的或有风险的。

药学上可接受的载体可以包含惰性成分，其不过度地抑制所述酚类化合物的生物活性。药学上可接受的载体应是生物相容性的，例如，无毒、非炎性、不致免疫或者在向受试者给药时没有其它不希望的反应或副作用。

可用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如吐温80、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠或锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂、糖(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉(如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素)、粉状黄蓍胶、明胶、滑石粉、赋形剂(如可可脂和栓剂蜡)、油(如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和豆油)、二醇类(如丙二醇或聚乙二醇)、酯类(如油酸乙酯和月桂酸乙酯)、琼脂、缓冲剂(如氢氧化镁和氢氧化铝)、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇和磷酸盐缓冲溶液以及其它无毒相容的润滑剂(如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)。需要时，着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

根据所治疗的疾病的性质和严重性，本发明的酚类化合物、提取物以及其药学上可接受的组合物可以经口服、经直肠、胃肠外、阴道内、腹膜内、局部(例如通过粉剂、软膏或滴剂)、经口腔施用于人类和其他动物。如本文使用的，术语“胃肠外”包括但不限于，皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、腱鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或灌注技术。优选地，口服或静脉内施用组合物。

任何口服可接受的剂型可以用于口服施用，所述剂型包括但不限于，胶囊、片剂、水性混悬剂或溶液。就口服用片剂而言，常用的载体包括但不限于，乳糖和玉米淀粉。还可以加入润滑剂例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服施用需要水性混悬剂时，活性成分与乳化剂和助悬剂结合。如果需要，也可加入某些甜味剂、芳香剂或着色剂。

口服给药用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性化合物(例如上文所述的寡肽类化合物)外，液体剂型还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯类及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，所述佐剂例如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒。在此类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或：a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，例如，例如羧甲基纤维素、藻酸盐(酯)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解阻滞剂，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润粘土；以及i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇类、十二烷基硫酸钠及其混合物。就胶囊、片剂和丸剂而言，剂型还可以包括缓冲剂。

相似类型的固体组合物也可以用作软和硬胶囊中的填充剂，所述软和硬胶囊使用赋形剂例如乳糖以及高分子量聚乙二醇等。可以使用包衣衣料和壳，例如肠溶衣和其他制药领域众所周知的包衣衣料制备片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型。它们可以任选包含遮光剂并且还可以具有仅或优先在肠道某些部位任选以延缓方式释放活性成分的组分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。相似类型的固体组合物也可以用作软和硬胶囊中的填充剂，所述软和硬胶囊使用赋形剂例如乳糖以及高分子量聚乙二醇等。

可以使用适合的分散剂、湿润剂或助悬剂，按照已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射的水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的赋形剂和溶剂包括例如水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，可采用无菌的非挥发性油作为溶剂或悬浮介质。例如，可以采用任何温和的非挥发性油，包括合成的单酸甘油酯或二酸甘油酯。另外，在注射剂的制备中也可以使用脂肪酸，例如油酸。还可以采用天然、药用可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或混悬剂也可以包含长链醇稀释剂或分散剂，例如羰甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于制备药学上可接受的剂型，包括乳剂和混悬剂。为了制备目的，也可使用其他通常使用的表面活性剂(例如吐温、司盘)和其他乳化剂或生物利用度增强剂，其通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型。

可注射制剂可以通过如下方式进行灭菌：例如⑴通过辐射灭菌，或者⑵通过细菌截留性滤器过滤，或者⑶掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，然后在使用前将其溶解或分散在无菌的水或其它无菌可注射介质中。

为了延长施用的活性化合物的作用，经常需要延缓化合物在皮下或肌内注射后的吸收。这可以利用水溶性差的晶体或无定形物质的液体悬浮液来实现。另外，还可以将化合物溶解或悬浮在油类赋形剂中，实现肠胃外给药的化合物形式的延迟吸收。还可以通过在生物可降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙醇酸交酯)中形成化合物的微囊基质，从而制备可注射的储库形式。根据化合物与聚合物的比例和所采用特定聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其他生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射制剂也可以通过将化合物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

直肠或阴道给药的组合物(特别是栓剂)可以如下制备：将活性化合物与适合的无刺激性赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂用蜡，它们在环境温度下是固体，但是在体温下是液体，从而在直肠或阴道腔中融化，并释放出活性化合物。

局部或经皮施用的剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何必需的防腐剂或缓冲剂(根据需要而定)混合。眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也被涵盖在本发明的范围内。另外，本发明涵盖透皮贴剂的使用，它们能够提供化合物向机体的受控递送。这类剂型可以通过将化合物溶解或分散在恰当的介质中来制备。还可以使用吸收增强剂，以增加化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或者将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

还可以通过经鼻气雾剂或吸入剂施用上文所述的寡肽类化合物、提取物以及其药学上可接受的组合物。按照药物制剂领域熟知的技术制备这类组合物，并可以将其制成盐水溶液。还可以向这类组合物中加入苯甲醇或其它适合的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规的增溶剂或分散剂。

可以将上文所述的Kobophenol B、提取物以及其药学上可接受的组合物制为单位剂型。术语“单位剂型”是指物理上离散的单位，其适于作为单位剂量用于接受治疗的受试者，并且各单位包含预定量的活性物质，该预定量的物质经计算可以产生希望的治疗作用。所述单位剂型可以用于每日一次给药或每日多次给药(例如，每日约1至4次或更多次)。当使用每日多次给药时，对各次给药而言，单位剂型可以相同或不同。

施用的活性化合物的量可以根据例如，所治疗的受试者的体重、年龄和总体健康状况、所治疗的疾病的性质和严重性、以及特定的给药模式而变化，并且可由主治医师进行判断。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：40％甲醇洗脱第5号馏分图谱(药理活性：TI＝>1280)。

图2：60％甲醇洗脱1号馏分图谱(药理活性：TI＝>1280)。

图3：60％甲醇洗脱第2号馏分图谱(药理活性：TI＝>1280)。

图4：60％甲醇洗脱第3号馏分图谱(药理活性：TI＝>5120)。

图5：60％甲醇洗脱第4号馏分图谱(药理活性：TI＝640)。

图6：60％甲醇洗脱第5号馏分图谱(药理活性：TI＝40)。

图7：60％甲醇洗脱第6号馏分图谱(未测得抑毒活性)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例从白颖苔草中提取Kobophenol B，并研究其抗病毒活性

提取步骤如下：

1.采集白颖苔草全草；

2.采用有机溶剂进行浸提：将10Kg干的白颖苔草，粉碎，放入20L 30％丙酮水溶液中，室温、超声震荡1h，重复提取2次，合并提取液，减压蒸馏去有机溶剂并浓缩粗提取物。

3.正相色谱柱分离：将上述粗提物用硅胶柱进行层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿与甲醇体积比依次为100/0、95/5、90/10、85/15、80/20、70/30、60/40、40/60、30/70、0/100，每比例洗脱液使用2倍柱体积量，分100支试管收集，50℃、0.1MPa减压旋蒸，用70％甲醇溶解，分别按照顺序命名，备做活性跟踪检测。

4.活性跟踪监测：采用HSV-1体外感染模型对以上正相色谱柱分离组分进行检测，以抗病毒活性为指标，获取所需洗脱组分。活性跟踪方法如下。

4.1制备多孔板单层细胞

将HEK293细胞接种于96孔板内，每孔10⁶/100μL，37℃、5％CO₂培养24h(成单层)，弃掉培养液,将细胞用磷酸盐生理盐水洗3次，将微孔板第一列每孔加细胞维持液(含2％血清的1640)198μL，其余每孔加细胞维持液100μL。

4.2接种样品作为实验组

取待检样品2μL加入到第一个微孔中，第一个孔的样品浓度相当于1∶10稀释，混匀后取100μL向后依次做2倍比系列稀释至1～11孔，维持每孔液体量一致(100μL)，稀释度依次为：1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120、1∶10240，每个样品一排。

4.3接种病毒并设对照组

每孔加含100个的HSV-1病毒液100μL，将12列的A、B、C、D孔作为病毒对照组(未加样品)，12列的E、F、G、H孔(未加病毒液、未加样品)补充等容量细胞维持液作为细胞对照。置35℃、5％CO₂培养。

4.4结果判断

培养48h时，病毒对照出现90％以上的CPE，终止培养。显微镜下观察实验组样品高浓度样品方向出现CPE为样品毒性，50％细胞出现CPE孔的样品浓度为TD50；低浓度方向出现CPE为病毒CPE，50％细胞出现CPE孔的样品浓度为IC50；TD50与IC50相比，获得TI，TI越大抑度效果越好。

结果发现，抗病毒活性部位位于氯仿/甲醇＝60/40～30/70洗脱部位，其中40/60中的77号洗脱组分毒性最低、效果最佳，为进一步分离的重点，结果见表3。

表3活性跟踪检测结果

5.制备型高效色谱仪分离

将步骤4所述正相色谱柱分离得到的77号活性组分用制备型高效液相色谱仪进行纯化,填料为C18，洗脱相为梯度比例的甲醇︰水。将收集组分减压蒸馏、浓缩，备做活性检测和高效液相色谱分析(公知技术)。

5.1活性检测

采用HSV-1体外感染模型进行活性跟踪(如上述步骤4所述方法)，检测发现，其活性部分主要存在于甲醇/水＝40/60洗脱相的最后1个组分和60/40洗脱相的1～5个组分，其中60/40洗脱相的第3个组分抑度效果最为突出，TI超过5120，提示该组分为分离重点，活性检测结果见表4。

表4活性跟踪检测结果

5.2液相色谱分析

将上述中获得的具有抗病毒活性的样品进行HPLC分析，结果见图1～7。

以上测活结果提示，抑毒活性最高组分为60/40洗脱相的第3个组分(TI>2560)，且色谱分析提示，该组分有两个主峰，且两主峰具有1～2秒的时间距离。故，该组分设为进一步分离单峰物质的重点。

6.单峰物质Kobophenol B的分离

6.1制备型高效液相色谱柱分离：将60/40洗脱相的第3个组分(TI>5120)以制备型高效液相色谱仪进行纯化，采用反相柱，洗脱相为甲醇︰水＝60︰40，从而将两峰分离，分别命名为P1、P2。

6.2测活

采用上述测活方法进行跟踪发现，P1具有抑毒活性，而P2未测得抑毒活性，测活结果见表5。

表5单峰物质抗病毒活性测定结果

6.3核磁共振

具有抗病毒活性的单峰化合物做核磁共振检测，获得核磁共振波谱数据如下：

Peak 1:¹H NMR(CD₃OD,600MHz),δ7.09(2H,d,J＝8.4Hz,H-2b,6b),6.94(1H,d,J＝1.8Hz,H-14b),6.79(2H,d,J＝8.4Hz,H-2d,6d),6.78(2H,d,J＝8.4Hz,H-2a,6a),6.72(2H,d,J＝6.6Hz,H-2c,6c),6.70(2H,d,J＝8.4Hz,H-3b,5b),6.65(2H,d,J＝8.4Hz,H-3c,5c),6.64(2H,d,J＝8.4Hz,H-3c,5c),6.57(1H,s,H-12c),6.56(2H,d,J＝8.4Hz,H-3d,5d),6.19(1H,t,J＝1.8Hz,H-12d),6.07(1H,d,J＝1.8Hz,H-12b),5.78(1H,d,J＝3.0Hz,H-8b),5.77(2H,br s,H-10d,14d),5.60(1H,s,H-14a),5.15(1H,d,J＝10.2Hz,H-7a),5.09(1H,s,H-7d),4.25(1H,dd,J＝7.2,7.2Hz,H-7c),3.87(1H,s,H-8d),3.84(1H,dd,J＝2.4,10.2Hz,H-8a),3.83(1H,d,J＝7.2Hz,H-8c),3.82(1H,d,J＝3.0Hz,H-7b),3.34(1H,d,J＝7.2Hz,H-12a)；¹³C NMR(CD₃OD,150MHz),δ204.0(C-11a),196.5(C-13a),171.2(C-9a),162.2(C-11c),160.2(C-11d,13d),160.0(C-11b),159.3(C-13b),158.1(C-4a),157.6(C-4d),157.4(C-4b,4c),155.2(C-13c),149.1(C-9d),141.1(C-9b),134.5(C-9c),133.8(C-1d),132.6(C-1b),130.2(C-1a,2a,6a),129.9(C-1c,2c,6c),129.7(C-2b,6b),127.5(C-2d,6d),126.2(C-14a),125.9(C-14c),116.9(C-10c),116.53(C-3a,5a),116.47(C-3b,5b),116.44(C-3c,5c),116.3(C-10b),116.0(C-3d,5d),110.2(C-14b),106.0(C-10d,14d),102.2(C-12d),97.6(C-12c),96.6(C-12b),92.7(C-7d),89.3(C-7a),69.8(C-12a),63.9(C-10a),56.1(C-8d),52.7(C-8a),47.6(C-8c),41.3(C-7b),40.3(C-7c),39.2(C-8b).HR-ESIMS:m/z 905.2562[M+H]⁺(cald for C₅₆H₄₁O₁₂,905.2539)。

以上数据与文献报道的Kobophenol B数据一致(Kawabata,J.；Mishima,M.；Kurihara,H.；Mizutani,J.Phytochemistry 1991,30,645-647.)即：本研究自白颖苔草中分离到的具有抗病毒活性的物质为Kobophenol B，分子结构为：

6.4Kobophenol B抗病毒谱分析

为了明确分离的Kobophenol B与白颖苔草粗提物的抗病毒活性和抗病毒谱是否存在差异，本研究又进行了如下研究。

6.4.1纯化前后细胞毒性的比较

6.4.1.1制备多孔板单层细胞

将HEK293、HEL、MDCK、MA104细胞接种于96孔板内，每孔106/100μL，37℃、5％CO₂培养成单层，并分别做标记HEK、HEL、MDCK、MA104。

6.4.1.2接种待检样品

取待检样品Kobophenol B和白颖苔草提取物(白颖苔草丙酮提取物为实施例1中的一项所述的白颖苔草丙酮浸提、旋转蒸发获得白颖苔草提取液真空干燥粉，棕色)各1.8mg分别用20μL DMS0溶解后加入200μL细胞培养液(含2％血清的1640)中(终浓度为9g/1000mL)，之后分别做2倍比系列稀释，并按稀释顺序分别横向接种于96板孔中的单层细胞上，共12个稀释度(1～12孔,第1稀释度为9g/1000mL,依次为9g、4.5g、2.25g、1.125g、0.5625、0.28125、0.1406125......)，每孔100μL，每稀释度纵向重复接种3孔，KobophenolB为A、B、C行，粗提物为E、F、G行。H行为细胞对照。35℃、5％CO₂培养48h、MDCK培养96h、HEL培养14d后终止培养，用MTT方法染色，测定A570值，采用用Reed-Muench方法计算半数中毒浓度(EC50)。结果见表6。

表6 Kobophenol B和白颖苔草提取物细胞毒性检测

从表6可以看出，纯化的Kobophenol B毒性显著低于粗提物。

6.4.2纯化前后抑制病毒发生CPE的活性比较

6.4.2.1制备多孔板单层细胞

将HEK293、HEL、MDCK、MA104细胞接种于96孔板内，每孔106/100μL，37℃、5％CO₂培养成单层，并分别做标记HEK、HEL、MDCK、MA104。(HEK293微孔板为HSV-1、HSV-2、AD5、AD3抑毒实验准备；HEL为HCMV、RSV、CoxA16、CoxB1、CoxB2、CoxB3、CoxB4、CoxB5、CoxB6、脊髓灰质炎病毒疫苗株准备；MA1O4为EV71、RV之NCDV、SA11、Wa准备；MDCK为Flu A和B准备)。

6.4.2.2接种样品

取待检样品Kobophenol B和白颖苔草提取物(白颖苔草丙酮提取物为白颖苔草丙酮浸泡24小时、过滤并将滤液中的丙酮挥发、获得白颖苔草提取液真空干燥粉，棕色)各0.1mg用10μL DMSO溶解后，加入到200μL细胞培养液(含2％血清的1640)中并分别做2倍比系列稀释，并按稀释顺序横向接种于每个96板孔中的单层细胞上，共12个稀释度(1～11孔，样品浓度依次为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125、0.9765625、0.48828125、0.244140625，单位为mg/1000mL)，每孔100μL，每稀释度纵向重复接种3孔。Kobophenol B为A、B、C行，白颖苔草提取物为D、E、F行，G行为病毒对照，以上各孔补充接种100个TCID₅₀的病毒100μL，H行为细胞对照，补充接种等容量的细胞维持液(含2％血清的1640)。

6.4.2.3培养

实验板置35℃、5％CO₂培养，每日显微镜下观察CPE；病毒对照出现90％以上的CPE时终止培养并进入染色、测定程序。

6.4.2.4染色测定

培养至终点后弃掉微孔中液体，加入MTT染色2h，用磷酸盐生理盐水洗涤5次，加终止液室温放置20min后测定A570值，实验组A值比细胞对照组A值获得细胞存活率，用Reed-Muench方法计算半数有效浓度(median effeicacious concentration EC50)、然后将TC50与EC50相比获得治疗指数(therapeutic index，TI)。

6.4.2.4.1HSV-1、HSV-2抑毒实验及镜下观察

病毒对照：HSV-1、HSV-2两种病毒均在接种HEK293细胞后24h渐渐出现CPE：细胞最初肿胀，随之融合，HSV-1出现大片融合特征。48h时两种病毒对照组均出现广泛的细胞脱落坏死，脱落率大约90％。

抑毒实验组观察

HSV-1

Kobophenol B的A、B、C 3行1～9孔细胞贴壁生长致密，未见肿胀或遮光性颗粒，与细胞对照比较无视觉差异，第10孔可见有部分细胞融合、遮光性颗粒增多，出现少许细胞脱落，第11孔可见70％～80的细胞出现CPE甚至有超过50％的细胞出现坏死脱落。12孔80％的细胞发生脱落，白颖苔草丙酮粗提物实验组可在第8孔出现少许病灶，第9孔出现典型病灶，病变率接近50％，第10、11、12孔出现广泛CPE。

HSV-2

Kobophenol B的D、E、F 3行1～8孔细胞贴壁生长致密，未见明显病毒特征性CPE，与细胞对照比较无视觉差异，第9孔可见有部分细胞融合、遮光性颗粒增多，出现少许细胞脱落，第10孔可见70％～80的细胞出现CPE甚至有超过50％的细胞出现坏死脱落，11、11孔出现广泛CPE。白颖苔草丙酮粗提物与Kobophenol B病变程度类似。

在培养48h时终止培养并进入染色、测A570值步骤，用Reed-Muench方法计算EC50，然后将TC50和EC50相比获得TI。结果见表7。

表7 Kobophenol B体外抑制单纯疱疹病毒活性纯化前后比较

从表7可以看出，与粗提物比较，分离纯化的单体化合物Kobophenol B降低了毒性、提高了抑制HSV-1、2指数TI，增强了成药性的可能性。

6.4.2.4.2HCMV抑制实验观察

病毒对照组于接种第4d开始出现CPE，最初细长的HEL表现为细胞肿胀、出现遮光性颗粒，之后逐渐变圆、出现典型的灶状病变，且病变范围随着培养时间的延长开始扩大，最后在培养至14d时CPE波及全孔细胞并出现脱落，提示可终止实验。

Kobophenol B实验组1～6孔细胞贴壁致密，未见明显肿胀或遮光性颗粒，与细胞对照组比较无显著差异。在第7孔细胞可见灶性细胞肿胀、变圆脱落灶，也可见串珠样特征性CPE灶，细胞脱落大约20-30％，第8孔脱落病变率超过60％。9～12孔细胞出现广泛CPE。粗提取物组病变发生与Kobophenol B类似，第7孔病变程度叫前者重。

染色、测定A值程序，用Reed-Muench方法计算EC50，将TC50和EC50相比获得TI，结果见表8。

表8 Kobophenol B体外抑制HCMV活性的纯化前后比较

从表8可以看出，与粗提物比较，分离纯化的单体化合物Kobophenol B降低了毒性、提高了抑制HCMV指数TI，增强了成药性的可能性。

6.4.2.4.3RSV抑毒实验及观察

病毒对照孔在接种后者HEL渐渐出现CPE：细胞最初出现遮光性颗粒，随之出现破碎，48h时，病毒对照细胞出现超过90％的细胞脱落，随后进入染色步骤。

染色前，显微镜观察实验组细胞1～9孔细胞贴壁致密，未见细胞肿胀或遮光性颗粒，未见细胞坏死或破碎或脱落，第10孔可见少部分细胞脱落，第11孔出现超过60％的细胞脱落，12孔出现广泛CPE。粗提物组在10孔可见大约有50％细胞出现脱落，11、12孔细胞出现广泛CPE。

终止培养并染色、检测A570值、以Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度EC50，最终将TC50和EC50相比获得治疗指数TI。结果见表9。

表9 Kobophenol B体外抑制RSV活性纯化前后比较

从表9可以看出，与粗提物比较，分离纯化的单体化合物Kobophenol B降低了毒性、提高了抑制RSV指数TI，增强了成药性的可能性。

Flu A和Flu B抑制实验及观察：

Flu A和Flu B在MDCK细胞导致的CPE以颗粒变性、空泡变性以及干性坏死但不脱落为特征，故而采用显微镜观察法判断CPE病变率。出现+为25％病变率、++为50％病变率、+++为75％病变率、++++为90～100％病变率。病毒对照着培养至96h出现++++，终止培养。

终止培养时的Flu A的Kobophenol B实验组在9孔、粗提物组在8孔，显微镜下观察到大约50％CPE。Flu B的Kobophenol B和粗提物组均在9孔出现50％CPE。Reed-Muench方法计算EC50，最终将TC50和EC50相比获得治疗指数TI。结果见表10。

表10分离前后Kobophenol B体外抑制流感病毒活性比较

从表10可以看出，与粗提物比较，分离纯化的单体化合物Kobophenol B降低了毒性、提高了抑制Flu A、B指数TI，增强了成药性的可能性。

6.4.2.4.4其他无效病毒观察

小RNA科肠道病毒属

CoxA16、CoxB1、CoxB2、CoxB3、CoxB4、CoxB5、CoxB6、脊髓灰质炎病毒疫苗株在实验48h(在HEL)，EV71培养72h(在MA104)，病毒对照组均出现预期CPE，抑毒实验组第1或3孔出现CPE，TI均在2位数以内，无显著抑毒活性，提示Kobophenol B治疗肠道病毒属感染性疾病无药用价值。

腺病毒科

AD5、AD3在HEK293培养48h，病毒对照组细胞均可见充分病变、抑毒实验孔也见充分病变，提示，白颖苔草粗提物和Kobophenol B无抑制腺病毒活性，提示Kobophenol B对腺病毒感染性疾病无药用价值。

呼肠孤病毒科

RV之NCDV、SA11、Wa株接种MA1O4培养72h，病毒对照可见充分CPE、抑毒实验孔也出现充分病变，提示白颖苔草粗提物和Kobophenol B无抑制RV活性，提示Kobophenol B对轮状病毒肠道病毒属感染性疾病无效。

6.4.3纯化前后病毒酶抑制活性比较

6.4.3.1可有效抑制的病毒酶谱

6.4.3.1.1HIV-蛋白酶

采用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型测定方法(公知技术)，该测定方法包括以下步骤：

样品自1mg/mL始以5倍比连续稀释5个稀释度后加入含有荧光标记底物的反应缓冲液中，并加入基因工程靶酶(HIV Pr)，37℃反应后，用FLUO star Galaxy荧光仪测定荧光值、如下公式计算IC50。

HIV-1蛋白酶抑制％＝(未加待测样品的荧光吸收值-加入待测样品后的荧光吸收值)/未加待测样品的荧光吸收值*100％。结果发现，粗提物对HIV-PrIC50为4.76μg/mL，经过纯化分离的Kobophenol B则为1.90μg/mL，活性提高2.51倍，可用于抑制HIV-1蛋白酶的相关疾病的治疗，比如治疗艾滋病。详细结果见表11。

表11分离前后Kobophenol B体外抑制HIV蛋白酶活性比较

6.4.3.1.2HIV-逆转录酶活性检测

将样品溶于DMSO成50mg/mL，在实验前用双蒸水配成1mg/mL，并做5倍比稀释，连续5个稀释度，然后加入含有(Tris-HCl,BSA，DTT,多聚(rA).寡聚(dT)18,3H-dTTP,MgCl2,KCl)的反应Buffer中，并加入适量酶。37℃反应0.5h后，测放射性强度，计算IC50。结果发现，白颖苔草粗体物对HIV逆转录酶抑制活性为29.42μg/mL，而分离纯化的Kobophenol B则为7.34μg/mL，活性提高了4.01倍。

上述两项检测结果提示，Kobophenol B对HIV存在2个作用靶点，此对于减少临床耐药的发生具有重要意义，适用于临床治疗艾滋病。详细结果见表12。

表12分离前后Kobophenol B体外抑制HIV逆转录酶活性比较

6.4.3.1.3 Flu V NS抑制活性的测定：荧光标记法

样品自1mg/mL始以5倍比连续稀释5个稀释度后加入神经氨酸酶(NS)，室温1h后，加入反应体系中(33mM、pH3.5的MES Buffer、4mM CaCl2、30μm MUNANA)，37℃反应15min，测定荧光强度值、计算IC50。

结果发现，白颖苔草粗提物对NS的IC50为138.4μg/mL，而纯化分离的KobophenolB的IC50为29.51μg/mL，活性提高了4.69倍。检测和比较结果见表13。

表13分离前后Kobophenol B体外抑制Flu NS活性比较

6.4.3.2无效抑制的病毒酶类

本研究还对DHBV多聚酶、HCV蛋白酶进行了活性检测，结果提示，白颖苔草粗提物和Kobophenol B对之均无抑制活性，方法步骤如下：

DHBV多聚酶(DHBV RCs DNAP)抑制活性的测定：样品稀释后加入含有(Tris-HCL,β-ME，NP-40,3H-dTTP,MgCl2,KCL)的反应缓冲液中，并加入DHBV RCs DNAP。37℃，反应1.5h。取样，测放射性强度、计算IC50。阳性对照药为磷甲酸钠(PFA)(瑞典Medivir公司)。

HCV Pr抑制活性的测定荧光标记法。将样品自1mg/mL始以5倍比连续稀释5次后加入含有荧光标记底物的反应缓冲液中，并加入适量酶，37℃孵育1.5h，Fluo star Galaxy荧光测定荧光值、计算IC50。阳性对照药为N-1725(HCV Pr抑制剂)(瑞典Medivir公司)。

7.小结和分析

分析以上实验，我们可以发现：

(1)与粗提物相比，分离纯化的Kobophenol B抗病毒谱无变化；

(2)分离纯化后的Kobophenol B细胞毒性降低；

(3)经过分离纯化，Kobophenol B对病毒酶的抑制能力和抑制病毒CPE的能力更强了。

因此：与粗提物比较，Kobophenol B用于临床治疗病毒感染性疾病对人类的毒性降低、效果更好，提示纯化的意义重大。总结为表14。

表14 Kobophenol B分离前后抗病毒活性的比较

另外，在上述实验中我们可以发现，Kobophenol B抑制病毒具有一定倾向性，比如：对小RNA病毒科中的肠道病毒属的几种实验病毒株基本全部无效，对呼肠孤科轮状病毒属的实验病毒株全部无效，对2株腺病毒实验株也无效。而对实验采用的几株疱疹病毒科病毒HSV-1、HSV-2和HCMV均测到抑毒活性，对实验采用的流感病毒实验株(Flu A、B)均有抑制活性，根据病毒生物学规律，相同种属的病毒结构类似、复制机制类似、关键酶的同源序列高的特点，我们可以推测，Kobophenol B可能对其敏感病毒株的同族病毒(比如：相同病毒种、相同属、甚至相同科)均有抑制作用，当然抑制活性的强弱可能有波动。

再者，体外酶活性检测在HIV发现2个抑制靶点：对蛋白酶和逆转录酶同时具有抑制活性，提示Kobophenol B在未来临床上应用治疗HIV和流感过程中，具有不易产生耐药的优势，对感染其它药物耐药的病毒株也存在优势。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims

1.Kobophenol B在制备抗病毒药物中的应用。

2.Kobophenol B在制备抗HIV-1的药物中的应用。

3.Kobophenol B在制备抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用。

4.Kobophenol B在制备抗甲型流感病毒的药物中的应用。

5.Kobophenol B在制备抗乙型流感病毒的药物中的应用。

6.Kobophenol B在制备抗单纯疱疹病毒1型或/和2型的药物中的应用。

7.Kobophenol B在制备抗人类巨细胞病毒的药物中的应用。

8.一种抗病毒药物，其特征在于：其有效成分为Kobophenol B。

9.根据权利要求8所述的抗病毒药物，其特征在于：所述病毒为HIV-1、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型或/和人类巨细胞病毒。

10.根据权利要求8所述的抗病毒药物，其特征在于：所述抗病毒药物中还包含药学上可接受的载体、助剂或/和赋形剂。