CN112126645A - 一种环形rna敲低方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种环形RNA的靶向敲低方法及其应用。本发明环形RNA敲低方法是使用dCas13蛋白融合表达HRSP12，再利用dCas13和配套的gRNA特异靶向环形RNA，通过dCas13‑HRSP12融合蛋白募集RNase P/MRP复合物，实现对环形RNA的特异靶向降解，具有对体内稳态环境干扰少，使实验结果更真实可靠和具备高效特异靶向敲低效率等有益效果。

Description

一种环形RNA敲低方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种环形RNA敲低方法及其应用。
背景技术
环形RNA(circular RNAs,circRNA)是一类主要由一个以上外显子构成的环形RNA分子，大量存在于真核细胞中，其表达具有一定的组织和时序特异性，且不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定。环形RNA可以作为miRNA海绵，调控宿主转录活性、直接翻译蛋白质，影响基因的调控与表达，在脑发育、帕金森、阿尔兹海默病和肿瘤发生中发挥重要作用，可望成为新型的疾病临床诊断标志物。
大部分circRNA是由蛋白质编码基因(宿主基因)的外显子反向剪接产生的，由于其反向剪切成环，与亲本基因有相同的序列，仅环化位点处序列具有特异性，使得环形RNA敲除和敲低的实验设计存在难度高、受限多等问题。目前对环形RNA敲低研究中广泛应用的是siRNA或shRNA敲低方法，但环形RNA与亲本RNA有相同的序列，仅在环化位点处序列有特异性，siRNA设计长度为19～21nt，因此只能针对环形RNA的环化位点处序列设计靶标，序列可选少，筛选设计符合GC含量等要求并特异的siRNA靶标难度太大，很容易非特异靶向亲本RNA或其他RNA，siRNA经常表现出敲低效率低、脱靶、非特异靶向亲本RNA等结果，直接影响实验结果的可靠性。
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在抵御病毒和质粒的不断入侵中演化来的一种获得性免疫防御机制。采用CRISPR/Cas9技术已被广泛验证可以对环形RNA敲除，能够通过靶向敲除环形RNA侧翼内含子中的反向重复元件(如Alu元件)，使环形RNA无法反向剪切成环，但环形RNA和亲本mRNA在基因组上序列相同，敲除侧翼的反向重复元件，可能同时影响亲本mRNA的生成，造成敲除靶标设计难度高；此外，环形RNA侧翼内含子中有很多反向重复元件组合，且同一反向重复元件可能同时介导多个环形RNA的生成，对RNA的特异性低，进一步加大了环形RNA特异性的敲除靶标设计和验证的难度。
CRISPR-Cas13系统是以Cas13酶作为Cas核酸酶的CRISPR子系统，仅靶向RNA而不靶向DNA，具有靶向效率高、酶切能力优异的特点。目前已经发现四类Cas13蛋白，分别为Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d，具有RNA酶活性，精确切割RNA，而且切割位点具有序列依赖性和结构依赖性，但不具有位点依赖性，能够通过调节RNA从而改变目的基因的表达效果，避免了直接操作基因组而产生的损伤。因此它既具有传统CRISPR基因编辑方法的大多数优点，而且在时间上、空间上和效率上比其他传统的RNA编辑方法更加安全可控。
热反应蛋白12(HRSP12)是一种内切核糖核酸酶，促进细胞内mRNA的降解，抑制蛋白质的合成和细胞增殖，促进细胞分化及发育调节，在人、细菌等多种生物中均能够检测到同源类似物的表达，在脑发育、帕金森、阿尔兹海默病和肿瘤中发挥了重要作用。
目前国内外并未检索到利用CRISPR-Cas13系统融合HRSP12蛋白以进行环形RNA敲低。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于解决环形RNA敲低时效率低、脱靶、非特异靶向亲本RNA等问题，经过反复测试和优化，本发明提供了一种高效特异靶向敲低环形RNA的方法，该方法可以有效避免脱靶，具有对体内稳态环境干扰少，使实验结果更真实可靠和具备高效特异靶向敲低效率，不会非特异靶向亲本基因等有益效果。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明使用dCas13蛋白融合表达HRSP12得到融合蛋白，再利用融合蛋白募集RNase P/MRP复合物，实现对环形RNA的特异靶向降解，技术命名为KDHP(circRNA Knock-down by dCas13/HRSP12 recruiting RNase P/MRP complex)，KDHP技术模式如图1。
本发明测试使用dLbaCas13a、dLwaCas13a、dPspCas13b、dPguCas13b、dRanCas13b、dEsCas13d、dAdmCas13d、dRfxCas13d共八个dCas13蛋白分别融合HRSP12进行表达，配套gRNA进行检测验证，发现dLwaCas13a、dPspCas13b和dRfxCas13d的结果符合预期，有明显的特异靶向降解作用。
优选的，所述dCas13蛋白包括dLwaCas13a，dPspCas13b和dRfxCas13d，所述dLwaCas13a，dPspCas13b和dRfxCas13d分别融合HRSP12进行表达的融合蛋白，分别命名为KDHP-a，KDHP-b和KDHP-d，所述KDHP-a，KDHP-b和KDHP-d的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
优选的，所述dCas13蛋白与HRSP12蛋白之间以柔性linker串联，柔性linker选自GS、GSGSGS、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGS、GGGS、GGGGS中的一种或多种。
优选的，所述HRSP12蛋白之后串联一个或多个蛋白标签，蛋白标签选自Myc、HA、GST、6xHis、Flag、3xFlag中的一种或多种。
优选的，所述蛋白标签为3xFlag。
一些情况下，所述KDHP蛋白的N端和C端同时添加核定位信号NLS或核输出信号NES序列，强制KDHP蛋白在胞内的定位，实现对特定范围内环形RNA的特异靶向敲低。
优选的，本发明将dLwaCas13a、dPspCas13b、dRfxCas13d分别融合HRSP12进行表达，针对RNA circPVT1和circHIPK3的环化位点处序列，设计gRNA靶标序列，并配套gRNA检测验证，结果显示dPspCas13b和dRfxCas13d表现出更高的特异靶向敲低效率。
本发明发现dPspCas13b删除第二个HEPN位点后得到dPspCas13b-truncated，氨基酸数目是983aa，蛋白分子量更小，融合HRSP12进行表达的蛋白，命名为KDHP-bt，本发明结果显示融合HRSP12进行表达并配套gRNA进行检测验证，结果符合预期，表现出更高的特异靶向敲低效率。优选的，所述KDHP-bt的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
优选的，dRfxCas13d蛋白分子量较小，融合HRSP12进行表达并配套gRNA进行检测验证，结果符合预期，表现出更高的特异靶向敲低效率。
一些情况下，本发明测试dLwaCas13a、dPspCas13b、dRfxCas13d单独表达后进行检测验证，结果符合预期，未表现出特异靶向降解作用。
一些情况下，本发明测试HRSP12单独表达后进行检测验证，结果符合预期，未表现出特异靶向降解作用。
一些情况下，本发明测试配套的gRNA单独表达后进行检测验证，结果符合预期，未表现出特异靶向降解作用。
一些情况下，本发明应用于dCas13-HRSP12融合蛋白的表达载体瞬时转染细胞，对细胞内源的环形RNA进行高效的特异靶向敲低。
一些情况下，本发明应用于以dCas13-HRSP12融合蛋白的表达载体包装成慢病毒颗粒，再感染细胞后对细胞内源的环形RNA进行高效的特异靶向敲低。
一些情况下，本发明应用于以重组表达纯化的dCas13-HRSP12融合蛋白直接处理纯化的RNA，在体外对RNA进行高效的特异靶向降解。
本发明另一方面提供了上述环形RNA靶向敲低方法使用dCas13-HRSP12融合蛋白的表达载体瞬时转染细胞的应用，以对细胞内源的环形RNA进行高效的靶向敲低。
本发明还提供了上述环形RNA靶向敲低方法使用dCas13-HRSP12融合蛋白的表达载体包装成慢病毒颗粒的应用，以对细胞内源的环形RNA进行高效的靶向敲低；
本发明还提供了上述环形RNA靶向敲低方法使用重组表达纯化的dCas13-HRSP12融合蛋白直接处理纯化的RNA的应用，以在体外对RNA进行高效的特异靶向降解。
与现有技术先比，本发明具有的有益效果有：
1)本发明的环形RNA敲低方法敲低效率高、脱靶少，特异靶向性高。
2)配套的gRNA设计可选性高，18～30nt的gRNA都有高效特异靶向性，能高效区分环形RNA和亲本RNA。
3)融合表达的HRSP12募集RNase P/MRP复合物对环形RNA进行特异靶向降解，降解机制是体内天然存在的，对体内稳态环境干扰少，使实验结果更真实可靠。
4)本发明的环形RNA敲低方法比siRNA等方法更适配环形RNA，能为环形RNA的功能缺失(Loss of function)研究提供技术基础和应用工具。
如本文所用，术语“环形RNA”、“环状RNA”与“circRNA”可互换使用。
如本文所用，除非特别注明，其他实验方法都可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南(第四版)》(科学出版社，2017)或按照供应商所建议的条件。
附图说明
图1为KDHP技术模式图。
图2测序结果比对图
图3为KDHP蛋白表达Wb检测图。
图4为组合转染KDHP-a/b/d/bt和G13/G16(NC)质粒后，circPVT1的表达丰度差异图。
图5为组合转染KDHP-a/b/d/bt和G13/G16(NC)质粒后，mPVT1的表达丰度差异图。
图6为组合转染KDHP-a/b/d/bt和G23/G26(NC)质粒后，circHIPK3的表达丰度差异图。
图7为组合转染KDHP-a/b/d/bt和G23/G26(NC)质粒后，mHIPK3的表达丰度差异图。
图8为分别转染KDHP-a/b/d/bt质粒后，circPVT1的表达丰度差异图。
图9为分别转染KDHP-a/b/d/bt质粒后，circHIPK3的表达丰度差异。
图10为分别转染gRNA质粒后，circPVT1的表达丰度差异图。
图11为分别转染gRNA质粒后，circHIPK3的表达丰度差异图。
图12为组合转染KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15/G16质粒后，circPVT1的表达丰度差异图。
图13为为组合转染KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15/G16质粒后，mPVT1的表达丰度差异。
图14为组合转染KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25/G26/G27质粒后，circHIPK3的表达丰度差异。
图15为组合转染KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25/G26/G27质粒后，mHIPK3的表达丰度差异。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
实施例1 dCas13-HRSP12载体构建
1.目的片段PCR扩增
分别以LwaCas13a-91902质粒、293T细胞cDNA和PCDH-3xFlag质粒为模板，分别扩增失活的dLwaCas13a部分序列D1为1459bp，失活的dLwaCas13a部分序列D2为1735bp，失活的dLwaCas13a部分序列和Linker和NES序列D3为418bp，Linker和HRSP12序列D4为430bp，蛋白标签3xFlag序列D5为147bp，具体序列如下：
KD131-D1-UnF:GCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCACCATGAAAGTGACCAAGGTCGA
KD131-mut1-R:CCGTGAGCAATACTAGAGATGGCCTCATCGATATTGGCGAAGAAGTCCTCGATCT
扩增大小1459bp；
KD131-mut1-F:CCATCTCTAGTATTGCTCACGGCATCGTGCATTTCAACCTGGAACTGGAAGGCAAG
KD131-mut2-R:GTTTGCAATATACAGGTCTTTCTTCTCCTGCTTCAGTTTCTTCACTTTCT
扩增大小1735bp；
KD131-mut2-F:GAAGAAAGACCTGTATATTGCAAACTACATCGCTCACTTTAATTATATTCCTCAT
KD131-mut2-Fin-:CGCTCACTTTAATTATATTCCTCATGCCGAGATTAGCCTGCTGGAAGTGC
KD131-D1-Rin:CCCAGTGTCAGTCTTTCAAGTGGAGGCAGTTGAAGggatccTTCCAGGGCCTTGTACTC
KD131/2-D1-R:
GATCAAGGACGACATACCAGAACCACCACCAGAACCACCCAGTGTCAGTCTTTCAAGTG
扩增大小418bp；
KD131/2-D2-F:TCTGGTATGTCGTCCTTGATCAGAAGGGT
KD131/2-D2-R:CAGTGGTCCTTGGATAGCTACTGCTTCAATTTCAATTCGGCTGCCT
扩增大小430bp；
KD131/2-D3-F:
AGTAGCTATCCAAGGACCACTGACAACGGCATCACTAGGTGGTTCTGGTGACTACAAAG
KD131/2-D3-UnR:AACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTACTTGTCATCGTCATCCTTGTA
扩增大小147bp。
PCR扩增反应程序：95℃5min，38个循环(98℃10s，58℃30s，68℃60s)，68℃5min，4℃保存。PCR扩增反应体系如表1所示。
表1 PCR扩增反应体系
Figure BDA0002677499960000051
Figure BDA0002677499960000061
2.PCR扩增产物回收
按照E.Z.N.A.
Figure BDA0002677499960000062
Gel Extraction Kit(Omega)说明书进行凝胶回收，PCR产物-20℃保存。
3.空载体双酶切
向空载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen,V790-20)中加入HindIII和NotI进行双酶切，用于构建瞬时转染骨架载体。向空载体PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-Puro中加入EcoRI和NotI进行双酶切，用于构建慢病毒骨架载体。反应体系如表所示，37℃温育1h。然后灌制1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的条带。双酶切反应体系如表2；
表2双酶切反应体系
Figure BDA0002677499960000063
4.In-Fusion连接
参考
Figure BDA0002677499960000064
HD Cloning Kit(TaKaRa)说明书配置连接反应液，50℃温育15min，然后进行转化或于-20℃保存，得到连接产物。IN-Fusion连接反应体系如表3
表3连接反应体系
Figure BDA0002677499960000065
5.转化感受态细胞Trans1 T1
(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞Trans1 T1，置于冰上融化；
(2)无菌状态下取50μL的感受态细胞置于灭菌后的1.5mL的离心管中；
(3)加入10μL上述连接产物，冰中放置30分钟；
(4)42℃放置30秒(热休克)，不要摇动离心管；
(5)快速转移离心管于冰中放置2～3min；
(6)加入200μL LB液体培养基，吹打混匀，涂布于LA琼脂平板培养基上，37℃倒置培养12～16h。
6.鉴定
阳性菌落的PCR鉴定：挑取单个菌落接种于LA培养液中，37℃摇床220rpm培养4h后取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。然后灌制1.5％琼脂糖凝胶，取5μL PCR产物进行电泳检测。
阳性菌液测序鉴定：将通过菌液PCR检测的阳性菌液进行测序，将得到的结果进行BLAST序列对比分析，测序结果比对结果如图2，确定为目的基因为dCas13-HRSP12。
PCR鉴定的引物序列为：
KD131-D1-UnF:
GCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCACCATGAAAGTGACCAAGGTCGA
KD131/2-D3-UnR:
AACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTACTTGTCATCGTCATCCTTGTA
7.无内毒素质粒抽提
按照E.Z.N.A.
Figure BDA0002677499960000071
Endo-free Plasmid Mini Kit I(Omega)试剂盒说明书进行无内毒素质粒抽提，-20℃保存。
实施例2 gRNA的设计与载体的构建
以dLwaCas13a(KDHP-a)示例，配套gRNA的设计与载体构建包括以下步骤：
1.配套dLwaCas13a的gRNA设计
配套dLwaCas13a的gRNA为DR加靶标序列组成，形式为GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，其中N为gRNA序列。
使用引物设计软件检索环形RNA circPVT1和circHIPK3的环化位点处序列，计算GC含量等参数，设计gRNA靶标序列如下，对应载体分别命名为G11～G16和G21～G27。
>gRNA targrt-circPVT1-1(11+11)
CTGGGCTTGAGGCCTGATCTTT
其中，括号内表示环化位点处上游碱基数量加下游碱基数量，即11+11表示gRNA靶标序列为环化位点上游11nt+下游11nt，共22nt，对应载体命名为G11，下同；
>gRNA targrt-circPVT1-2(12+13)
GCTGGGCTTGAGGCCTGATCTTTTG
对应载体命名为G12；
>gRNA targrt-circPVT1-3(14+14)
CAGCTGGGCTTGAGGCCTGATCTTTTGG
对应载体命名为G13；
>gRNA targrt-circPVT1-4(10+20)
TGGGCTTGAGGCCTGATCTTTTGGCCAGAA
对应载体命名为G14；
>gRNA targrt-circPVT1-5(20+10)
GGCGCTCAGCTGGGCTTGAGGCCTGATCTT
对应载体命名为G15；
>gRNA targrt-NC-6
GCCAAAAGATCAGGCCTCAAGCCCAGCTGA
对应载体命名为G16；
>gRNA targrt-circHIPK3-1(11+11)
CGGTACTACAGGTATGGCCTCA
其中，括号内表示环化位点处上游碱基数量加下游碱基数量，即11+11表示gRNA靶标序列为环化位点上游11nt+下游11nt，共22nt，对应载体命名为G21，下同；
>gRNA targrt-circHIPK3-2(12+13)
TCGGTACTACAGGTATGGCCTCACA
对应载体命名为G22；
>gRNA targrt-circHIPK3-3(14+14)
TCTCGGTACTACAGGTATGGCCTCACAA
对应载体命名为G23；
>gRNA targrt-circHIPK3-4(10+20)
GGTACTACAGGTATGGCCTCACAAGTCTTG
对应载体命名为G24；
>gRNA targrt-circHIPK3-5(20+10)
CTACAATCTCGGTACTACAGGTATGGCCTC
对应载体命名为G25；
>gRNA target-NC-6
GCTCACTTCTATTTGACCTTGACGGGCA
对应载体命名为G26；
>gRNA targrt-bothHIPK3-7
TGCCCGTCAAGGTCAAATAGAAGTGAGC
对应载体命名为G27。
2.目的片段PCR扩增
以PLKO.1质粒为模板，分别使用引物扩增G11～G16和G21～G27的PCR产物320bp。
KD6/7/8-F:ctaGCTAGCgagggcctatttcccatgattc
G-inR:GTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCggtgtttcgtcctttccacaag
G11-R:gGAATTCAAAAAACTGGGCTTGAGGCCTGATCTTTGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G12-R:gGAATTCAAAAAAGCTGGGCTTGAGGCCTGATCTTTTGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G13-R:gGAATTCAAAAAACAGCTGGGCTTGAGGCCTGATCTTTTGGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G14-R:gGAATTCAAAAAATGGGCTTGAGGCCTGATCTTTTGGCCAGAAGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G15-R:gGAATTCAAAAAAGGCGCTCAGCTGGGCTTGAGGCCTGATCTTGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G16-R:gGAATTCAAAAAACCAAAAGATCAGGCCTCAAGCCCAGCTGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G21-R:gGAATTCAAAAAACGGTACTACAGGTATGGCCTCAGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G22-R:gGAATTCAAAAAATCGGTACTACAGGTATGGCCTCACAGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G23-R:gGAATTCAAAAAATCTCGGTACTACAGGTATGGCCTCACAAGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G24-R:gGAATTCAAAAAAGGTACTACAGGTATGGCCTCACAAGTCTTGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G25-R:gGAATTCAAAAAACTACAATCTCGGTACTACAGGTATGGCCTCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G26-R:gGAATTCAAAAAAGCTCACTTCTATTTGACCTTGACGGGCAGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
G27-R:gGAATTCAAAAAATGCCCGTCAAGGTCAAATAGAAGTGAGCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATC
PCR扩增反应程序：95℃5min，38个循环(98℃10s，58℃30s，68℃60s)，68℃5min，4℃保存。反应体系如表4所示。
表4 PCR扩增反应体系
Figure BDA0002677499960000091
Figure BDA0002677499960000101
2.PCR扩增产物回收
方法与实施例1相同。
3.目的片段与空载体双酶切
分别向目的片段G11～G16、G21～G27和空载体PLKO.1中加入NheI和EcoRI两种内切酶进行双酶切。反应体系如表5所示，37℃温育1h。然后灌制1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的条带。
表5双酶切反应体系
Figure BDA0002677499960000102
4.目的片段与载体连接
双酶切后用T4 DNA连接酶连接目的片段和载体质粒，在0.2mL的离心管中配置连接反应液，用移液器吹打混匀连接反应物，常温反应30min。反应体系如表6所示。
表6连接反应体系
Figure BDA0002677499960000103
5.转化感受态细胞Trans1 T1
与实施例1相同。
6.鉴定
与实施例1相同。
7.无内毒素质粒抽提
与实施例1相同。
实施例3载体转染与KDHP蛋白的表达
使用Lipofectamine 3000分别将dLwaCas13a(KDHP-a)、dPspCas13b(KDHP-b)、dRfxCas13d(KDHP-d)和dPspCas13b-truncated(983aa)(KDHP-bt)载体转染293T细胞，48h后消化离心收取样品。
用预冷的PBS洗涤3次，尽量吸干残液后加入含有PMSF的细胞裂解液100μL，低温裂解20分钟后，将液体转移到1.5mL EP管中。然后加入5×Loading buffer(按2：1的比例)，100℃煮沸10min进行SDS-PAGE电泳。
使用PVDF膜，350mA转膜80min。然后将膜浸在封闭液中37℃封闭1h；将膜取出直接放入一抗(Flag抗体稀释3000倍)中，4℃过夜；PBST洗膜，5min×4次；将膜转入二抗(稀释10000倍)中，37℃孵育40分钟；PBST洗膜，5min×5次；用化学发光法(ECL)显影。
Wb检测结果如图3，结果表明dLwaCas13a(KDHP-a)、dPspCas13b(KDHP-b)、dRfxCas13d(KDHP-d)和dPspCas13b-truncated(983aa)(KDHP-bt)载体能成功转染并表达融合蛋白dCas13-HRSP12。
实施例4靶向环化位点circPVT1，转染KDHP-a/b/d/bt和G13/G16(NC)质粒
分别组合转染KDHP-a/b/d/bt和G13/G16(NC)质粒，同时转染siRNA作为对照，siRNA序列如下：
siRNA-target-circPVT1:TGGGCTTGAGGCCTGATCT
siRNA-NC:TTCTCCGAACGTGTCACGT
1.细胞瞬时转染
(1)转染前一天，5*105个细胞接种在6孔板上，2mL完全培养基，转染前细胞汇合达到70-90％。
(2)在100μL无血清培养基加入3μg质粒，柔和混匀。
(3)混匀lipofectamine试剂，用100μL无血清培养基稀释4μL lipofectamine试剂，轻轻混匀，室温放置5min。
(4)将稀释好的质粒和lipofectamine试剂混合，轻柔混匀，室温放置20min，以便形成质粒-lipofectamine复合物。
(5)将200μL质粒-lipofectamine复合物加到含800μL无血清培养基的细胞孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板。
(6)细胞在37℃，5％CO2培养箱中，培养5-6h后吸去转染培养基，更换完全培养基。
(7)48h后收样。
2.样品RNA抽提
(1)细胞加1mL Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；
(2)按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置5min；
(3)4℃，12,000g离心15min；
(4)吸取上层水相，移至另一离心管中；
(5)按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min；
(6)4℃，12,000g离心10min，弃上清；
(7)4℃，12,000g离心10min，弃上清；
(8)按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
(9)4℃7,500g离心5min，尽量弃上清。
(10)室温晾干5～10min，加入20μL DEPC水溶解沉淀。
(11)对RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测并测量浓度。
3.逆转录
a.配制第一链cDNA合成反应液
Figure BDA0002677499960000121
用移液器轻轻吹打混匀。
b.按下列条件进行第一链cDNA合成反应
Figure BDA0002677499960000122
4.qPCR实验
a.qPCR反应体系配制
Figure BDA0002677499960000123
Figure BDA0002677499960000131
b.qPCR反应程序设置
Figure BDA0002677499960000132
对转染的10组样品分别检测环形RNA circPVT1和亲本基因mPVT1的表达丰度，所述circPVT1和mPVT1引物序列如下：
circPVT1-F:TCAGCTGGGCTTGAGGCCTGA
circPVT1-R:CCAGACCACTGAAGATCACTG
扩增大小143bp；
mPVT1-F:TGCAGTGCAGGAAGCCAACTA
mPVT1-R:TGACAGGCACAGCCATCTTGA
扩增大小213bp。
5.qPCR数据处理
根据2-△△Ct公式计算目标基因进行表达情况分析，设定CtA1为1号样本目标基因Ct值，CtB1为1号样本内参基因Ct值；CtA2为2号样本目标基因Ct值，CtB2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为(2-△△Ct法)：
△△Ct＝(CtA2-CtB2)-(CtA1-CtB1)＝X
则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2-X倍。
6.实验结果-qPCR数据
分别检测转染KDHP-a/b/d/bt和G13/G16(NC)质粒以及siRNA的10组样品中circPVT1的相对表达丰度，结果如图4，结果符合预期，其中KDHP-a/b/d/bt和G13共转染表达时都能特异靶向敲低circPVT1，KDHP-a和G13共转染时特异靶向敲低效率较低，KDHP-b/d/bt和G13共转染时特异靶向敲低效率较高，KDHP-bt和G13共转染时特异靶向敲低效率最高，转染si-circPVT1组中circPVT1也被靶向敲低，但敲低效率比KDHP-b/d/bt和G13共转染的特异靶向敲低效率低。
分别检测转染KDHP-a/b/d/bt和G13/G16(NC)质粒以及siRNA的10组样品中亲本基因mPVT1的相对表达丰度，结果如图5，由图5可以看出KDHP-a/b/d/bt和G13共转染表达时亲本基因mPVT1的丰度基本不变，表明靶向敲低的特异性高，不会非特异靶向亲本基因mPVT1。而转染si-circPVT1组中亲本基因mPVT1的丰度有明显降低，表明靶向敲低的特异性较弱，会非特异靶向亲本基因mPVT1。
上述结果显示同时表达KDHP-a/b/d/bt和gRNA时能特异靶向敲低环形RNA，对亲本RNA无影响，说明KDHP方法的靶向敲低效率更高，特异性更强，不会非特异靶向亲本基因。
实施例5靶向环化位点circHIPK3，组合转染KDHP-a/b/d/bt和G23/G26(NC)质粒
分别组合转染KDHP-a/b/d/bt和G23/G26(NC)质粒，同时转染siRNA作为对照，其中siRNA序列如下：
siRNA-target-circHIPK3:CTACAGGTATGGCCTCACA
siRNA-NC:TTCTCCGAACGTGTCACGT
1.细胞瞬时转染
与实施例4相同。
2.样品RNA抽提
与实施例4相同。
3.逆转录
与实施例4相同。
4.qPCR实验
实验步骤与实施例4相同。对转染的10组样品分别检测环形RNA circHIPK3和亲本基因mHIPK3的表达丰度，所述circHIPK3和亲本mHIPK3的序列如下：
circHIPK3-F:CAATCTCGGTACTACAGGTATG
circHIPK3-R:TCACATAGGTCCGTGGATAG
扩增大小155bp；
mHIPK3-F:GGTCGGCCAGTCATGTATCAA
mHIPK3-R:GTAGAGCGGCCATCCAAGAA
扩增大小161bp。
5.qPCR数据处理
与实施例4相同。
6.实验结果-qPCR数据
分别检测转染KDHP-a/b/d/bt和G23/G26(NC)质粒以及siRNA的10组样品中circHIPK3的相对表达丰度的结果如图6，符合预期，其中显示KDHP-a/b/d/bt和G23共转染表达时都能特异靶向敲低circHIPK3，KDHP-a和G23共转染时特异靶向敲低效率较低，KDHP-b/d/bt和G23共转染时特异靶向敲低效率较高。转染si-circHIPK3组中circHIPK3也被靶向敲低，但敲低效率比KDHP-b/d/bt和G23共转染的特异靶向敲低效率低。
分别检测转染KDHP-a/b/d/bt和G23/G26(NC)质粒以及siRNA的10组样品中亲本基因mHIPK3的相对表达丰度的结果如图7，结果显示KDHP-a/b/d/bt和G23共转染表达时亲本基因mHIPK3的丰度基本不变，表明靶向敲低的特异性高，不会非特异靶向亲本基因mHIPK3。而转染si-circHIPK3组中亲本基因mHIPK3的丰度有明显降低，表明靶向敲低的特异性较弱，会非特异靶向亲本基因mHIPK3。
上述结果显示同时表达KDHP-a/b/d/bt和gRNA时能特异靶向敲低环形RNA，对亲本RNA无影响，说明KDHP方法的靶向敲低效率更高，特异性更强，不会非特异靶向亲本基因。
实施例6分别转染KDHP-a/b/d/bt质粒
分别转染KDHP-a/b/d/bt质粒，以293T细胞组为对照。
1.细胞瞬时转染
与实施例4相同。
2.样品RNA抽提
与实施例4相同。
3.逆转录
与实施例4相同。
4.qPCR实验
实验步骤与实施例4相同。对转染的5组样品分别检测环形RNA circPVT1和circHIPK3。
5.qPCR数据处理
与实施例4相同。
6.实验结果-qPCR数据
分别检测转染KDHP-a/b/d/bt和293T组样品中circPVT1的相对表达丰度，结果如图8，结果显示circPVT1的相对表达丰度基本不变，说明单独表达KDHP-a/b/d/bt时无法特异靶向敲低circPVT1。
分别检测转染KDHP-a/b/d/bt和293T组样品中circHIPK3的相对表达丰度，结果如图9，结果显示circHIPK3的相对表达丰度基本不变，说明单独表达KDHP-a/b/d/bt时无法特异靶向敲低circHIPK3。
上述结果显示单独表达KDHP-a/b/d/bt时无法靶向敲低环形RNA，说明KDHP方法的靶向敲低特异性强。
实施例7分别转染gRNA质粒G11/G12/G13/G14/G15/G16/G21/G22/G23/G24/G25/G26/G27
分别转染gRNA质粒G11/G12/G13/G14/G15/G16/G21/G22/G23/G24/G25/G26/G27，以293T细胞组为对照。
1.细胞瞬时转染
与实施例4相同。
2.样品RNA抽提
与实施例4相同。
3.逆转录
与实施例4相同。
4.qPCR实验
实验步骤与实施例4相同。对转染的14组样品分别检测环形RNA circPVT1和circHIPK3。
5.qPCR数据处理
与实施例4相同。
6.实验结果-qPCR数据
分别检测转染gRNA质粒和293T组样品中circPVT1的相对表达丰度，结果如图10，结果显示circPVT1的相对表达丰度基本不变，说明单独表达gRNA时无法特异靶向敲低circPVT1。
分别检测转染gRNA质粒和293T组样品中circHIPK3的相对表达丰度，结果如图11，结果显示circHIPK3的相对表达丰度基本不变，说明单独表达gRNA时无法特异靶向敲低circHIPK3。
上述结果显示，单独表达gRNA时无法靶向敲低环形RNA，说明KDHP方法的靶向敲低特异性强。
实施例8分别组合转染KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15/G16质粒
分别组合转染KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15/G16质粒，同时转染siRNA作为对照。
1.细胞瞬时转染
与实施例4相同。
2.样品RNA抽提
与实施例4相同。
3.逆转录
与实施例4相同。
4.qPCR实验
实验步骤与实施例4相同。对转染的8组样品分别检测环形RNA circPVT1和亲本基因mPVT1。
5.qPCR数据处理
与实施例4相同。
6.实验结果-qPCR数据
分别检测转染KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15/G16质粒以及siRNA的8组样品中circPVT1的相对表达丰度，结果如图12，结果符合预期，由图12可以看出，KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15共转染表达时都能特异靶向敲低circPVT1，而KDHP-bt和G16(NC)共转染表达时circPVT1丰度基本不变；且转染si-circPVT1组中circPVT1也能被靶向敲低，但敲低效率比KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15共转染的特异靶向敲低效率低。
分别检测转染KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15/G16质粒以及siRNA的8组样品中亲本基因mPVT1的相对表达丰度，结果如图13，由图13可以看出，KDHP-bt和G11/G12/G13/G14/G15/G16共转染表达时亲本基因mPVT1的丰度基本不变，表明靶向敲低的特异性高，不会非特异靶向亲本基因mPVT1，结果符合预期。而转染si-circPVT1组中亲本基因mPVT1的丰度有明显降低，表明靶向敲低的特异性较弱，会非特异靶向亲本基因mPVT1。
上述结果显示，转染KDHP-bt和gRNA质粒能高效特异靶向敲低环形RNA，针对环化位点设计不同的gRNA靶标，如(11+11,12+13,14+14,10+20,20+10)都能高效特异靶向降解环形RNA，说明KDHP方法的靶向敲低效率更高，特异性更强，不会非特异靶向亲本基因。
实施例9分别组合转染KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25/G26/G27质粒
分别组合转染KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25/G26/G27质粒，同时转染siRNA作为对照。
1.细胞瞬时转染
与实施例4相同。
2.样品RNA抽提
与实施例4相同。
3.逆转录
与实施例4相同。
4.qPCR实验
实验步骤与实施例4相同。对转染的9组样品分别检测环形RNA circHIPK3和亲本基因mHIPK3。
5.qPCR数据处理
与实施例4相同。
6.实验结果-qPCR数据
分别检测转染KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25/G26/G27质粒以及siRNA的9组样品中circHIPK3的相对表达丰度，结果如图14，结果符合预期，由图14可以看出，KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25共转染表达时都能特异靶向敲低circHIPK3，KDHP-bt和G26(NC)共转染表达时circHIPK3丰度基本不变，KDHP-bt和G27(both)共转染表达时circHIPK3丰度也明显降低，表明设计为同时靶标circHIPK3和mHIPK3的gRNA可以高效特异靶向降解circHIPK3。转染si-circHIPK3组中circHIPK3也能被靶向敲低，但敲低效率比KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25共转染的特异靶向敲低效率低。
分别检测转染KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25/G26/G27质粒以及siRNA的9组中亲本基因mHIPK3的相对表达丰度，结果如图15，结果符合预期，由图15可以看出，KDHP-bt和G21/G22/G23/G24/G25/G26共转染表达时亲本基因mHIPK3的丰度基本不变，表明靶向敲低的特异性高，不会非特异靶向亲本基因mPVT1。KDHP-bt和G27(both)共转染表达时mHIPK3丰度也明显降低，表明设计为同时靶标circHIPK3和mHIPK3的gRNA可以高效特异靶向降解mHIPK3。而转染si-circHIPK3组中亲本基因mHIPK3的丰度有明显降低，表明靶向敲低的特异性较弱，会非特异靶向亲本基因mPVT1。
上述结果显示转染KDHP-bt和gRNA质粒能高效特异靶向敲低环形RNA，针对环化位点设计不同的gRNA靶标(11+11,12+13,14+14,10+20,20+10)都能高效特异靶向降解环形RNA，不会影响亲本RNA，设计为同时靶标环形RNA和亲本基因的gRNA可以高效特异靶向降解环形RNA和亲本基因，说明KDHP方法的靶向敲低效率更高，特异性更强。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 广州吉赛生物科技股份有限公司； 中华人民共和国泰安海关
<120> 一种环形RNA敲低方法及其应用
<130> 2020.09.01
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1336
<212> PRT
<213> KDHP-a
<400> 1
Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu
1 5 10 15
Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr
85 90 95
Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe
100 105 110
Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn
130 135 140
Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
145 150 155 160
Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile
165 170 175
Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn
180 185 190
Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu
195 200 205
Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys
210 215 220
Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu
225 230 235 240
Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile
245 250 255
Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser
260 265 270
Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys
275 280 285
Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln
290 295 300
Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp
305 310 315 320
Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu
325 330 335
Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys
340 345 350
Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile
355 360 365
Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val
370 375 380
Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn
385 390 395 400
Glu Asn Gly Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn
405 410 415
Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn
420 425 430
Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser
435 440 445
Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala
450 455 460
Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Ala His Gly Ile Val His Phe
465 470 475 480
Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala
485 490 495
Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys
500 505 510
Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe
515 520 525
Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys
530 535 540
Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys
545 550 555 560
Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp
565 570 575
Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu
580 585 590
Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser
595 600 605
Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln
610 615 620
Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile
625 630 635 640
Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu
645 650 655
Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe
660 665 670
Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn
675 680 685
Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile
690 695 700
Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys
705 710 715 720
Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His
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805 810 815
His Cys Phe Thr Ser Val Glu Glu Arg Glu Gly Leu Trp Lys Glu Arg
820 825 830
Ala Ser Arg Thr Glu Arg Tyr Arg Lys Gln Ala Ser Asn Lys Ile Arg
835 840 845
Ser Asn Arg Gln Met Arg Asn Ala Ser Ser Glu Glu Ile Glu Thr Ile
850 855 860
Leu Asp Lys Arg Leu Ser Asn Ser Arg Asn Glu Tyr Gln Lys Ser Glu
865 870 875 880
Lys Val Ile Arg Arg Tyr Arg Val Gln Asp Ala Leu Leu Phe Leu Leu
885 890 895
Ala Lys Lys Thr Leu Thr Glu Leu Ala Asp Phe Asp Gly Glu Arg Phe
900 905 910
Lys Leu Lys Glu Ile Met Pro Asp Ala Glu Lys Gly Ile Leu Ser Glu
915 920 925
Ile Met Pro Met Ser Phe Thr Phe Glu Lys Gly Gly Lys Lys Tyr Thr
930 935 940
Ile Thr Ser Glu Gly Met Lys Leu Lys Asn Tyr Gly Asp Phe Phe Val
945 950 955 960
Leu Ala Ser Asp Lys Arg Ile Gly Asn Leu Leu Glu Leu Val Gly Ser
965 970 975
Asp Ile Val Ser Lys Glu Asp Gly Ser Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu
980 985 990
Arg Leu Thr Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Ser Ser Leu
995 1000 1005
Ile Arg Arg Val Ile Ser Thr Ala Lys Ala Pro Gly Ala Ile Gly Pro
1010 1015 1020
Tyr Ser Gln Ala Val Leu Val Asp Arg Thr Ile Tyr Ile Ser Gly Gln
1025 1030 1035 1040
Ile Gly Met Asp Pro Ser Ser Gly Gln Leu Val Ser Gly Gly Val Ala
1045 1050 1055
Glu Glu Ala Lys Gln Ala Leu Lys Asn Met Gly Glu Ile Leu Lys Ala
1060 1065 1070
Ala Gly Cys Asp Phe Thr Asn Val Val Lys Thr Thr Val Leu Leu Ala
1075 1080 1085
Asp Ile Asn Asp Phe Asn Thr Val Asn Glu Ile Tyr Lys Gln Tyr Phe
1090 1095 1100
Lys Ser Asn Phe Pro Ala Arg Ala Ala Tyr Gln Val Ala Ala Leu Pro
1105 1110 1115 1120
Lys Gly Ser Arg Ile Glu Ile Glu Ala Val Ala Ile Gln Gly Pro Leu
1125 1130 1135
Thr Thr Ala Ser Leu Gly Gly Ser Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly
1140 1145 1150
Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1155 1160 1165

Claims (10)

1.一种环形RNA敲低方法，其特征在于，所述方法是用dCas13蛋白融合表达HRSP12得到融合蛋白，再利用融合蛋白募集RNase P/MRP复合物，实现对环形RNA的特异靶向降解。
2.根据权利要求1所述的环形RNA敲低方法，其特征在于，所述dCas13蛋白包括dLwaCas13a，dPspCas13b和dRfxCas13d，所述dLwaCas13a，dPspCas13b和dRfxCas13d分别融合HRSP12进行表达的融合蛋白，分别命名为KDHP-a，KDHP-b和KDHP-d，所述KDHP-a，KDHP-b和KDHP-d的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
3.根据权利要求1所述的的环形RNA敲低方法，其特征在于，所述dCas13蛋白与HRSP12蛋白之间以柔性linker串联，柔性linker选自GS、GSGSGS、GGSG、GGSGGGSG、GGSGGS、GGGS、GGGGS中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的的环形RNA敲低方法，其特征在于，所述HRSP12蛋白之后串联一个或多个蛋白标签，所述蛋白标签选自Myc、HA、GST、6xHis、Flag、3xFlag中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的的环形RNA敲低方法，其特征在于，所述蛋白标签为3xFlag。
6.根据权利要求1所述的的环形RNA敲低方法，其特征在于，所述KDHP蛋白的N端和C端同时添加核定位信号NLS或核输出信号NES序列，强制KDHP蛋白在胞内的定位。
7.根据权利要求2所述的的环形RNA敲低方法，其特征在于，所述dPspCas13b删除第二个HEPN位点后得到dPspCas13b-truncated，命名为KDHP-bt，所述KDHP-bt的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
8.一种如权利要求1-6任一所述环形RNA敲低方法以dCas13-HRSP12融合蛋白表达载体瞬时转染细胞的应用。
9.一种如权利要求1-6任一所述环形RNA敲低方法以dCas13-HRSP12融合蛋白的表达载体包装成慢病毒颗粒的应用。
10.一种如权利要求1-6任一所述环形RNA敲低方法以重组表达纯化的dCas13-HRSP12融合蛋白直接处理纯化的RNA的应用。
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