CN112111545B

CN112111545B - 一种生物法来源的6″-o-琥珀酰大豆苷及其在制备神经保护药物和保健品方面的应用

Info

Publication number: CN112111545B
Application number: CN202010639876.6A
Authority: CN
Inventors: 张森; 段金廒; 黄志恒; 刘佳琪; 张恩泽; 俞子静; 黄子争
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2040-07-06
Also published as: CN112111545A

Abstract

本发明公开了以下式(1)所述的一种生物法来源的6＇＇‑O‑琥珀酰大豆苷及其在制备神经保护药物和保健品方面的应用，6＇＇‑O‑琥珀酰大豆苷为活性成分的药物，属于医药技术领域。本发明所提供的6＇＇‑O‑琥珀酰大豆苷作为功能食品纳豆中的一种稀有的功效物质，是大豆异黄酮衍生物，具有神经保护作用强的特点，为保健品开发及神经保护药物开发提供了新的选择。

Description

一种生物法来源的6″-O-琥珀酰大豆苷及其在制备神经保护药物和保健品方面的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种6″-O-琥珀酰大豆苷在制备神经保护药物和保健品方面的用途。

背景技术

大豆异黄酮(Soy isoflavone)是一种植物化学素，主要来源于豆科植物的荚豆中。研究表明大豆具有预防心血管疾病、防治妇女骨质疏松、治疗糖尿病、肾病之功效。大豆中天然存在的大豆异黄酮共有12种，主要包括大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)、大豆黄素(glycitein)，大豆苷(daidzin)、染料木苷(genistin)，丙二酰大豆苷(6″-O-malonydaidzin)、丙二酰染料木苷(6″-O-malonygenistin)等。

纳豆(由大豆与纳豆菌发酵而成)是一种功能性保健食品，研究表明相比于大豆而言，纳豆的功能保健作用更强，具有溶血栓、抗肿瘤、降血压、抗菌消毒、调整肠道功能、延缓衰老等多重功效。1999年，Toda等(Biol Pharm Bull,22(11),1193-1201)从纳豆中分离获得一种新型的功能性大豆异黄酮衍生物6″-O-琥珀酰大豆苷(6″-O-succinyldaidzin)，但由于含量极低，难以被商业推广应用，生物活性方面该文章报道黄酮类衍生物6″-O-琥珀酰大豆苷具有抗骨质疏松的效果。采用生物发酵转化的方法，获得6″-O-琥珀酰大豆苷有望突破瓶颈(Journal of Food Science,2010,75(1)：C128-33；Biotechnology and AppliedBiochemisstry,2015,62(2):255-259)，但由于发酵水平低，采用纳豆菌或地衣芽孢杆菌，产能低于0.015g/L/h，难以大量获得6″-O-琥珀酰大豆苷并进行药理活性研究，因此限制了其在医药、食品领域的应用。

从纳豆中分离获得大豆异黄酮衍生物的方法通常存在成本高、纯化步骤繁琐等问题，且普通生物发酵转化方法生产效率低，难以大规模获取6″-O-琥珀酰大豆苷类的大豆异黄酮衍生物。如何制备高高效的大豆异黄酮基药物、保健品是本发明的关键所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以大规模生物法制备6″-O-琥珀酰大豆苷化合物及其该化合物在制备神经保护药物及保健品方面的应用，本发明采用解淀粉芽孢杆菌FJ18作为发酵菌种,6″-O-琥珀酰大豆苷产能高于0.15g/L/h，产物易分离纯化制备，首次研究并报道了该物质显著的神经保护活性。

为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：一种生物法来源的6″

-O-琥珀酰大豆苷的制备方法，所述的6″-O-琥珀酰大豆苷具有下式(1)

所示的结构：

解淀粉芽孢杆菌FJ18在非水相中制备6″-O-琥珀酰大豆苷，反应化学式如下：

以大豆苷元和糖基供体为原料，在解淀粉芽孢杆菌FJ18的催化作用下，大豆苷元7位酚羟基发生糖基化反应，形成大豆苷元-7-O-葡萄糖苷；大豆苷元-7-O-葡萄糖苷继而在解淀粉芽孢杆菌FJ18的催化作用下，葡萄糖基6”位羟基发生琥珀酰化，形成6″-O-琥珀酰大豆苷。

优选的，具体步骤如下：

步骤(1)：将所述的解淀粉芽孢杆菌FJ18，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；

步骤(2)：以大豆苷元和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；

步骤(3)：将步骤(1)的湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(2)的溶液中进行催化反应。

优选的，所述的磷酸缓冲溶液浓度为100～150mmol/L，pH为8.0。

优选的，步骤(2)中所述的原料溶液，其组分中，大豆苷元的浓度为0.01～5g/L，糖基供体的溶液浓度为5～50g/L，非水相溶剂体积百分比为5％～20％；所述的非水相溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮中的任意一种。

优选的，所述的非水相溶剂为二甲基亚砜或乙醇；所述的糖基供体为蔗糖或麦芽糖。

为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：一种神经保护药物，包括活性成分为式(1)所示的6″-O-琥珀酰大豆苷，以及药学上可接收的药用辅料。

优选的，包括活性成分为式(1)所示的6″-O-琥珀酰大豆苷或其盐，以及药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。

优选的，所述6″-O-琥珀酰大豆苷盐指6″-O-琥珀酰大豆苷与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸、烷基或芳基磺酸形成的盐。

优选的，含有式(1)所示的6″-O-琥珀酰大豆苷，以及辅料。

为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：神经保护保健品，所述保健品的剂型为胶囊、颗粒或液体，所述辅料包括抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂和释放阻滞剂中的一种或多种。

为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：一种神经保护保健食品添加剂，为式(1)所示的6″-O-琥珀酰大豆苷。

本发明所述式(1)化合物，为解淀粉芽孢杆菌FJ18(保藏号为：CCTCC NO：M2016272)在非水相中制备6″-O-琥珀酰大豆苷而得，反应化学式见下式：

本发明所述6″-O-琥珀酰大豆苷为纳豆中稀有的大豆异黄酮衍生物，含量极低，此前鲜有神经保护方面的报道。

6″-O-琥珀酰大豆苷具有良好的神经保护，为大豆苷元衍生物在功能保健品和医学上的拓展应用奠定了基础。

有益效果：

1.本发明提供了式(1)所述的6″-O-琥珀酰大豆苷的新的生物制备方法；采用纳豆菌或地衣芽孢杆菌，产能低于0.015g/L/h，本发明的采用解淀粉芽孢杆菌FJ18作为发酵菌种,6″-O-琥珀酰大豆苷产能高于0.15g/L/h，为大规模生产6″-O-琥珀酰大豆苷提供了可能。

2.本发明所提供的6″-O-琥珀酰大豆苷作为纳豆中稀有的大豆异黄酮衍生物，首次发现在神经保护方面具有显著药效，可用于制备神经保护方面的药物及保健品；为神经保护提供了新的药物选择。

3、本发明所提供的6″-O-琥珀酰大豆苷可以作为一种食品添加剂添加到食品中，例如添加到面粉及其制品(面条、面包、馒头、饼干、烧饼、包子、饺子、糕点等)或饮料，制备成具有神经保护的保健功能食品。

附图说明

图1是6″-O-琥珀酰大豆苷的¹H NMR谱图。

图2是6″-O-琥珀酰大豆苷的¹³C NMR谱图。

图3是6″-O-琥珀酰大豆苷的HMBC谱图。

图4是6″-O-琥珀酰大豆苷神经保护、改善卒中动物行动能力的作用。

图5是6″-O-琥珀酰大豆苷调节体内抗氧化酶活力的作用。

图6是6″-O-琥珀酰大豆苷调节ERK/Nrf2/HO-1信号通路、改善体内氧化水平从而产生神经保护作用。

图7是6″-O-琥珀酰大豆苷能够上调HT22细胞中p-ERK/ERK，使Nrf2发生核表达，激活HO-1，阐明神经保护机制。

具体实施方式

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌FJ18，保藏名称：解淀粉芽孢杆菌FJ18(Bacillusamyloliquefaciens FJ18)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2016年5月20日；保藏号为：CCTCC NO：M2016272，授权专利CN201610719089.6中已报道该解淀粉芽孢杆菌FJ18。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

解淀粉芽孢杆菌FJ18的发酵及静息细胞的制备

将解淀粉芽孢杆菌FJ18的发酵接种到种子培养基中：酵母膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH7.0，于30℃，200rpm培养12小时。扩大培养基、发酵培养基，其组分和含量均为：蔗糖20g/L，酵母粉15g/L.KH₂PO₄ 1.0g/L，CaCl₂ 0.8g/L。以NaOH调节pH至8.0。种子液按0.5％(v/v)接种到扩大培养基、发酵培养基，于30℃，200rpm培养12小时。10000rpm离心15分钟后收集菌体细胞，以生理盐水洗涤l～2次，得解淀粉芽孢杆菌FJ18的静息细胞。

实施例2

将实施例1中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、大豆苷元、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，大豆苷元0.5g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，蔗糖浓度为50g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养12h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得大豆苷元转化率为96.2％。

产物用大孔树脂进行分离，取适量树脂，用乙醇浸泡24h后，除去树脂碎片和杂物。湿法装柱

用1L乙醇冲洗，再用蒸馏水洗至无醇味；接行酸碱处理，即先后用体积分数5％的HCl溶液与质量分数2％的NaOH溶液分别以2BV/h流速通过树脂柱，并静止置2～4h后，用蒸馏水洗至pH值中性。为避免DMSO溶解转化产物降低上样吸附率，所以转化液用5倍体积的去离子水(pH4.0，冰醋酸调节)稀释至DMSO<2％后加样。加样量20mg/g湿树脂，加样流速20mL/min。用10倍柱床体积的去离子水(pH4.0，冰醋酸调节)淋洗过量未反应的糖基供体(蔗糖)，直到洗脱液用浓硫酸检测不出糖为止，流速20mL/min。选用甲醇加去离子水作流动相进行洗脱，调整甲醇和去离子水的体积比，在洗脱流速20mL/min时，确定洗脱液中甲醇比例。浓缩干燥：经HPLC检测，合并洗脱液，用旋转蒸发仪对其减压真空浓缩，加热温度40℃。最后将固体置于真空干燥箱中，40℃干燥6h。

解淀粉芽孢杆菌FJ18非水相中制备6″-O-琥珀酰大豆苷的反应化学式见下式：

经核磁共振质谱分析鉴定从NMR图谱上看，获得的结构与预期产物的结构一致。以上结果证实该反应中生成了葡萄糖基化的大豆苷元，即6″-O-琥珀酰大豆苷。6″-O-琥珀酰大豆苷的核磁共振波谱数据为：

6″-O-琥珀酰大豆苷的¹H NMR、¹³C NMR谱峰的归属：¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ：8.35(1H,s，2-H),8.06(1H,d,J＝8.9Hz，5-H),7.41(2H,d,J＝8.6Hz，2′and 6′-H),7.24(1H,d,J＝2.3Hz，8-H),7.14(1H,dd,J＝8.9Hz,2.4Hz,6-H),6.83(2H,d,J＝8.6Hz,3′and5′-H),5.14(1H,d,J＝7.4Hz，1″-H),4.42(1H,dd,J＝11.0Hz，2.4Hz,6″-H_A),4.04(1H,dd,J＝11.0Hz，7.2Hz,6″-H_B),3.80-3.20(4H,m,2″and 5″-H),2.50-2.57(4H,m,2″′and 3″′-H).

C-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ：174.7(C-4),173.4(C-4″′),171.9(C-1″′),161.1(C-7),157.3(C-4′),157.0(C-9),153.3(C-2),130.0(C-2′,6′),126.9(C-5),123.7(C-3),122.3(C-1′),118.5(C-10),115.5(C-6),115.0(C-3′,5′),103.4(C-8),99.7(C-1″),76.3(C-3″),73.9(C-5″),73.0(C-2″),69.9(C-4″),63,6(C-6″),28.7(C-2″′),28.7(C-3″′).

实施例3

将实施例1中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、大豆苷元、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为15％(v/v)，大豆苷元1.0g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为125mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，蔗糖浓度为25g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养12h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得大豆苷元转化率为95.6％。

产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例2；产物检测方法同实施例2。

实施例4

将实施例1中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、大豆苷元、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为5％(v/v)，大豆苷元1.0g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为100mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，蔗糖浓度为5g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养12h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得大豆苷元转化率为94.8％。产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例2；产物检测方法同实施例2。

实施例5

将实施例1中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以乙醇、大豆苷元、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂乙醇的比例为15％(v/v)，大豆苷元1.0g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为125mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，乳糖浓度为30g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养12h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得大豆苷元转化率为92.5％。产物用大孔树脂进行分离，方法同实施例2；产物检测方法同实施例2。

实施例6

将实施例1中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、大豆苷元、麦芽糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为15％(v/v)，大豆苷元1.0g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为125mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，麦芽糖浓度为25g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养12h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得大豆苷元转化率为92.1％。

实施例7

本发明的6″-O-琥珀酰大豆苷在神经保护方面的应用

实验方法：

选用体重约180-220g的超洁净级雄性SD大鼠(购于上海杰思捷实验动物公司)，根据随机的原则，将40只大鼠分为4组，正常组、模型组、低剂量组以及高剂量组，每组10只大鼠。

在室温22℃条件下，大鼠称重后，参考Koizum线栓法，进行右侧MCAO/R手术，制备急性脑梗死动物模型。具体方法为所有大鼠均选择右侧大脑中动脉(middle cerebralartery,MCA)区作为梗死侧，10％水合氯醛(3ml/100g)腹腔麻醉成功后常规去毛消毒，正中切开颈部皮肤，暴露颈总动脉并向上分离出颈内动脉和颈外动脉主干及分支，在颈内、外动脉分叉处结扎颈外动脉，在近心端结扎颈总动脉。用动脉夹夹闭颈内动脉，然后在颈总动脉结扎处远端约3mm处剪一小口，将直径为0.24mm的尼龙线从切口导入，经颈内动脉至右侧大脑中动脉起始部阻断血流(有少许阻力为止)，从颈外动脉与颈内动脉分叉处插入约18—22mm，从而造成局灶性脑缺血。缺血期间进行尾静脉注射给药，高、低剂量组分别给予12mg/kg和8mg/kg的6″-O-琥珀酰大豆苷，正常组和模型组注射相同体积的生理盐水。2h后缓慢退出尼龙线实现再灌注。

分别在再灌注1h、2.5h、4h和5.5h将各组动物通过异氟烷麻醉，仰卧位、头部放入7.0T小动物核磁共振成像仪，调节动物呼吸保持在50次/分钟左右。导出每只动物每个时间点的ADC图像，用image j软件圈画出每一片的梗死灶面积，计算得到体积。计算公式为：体积＝∑面积*1。MCAO后再灌24h，进行神经行为学评分，观察性评价指标包括运动减少、姿势侧倾、拖地步态、共济失调等；操作性评分指标包括低反应性、前肢屈曲、肌肉强度降低、身体旋转和运动失调等，分值越高，代表损伤越严重。采用Longa 5分法分别在局灶性脑缺血和再灌注时进行神经行为学评分。评分标准：0分：无神经功能缺损症状；1分：提尾悬空后不能伸展右侧前爪；2分：行走向右侧转圈；3分：行走困难，并向右侧倾倒；4分：不能自发行走或昏迷。

再灌注24h后腹主动脉取血，收集血清样本并处死大鼠利用试剂盒检测大鼠血清中SOD、MDA和GSHPx酶的活力。

选取对数生长期的HT22心肌细胞，调整细胞密度为4×10⁴个/mL，每孔100μL接种于96孔板，置于37℃、5％CO₂的培养箱培养至细胞贴壁后，用0.05、0.5或5μM浓度的6″-O-琥珀酰大豆苷预处理24h，随后吸弃上清液，用无血清的EBSS清洗细胞2次，加入无血清的EBSS，置于三气培养箱(5％CO₂+0.5％O₂+94.5％N₂)中孵育2h，造成缺氧缺糖(oxygenglucose deprivation，OGD)损伤。OGD后，吸弃上清，加入正常培养基，在37℃、5％CO₂的培养箱中继续培养6h，形成缺氧复氧环境，即OGD/R损伤模型建立。

正常组用正常培养基培养，模型组和药物组OGD/R模型建立后，置于37℃、5％CO₂的培养箱中，待OGD/R后，每孔加入20μL MTT(5mg·mL^-1)，置于37℃、5％CO₂培养箱中避光孵育4h，小心吸弃上清液后，每孔加入150μL DMSO，摇床低速振荡溶解20min，酶标仪492nm处检测OD值(A)。其中，另设空白对照组，不加细胞，其余与正常组或模型组相同。为防止边缘效应，96孔板周围一圈用无菌PBS填充。

细胞存活率(％)＝(模型组A或药物组A-空白对照组)/(正常组A-空白对照组)×100。

细胞凋亡检测

按照annexin V/FITC细胞凋亡试剂盒(碧云天)对细胞凋亡率进行检测。细胞染色后，使用流式细胞仪对早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、死亡细胞及正常细胞比例进行检测。

HT22细胞经过6″-O-琥珀酰大豆苷预处理及OGD/R后，进行细胞爬片，随后用含有0.15％曲拉通100的通透剂进行细胞通透。加入含有山羊血清的封闭液室温封闭1小时，之后加入一抗，4℃孵育过夜，次日取出，复温1小时后，PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加对应荧光二抗，37℃孵育1小时，PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加5μg/ml的hoechst溶液避光反应15分钟，PBS冲洗数次后，采用荧光显微镜观察相应蛋白的表达并拍照。

实验结果

梗死体积和神经评分

如图4所示，MCAO模型导致了模型组大鼠脑组织出现明显的脑梗死(白色区域)。与模型组相比，给予6″-O-琥珀酰大豆苷的动物其梗死体积明显减小(p<0.001)。此外，给药组动物的神经评分也被显著改善(p<0.001)。实验结果表明，6″-O-琥珀酰大豆苷能够有效减小脑缺血再灌注过程中的脑梗死体积，同时产生较强的神经保护作用，使卒中动物的行动能力得到改善。

SOD、MDA和GSHPx活性

如图5所示，与正常组动物相比，MCAO模型使大鼠血清中的SOD和GSHPx活性显著降低(p<0.001)，而MDA释放增加(p<0.001)。在给予6″-O-琥珀酰大豆苷后，MCAO大鼠血清中的SOD和GSHPx活性显著上调(p<0.001)，MDA释放减少(p<0.001)。说明6″-O-琥珀酰大豆苷具有调节体内抗氧化酶活性的能力。

ERK/Nrf2/HO-1信号通路

如图6所示，利用western blot检测大鼠海马组织中ERK/Nrf2/HO-1信号通路上的蛋白表达情况，结果发现6″-O-琥珀酰大豆苷能够显著上调p-ERK/ERK的表达水平(p<0.05)，并且下调Keap1的表达。同时，给药后海马组织中HO-1的表达被明显激活(p<0.05)。说明6″-O-琥珀酰大豆苷可以通过调节ERK/Nrf2/HO-1信号通路改善体内氧化水平，产生神经保护作用。

体外验证

如图7所示，通过在HT22细胞上建立OGD/R模型，在体外验证6″-O-琥珀酰大豆苷的神经保护机制。结果发现，6″-O-琥珀酰大豆苷预处理后，细胞存活率显著提高(p<0.001)，细胞凋亡率降低。p-ERK/ERK和HO-1的表达量在给药组中也上调的更加明显。虽然，总Nrf2在各组中差异不明显，但是核Nrf2在给药后显著上调。同时，免疫荧光的结果也证实，6″-O-琥珀酰大豆苷预处理能够促使Nrf2在细胞核内表达。结果说明6″-O-琥珀酰大豆苷能够上调p-ERK/ERK，使Nrf2发生核表达，激活HO-1，上调体内抗氧化酶活性，产生神经保护作用。

实施例8

片剂的制备

处方(以1000片的处方量计)：

实施例3中所得6″-O-琥珀酰大豆苷纯品 60g；

蔗糖 60g；

玉米淀粉 80g；

硬脂酸镁 2g。

制备方法：将活性成分与蔗糖、玉米淀粉混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。平均片重202mg/片，活性成分含量为60mg。

实施例9

注射液的制备

处方：(以1000支的处方量计)

实施例4中中所得6″-O-琥珀酰大豆苷纯品 10g；

丙二醇 100g；

注射用水加至1000ml。

将处方量的6″-O-琥珀酰大豆苷纯品纯品溶解于丙二醇中，加注射用水至1000ml，混合均匀，过滤，将所获得的溶液在无菌条件下分装于安瓿瓶中，制成1ml/瓶注射液，活性成分含量为10mg/mL。

实施例10

颗粒剂的制备

实施例5中所得6″-O-琥珀酰大豆苷纯品 80g；

甘露醇 80g；

蔗糖 320g；

玉米淀粉 80g；

羧甲基纤维素钠 32g；

10％淀粉浆适量

制备方法：将6″-O-琥珀酰大豆苷纯品、甘露醇、蔗糖、玉米淀粉、羧甲基纤维素钠分别过100目筛，按处方量称取、混匀、加10％淀粉浆制成软材，以14目筛制粒后，置70～80℃干燥后于12目筛整粒，分装即可。

实施例11

一种保护神经保健品胶囊的制备方法，包括如下步骤：

称取实施例5中所得6″-O-琥珀酰大豆苷纯品50g、白糊精32.4g和硬脂酸镁1.6g，充分均匀混合后，将所得混合原料灌装到空心胶囊壳中，每个空心胶囊壳中分别装入0.45g混合原料，制备得到一种保护神经保健品胶囊产品。

实施例12

一种保护神经保健食品的制备方法，包括如下步骤：

面粉与实施例5中所得6″-O-琥珀酰大豆苷纯品及其它辅料，充分搅拌混合后打浆，(如液体量不足，适量补水)，发泡，按需要形状置入不同的模具中，入烤箱烘烤，包装，即得成品。

Claims

1.6＇＇-O-琥珀酰大豆苷在制备用于神经保护药物中的应用，其特征在于: 6＇＇-O-琥珀酰大豆苷用于制备神经保护药物，所述的6＇＇-O-琥珀酰大豆苷具有下式（1）所示的结构：

（1）。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的神经保护药物包括活性成分为式（1）所示的6＇＇-O-琥珀酰大豆苷或其盐，以及药学上可接受的载体，制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述6＇＇-O-琥珀酰大豆苷盐指6＇＇-O-琥珀酰大豆苷与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸、烷基或芳基磺酸形成的盐。