CN112111498A

CN112111498A - 小麦旱敏基因TaANTHSYS1及其应用

Info

Publication number: CN112111498A
Application number: CN202010860470.0A
Authority: CN
Inventors: 王勐骋; 夏光敏
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2020-12-22

Abstract

本发明公开了一种小麦旱敏基因TaANTHSYS1和含有所述基因的植物基因编辑相关载体及其在培育耐旱植物中的应用。实验证明，通过根瘤农杆菌介导的方法将本发明所述基因转入小麦，获得的转基因植株的耐旱能力明显降低，证实本发明提供的基因可以作为基因编辑的靶点，进而通过基因编辑的方法获得抗旱小麦，具有广泛的应用前景。

Description

小麦旱敏基因TaANTHSYS1及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及小麦类黄酮合成相关基因及其在植物干旱过程中的作用，尤其涉及一种小麦旱敏基因TaANTHSYS1及其应用。

背景技术

干旱严重影响农作物产量，特别是随着工业的发展，淡水资源短缺愈来愈严重，使得干旱胁迫变成了一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而干旱灾害更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，培育抗旱作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因技术改良植物将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种，是一项具有广阔应用前景的技术。

目前，利用基因工程技术开展植物旱响应方面的研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于旱胁迫机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与旱响应相关的基因转入植物中，其转录和翻译产物可以使转基因植物的抗旱能力得到提高。

检索表明已发现了一些能显著改变植物抗旱能力的基因，但有关类黄酮合成相关基因在植物干旱过程中的作用报道较少，尤其是关于小麦旱敏基因TaANTHSYS1及其应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种小麦旱敏感基因——小麦基因TaANTHSYS1及其应用。

本发明的技术方案是：从小麦中分离得到小麦抗旱基因(小麦类黄酮合成相关基因)，命名为小麦旱敏基因TaANTHSYS1，然后将该基因转化到小麦中，进行转基因功能验证(控水表型分析)，以实现通过基因编辑的方法获得抗旱小麦和对有关小麦类黄酮合成相关基因的功能以及旱响应机理的研究。

本发明所述的小麦抗旱基因，其特征在于：所述基因命名为小麦旱敏基因TaANTHSYS1，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述小麦旱敏基因TaANTHSYS1的植物基因编辑或敲低相关载体。

本发明所述的小麦旱敏基因TaANTHSYS1或其相关的植物基因编辑或敲低载体在培育耐旱植物中的应用。

其中：所述植物优选是普通小麦。

本发明所述的小麦耐盐基因TaANTHSYS1可广泛用于培育抗旱农作物品种。

将本发明所述小麦旱敏基因TaANTHSYS1导入植物细胞，植物即可相应地降低抗旱能力。因而是通过基因编辑技术培育抗旱作为品种的重要靶点，为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaANTHSYS1的植物编辑载体进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

实际上，任何一种可以进行基因编辑的植物中表达的载体都可以应用。

本发明公开了一种小麦旱敏基因TaANTHSYS1及其应用，是利用现有的植物基因工程技术，首次克隆得到了小麦旱敏基因TaANTHSYS1，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入小麦，经过比较分析证明，本发明的转基因植株的抗旱能力明显降低，证实本发明提供的基因可以作为基因编辑的靶点，进而通过基因编辑的方法获得抗旱小麦，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：TaANTHSYS1基因全长cDNA序列的扩增结果

其中：M为λDNA/(BamH I+Sac I)Marker。

图2：渗透胁迫下小麦中TaANTHSYS1的实时定量PCR分析

其中：分析材料为山融3号小麦，分子组织为根。

图3：小麦TaANTHSYS1转基因植株的转基因基因组PCR和实时定量PCR检测

其中：A图为基因组PCR电泳图谱，验证了TaANTHSYS1整合到小麦基因组；B图为实时定量PCR结果，验证TaANTHSYS1在转基因株系中正常表达。CE1和CE2为两个独立的转基因株系；WT为野生型小麦；Genomic PCR为通过基因组PCR验证TaANTHSYS1整合到小麦基因组；RT-PCR为通过RT-PCR验证TaANTHSYS1在转基因株系中正常表达。基因组PCR结果显示，在转基因株系中能够扩增出TaANTHSYS1条带，而在野生型中不能扩增出条带，表明TaANTHSYS1整合到小麦基因组中。实时定量PCR结果显示，在转基因株系中能够检测出TaANTHSYS1的转录本，表明TaANTHSYS1在小麦中表达。

图4：控水条件下小麦幼苗的生长状况

转基因功能验证－抗旱表型分析，将野生型和过表达小麦种子点种在培养盆的土中(各培养盆中土量一致)，待小麦幼苗生长至3叶期后，开始控水，控水3周后，开始复水。数据表明，控水前对照条件下各株系的生长状态相似，而控水后转化TaANTHSYS1的转基因小麦的生长状态更差，表明TaANTHSYS1使植株的抗旱能力明显降低。其中，WT为野生型小麦；CE1-CE3为独立的转基因株系。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1、TaANTHSYS1的克隆和表达分析

1.1提取小麦Total RNA

1.将小麦组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4. 4℃，12000rpm离心15分钟；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min或过夜；

6. 4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7.RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤；4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNA Marker作为对照。

1.2 cDNA反转录

反转录酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

1. 12μl反应体系

2. 65℃变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer 4μl

0.1M DTT 2μl

RNaseOUT(Invitrogen) 1μl

3.轻轻混匀，37℃反应2min；

4.加入1μl M-MLV RT，混匀，37℃反应50min；

5.70℃温育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μl RNase H(Invitrogen)，37℃反应20min；

7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。

1.3开放阅读框的克隆和序列测定

1.引物序列：根据测序结果，相应设计基因上下游引物：ATGGCGCGGGTGGAGGCGCT和TCACTCTGCTCCTTCTTCAC，扩增基因的开放阅读框。

2.PCR反应体系(50μl)：

3.PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

4.扩增片段回收后与pMD-18T载体连接并转化大肠杆菌DH10B，测序由上海Invirtron公司完成。结果见图1。

1.4基因表达分析(实时定量PCR)

1.RNA的提取

山融3号小麦种子正常萌发，Hangload培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)开始施加盐胁迫(200mM NaCl或10mM H₂O₂)，处理0、1、6、12、24、48小时取幼嫩的叶片和根系提取RNA。

2.反转录(RT)产生cDNA

反转录产生cDNA，方法同上。

3.PCR反应及数据处理方法

(1)以cDNA为模板，进行PCR反应。

(2)PCR体系：

(3)PCR程序：

95℃5min；95℃10S，60℃10S，72℃20S，40个循环；65℃-95℃，每隔0.5℃作熔解曲线；10℃保存。

(4)利用熔解曲线判断产物单一性以及溶解温度，利用给出的Ct值采用ΔΔCt算法计算得到目的基因在不同样品中的相对含量。结果见图2。

实施例2、植物表达载体的构建

利用植物表达载体p3426，选用XbaI和BamHⅠ分别对p3426和含有目的基因的Blunt载体进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用T₄ DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。

1.双酶切，以p3426空载体和Blunt为例

碱裂解法提取p3426空载体和Blunt-T质粒，各取10μg酶切，酶切体系如下：

于30℃恒温水浴锅酶切2小时以上。双酶切后以1×TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下p3426载体大片段和Blunt的目的基因条带，回收该条带。

2.P3426质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。

3.经酶切和脱磷的p3426载体片段和Blunt双酶切回收片段以摩尔比1:4的比例进行连接，16℃过夜。

4.利用热激法将连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，转化菌在含50μg/mlKan的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

5.重组子的鉴定

(1)质粒的PCR验证

挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR扩增。

PCR反应条件：预变性94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

(2)质粒酶切鉴定

提质粒进行XbaI和BamHI双酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

实施例3、农杆菌感受态的制备与转化

3.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备

1.从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于YEP液体培养基(含50μg/ml利福平)中，200rpm/min，28℃培养过夜。

2.取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

3.菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

4.将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

5.再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl₂溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

3.2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105

1.在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min。

2.置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

3.加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3小时。

4. 7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

3.3菌体PCR鉴定

挑取2.4的单菌落转移到如前所述的PCR体系(不加DNA模板)中，用基因特异引物进行PCR扩增。

实施例4、转基因功能验证－小麦转化筛选

4.1小麦种植

小麦种子70％乙醇中浸泡5min，洗涤10-15min，无菌水冲洗4次，放置到培养皿滤纸上，在人工气候室正常光照条件下萌发至胚芽2-3cm。

4.2小麦转化

1.利用农杆菌介导的小麦苗端转化法转化。

2.侵染农杆菌的小麦幼苗春化一定时间后，转移到人工气候室培养至结实。

4.3小麦转化阳性株系筛选

1.PCR扩增以转化株系的基因组DNA为模板，使用基因特异引物：GCGAGCCTTGCCGTCGTTGA和TCCCACTCCCTCTTCCCGTCCT，进行基因组PCR，鉴定阳性克隆。结果见图3A。

2.按照上述方法提取RNA，进行实时定量PCR分析，鉴定转基因的表达情况。结果见图3B。

实施例5、转基因功能验证－抗旱表型分析

1.将野生型和过表达小麦种子点种在培养盆的土中(各培养盆中土量一致)，待小麦幼苗生长至3叶期后，开始控水，控水3周后，开始复水。

2.在控水前、控水后和复水后分别拍照。结果见图4。

经过比较分析证明，转基因植株的抗旱能力明显降低，证实本发明的基因可以通过基因编辑的方法获得抗旱小麦。

序列表

<110>山东大学

<120>小麦旱敏基因TaANTHSYS1及其应用

<141>2020-08-24

<160>1

<210>1

<211>1182

<212>cDNA

<213>小麦（Triticum aestivum L.）

<221>小麦旱敏基因TaANTHSYS1的核苷酸序列

<222>（1）…（1182）

<400> 1

atggcgcggg tggaggcgct gagcatgagc ggcgcgacgg cgatcccggc ggagtacgtg 60

cggccgcagg aggagcgcca gggcctgggc gacgcctacg ccgaggcggc ggcctgctgg 120

tccgcggcgg gctcccctcg aatccccatc gtcgacgtgg ccgccttcga cgccgcggac 180

ccggcctccc cagcgagcct tgccgtcgtt gacgccgtgc gcgccgccgc ggaggactgg 240

ggcgtcatgc acctggccgg ccacggcatc ccggaggacc tcatcgatgc actgcgcggc 300

gccggcacgg ggttcttccg catgccgatc gaggacaagg aggcctacgc caacgacccg 360

atggcgggga ggttggaggg gtacggcagc cggctcgccg gatccgccgg cgaggacggg 420

aagagggagt gggaggacta cctgttgcac atgctccacc ccgacgcccg cgccgaccac 480

gcgctctggc cggcgcaccc gcccgagtac gtgcccgtca ccaagagctt cggggagcac 540

gtgagcgcgc tctcgtcccg gctcctcgcc atcctctccc tcgggctcgg cgtccaggcc 600

ggcaccctcg agcgccgcct ccgcctcacc tccggcgagg cccaggtgga ggacgacctg 660

ctgctgaagc tcaagatcaa ctactacccg aggtgcccgc agccggagct ggccgtgggc 720

gtggaggcgc acaccgacgt ctccgcgctc tccttcatcc tcaccaacgg cgtgccgggc 780

ctgcaggtcc tccgtcccgg cgacggccag acctgggtca ccgcgcgtga cgagccgggc 840

acgctcgtgg tccacgtcgg cgacgcgctg gagatcctca gcaacgggcg ctacaccagc 900

gtgctccacc gcgtgctcgt caaccggcag gccgtgcgag tctcctgggt cgtcttcgcc 960

cagccgccgc ccgactccgt gctgctgcgc ccgctgccgg agctcgtcca aggggatggc 1020

gccgagacgc cgcgcttcga accgcgcacc ttcaggcagc agctcgagcg caaggtcctc 1080

aagaagacga atgatcaaca agaggacgag gttaagaagc agccggtcgc cgccggtcgt 1140

cggcgaggag gagcagaagg tcgtgaagaa ggagcagagt ga 1182

Claims

1.一种小麦类黄酮合成相关基因，其特征在于：所述基因命名为小麦旱敏基因TaANTHSYS1，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述小麦旱敏基因TaANTHSYS1的植物基因编辑或敲低相关载体。

3.权利要求1所述的小麦旱敏基因TaANTHSYS1在培育耐旱植物中的应用。

4.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述植物是普通小麦。

5.权利要求2所述植物基因编辑或敲低相关载体在培育耐旱植物中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述植物是普通小麦。