CN112111461B - 一种单细胞分选构建单克隆抗体高产株细胞工作库的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于杂交瘤细胞培养技术领域，具体涉及一种单细胞分选构建单克隆抗体高产株细胞工作库的方法，对杂交瘤细胞进行单细胞分选，并在分选过程中加入BAFF和IL4。本发明采用单细胞分选与刺激结合，在单细胞分选过程中加入BAFF和IL4促进B细胞的繁殖和单抗分泌，通过单细胞分选刺激后单抗产量最高的杂交瘤细胞单克隆细胞，并对单克隆细胞进行扩增繁殖，公司成功翻新了老化的杂交瘤细胞，新构建的高产株细胞的抗体产量可达到50‑100mg/L以上。
Description
技术领域
本发明属于杂交瘤细胞培养技术领域，具体涉及一种单细胞分选构建单克隆抗体高产株细胞工作库的方法。
背景技术
杂交瘤细胞(hybridoma)是用骨髓瘤细胞和单克隆的B细胞融合成的细胞，其融合细胞既具有骨髓瘤细胞无限复制的能力，也具有成熟的单克隆B浆细胞不断分泌单克隆抗体的功能。抗体工业生产上利用这种融合细胞进行单克隆抗体的规模化生产，这种融合细胞被称为杂交瘤细胞。
但是，杂交瘤细胞随着传代次数的增多以及细胞的衰老，其单抗分泌的产量会逐渐降低，严重影响了单克隆抗体的生产。
发明内容
本发明的目的之一是提供BAFF的新用途，用于刺激杂交瘤细胞的繁殖，抑制杂交瘤细胞的老化。
作为优选，BAFF与IL4共同使用，用于刺激杂交瘤细胞的繁殖，抑制杂交瘤细胞的老化。
本发明的目的之二是提供IL4的新用途，用于刺激杂交瘤细胞的繁殖，抑制杂交瘤细胞的老化。
作为优选，IL4与BAFF共同使用，用于刺激杂交瘤细胞的繁殖，抑制杂交瘤细胞的老化。
本发明的目的之三是提供构建单克隆抗体高产株细胞工作库的新方法，翻新了老化的杂交瘤细胞，新构建的高产株细胞的抗体产量可达到100mg/L，最高可达到500mg/L以上。
本发明采用如下的技术方案：
一种单细胞分选构建单克隆抗体高产株细胞工作库的方法，包括如下步骤：
对杂交瘤细胞进行单细胞分选，并在分选过程中加入BAFF和 IL4。
作为优选，BAFF的加入量为100ng/ml～1mg/ml。
进一步优选为500ng/ml。
作为优选，IL4的加入量为10ng/ml-500ng/ml。
进一步优选为20ng/ml。
具体操作步骤包括：
(1)获取杂交瘤细胞；
(2)将事先培养好的老化杂交瘤细胞进行计数，按计数结果将细胞稀释成单细胞后，加入含BAFF、IL4培养液进行刺激培养；
(3)培养4-5天后进行换液，继续培养2-3天；
(4)培养2-3天后，进行单细胞检测；
(5)对于单细胞检测阳性的细胞株，用10％FBS RPMI进行扩增，建立筛选后单克隆主细胞库。
通过实施上述技术方案，本发明具有如下的有益效果：
本发明提供了BAFF的新用途，扩大了其使用范围。
本发明提供了IL4的新用途，扩大了其使用范围。
本发明采用单细胞分选与刺激结合，在单细胞分选过程中加入 BAFF和IL4促进B细胞的繁殖和单抗分泌，通过单细胞分选刺激后单抗产量最高的杂交瘤细胞单克隆细胞，并对单克隆细胞进行扩增繁殖，公司成功翻新了老化的杂交瘤细胞，新构建的高产株细胞的抗体产量可达到100mg/L，最高可达到500mg/L以上。
附图说明
图1为未翻新的抗人CD3[克隆号:OKT3]杂交瘤细胞株生产的抗体产量，50ml杂交瘤细胞无血清培养上清中纯化的抗体为0.94mg，产量为18.8mg/L。
图2为翻新后的抗人CD3[克隆号:OKT3]杂交瘤细胞株生产的抗体产量，50ml杂交瘤细胞无血清培养上清中纯化的抗体为 16.501mg，翻新后细胞产量为330mg/L。
图3为未翻新后的抗人CD4[克隆号:OKT4]杂交瘤细胞株生产的抗体产量，50ml杂交瘤细胞无血清培养上清中纯化的抗体为 1.448mg，产量为28.96mg/L。
图4为翻新后的抗人CD4[克隆号:OKT4]杂交瘤细胞株生产的抗体产量，50ml杂交瘤细胞无血清培养上清中纯化的抗体为 25.908mg，产量为518.16mg/L。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：
一种单细胞分选构建单克隆抗体高产株细胞工作库的方法，以抗人CD3[克隆号:OKT3]为例，包括：
1.杀死小鼠：用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净镊子夹住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜，用巴氏管向腹腔内加5ml(10％FBS RPMI)培养基，吹打几次，吸出培养基，吸出的培养基里即含有腹腔巨噬细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞500G离心5min，去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基(用于刚融合的细胞需要加HAT，用于克隆化的细胞需要加HT)，用移液枪反复吹打均匀，可用血球计数板计数(一般一只老鼠的腹腔巨噬细胞约为3*10^6个)。根据计数的结果将巨噬细胞稀释到合适的浓度(以96孔板为例，平均每孔含1*10^4 个巨噬细胞为宜)。稀释好后，用移液枪吸取饲养层细胞按100ul滴到96孔板(平均每只老鼠的腹腔巨噬细胞可铺两至三块96孔板)，静置培养一天。
2.将事先培养好需要的老化杂交瘤细胞进行计数，按计数结果将细胞稀释(按10倍逐次进行稀释，减小误差)成单细胞，另取一个15ml离心管，加入10ml(10％FBS RPMI1640,100ng/ml重组 BAFF,20ng/ml重组IL4)培养液进行刺激培养。按稀释结果将细胞接种到10ml离心管中，使离心管中的细胞总数量为80个细胞左右。将离心管中的细胞混匀，按每孔100ul加满96孔板静置培养4-5天。每天对细胞进行计数观察。
3.培养4天后对96孔板进行换液，用移液枪将96孔板中的上清液吸取(尽量不要吸到底层细胞)，然后按每孔100ul进行换液。继续培养3天。每天对细胞进行计数观察。
4.培养2天后，用记号笔对有细胞生长的孔进行标记，用移液枪将标记的孔的上清液吸取100ul至1.5ml离心管中，一一对应，并吸取2个无细胞生长的孔的上清液作为阴性对照，进行流式细胞仪的检测。
5.对于单细胞检测阳性的细胞株，用10％FBS RPMI进行扩增，建立筛选后单克隆主细胞库，再对该主细胞库进行复苏，CD培养基适应后建立工作库，通过工作库进行无血清培养生产的单抗产量较未通过B细胞因子刺激及单细胞分选构建前的产量提高10-50倍，并且新建立的工作库细胞传代后抗体产量表现稳定。
实施例2：
一种单细胞分选构建单克隆抗体高产株细胞工作库的方法，以抗人CD3[克隆号:OKT3]为例，包括：
1.杀死小鼠：用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净镊子夹住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜，用巴氏管向腹腔内加5ml(10％FBS RPMI)培养基，吹打几次，吸出培养基，吸出的培养基里即含有腹腔巨噬细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞500G离心5min，去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基(用于刚融合的细胞需要加HAT，用于克隆化的细胞需要加HT)，用移液枪反复吹打均匀，可用血球计数板计数(一般一只老鼠的腹腔巨噬细胞约为3*10^6个)。根据计数的结果将巨噬细胞稀释到合适的浓度(以96孔板为例，平均每孔含1*10^4 个巨噬细胞为宜)。稀释好后，用移液枪吸取饲养层细胞按100ul滴到96孔板(平均每只老鼠的腹腔巨噬细胞可铺两至三块96孔板)，静置培养一天。
2.将事先培养好需要的老化杂交瘤细胞进行计数，按计数结果将细胞稀释(按10倍逐次进行稀释，减小误差)成单细胞，另取一个15ml离心管，加入10ml(10％FBS RPMI1640,500ng/ml重组 BAFF,10ng/ml重组IL4)培养液进行刺激培养。按稀释结果将细胞接种到10ml离心管中，使离心管中的细胞总数量为80个细胞左右。将离心管中的细胞混匀，按每孔100ul加满96孔板静置培养4-5天。每天对细胞进行计数观察。
3.培养4-5天后对96孔板进行换液，用移液枪将96孔板中的上清液吸取(尽量不要吸到底层细胞)，然后按每孔100ul进行换液。继续培养2-3天。每天对细胞进行计数观察。
4.培养2-3天后，用记号笔对有细胞生长的孔进行标记，用移液枪将标记的孔的上清液吸取100ul至1.5ml离心管中，一一对应，并吸取2个无细胞生长的孔的上清液作为阴性对照，进行流式细胞仪的检测。
5.对于单细胞检测阳性的细胞株，用10％FBS RPMI进行扩增，建立筛选后单克隆主细胞库，再对该主细胞库进行复苏，CD培养基适应后建立工作库，通过工作库进行无血清培养生产的单抗产量较未通过B细胞因子刺激及单细胞分选构建前的产量提高10-50倍，并且新建立的工作库细胞传代后抗体产量表现稳定。
实施例3：
一种单细胞分选构建单克隆抗体高产株细胞工作库的方法，以抗人CD3[克隆号:OKT3]为例，包括：
1.杀死小鼠：用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净镊子夹住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜，用巴氏管向腹腔内加5ml(10％FBS RPMI)培养基，吹打几次，吸出培养基，吸出的培养基里即含有腹腔巨噬细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞500G离心5min，去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基(用于刚融合的细胞需要加HAT，用于克隆化的细胞需要加HT)，用移液枪反复吹打均匀，可用血球计数板计数(一般一只老鼠的腹腔巨噬细胞约为3*10^6个)。根据计数的结果将巨噬细胞稀释到合适的浓度(以96孔板为例，平均每孔含1*10^4 个巨噬细胞为宜)。稀释好后，用移液枪吸取饲养层细胞按100ul滴到96孔板(平均每只老鼠的腹腔巨噬细胞可铺两至三块96孔板)，静置培养一天。
2.将事先培养好需要的老化杂交瘤细胞进行计数，按计数结果将细胞稀释(按10倍逐次进行稀释，减小误差)成单细胞，另取一个15ml离心管，加入10ml(10％FBS RPMI1640,500ng/ml重组 BAFF,20ng/ml重组IL4)培养液进行刺激培养。按稀释结果将细胞接种到10ml离心管中，使离心管中的细胞总数量为80个细胞左右。将离心管中的细胞混匀，按每孔100ul加满96孔板静置培养4-5天。每天对细胞进行计数观察。
3.培养4-5天后对96孔板进行换液，用移液枪将96孔板中的上清液吸取(尽量不要吸到底层细胞)，然后按每孔100ul进行换液。继续培养2-3天。每天对细胞进行计数观察。
4.培养2-3天后，用记号笔对有细胞生长的孔进行标记，用移液枪将标记的孔的上清液吸取100ul至1.5ml离心管中，一一对应，并吸取2个无细胞生长的孔的上清液作为阴性对照，进行流式细胞仪的检测。
5.对于单细胞检测阳性的细胞株，用10％FBS RPMI进行扩增，建立筛选后单克隆主细胞库，再对该主细胞库进行复苏，CD培养基适应后建立工作库，通过工作库进行无血清培养生产的单抗产量较未通过B细胞因子刺激及单细胞分选构建前的产量提高10-50倍，并且新建立的工作库细胞传代后抗体产量表现稳定，如附图2所示。
实施例4：
一种单细胞分选构建单克隆抗体高产株细胞工作库的方法，以抗人CD4[克隆号:OKT4]为例，包括：
1.杀死小鼠：用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净镊子夹住腹膜，用另一把镊子捅破腹膜，用巴氏管向腹腔内加5ml(10％FBS RPMI)培养基，吹打几次，吸出培养基，吸出的培养基里即含有腹腔巨噬细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞500G离心5min，去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基(用于刚融合的细胞需要加HAT，用于克隆化的细胞需要加HT)，用移液枪反复吹打均匀，可用血球计数板计数(一般一只老鼠的腹腔巨噬细胞约为3*10^6个)。根据计数的结果将巨噬细胞稀释到合适的浓度(以96孔板为例，平均每孔含1*10^4 个巨噬细胞为宜)。稀释好后，用移液枪吸取饲养层细胞按100ul滴到96孔板(平均每只老鼠的腹腔巨噬细胞可铺两至三块96孔板)，静置培养一天。
2.将事先培养好需要的老化杂交瘤细胞进行计数，按计数结果将细胞稀释(按10倍逐次进行稀释，减小误差)成单细胞，另取一个15ml离心管，加入10ml(10％FBS RPMI1640,500ng/ml重组 BAFF,20ng/ml重组IL4)培养液进行刺激培养。按稀释结果将细胞接种到10ml离心管中，使离心管中的细胞总数量为80个细胞左右。将离心管中的细胞混匀，按每孔100ul加满96孔板静置培养4-5天。每天对细胞进行计数观察。
3.培养4-5天后对96孔板进行换液，用移液枪将96孔板中的上清液吸取(尽量不要吸到底层细胞)，然后按每孔100ul进行换液。继续培养2-3天。每天对细胞进行计数观察。
4.培养2-3天后，用记号笔对有细胞生长的孔进行标记，用移液枪将标记的孔的上清液吸取100ul至1.5ml离心管中，一一对应，并吸取2个无细胞生长的孔的上清液作为阴性对照，进行流式细胞仪的检测。
5.对于单细胞检测阳性的细胞株，用10％FBS RPMI进行扩增，建立筛选后单克隆主细胞库，再对该主细胞库进行复苏，CD培养基适应后建立工作库，通过工作库进行无血清培养生产的单抗产量较未通过B细胞因子刺激及单细胞分选构建前的产量提高10-50倍，并且新建立的工作库细胞传代后抗体产量表现稳定，如附图4所示。
对比例1：
与实施例3的不同在于，不进行单细胞分选，不加入BAFF和IL4 的老化杂交瘤细胞株(抗人CD3[OKT3])扩增后通过50ml无血清培养基培养后抗体纯化产量如附图1所示。
对比例2：
与实施例4的不同在于，不进行单细胞分选，不加入BAFF和IL4 的老化杂交瘤细胞株(抗人CD3[OKT3])扩增后通过50ml无血清培养基培养后抗体纯化产量如附图3所示。
上述实施例的细胞培养及抗体纯化(翻新及未翻新杂交瘤细胞培养纯化流程)步骤(参照申请号为“201811187760.2”、专利名称为“利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法及其生产的单克隆抗体”的专利申请):
将杂交瘤细胞置于含20％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中复苏后，进行传代培养和扩大培养；
具体地，先将杂交瘤细胞置于含20％(体积分数)胎牛血清的 RPMI完全培养基中，将培养皿置于5％CO、37℃培养箱内培养，待杂交瘤细胞复苏后完成一次传代，培养过程(3天)中每天进行细胞计数；
然后，将细胞密度生长至1×106个/mL左右或颜色变为橙黄色时的培养液转移至15ml离心管内，4℃下1500rpm离心5min，去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含20％胎牛血清的RPMI完全培养基内，并将细胞重悬液转移至T-25细胞培养瓶中，用含20％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至120mL；将T-25细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(3 天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(2)将杂交瘤细胞转移至置于含10％(体积分数)胎牛血清的 RPMI完全培养基中，进行扩大培养；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-25细胞培养瓶中的120mL培养液转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，然后去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含10％胎牛血清的RPMI完全培养基中；并将细胞重悬液转移至T-75细胞培养瓶中，用含10％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至540mL；将T-75细胞培养瓶置于5％CO、37℃培养箱内培养，培养过程(5天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(3)将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养，进行单克隆抗体的生产；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-75细胞培养瓶中的培养液分次转移至50ml离心管内， 4℃1500rpm离心5min，去掉细胞上层清液，用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在装有50ml无血清CD-hybridoma培养基的125ml 细胞培养摇瓶内，将摇瓶放置于5％CO、37℃，100rpm培养箱内培养，进行单克隆抗体的生产；抗体生产周期为10天，在第11天收集培养液用于下一步抗体纯化(采用通用公司的AKTA设备和Mabselect Protein A的柱子进行亲和层析，以纯化抗体，下同)。
Claims (4)
1.BAFF与IL4的用途，其特征在于，BAFF与IL4共同使用，用于刺激杂交瘤细胞的繁殖，抑制杂交瘤细胞的老化，BAFF的加入量为100ng/ml~1mg/ml，IL4的加入量为10ng/ml-500ng/ml。
2.一种单细胞分选构建单克隆抗体细胞工作库的方法，其特征在于，包括如下步骤：对杂交瘤细胞进行单细胞分选，并在分选过程中加入BAFF和IL4，BAFF的加入量为100ng/ml~1mg/ml，IL4的加入量为10ng/ml-500ng/ml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，BAFF的加入量为500ng/ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，IL4的加入量为20 ng/ml。
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Denomination of invention: A method for constructing a high-yield monoclonal antibody cell library through single-cell sorting Granted publication date: 20220830 Pledgee: Deqing sub branch of Bank of China Ltd. Pledgor: Zhejiang Zhengxi Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2024980010535 |