CN112111455B - 一种体外人工类反射弧结构及其构建方法和应用 - Google Patents

一种体外人工类反射弧结构及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种体外人工类反射弧结构及其构建方法和应用，属于组织工程技术领域。本发明结合基于微接触印刷的微蛋白图案法的高结构精度以及培养的突触连接形成稳定的优点来体外构建得到神经元网络结构清晰、信号传播可靠性高的体外人工类反射弧结构；利用单向阈门单元微蛋白掩模图案约束及引导神经元轴突伸展，使得体外人工类反射弧结构内的信号传播的阈值和方向可控；采用微型机械臂进行微接触印刷，降低了对操作手法的要求且蛋白图案成形稳定；利用单向阈门单元微蛋白掩模图案允许较密集的神经元细胞群生长的特点，在培养时无需加入额外的神经胶质细胞层用作神经元的营养支撑层，大大降低了体外人工类反射弧结构的培养要求并简化了培养流程。

Description

一种体外人工类反射弧结构及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种体外人工类反射弧结构及其构建方法和应用。
背景技术
人或各类脊椎动物具有一些与生俱来的非条件反射，如刺激角膜引起眨眼反射、经典的膝跳反射以及瞳孔遇光收缩等。从物种进化的角度来看，这些非条件反射是人类及各类脊椎动物能得以延续的重要条件。因此，研究非条件反射的载体—反射弧的发育形成过程中的形态和功能变化，对理解非条件反射的工作机理及高可靠性的结构基础具有重要意义。
目前，反射弧研究主要是基于活体动物模型做侵入式测量，其弊端包括：侵入操作会影响反射弧周边肌肉群或神经活动，进而影响反射弧功能及电生理反应，无法进行长期研究。因此，体外构建孤立且完整的反射弧结构，对长期且稳定的反射弧研究、药理反应及反射弧退化相关疾病等具有十分重要的意义。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种体外人工类反射弧结构及其构建方法和应用，本发明提供的方法能够在人或各类脊椎动物的体外构建得到具有神经元网络结构清晰、信号传播可靠性高、反射弧内信号传播的阈值及方向可控优点的人工类反射弧结构，能够作为研究反射弧形成过程、药理及电生理测试的体外模型。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种体外人工类反射弧结构的构建方法，包括以下步骤：
(1)在基底表面直流磁控溅射形成氮化铬薄膜，在所述氮化铬薄膜表面形成光刻胶层，得到匀胶铬版；
对所述匀胶铬版的光刻胶层依次进行激光直写和显影，生成单向阈门单元微蛋白掩模图案，得到母版；所述单向阈门单元微蛋白掩模图案包括顺次连接的传入神经群生长部分、轴突伸展连接部分和传出神经群生长部分；
(2)在所述步骤(1)得到的母版有图案一面加入包含硅橡胶预聚物和固化剂的混合物，进行固化，得到硅橡胶微印刷版；
(3)将多电极阵列培养皿进行等离子处理后加入琼脂糖水溶液进行表面改性，得到改性多电极阵列培养皿；
(4)通过微型机械臂将所述步骤(2)得到的硅橡胶微印刷版置于粘性蛋白液中浸泡后取出，微接触印刷于所述步骤(3)得到的改性多电极阵列培养皿的表面，得到含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿；
(5)在所述步骤(4)得到的含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿中加入感觉神经元悬浮液和神经基础培养液，进行培养，得到体外人工类反射弧结构；
所述步骤(1)与步骤(3)、步骤(2)与步骤(3)之间没有时间顺序限制。
优选的，步骤(1)中，所述氮化铬薄膜的厚度为90～110nm；
所述光刻胶层的厚度为10～15μm。
优选的，步骤(1)中，所述激光直写的条件包括：激光占空比为20～50％，激光功率为5～30mW。
优选的，步骤(2)中，所述硅橡胶预聚物和固化剂的质量比为(5～15)：1；
所述固化的温度为50～70℃，时间为2～5h。
优选的，步骤(3)中，所述琼脂糖水溶液的浓度为0.1～0.5w/v％。
优选的，步骤(4)中，所述粘性蛋白液包括ECM凝胶、纤连蛋白、聚赖氨酸和汉克平衡盐缓冲溶液；所述粘性蛋白液中，ECM凝胶的浓度为1.5～2.5wt％，纤连蛋白的浓度为8～12μg/mL，聚赖氨酸的浓度为45～55μg/mL。
优选的，步骤(4)中，所述微接触印刷的压力为450～550g，时间为15～25min。
优选的，步骤(5)中，所述感觉神经元悬浮液的浓度为(5～50)×104个/mL；
所述培养的时间为5～7天。
本发明提供了上述技术方案所述构建方法得到的体外人工类反射弧结构，传入神经群的轴突通过轴突伸展连接部分连接至传出神经群部分形成单向连通的神经元网络。
本发明还提供了上述技术方案所述体外人工类反射弧结构作为反射弧形成过程研究、药理测试或电生理测试用体外模型的应用。
本发明提供了一种体外人工类反射弧结构的构建方法，包括以下步骤：(1)在基底表面直流磁控溅射形成氮化铬薄膜，在所述氮化铬薄膜表面形成光刻胶层，得到匀胶铬版；对所述匀胶铬版的光刻胶层依次进行激光直写和显影，生成单向阈门单元微蛋白掩模图案，得到母版；所述单向阈门单元微蛋白掩模图案包括顺次连接的传入神经群生长部分、轴突伸展连接部分和传出神经群生长部分；(2)在所述步骤(1)得到的母版有图案一面加入包含硅橡胶预聚物和固化剂的混合物，进行固化，得到硅橡胶微印刷版；(3)将多电极阵列培养皿进行等离子处理后加入琼脂糖水溶液进行表面改性，得到改性多电极阵列培养皿；(4)通过微型机械臂将所述步骤(2)得到的硅橡胶微印刷版置于粘性蛋白液中浸泡后取出，微接触印刷于所述步骤(3)得到的改性多电极阵列培养皿的表面，得到含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿；(5)在所述步骤(4)得到的含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿中加入感觉神经元悬浮液和神经基础培养液，进行培养，得到体外人工类反射弧结构；所述步骤(1)与步骤(3)、步骤(2)与步骤(3)之间没有时间顺序限制。在本发明中，采用微接触印刷的微蛋白图案具有高结构精度，培养的轴突伸展稳定性好，本发明结合基于微接触印刷以及培养的轴突伸展，构建了体外人工类反射弧结构，得到的体外人工类反射弧结构具有神经元网络结构清晰以及信号传播可靠性高优点；利用单向阈门单元微蛋白掩模图案约束及引导神经元轴突伸展，具有调节蛋白图案，进而使得体外人工类反射弧结构内的信号传播阈值和传播方向可控；采用微型机械臂粘接硅橡胶微印刷版来进行微接触印刷操作，具有对操作手法要求低及蛋白图案成形稳定的优点；本发明利用的单向阈门单元微蛋白掩模图案允许较密集的神经元细胞群生长，在培养时无需加入额外的神经胶质细胞层用作神经元的营养支撑层，大大降低了体外人工类反射弧结构的培养要求，并简化了培养流程。
本发明提供了上述技术方案所述构建方法得到的体外人工类反射弧结构。本发明提供的体外人工类反射弧结构具有神经元网络结构清晰、信号传播可靠性高、反射弧内信号传播的阈值及方向可控优点，能够作为研究反射弧形成过程、药理及电生理测试的体外模型。
附图说明
图1为单向阈门单元微蛋白掩模图案，其中，a为高阈值传播单元的蛋白图案，b中阈值为传播单元的蛋白图案，c为低阈值传播单元的蛋白图案；
图2为硅橡胶微印刷版的制作流程图；
图3为微接触印刷原理图；
图4为在改性多电极阵列培养皿上培养神经元的结构示意图；
图5为微接触蛋白印刷及神经元培养流程图；
图2～5中，1-苏打玻璃基板，2-氮化铬涂层，3-光刻胶层，4-SYLGARD184，5-硅橡胶微印刷版，6-粘性蛋白溶液，7-琼脂糖涂层，8-改性多电极阵列的培养皿，9-微蛋白图案，10-多电极阵列的圆形触点，11-多电极阵列的底座，12-解剖得到的感觉神经元，13-伸展出轴突的感觉神经元。
具体实施方式
本发明提供了一种体外人工类反射弧结构的构建方法，包括以下步骤：
(1)在基底表面直流磁控溅射形成氮化铬薄膜，在所述氮化铬薄膜表面形成光刻胶层，得到匀胶铬版；
对所述匀胶铬版的光刻胶层依次进行激光直写和显影，生成单向阈门单元微蛋白掩模图案，得到母版；所述单向阈门单元微蛋白掩模图案包括顺次连接的传入神经群生长部分、轴突伸展连接部分和传出神经群生长部分；
(2)在所述步骤(1)得到的母版有图案一面加入包含硅橡胶预聚物和固化剂的混合物，进行固化，得到硅橡胶微印刷版；
(3)将多电极阵列培养皿进行等离子处理后加入琼脂糖水溶液进行表面改性，得到改性多电极阵列培养皿；
(4)通过微型机械臂将所述步骤(2)得到的硅橡胶微印刷版置于粘性蛋白液中浸泡后取出，微接触印刷于所述步骤(3)得到的改性多电极阵列培养皿的表面，得到含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿；
(5)在所述步骤(4)得到的含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿中加入感觉神经元悬浮液和神经基础培养液，进行培养，得到体外人工类反射弧结构；
所述步骤(1)与步骤(3)、步骤(2)与步骤(3)之间没有时间顺序限制。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明在基底表面直流磁控溅射形成氮化铬薄膜，在所述氮化铬薄膜表面形成光刻胶层，得到匀胶铬版。
本发明对于所述基底的种类没有特殊限定，采用本领域技术任何熟知的表面平整的基底即可，具体如苏打玻璃或硅片。
在本发明中，所述直流磁控溅射的工作条件包括：溅射气压优选为0.3～0.7Pa，更优选为0.4～0.6Pa，最优选为0.5Pa；靶电压优选为400～600V，更优选为450～550V，最优选为500V；靶电流密度优选为8～12mA/cm2，更优选为9～11mA/cm2，最优选为10mA/cm2；本发明对于所述直流磁控溅射的时间没有特殊限定，使得所得氮化铬薄膜的厚度为90～110nm即可，所述氮化铬薄膜的更优选为95～105nm，最优选为100nm；所述氮化铬薄膜的厚度太小会影响激光直写的精度，厚度太大会提高成本。
在本发明中，所述光刻胶层优选为将光刻胶涂覆在所述氮化铬薄膜表面、静置和干燥得到。在本发明中，所述涂覆的方式优选为旋涂；所述旋涂优选利用旋涂机进行；所述旋涂机的转速优选为1400～1600r/min，更优选为1450～1550r/min，最优选为1500r/min；所述旋涂的时间优选为15～25s，更优选为18～22s，最优选为20s。在本发明中，所述静置的温度优选为室温；时间优选为20～40min，更优选为30min。在本发明中，所述干燥的温度优选为60～80℃，更优选为65～75℃，最优选为70℃；时间优选为1～4h，更优选为2～3h。
在本发明中，所述光刻胶层的厚度优选为10～15μm，更优选为11～14μm，最优选为12～13μm。本发明对于所述光刻胶的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的光刻胶即可；在本发明的实施例中，所述光刻胶优选为AZ 4562光刻胶。
得到匀胶铬版后，本发明对所述匀胶铬版的光刻胶层依次进行激光直写和显影，生成单向阈门单元微蛋白掩模图案，得到母版；所述单向阈门单元微蛋白掩模图案包括顺次连接的传入神经群生长部分、轴突伸展连接部分和传出神经群生长部分。
所述激光直写前，本发明优选还包括对所述匀胶铬版进行切割，得到小块匀胶铬版。在本发明中，所述小块匀胶铬版的形状优选为方形，所述小块匀胶铬版的尺寸优选为20～30mm，更优选为25mm。
在本发明中，所述单向阈门单元微蛋白掩模图案优选经绘制得到。在本发明中，所述绘制优选利用AutoCAD软件进行。在本发明中，所述传入神经群生长部分和传出神经群生长部分的形状优选为矩形。在本发明中，所述轴突伸展连接部分的形状优选为漏斗形。在本发明中，所述轴突伸展连接部分与传入神经群生长部分的连接处(即粗段)较粗，所述轴突伸展连接部分与传出神经群生长部分的连接处(即细段)较细，以此约束轴突的伸张方向。在本发明中，所述粗段的最大宽度优选为10～30μm，更优选为20μm；所述细段的宽度优选为2～5μm，更优选为3～4μm。在本发明中，传播阈值可以通过改变轴突伸展连接部分的粗段和细段的宽度参数来改变，当传入神经群的神经活动达到传播阈值后，经过轴突传播到传出神经群，引起大规模的放电活动，而传出神经群由于轴突伸展连接部分的结构约束，缺乏投射至传入神经群的轴突，因此传出神经群的神经活动不会传入传入神经群，以上结构构成了单向阈门单元，即为人工类反射弧结构的神经传导基础结构。
在本发明中，所述单向阈门单元微蛋白掩模图案优选包括高阈值传播单元的蛋白图案(粗段最大宽度为15μm)、中阈值传播单元的蛋白图案(粗段最大宽度为30μm)或低阈值传播单元的蛋白图案(粗段最大宽度为50μm)，如图1所示，方向均为从左向右，其中，a为高阈值传播单元的蛋白图案，b中阈值为传播单元的蛋白图案，c为低阈值传播单元的蛋白图案。
在本发明中，所述激光直写优选在掩模生成器中的真空夹持平台上进行，本发明对于所述掩模生成器没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的掩模生成器即可，具体如μPG 101(德国Heidelberg)。
在本发明中，所述激光直写的条件包括：激光占空比优选为20～50％，更优选为30～40％；所述激光直写的激光功率优选为5～30mW，更优选为10～20mW。本发明通过控制激光直写的占空比和激光功率，有利于后续显影后的目标区域完全穿透且边界区域清晰光滑。
在本发明中，所述显影的温度优选为室温；时间优选为5～8min，更优选为6～7min。本发明对于所述显影采用的显影剂的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的显影剂即可；在本发明的实施例中，所述显影剂优选为AZ 400K显影剂；本发明对于所述显影剂的用量没有特殊限定，能够将匀胶铬版浸没即可。
所述显影后，本发明优选还包括将所述显影后的匀胶铬版进行水洗和干燥，生成单向阈门单元微蛋白掩模图案，得到母版。在本发明中，所述水洗优选为去离子水洗；本发明对于所述水洗的次数没有特殊限定，能够将显影剂去除干净即可。在本发明中，所述干燥的方式优选为氮气吹干。
得到母版后，本发明在所述母版有图案一面加入保含硅橡胶预聚物和固化剂的混合物，进行固化，得到硅橡胶微印刷版。
在本发明中，所述包含硅橡胶(聚二甲基硅氧烷，PDMS)预聚物和固化剂的混合物优选为SYLGARD 184(道康宁公司)。在本发明中，所述硅橡胶预聚物和固化剂的质量比优选为(5～15)：1，更优选为10:1。在本发明中，所述硅橡胶预聚物和固化剂的混合物在使用前，优选进行除气泡，所述除气泡的方式优选为将混合物进行避光静置。在本发明中，所述避光优选为在所述混合物外侧包覆锡纸；所述静置的温度优选为2～7℃，更优选为3～5℃；所述静置的时间优选为20～40min，更优选为30min。在本发明中，通过除气泡有利于避免硅橡胶微印刷版出现小孔从而破坏硅橡胶微印刷版的形状。
在本发明中，所述固化的温度优选为50～70℃，更优选为55～65℃，最优选为60℃；时间优选优选为2～5h，更优选为3～4h。在本发明中，所述硅橡胶微印刷版表面的硅橡胶预聚物和固化剂的混合物形成的PDMS凝聚物的厚度优选为1.5～2.5μm，更优选为1.8～2.2μm，最优选为2μm。
所述固化后，本发明优选还包括将所述固化后的母版沿匀胶铬版的边缘剪开后水洗和干燥，得到硅橡胶微印刷版。在本发明中，所述水洗优选为去离子水洗。在本发明中，所述干燥的方式优选为氮气吹干。
本发明将多电极阵列培养皿进行等离子处理后加入琼脂糖水溶液进行表面改性，得到改性多电极阵列培养皿。
所述等离子处理前，本发明优选还包括在所述多电极阵列培养皿中加入有机清洗介质进行超声清洗、水洗和干燥。在本发明中，所述有机清洗介质优选包括异丙醇或乙醇；所述超声清洗的频率优选为15～25Hz，更优选为18～22Hz，最优选为20Hz；时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min；所述超声清洗优选在超声清洗机中进行。在本发明中，所述水洗优选为去离子水洗。在本发明中，所述干燥的方式优选为氮气吹干。
在本发明中，所述等离子处理优选在低压环境中进行，所述低压环境的压力≤400mtorr；所述等离子处理的功率优选为80～120W，更优选为90～110W；时间优选为20～40s，更优选为25～35s，最优选为30s；射频电磁场的辐射频率优选为8～12MHz，更优选为9～11MHz；等离子来源优选包括空气或氧气；通过等离子处理有利于多电极阵列培养皿表面增加羟基从而提升其亲水性。
在本发明中，所述琼脂糖水溶液的浓度优选为0.1～0.5w/v％，更优选为0.2～0.4w/vt％，最优选为0.3w/v％。在本发明中，所述琼脂糖水溶液优选现用现配，所述琼脂糖水溶液的配制方法优选为将琼脂糖和水加热混合至沸腾。在本发明中，所述水优选为去离子水。在本发明中，所述混合的方式优选为磁力搅拌混合，所述磁力搅拌混合的速度优选为200～300r/min，更优选为250r/min，所述磁力搅拌混合的速度过慢则磁性搅拌子难以克服液体阻力，所述磁力搅拌混合的速度太快则液体容易洒出；所述混合的温度优选为≥100℃，更优选为100～120℃，本发明在上述温度下进行混合，能够避免琼脂糖水溶液发生凝固；本发明对于所述混合的时间没有特殊限定，能够将琼脂糖完全溶解于水中即可。本发明采用上述混合条件，能够保证琼脂糖充分溶解，同时不产生局部凝固。
在本发明中，所述琼脂糖水溶液沸腾后降温至75～85℃，更优选为80℃，待琼脂糖水溶液不再冒出气泡且澄清后加入至多电极阵列培养皿中。本发明对于所述琼脂糖水溶液的用量没有特殊限定，能够覆盖多电极阵列培养皿底部即可。
在本发明中，所述表面改性的温度优选为室温；所述表面改性的时间优选为24～30h，更优选为26～28h；所述表面改性优选在通风橱中进行；所述通风橱在使用期优选进行紫外线消毒处理。
得到硅橡胶微印刷版和改性多电极阵列培养皿后，本发明通过微型机械臂将所述硅橡胶微印刷版置于粘性蛋白液中浸泡后取出，微接触印刷于所述改性多电极阵列培养皿的表面，得到含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿。
在本发明中，所述硅橡胶微印刷版优选通过胶水粘结在所述微型机械臂的末端执行器上，通过操作器引导微型机械臂向下将硅橡胶微印刷版具有硅橡胶的一面浸泡在粘性蛋白液中。在本发明中，所述操作器优选为机械臂自身配套的操作器，通过按动操作器上的按键来控制微机械臂末端的位置及姿态。在本发明中，所述浸泡的温度优选为8～12min，更优选为10min。在本发明中，所述微型机械臂优选为三自由度微型机械臂，由三个设备型号为NewportNSA12微型线性驱动器以及一个NewportM-461基座组成。
在本发明中，所述粘性蛋白液优选包括ECM凝胶、纤连蛋白、聚赖氨酸和汉克平衡盐缓冲(HBSS)溶液；所述粘性蛋白液中，ECM凝胶的浓度优选为1.5～2.5wt％，更优选为2wt％；所述纤连蛋白的浓度优选为8～12μg/mL，更优选为10μg/mL；所述聚赖氨酸的浓度优选为45～55μg/mL，更优选为50μg/mL。在本发明中，所述HBSS溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.3。
本发明对于所述粘性蛋白液的用量没有特殊限定，能够将硅橡胶微印刷版浸没即可。
在本发明中，所述微接触印刷于所述改性多电极阵列培养皿的表面优选通过微型机械臂进行，具体的，将微型机械臂固定在光学平台上，将改性多电极阵列培养皿放置在正置显微镜的载物台上，通过操作器手动引导微型机械臂的末端出现在显微镜视野中，引导微型机械臂使改性多电极阵列培养皿与硅橡胶微印刷版中的传入神经群生长蛋白图案部分和传出神经群生长蛋白图案部分与多电极阵列培养皿上的微电极触点重合，引导硅橡胶微印刷版向下，施加压力使得硅橡胶微印刷版具有粘性蛋白的一面和改性多电极阵列培养皿表面充分接触，移开微型机械臂后用HBSS溶液冲改性多电极阵列培养皿后氮气吹干。本发明对于所述正置显微镜没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的正置显微镜即可，具体如Olympus SZX16。在本发明中，所述微接触印刷的压力(即施加压力)优选为450～550g，更优选为500g；时间优选为15～25min，更优选为20min。在本发明中，所述冲改性多电极阵列培养皿用HBSS溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.3。在本发明中，所述微电极触点重合优选为使传入神经群和传出神经群蛋白图案区域覆盖更多的微电极触点。本发明采用微机械臂粘接硅橡胶微印刷版来进行微接触印刷操作，具有对操作手法要求低及蛋白图案成形稳定的优点。
得到含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿后，本发明在所述含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿中加入感觉神经元悬浮液和神经基础培养液，进行培养，得到体外人工类反射弧结构。
在本发明中，所述含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿在使用前优选进行预处理，所述预处理优选包括依次进行的有机溶剂洗涤、HBSS溶液洗涤、干燥和消毒。在本发明中，所述有机溶剂优选为异丙酮或乙醇。在本发明中，所述HBSS溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.3。在本发明中，所述干燥的方式优选为氮气吹干。在本发明中，所述消毒的方式优选为紫外线消毒；所述消毒优选在通风橱中进行。
在本发明中，所述感觉神经元悬浮液的制备方法，优选包括以下步骤：在神经节组织中加入胰蛋白酶进行酶解后离心分离，移除胰蛋白酶后加入神经基础培养液，得到感觉神经元悬浮液。在本发明的实施例中，所述神经节组织优选为成熟、具有健康反射弧、成年大鼠的背根神经节组织；所述背根神经节组织优选购买于BrianBits公司。在本发明中，经神经节组织优选经切碎处理后再加入胰蛋白酶进行酶解，本发明对于所述切碎的方式没有特殊限定，采用本领域人员熟知的切碎方式即可，具体如利用微移液管切碎；所述切碎得到的经神经节组织切片的尺寸优选≤3mm。在本发明中，所述胰蛋白酶优选以胰蛋白酶的PBS溶液形式使用，所述胰蛋白酶的PBS溶液的浓度优选为0.2～0.3wt％，更优选为0.25wt％。本发明对于所述胰蛋白酶没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的胰蛋白酶即可；所述胰蛋白酶优选以胰蛋白酶的PBS溶液形式使用，所述胰蛋白酶的PBS溶液的浓度优选为0.2～0.3wt％，更优选为0.25wt％；本发明对于所述胰蛋白酶的用量没有特殊限定，能够覆盖经神经节组织即可。
在本发明中，所述酶解的温度优选为37℃；时间优选为1～4min，更优选为2～3min；所述酶解优选在培养箱中进行；所述培养箱的相对湿度优选为90％，二氧化碳的体积浓度优选为5％。在本发明中，所述离心分离的温度优选为室温；转速优选为1100～1300r/min，更优选为1150～1250r/min，最优选为1200r/min；时间优选为1～5min，更优选为2～4min，最优选为3min。
本发明对于所述神经基础培养液没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的神经基础培养液即可；在本发明的实施例中，所述神经基础培养液的组成优选为2～3wt％B-27(17504-044，Gibco)、1～2wt％谷氨酰胺(25050-061，Gibco)和余量Neurobasal(21103-049，Gibco)。在本发明中，所述感觉神经元悬浮液的浓度优选为(5～50)×104个/mL，更优选为(10～40)×104个/mL，最优选为(20～30)×104个/mL。
在本发明中，所述感觉神经元悬浮液和神经基础培养液的体积比优选为1：(10～40)，更优选为1：(20～30)。在本发明中，所述神经基础培养液优选与感觉神经元悬浮液中含有的感觉神经元悬浮液的组成相同，在此不再赘述。
在本发明中，所述培养的温度优选的为37℃；时间优选为5～7天。在本发明中，所述优选在培养箱中进行；所述培养箱的相对湿度优选为90％，二氧化碳的体积浓度优选为5％。在本发明中，所述培养过程中，每隔4天将含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿中的一半液体更换为新的神经基础培养液。
在本发明中，所述培养过程中，神经元发生自组装，其中，培养1天后大部分神经元在微蛋白图案区域贴壁生长；培养3天后，属于外周神经系统的感觉神经元能重新伸展出轴突；培养5～7天后，被微蛋白图案约束的神经元之间形成单向传输的神经元网络，此时传入神经群的神经活动达到阈值后，会引起传出神经群的大规模放电行为；借助传入神经群下的数个微电极触点可以对传入神经群施加正负脉冲刺激，当刺激频率高于某一阈值时，即可引起传出神经群的大规模放电行为，这一放电行为可以通过与传出神经群下的微电极触点进行细胞外电位观测记录到，构成了信号传播回路包含刺激电极，传入神经群，传出神经群以及记录电极的体外人工类反射弧结构。在本发明中，所述阈值优选为0～100％，更优选为40～80％。在本发明中，所述正负脉冲刺激优选为+/-600mV，每段200μs的方波。在本发明中，所述刺激频率优选为5～1000Hz，更优选为100～300Hz。
本发明利用微蛋白图案约束及引导神经元轴突伸展，具有调节蛋白图案进而使得反射弧内信号传播的阈值和方向可控的优点；而且本发明设计的用于构建体外人工类反射弧结构的微蛋白图案允许较密集的神经元细胞群生长，在培养时无需加入额外的神经胶质细胞层用作神经元的营养支撑层，大大降低了培养要求并简化了培养流程。
本发明提供了上述技术方案所述构建方法得到的体外人工类反射弧结构，传入神经群的轴突通过轴突伸展连接部分连接至传出神经群部分形成单向连通的神经元网络。本发明提供的体外人工类反射弧结构具有神经元网络结构清晰、信号传播可靠性高、反射弧内信号传播的阈值及方向可控优点，能够作为研究反射弧形成过程、药理及电生理测试的体外模型。
本发明还提供了上述技术方案所述体外人工类反射弧结构作为反射弧形成过程研究、药理测试或电生理测试用体外模型的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
按照图2～5所示的流程图构建体外人工类反射弧结构，其中，图2为硅橡胶微印刷版的制作流程图，图3为微接触印刷原理图，图4为在改性多电极阵列培养皿上培养神经元的结构示意图，图5为微接触蛋白印刷及神经元培养流程图，其中，1-苏打玻璃基板，2-氮化铬涂层，3-光刻胶层，4-SYLGARD184，5-硅橡胶微印刷版，6-粘性蛋白溶液，7-琼脂糖涂层，8-改性多电极阵列的培养皿，9-微蛋白图案，10-多电极阵列的圆形触点，11-多电极阵列的底座，12-解剖得到的感觉神经元，13-伸展出轴突的感觉神经元。
(1)基于激光直写的掩模生成器直接制备母版
(1-1)使用直流磁控溅射在苏打玻璃基地1表面形成一层厚度为100nm的氮化铬薄膜2，利用旋涂机将AZ 4562光刻胶旋涂在所述氮化铬薄膜2表面，在室温下静置30min，在70℃下干燥2h，成厚度为12μm的光刻胶层3，得到匀胶铬版，其中，直流磁控溅射的工作条件：溅射气压为0.5Pa，靶电压为500V，靶电流密度为10mA/cm2；旋涂：旋涂机转速为1500r/min，旋涂时间为20s。
(1-2)利用利用AutoCAD软件绘制单向阈门单元微蛋白掩模图案：该图案用于构建约束神经元轴突伸展的微蛋白图案，包括三个部分：传入神经群生长部分、传出神经群生长部分以及轴突伸展连接部分(粗段最大宽度为15μm，细段恒为3μm)。其中输入和传出神经群生长部分为正方形形状，而轴突伸展连接部分为漏斗形结构，其连接至传入神经群的部分较粗，连接至传出神经群的部分较细，以此约束轴突的伸展方向，当传入神经群的神经活动达到传播阈值后，经过轴突传播到传出神经群，引起大规模的放电活动，而传出神经群由于轴突伸展连接部分的结构约束，缺乏投射至传入神经群的轴突，因此传出神经群的神经活动不会传入传入神经群。以上结构构成了单向阈门单元，即为人工类反射弧结构的神经传导基础结构。
(1-3)将匀胶铬版分割为边长为25mm的正方形小块匀胶铬版，置于掩模生成器(设备型号为μPG 101，德国Heidelberg)的真空夹持平台上，进行激光直写，得到曝光铬版；将曝光后的铬版置入烧杯内，加入AZ 400K显影剂在室温下显影6min，去离子水冲洗后氮气吹干，生成单向阈门单元微蛋白掩模图案，得到母版；其中，激光直写的条件：占空比为35％，激光功率为15mW。
(2)制备PDMS微印刷版
将SYLGARD 184(PDMS预聚物与固化剂质量比＝10:1，道康宁公司)避光置入冰箱静置30min，待气泡完全消失后倒入底部放置母版的小纸杯，将纸杯放入恒温箱中在60℃下固化12h，剪开纸杯，取出厚度为2μm的完全凝胶的PDMS凝聚物，利用剪刀沿着小块匀胶铬版的边缘剪开，并用镊子夹起PDMS微印刷版5用去离子水冲洗后氮气吹干，得到PDMS微印刷版。
(3)改性多电极阵列培养皿
(3-1)在多电极阵列培养皿8中倒入3mm高的异丙醇，置于超声清洗机内盖上清洗机顶盖，在20kHz下超声清洗10min，取出，用去离子水冲洗后氮气吹干，置于等离子处理器中，在300mtorr、100W、10MHz、大气环境下等离子处理2min，得到等离子处理培养皿；
(3-2)在烧杯中加入琼脂糖粉末和去离子水，置于磁力搅拌机上在100℃、300r/min搅拌至琼脂糖粉末沸腾溶解，将温度降低至80℃，溶液不再冒出气泡且清澈透明，得到琼脂糖水溶液；用移液管将琼脂糖水溶液移至等离子处理培养皿中，覆盖整个培养皿底部即可，然后置于经过紫外线消毒的通风橱中静置12h，得到表面覆盖琼脂糖涂层7的改性多电极阵列培养皿8。
(4)基于微机械臂的微接触印刷
(4-1)粘性蛋白溶液6：将ECM凝胶溶解于pH＝7.3的HBSS溶液中，加入纤维连接蛋白和聚赖氨酸，得到粘性蛋白溶液，其中，ECM凝胶的浓度为2wt％，纤维连接蛋白浓度为10μg/mL，聚赖氨酸浓度为50μg/mL；
(4-2)将PDMS微印刷版通过胶水粘接在三自由度微型机械臂(由三个设备型号为NewportNSA12微型线性驱动器以及一个NewportM-461基座组成)的末端执行器上，通过操作器引导三自由度微型机械臂向下浸没在粘性蛋白溶液中保持10min后取出，接着将三自由度微型机械臂固定在光学平台上，将改性多电极阵列培养皿放置在正置显微镜(设备型号为Olympus SZX16)的载物台上，并通过操作器手动引导三自由度微型机械臂，使其末端出现在显微镜视野中，引导三自由度微型机械臂使与其粘接的PDMS微印刷版的传入神经群生长蛋白图案部分和传出神经群生长蛋白图案部分和多电极阵列培养皿上的微电极触点重合，引导PDMS微印刷版向下，施加500g的压力保持20min，移开三自由度微型机械臂，并用pH＝7.3的HBSS溶液冲洗改性多电极阵列培养皿后氮气吹干，在改性多电极阵列培养皿表面便形成一层微蛋白图案9，得到含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿。
(5)含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿上的神经元培养及自组装(5-1)将含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿依次用异丙酮清洗、pH＝7.3的HBSS溶液反复清洗和氮气吹干，然后放置在通风橱中用紫外线消毒12h；
(5-2)将具有成熟、健康反射弧、成年大鼠的背根神经节组织(BrianBits公司)，放入培养皿中，用微移液管切碎并加入2mL含有0.25wt％胰蛋白酶的PBS溶液，放入37℃、CO2体积浓度为5％、相对湿度为90％的培养箱中酶解2min后取出后2mL神经基础培养液打断胰蛋白酶的分解作用，移入空离心管，用离心机以1200r/min的转速离心3min，取出后移除溶液，再加入2mL神经基础培养液，并用微移液管吹散数次，使感觉神经元12悬浮在溶液中，得到感觉神经元悬浮液；其中，神经基础培养液组成为2wt％B-27(17504-044，Gibco)、1wt％谷氨酰胺(25050-061，Gibco)和余量Neurobasal(21103-049，Gibco)；感觉神经元悬浮液的浓度为3×105个/mL。
(5-3)取200μL神经细胞悬浮液添加到经过消毒处理的含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿表面，添加8mL神经基础培养液，在37℃、CO2体积浓度为5％、相对湿度为90％的培养箱中培养，每4天更换一半培养液。观察得到：培养1天后，大部分神经元在微蛋白图案区域贴壁生长；培养3天以后，属于外周神经系统的感觉神经元能伸展出轴突；培养5～7天后，被微蛋白图案约束的神经元之间形成单向传输的神经元网络，此时传入神经群的神经活动达到阈值后，会引起传出神经群的大规模放电行为。借助传入神经群下的数个微电极触点可以对传入神经群施加正负脉冲刺激，当刺激频率高于某一阈值时，即可引起传出神经群的大规模放电行为，这一放电行为可以通过与传出神经群下的微电极触点进行细胞外电位观测记录到，得到信号传播回路包含刺激电极，传入神经群，传出神经群以及记录电极的体外人工类反射弧结构。
实施例2
按照实施例1的方法制备体外人工类反射弧结构，与实施例1的区别在于，步骤(1-2)中轴突伸展连接部分的粗段最大宽度为30μm。
实施例3
按照实施例1的方法制备体外人工类反射弧结构，与实施例1的区别在于，步骤(1-2)中轴突伸展连接部分的粗段最大宽度为50μm。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种体外人工类反射弧结构的构建方法，包括以下步骤：
（1）在基底表面直流磁控溅射形成氮化铬薄膜，在所述氮化铬薄膜表面形成光刻胶层，得到匀胶铬版；
对所述匀胶铬版的光刻胶层依次进行激光直写和显影，生成单向阈门单元微蛋白掩模图案，得到母版；所述单向阈门单元微蛋白掩模图案包括顺次连接的传入神经群生长部分、轴突伸展连接部分和传出神经群生长部分；所述轴突伸展连接部分与所述传入神经群生长部分的连接处较粗，所述轴突伸展连接部分与所述传出神经群生长部分的连接处较细，以此约束轴突的伸张方向；所述传出神经群生长部分由于轴突伸展连接部分的结构约束，缺乏投射至传入神经群的轴突，传出神经群的神经活动不会传入传入神经群，以上结构构成了所述单向阈门单元；
（2）在所述步骤（1）得到的母版有图案一面加入包含硅橡胶预聚物和固化剂的混合物，进行固化，得到硅橡胶微印刷版；
（3）将多电极阵列培养皿进行等离子处理后加入琼脂糖水溶液进行表面改性，得到改性多电极阵列培养皿；
（4）通过微型机械臂将所述步骤（2）得到的硅橡胶微印刷版置于粘性蛋白液中浸泡后取出，微接触印刷于所述步骤（3）得到的改性多电极阵列培养皿的表面，得到含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿；
（5）在所述步骤（4）得到的含微蛋白图案的改性多电极阵列培养皿中加入感觉神经元悬浮液和神经基础培养液，进行培养，得到体外人工类反射弧结构；
所述步骤（1）与步骤（3）、步骤（2）与步骤（3）之间没有时间顺序限制。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氮化铬薄膜的厚度为90~110nm；
所述光刻胶层的厚度为10~15μm。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述激光直写的条件包括：激光占空比为20~50%，激光功率为5~30mW。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述硅橡胶预聚物和固化剂的质量比为（5~15）：1；
所述固化的温度为50~70℃，时间为2~5h。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，所述琼脂糖水溶液的浓度为0.1~0.5w/v%。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，所述粘性蛋白液包括ECM凝胶、纤连蛋白、聚赖氨酸和汉克平衡盐缓冲溶液；所述粘性蛋白液中，ECM凝胶的浓度为1.5~2.5wt%，纤连蛋白的浓度为8~12μg/mL，聚赖氨酸的浓度为45~55μg/mL。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，所述微接触印刷的压力为450~550g，时间为15~25min。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（5）中，所述感觉神经元悬浮液的浓度为（5~50）×104个/mL；
所述培养的时间为5~7天。
9.权利要求1~8任一项所述构建方法得到的体外人工类反射弧结构作为反射弧形成过程研究、药理测试或电生理测试用体外模型的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1678733A (zh) * 2002-08-26 2005-10-05 独立行政法人科学技术振兴机构 神经细胞培养微室
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2007009235A1 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Neurosilicon (1145990 Alberta Ltd.) Method and apparatus for guiding growth of neurons

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1678733A (zh) * 2002-08-26 2005-10-05 独立行政法人科学技术振兴机构 神经细胞培养微室
CN101629945A (zh) * 2009-08-06 2010-01-20 浙江大学 检测神经细胞电信号的装置
CN111621420A (zh) * 2020-05-26 2020-09-04 大连理工大学 一种用于增强神经元功能的细胞共培养微流控芯片

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