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Abstract

神经细胞培养微室，其由在透明玻璃基板上具有细胞水平大小的电极排列，在其上面具有厚度10μm以上厚壁的细胞配列用微室排列，以及在上述微室上面的半透膜构成，上述半透膜是，对于被覆微室上面的细胞不能通过程度的以使细胞不从微室中逃逸对粗的上述集束光在光学上是透明的网眼粗细的半透膜，此外，上述半透膜的上面具有能够使培养液循环的溶液交换部液体交换的装置，此外，具有在光学上连续观察上述微室排列内的细胞的状态变化的装置和与连续计测各神经细胞的电位变化的装置组合的装置，其为能够对网络形状进行完全控制，而且在无细菌等侵入的情况下长时间对神经网络的刺激应答的变化进行计测的装置。

Description

神经细胞培养微室
技术领域
本发明申请涉及能够边对细胞的状态进行显微镜观察，边以1细胞单位培养神经细胞并且同时计测电位变化的新型神经细胞培养微室。
背景技术
神经科学的进步显著，为了弄清脑功能，开发了利用光、磁场、化学物质等的各种各样的手法，用于研究。特别是对于高度的信息处理能力，一般用体内(invivo)使其功能明确，但由于神经回路网的复杂性，要完全实现稳定的样品状态的维持、样品条件的再现性等近乎不可能。因此，人工构筑由少数的神经细胞构成的比较单纯的神经回路网，要在完全控制的环境下弄清细胞网络的信息处理功能的研究也在蓬勃地进行。例如，Dichter，M.A.Brain Res.，149，279-293(1978)、Mains R.E.，Patterson P.H.J. Cell.Biol.，59，329-345(1973)、或Potter S.M.，DeMarse T.B.，J.Neurosci.Methods，110，17-24(2001)、以及Jimbo Y.，Tateno T.，RobinsonH.P.C.，Biophys.J.76，670-678(1999)等的研究。
为了进行以1个1个神经细胞为最小构成单位的信息处理模型的计测，重要的是多点同时计测技术和细胞网络图案的控制技术，但神经细胞的活动电位计测技术也处于初期阶段，膜片钳法(パツチクランプ)法等给予细胞损伤的手法为主，因此存在不能同时在3点以上的多点进行计测，在开始计测后数小时内测定的细胞死亡的问题，近年来开发了在电极排列(MEAS)基板上的神经细胞的培养计测法，克服了上述问题，可以进行达到数周时间的长期培养。
另一方面，对于使用化学或物理的方法对神经细胞的网络图案进行控制的技术，从古至今进行了大量研究。例如，在化学方法方面，Letourneau等在用层粘连蛋白(ラミニン)等细胞粘接性的基质在培养神经细胞的基板表面描绘图案，沿着图案使神经突起伸展方面获得成功。对此，例如在Letourneau P.C.：Dev.Biol.，66，183-196(1975)进行了报告。在物理学方法方面，报告了通过在构筑了对于基板表面上神经细胞的伸展成为障壁的台阶高差的基板上进行培养，如果障壁的高度为10μm左右以上，可以限制神经细胞的伸展和移动(StopakD.et al.：Dev.Biol.，90，383-398(1982)或HironoT.，TorimitsuK.，Kawana A.，Fukuda J.，Brain Res.，446，189-194(1988)等)。
但是，对于上述以往技术中发明的电极排列基板技术，由于基板上不具有立体障碍，因此难于完全控制细胞的空间配置。此外，当使用上述以往技术的立体结构对细胞的空间配置进行控制时，不易防止从循环的培养液等外界侵入细菌等。
本申请发明消除了上述以往技术的问题，其课题在于提供为了弄清细胞的学习过程，能够完全控制网络形状，而且在无细菌等侵入的情况下长时间对神经网络的刺激应答的变化进行计测的新型技术手段。
发明内容
作为解决上述课题的技术，本发明申请第1提供神经细胞培养微室，其特征在于：在基板上具有用于计测神经细胞的电位变化的多个电极图案，在其上面具有用于将神经细胞封入特定的空间配置中的多个分割壁，在分割壁上配置光学上透明的半透膜。即，更具体地说，例如，本发明申请的神经细胞培养微室由在透明玻璃基板上具有细胞水平大小的电极排列，在其上面具有的厚度10μm以上厚壁的细胞配列用微室排列，以及在上述微室上面的半透膜构成，上述半透膜是对于被覆微室上面的细胞不能通过程度的以使细胞不从微室中逃逸而对粗的上述集束光在光学上透明的网眼粗细的半透膜。
此外，本发明申请提供神经细胞培养微室，对于上述第1发明，其第2特征在于：电极图案为光学上透明的电极，其第3特征在于：电极图案能够独立计测的电极数为3个以上，其第4特征在于：用多个分割壁隔开的细胞培养的区域为3个以上，其第5特征在于：上述各电极和各区域是一一对应的。
在本发明申请的神经细胞培养微室中，上述半透膜的上面还具有能够使培养液循环的溶液交换部液体交换的装置。此外，具有在光学上连续观察上述微室排列内的细胞的状态变化的装置和与连续计测各神经细胞的电位变化的装置组合的装置。
附图说明
图1为例示本申请的多电极排列长期培养显微观察系的基本构成的模式图。
图2为多电极排列和微室的显微镜照片。
图3为半透膜的基板粘接顺序的概念图。
图4为多电极排列芯片的外观的显微镜照片。
图5为多电极计测单元的概要和装置外观的照片。
图6为计测、观察用长期培养显微镜系统的外观的照片。
图7为表示多电极排列芯片上的大鼠小脑颗粒细胞的显微镜照片。
具体实施方式
本发明申请具有如上所述的特征，以下对其实施方式进行说明。
例如，附图1表示使用本发明申请的神经细胞微室的多电极长期培养显微观察系的一例。如图1(a)所示，为该系统心脏部分的多电极排列芯片(1)固定在显微镜观察系统中，可以进行从光学系统通过CCD照相机向控制用计算机的一趟时间(lap time)计测和来自电极排列的电信号的记录和从各电极排列端子向细胞的电刺激，可以进行电信号和光学数据的同时计测、记录。
图1(b)表示作为该系统心脏部分的多电极排列芯片(1)的一例的一部分截面。在可以用100倍的物镜观察的0.18mm壁薄的滑动玻璃(11)上，首先配置电极(12)排列的层。然后，用对粘度进行了调整的光固化性树脂SU-8(为环氧系高分子，通过光照射使光照到的部分聚合的壁厚光致抗蚀剂材料：Micro Chem Inc.制，USP 4882245)被覆电极面以使层的厚度达到25μm，同时进行蚀刻局部地将该树脂层除去，形成分割壁(13)，构成封入细胞(2)的穴(微室排列)。当然，除了上述SU-8以外，如果是光固化性且壁比较厚的抗蚀剂材料，可以使用各种树脂。
此外，在这里，在封入细胞(2)的金电极(12)表面上涂布层粘连蛋白或胶原等。在封入了细胞(2)的微室排列的上面用半透膜(14)封盖，以防止来自外部的污染并防止细胞(2)的逃逸。芯片上的培养液缓冲液经常循环保持新鲜的状态。在该例中使用金电极，但也可以使用ITO等光学上透明的电极。
以下，对多电极排列芯片进行详细介绍。图2表示加工的各阶段中基板的状态的显微镜照片。图2的各照片右下方的比例尺为长100μm。图2(a)为在滑动玻璃基板上以Cr100、Au1000的顺序蒸镀后，经过光致抗蚀剂涂布、曝光、显影、蚀刻工序而作成的电极图案。电极的大小与同其组合的微室的尺寸相匹配，为一边30μm。图2(b)为将上述光固化性树脂SU-8涂布到滑动玻璃基板并干燥后，进行所希望的图案曝光、蚀刻处理而作成的微室排列。在该例中，与图2(a)的电极的位置相适合，配置8个1边30μm的壁。SU-8的壁的高度为25μm(用台阶高差计测定)，如从图中看到的那样，微室排列的壁的宽度为1-5μm左右。如上所述通过使用SU-8，可以简单地作成(高度/宽度)的比高的构造物。图2(c)实际上将图2(a)的电极和图2(b)的微结构组合，在作为实施例的神经细胞的培养中使用该形状的多电极排列芯片。
以下，对覆盖多电极排列芯片上面的半透膜的盖的固定方法的手法之一进行简单介绍。图3简单表示在基板(11)表面生物素改性方法和在半透膜上抗生物素蛋白改性方法的顺序。首先，在基板(11)表面上加成氨基，使其与末端导入环氧基的生物素反应。另一方面，半透膜(14)例如由纤维素构成，因此使该糖的五元环的一部分开裂，使其与加成在抗生物素蛋白末端的氨基反应，制作抗生物素蛋白改性半透膜。半透膜(14)和基板(11)通过抗生物素蛋白-生物素键接合固定。
当使用上述光固化性树脂SU-8时，由于SU-8具有反应性的环氧基，因此可以在光照射前使预烘烤的基板(11)表面和蛋白质的氨基反应，然后进行光照射，或者在用SU-8作成图案后，通过溅射将SiO2涂布到其表面上，用硅烷偶联剂在其上面使环氧基加成，使其与蛋白质的氨基共价键结合。
图4(a)为表示这样作成的多电极排列芯片的整体像的显微镜照片。比例尺的长度为150μm。此外，图4(b)为将该多电极排列芯片的滑动玻璃基板固定到支座上的照片。该滑动玻璃的大小为3cm×3cm。当实际培养、观察时，与该图4(b)所示的支座一起载置到安装在显微镜平台上的多电极1次放大器上，进行观察。
以下，对载置多电极排列芯片，实际进行计测、培养的系统进行简单说明。图5表示实际给予神经细胞刺激，或电计测细胞冲动的系统的概略情况。本装置的特征在于可以使用配置在多电极排列内的同一电极给予细胞刺激进行计测，可以在光学上连续观察细胞网络形态，而且由于细胞与信息记录装置光学地连接，在1次放大器内以接地水平进行绝缘。因此，即使当长期培养时，通过接地不使脉冲信号波及细胞。图5(a)为该系统的概略图，该装置的1次放大器部的照片为图5(b)。图5(b)所示的1次放大器基板的中心部为了进行显微镜观察而空着，直接固定到显微镜的平台上。安装基板使用4层多层基板，最上层和最下层为接地面，此外，如前所述，这些接地面的内侧和外侧彼此独立，细胞为电池驱动，控制用计算机为电源装置驱动。本试制机为用于试制的12通道型，通过提高安装密度，可以成为更多通道型。
图6表示载置多电极排列芯片进行培养的显微镜系统。图6(a)为表示固定在显微镜系统平台上的1次放大器基板和固定在该基板上的芯片的照片。饱和蒸汽压的含有5％CO2的空气加热到37℃，直接吹到基板上的芯片上。在该照片中，没有安装培养液的回流系，培养时采用2根SUS细管边置换培养液边连续进行培养。此外，如图6(b)所示，用恒温槽将显微镜系统整体包起，努力使包括显微镜的系统整体的温度维持一定。
图7为用40倍物镜拍摄的用本系统实际培养大鼠小脑颗粒细胞的结果的1例的图像。观察到封入微室排列的细胞没有从微室逃逸而形成了网络。此外，也没有观察到大肠菌等来自环境的杂质的混入。由此可知，微室的结构发挥了所期待的性能。
当然，本发明申请并不限于以上的例示。其细节部分的实施方式可以各种各样。
如上所述，通过使用本发明申请，可以以1细胞单位对神经细胞的网络空间配置进行控制，同时边长期培养边连续地计测其形态变化、电特性的变化。

Claims (5)

1.神经细胞培养微室，其特征在于：在基板上具有用于计测神经细胞的电位变化的多个电极图案和，在其上面具有用于将神经细胞封入特定的空间配置中的多个分割壁，在分割壁上配置光学上透明的半透膜。
2.权利要求1所述的神经细胞培养微室，其特征在于：电极图案为光学上透明的电极。
3.权利要求1或2所述的神经细胞培养微室，其特征在于：电极图案的能够独立计测的电极数为3个以上。
4.权利要求1所述的神经细胞培养微室，其特征在于：用多个分割壁隔开的细胞的区域为3个区域以上。
5.权利要求1-4的任一项所述的神经细胞培养微室，其特征在于：对于电极图案和用多个分割隔开的区域，各电极和各区域一一对应。
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