JP4320286B2 - 電極付細胞培養マイクロアレーおよび電気的細胞計測法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の状態を顕微鏡観察しながら、１細胞単位で神経細胞を培養し、かつ、同時に細胞活動にかかわる電位変化を計測することのできる新しい細胞培養マイクロチャンバーに関する。

従来、細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、細胞集団の値の平均値をあたかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。

これらの問題を解決するために、同調培養等の手法が開発されているが、培養された細胞の由来が全く同一の一細胞からでは無いことから、培養前の由来細胞各々の遺伝子の違いがタンパク質発現の違いを生み出す可能性があり、実際に刺激に対する応答の結果を解析するときに、そのゆらぎが細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎに由来するものなのか、細胞の違い（すなわち遺伝情報の違い）に由来するゆらぎなのか明らかにすることは難しかった。

また、同様の理由から、細胞株についても、一般には完全に一細胞から培養したものでは無いため、刺激に対する応答の再現性が細胞各々の遺伝子の違いによってゆらぐものか明らかにするのは難しかった。

また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触によるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。

さらに、細胞活動をモニターするには、細胞表面に露出するタンパク質や糖鎖を蛍光標識抗体で修飾して得られる蛍光像を観察するように、細胞そのものが損傷を受ける検出法が多用されている。

細胞にそれほどダメージを与えない方法としては、細胞内のカルシウムやｐHをこれらの指示薬で測定する方法が開発されている。いずれにせよ、指示薬（一般的には蛍光試薬）を細胞内に挿入して計測するのが一般的である。あるいは、細胞に電極を接触させて電位変化を追跡できるように工夫された計測法もある。

細胞の状態を測定する上で、特に神経細胞においては、人工的に少数の神経細胞からなる比較的単純な神経回路網を構築し、完全に制御した環境下で細胞ネットワークが情報処理機能を明らかにしようとする研究も盛んに行われている（非特許文献１−３）。

神経細胞を１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために重要なものは、多点同時計測技術と、細胞ネットワークパターンの制御技術であるが、神経細胞の活動電位計測技術も初期の段階では、パッチクランプ法などの細胞に損傷を与える手法が主だったため、同時に３点以上の多点で計測できない、計測を開始してから数時間で測定している細胞が死んでしまうといった問題点があったが、近年、電極アレー（ＭＥＡＳ）基板上での神経細胞の培養計測法が開発されることで上記の問題点を克服して数週間に及ぶ長期培養も可能となっている。

また、神経細胞のネットワークパターンを化学的、あるいは物理的な手法を用いて制御する技術についても古くから多くの研究がなされている。たとえば、化学的方法では、Letourneau達が神経細胞を培養する基板表面にラミニンなどの細胞接着性の基質でパターンを描き、神経突起をパターンに沿って伸展させることに成功している（例えば、非特許文献４）。

物理学的方法では、基板表面に神経細胞の伸展にとって障壁となる段差を構築した基板上で培養することで、障壁の高さが１０μｍ程度以上であれば神経細胞の伸展・移動を制限することが可能という報告がある（例えば、非特許文献５−６）。

発明者らのグループは、特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術、及び細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を開発した（特許文献１）。また、細胞培養を行いながら集束光を照射して加熱した領域の細胞培養容器の形状を自在に変化させることが可能な細胞培養マイクロチャンバーを開発している（特許文献２）。

特開２００４−８１０８６号公報 特開２００４−８１０８５号公報 Dichter, M.A. Brain Res., 149, 279-293 (1978) や、Mains R.E., Patterson P. H. J. Cell. Biol., 59, 329-345 (1973) Potter S.M., DeMarse T.B., J. Neurosci. Methods, 110, 17-24 (2001) Jimbo Y., Tateno T., Robinson H.P.C., Biophys. J. 76, 670-678 (1999) Letourneau P.C.: Dev. Biol., 66, 183-196 (1975) Stopak D. et al.: Dev. Biol., 90, 383-398 (1982) Hirono T.,Torimitsu K., Kawana A., Fukuda J., Brain Res., 446, 189-194 (1988)

従来の電極アレー基板技術では、細胞が直に電極と接する構造をしている。このため、細胞そのものの電位変化を測定することはできるが、たとえば、神経細胞のようにネットワークを構成する細胞群においては、どの細胞とインタラクションを行っているかの情報が抜け落ちてしまい、すべての平均値的な実験結果しか得られない問題点がある。神経細胞のように神経突起や軸索を伸ばし、複数の細胞とインタラクションする系では、電極と細胞の方向と向きの配置関係を厳密に規定してデータをとるようにしなければ、有用なデータを得ることが難しい。

本発明は、以上のような従来技術の問題点を解消し、細胞の機能を明らかにするため、細胞間ネットワーク形状を完全に制御しながら、細胞ネットワークの刺激応答の変化を、長期間に渡って電気的な計測を行うことのできる新しい技術手段を提供することを課題としている。

本発明は、上記の課題を解決するものとして、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の細胞培養区画を有し、各区画は細胞の通り抜けることができない溝でお互いが連結されており、この溝の中に細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンを持つ構造としている。

電極パターンは、隣り合う細胞培養区の間の溝に設置されており、細胞間のポテンシャルの違いを測定できる構造となっている。測定細胞が、神経細胞の場合は、細胞が軸索を伸ばし、隣接する細胞とシナプスでカップルする細胞間の軸索そのものの電位変化を測定することとなる。

本発明によれば、細胞のネットワークの空間配置を１細胞単位で制御しつつ、長期培養しながら、その形態変化、電気的特性の変化を連続的に計測することが可能となる。電気特性変化を検出する電極は、細胞間に配置されているので、電極をはさむ細胞同士の情報のみを得ることができる。

（実施例１）
図１は実施例１に係る本発明の電極付細胞培養マイクロアレーの構造の１例を模式的に示した上面図、図２は、図１のＡ−Ａ位置において矢印方向に見た断面図である。１は基板であり、すべての構造物は基板１の上に構築されている。２は細胞培養区画であり、所定の間隔で周期的に複数個構築されている。３は溝であり、隣接する細胞培養区画を互いに結んでいる。１０は樹脂層であり、基板１の上に形成され、細胞培養区画２とこれらの間を連絡する溝３は、樹脂層１０を除去して形成されている。４は電位測定用の電極であり、溝３のすべてに設けられる。電極４は１００ｎｍの厚みの金で基板１の表面に蒸着で付けてある。５は外部端子であり、基板１の周辺で電極４に対応してその近傍に設けられる。６は配線で電極４と外部端子５とを接続する。

９は半透膜であり、細胞培養区画２とこれらの間を連絡する溝３を形成した樹脂層１０の上面に密着して設けられる。２２は上部ハウジングであり、半透膜９の上に適当なスペースをとって樹脂層１０の全面を覆う。２２−１は、上部ハウジング２２の立下り部である。２１は半透膜９と上部ハウジング２２との間に形成される培養液槽である。２３は、上部ハウジング２２に設けられた開口部であり、これを通して培養液が培養液槽２１に供給される。１４は共通電極であり、培養液槽２１に設けられる。

実施例１は、ヒト由来の細胞を１細胞ずつ培養しながら計測する目的のため、各細胞培養区画２は一辺が３０μｍで深さが２５μｍとされている。溝３は幅が５μｍ、深さは２５μｍである。細胞培養区画１間の距離は３０から２００μｍである。

具体的な作成法を述べる。基板１は１００倍の対物レンズでの観察が可能な０．１８ｍｍの無蛍光ガラスであり、この上面に、まず電極４、配線６、端子５の層が蒸着により形成される。次に、電極４および端子５の領域をマスクして、全面に絶縁層を形成する。次に、層の厚さが２５μｍとなるように粘度を調整した光硬化性樹脂ＳＵ−８（エポキシ系フォトレジスト材料：Micro Chem Inc.製、米国特許４，８８２，２４５号）で電極４、絶縁層、端子５の面を被覆して樹脂層１０を形成する。次いで、樹脂層１０の細胞培養区画２と溝３に対応する位置を局所的に除去する。これにより、細胞培養区画２と溝３を形成する。溝３には露出した電極４が配置されることになるが、溝３を横切る配線６は絶縁層で隔離される。また、端子５も露出させる。

細胞培養区画２と溝３の表面にはラミニンやコラーゲンなどの細胞親和性物質を塗布するとともに、細胞培養区画２と溝３を培養液バッファで満たし、細胞培養区画２に細胞を入れる。次いで、細胞培養区画２に細胞を封入するために、細胞培養区画２と溝３の領域の上面に半透膜９の蓋をかぶせる。その後、半透膜９の蓋（樹脂層１０の全面）を全面的にカバーする上部ハウジング２２を取り付ける。この際、上部ハウジング２２は、適当な立下り部２２−１を有し、半透膜９の上に適当なスペースをとって覆い、培養液槽２１を形成する。１４は共通電極で、培養液槽２１の上部ハウジング２２内面にＩＴＯなどの光学的に透明な電極を用いて形成してある。２３は、培養液槽２１の開口部であり、この開口部を介して培養液槽２１には、常に新鮮な培養液が供給、排出されている。

上述の半透膜９は光学的観察を妨げないように透明なセルロース膜を用いる。ここでは分画分子量３万ダルトンのものを用いている。上部ハウジング２２も、光学的観察を妨げないように透明な材質の材料、例えば、プラスティックで作られる。

このようにして複数の細胞を個々に収納した細胞培養マイクロアレーが作成できる。ここで、細胞培養区画２に細胞を入れる方法についてみると、いくつかの方法が考えられる。例えば、細胞を入れた容液中にマイクロキャピラリを挿入し、先端に細胞を一つ捕らえて、これを細胞培養区画２に入れる方法がある。あるいは、細胞培養区画２と細胞のサイズがほぼ同じ程度である場合には、細胞培養区画２と溝３の領域の上面に細胞を含む液滴を垂らし、余分な液を押し出すように上面をなぞることにより、細胞培養区画２に細胞を入れることができる。

細胞培養区画２に入れられた細胞を安定に定着させるには、ビオチンアビジン反応による自立的結合形成を用いる。光硬化性樹脂ＳＵ−８は、反応性のエポキシ基を有していることから、光照射の前にプレベークして基板ＳＵ−８層を形成した後に、直ちにビオチンヒドラジドを含む溶液を塗布し、樹脂のエポキシ基とヒドラジド基を反応させてビオチンを固定する。光照射して、樹脂を固化させ構造体を形成することで、表面にビオチンを導入したＳＵ−８パターンを得ることができる。

溝３を軸索が延伸する状態は、溝３に配置された電極４に接続された端子５と共通電極１４との間で電極間のインピーダンスを測定し、あるいは、電極４に接続された端子５に検出される細胞そのものによる起電力を、共通電極14の電位を基準値として測定することで検出できる。これらはすべて顕微鏡で細胞を観察しながら行うことができる。また、本発明の電極付細胞培養マイクロアレーでは、多数ある電極を選択することで、特定の細胞に同一電極で細胞に刺激を与えたり、計測したりすることが可能である。

例えば、ラット小脳顆粒細胞を、本発明の電極付細胞培養マイクロアレーで培養した結果、細胞培養区画２に入れられた細胞は、細胞培養区画２から逃れることなく、ネットワークを形成しているのが観察される。軸索が伸び細胞同士が接触する前と後では、軸索が伸び細胞同士が接触した細胞培養区画２間の溝３に配した電極４と、細胞の反対側の軸索が伸びていない溝３に配した電極４間で起電力が生じることが確認される。これらのことから、本発明の電極付細胞培養マイクロアレーの構造は、期待された性能を発揮していることがわかる。

また、ペプチドやアミノ酸などの生体物質ないし、内分泌かく乱物質や毒性を疑われる化学物質を添加し、細胞の応答を電位変化で測定することができる。

（実施例２）
実施例２は光硬化性樹脂ＳＵ−８に代えてアガロースゲル１００で、細胞培養区画２や溝３を形成する例に付いて説明する。

図３は、本発明の実施例２の平面図、図４は、図３のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。図１,２と図３,４とを対比して明らかなように、細胞培養区画２を結ぶ溝３がトンネル３に変えられ、トンネル３に複数の電極４が設けられたことおよびトンネル３がアガロースゲル１００の底面部にのみ作られている点を除けば、本質的には実施例１と同じ構造である。ただし、１−１は壁であり、基板１上に設けられ、アガロースゲル１００の周辺部を、この壁で形成、保持するものとしている。

実施例２では、実施例１と同様に基板１上に、電極４、配線６、端子５を形成した後、壁１−１を基板１上面に貼り付け、壁１−１内にアガロースゲル１００を入れる。２％アガロースゲル（融解温度６５℃）を電子レンジで加熱し、融解させる。６５℃に加熱した下部基板１の外壁の内側に融解したアガロース溶液を添加し、直ちにスピンコーターを用いて均一の厚さに広げる。ここではアガロースゲル膜が１ｍｍ厚になるようにアガロースゲルの添加量とスピンコーターの回転速度を調整する。装置やアガロースゲルのロットにより厚みが異なるが、５０ｒｐｍ，１５秒間、続いて２００ｒｐｍ１０秒間で良い結果を得ている。湿潤箱の中で２５℃１時間放置することでアガロースゲル膜１００を形成する。この時点では、アガロースゲル膜は基板１の外壁の内側全面に形成されている。次に、アガロースゲル１００で細胞培養区画２を形成するために、アガロースゲル１００を形成した後、細胞培養区画２の部分を取り除く。

図４には細胞培養区画２の作成が終わったアガロース製電極付細胞培養マイクロアレーの断面図と、アガロースゲル１００にトンネル３を作成する光学系と制御系を模式的に示している。アガロースゲル上面は実施例１と同様にセルロース膜を貼って用いる。たとえば、加熱溶融したアガロースをスピンコーターでセルロース膜表面に塗布、片面にアガロース薄膜を形成したものを予め作成し、これを、細胞を区画２に入れた後にアガロース塗布面がアガロースゲル１００に接するように乗せればよい。あるいは、アガロースゲル１００を形成するときに、ストレプトアビジンコンジュゲートアガロースを少量添加して固める。このアガロースゲル誘導体の表面にはストレプトアビジンが露出している。別途、実施例１と同様に過ヨウ素酸酸化によりアルデヒド基を導入したセルロース膜にビオチンヒドラジドを反応させ、ハイドロボレーション反応で還元して得るビオチン修飾セルロース膜を調製する。アガロースゲル誘導体とビオチン修飾セルロース膜をビオチン―アビジン反応を用いて固定することで、アガロース構造体に細胞を封じ込めた構造体を形成することができる。

照射するレーザーは水に吸収される１４８０ｎｍのレーザー１４１を用いる。レーザービーム１４２はエキスパンダー１４３を通り、７４０ｎｍ以上の赤外光を反射するが１４８０ｎｍ（±２０ｎｍ）の光を透過するフィルター１４４を通過し、さらに７００ｎｍ以上の光を透過する蒸着フィルター１４５を通り抜け、集光レンズ１４６で基板１の上面に焦点が合う。１４８０ｎｍの収束光はアガロース層に含まれる水に吸収され、近傍の温度が沸点近くまで上昇する。レーザーパワーが２０ｍＷでは、収束光の当った近傍が２０μｍ程度の線幅でアガロースが融解し、熱対流により除去される。問題は基板１の電極の有る無しでアガロースに吸収される収束光の強度が変化することである。そこで、アガロースゲル温度を推定してフィードバック制御によりレーザーパワーを制御し常に収束光照射での温度コントロールをできるように工夫してある。アガロース部に到達した収束光は熱に変換されると共に赤外光を発する。赤外光はフィルター１４５を通過し、フィルター１４４で反射され赤外カメラ１６０−１に到達する。赤外カメラ１６０−１の画像データをビデオ記録機構付き演算装置１６１に取り込み、光検出強度から温度を推計し、レーザー１４１のパワーを調整する。レーザーパワーのみで温度コントロールが困難な場合は、演算装置からの出力でステージ１６４の移動速度をコントロールし、常に収束光照射部のアガロース温度が維持されるようにする。即ち、演算装置１６１によりステッピングモータ１６２の回転を制御し、ステッピングモータの回転は動力伝達装置１６３によりステージ１６４が動く仕掛けになっている。

ステージ１６４には基板１が装着されており、自在にアガロースゲルにトンネル３を形成することができる。トンネル３にはＩＴＯ透明電極が予め形成されている。また、細胞観察やアガロース加工の進捗状況をモニターするために、光源１７０からの透過光を検出する光学系も組み込まれている。光源１７０からの光は透明な上部ハウジング２２を透過し、アガロース部分で散乱しながら対物レンズ１４６を透過し、可視光を反射する蒸着フィルター（ミラー）でＣＣＤカメラ１６０−２で画像として取り込まれる。画像データは演算装置１６１に送られ、赤外カメラ１６０−１とオーバーラップさせて、レーザー照射による温度上昇部と構造体のパターンの確認などに用いられる。

アガロースゲルの上面は開口部２３より供給排出される培養液が常に循環している。或いは開口部２３より細胞の刺激物質や内分泌かく乱物質を始めとする種々化学物質を添加し、電極や兼備観察で細胞の状態をモニターできる。

実施例２では、一つのトンネル３に電極を二つ設けたので、トンネル３内でのインピーダンスやインダクタンスの変異をとらえやすくなっている。各電極はそれぞれ配線６で端子５に結合しており、独立にあるいは対として電気的計測ができるようになっている。たとえば、神経細胞が軸索を伸ばし隣の細胞とカップリングするとき、片方の細胞と隣接した電極５の電位を他の電極を基準電位として、計測するといった使い方ができる。

また、実施例２では、トンネル３を追加的に掘ることができるから、研究の状況を見ながら、トンネル構成を変えた細胞の活動状況を評価することができる。

（実施例３）
図５は、最も実用上重要である複数の細胞培養区画２を１次元アレーとして複数隣接させた実施例３を示す平面図である。図５と図３とを対比して明らかなように、実施例３では、アガロースゲル１００を用いた細胞培養区画２とこれらを繋ぐトンネル３が横方向に形成されているだけで、他は実施例２と同じである。実施例３でも、細胞培養区画２をつなぐトンネル３は最初から形成されている必要は必ずしもなく、たとえば、神経細胞が軸索を延ばしたい方向のみを軸索が形成されるときにあわせて開通させることができる。電極４は各トンネル或いは将来トンネルを作成するであろう位置に全てあらかじめ作成しておく。

実施例３の断面図は、実施例２と同様であるから、省略する。

（その他）
上述の実施例は、いずれも、完成された細胞培養マイクロアレーとして説明した。しかし、細胞培養マイクロアレーは、これを使用する研究者等が細胞等を細胞培養区画２に入れることが必要である。したがって、実施例１で見れば、電極４、外部端子５、配線６、細胞培養区画２および溝３を形成した基板１と、半透膜９および上部ハウジング２２を細胞培養マイクロアレーキットとして供給され、これを購入した研究者等が培養液を準備し、細胞等を細胞培養区画２に入れ、半透膜９および上部ハウジング２２を重ねて、完成させて使用することにするのが実用的である。実施例２，３でも、同様に、基板１上に、電極等、細胞培養区画２および必要なトンネルを形成したアガロースゲルを配した基板１と、半透膜９および上部ハウジング２２を細胞培養マイクロアレーキットとして供給され、これを研究目的に合わせて、使用することにするのが実用的である。

実施例１に係る本発明の電極付細胞培養マイクロアレーの構造の１例を模式的に示した上面図。 図１のＡ−Ａ位置において矢印方向に見た断面図。 本発明の実施例２の平面図。 図３のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図。 最も実用上重要である複数の細胞培養区画２を１次元アレーとして複数隣接させた実施例３を示す平面図。

符号の説明

１…基板、１−１…壁、２…細胞培養区画、３…溝、４…電位測定用の電極、５…外部端子、６…配線、９…半透膜、１０…樹脂層、１４…共通電極、２１…培養液槽、２２…上部ハウジング、２２−１…上部ハウジングの立下り部、２３…開口部、１００…アガロースゲル、１４１…レーザー、１４２…レーザービーム、１４３…エキスパンダー、１４４…フィルター、１４５…蒸着フィルター、１４６…集光レンズ、１６０−１…赤外カメラ、１６０−２…ＣＣＤカメラ、１６１…演算装置、１６３…動力伝達装置、１６４…ステージ、１７０…光源。

Claims (9)

1. 基板と、
   前記基板上に、
   細胞を1細胞ずつ保持できる複数の微小区画と、
   隣接する前記微小区画間を連絡する溝またはトンネルと、
   前記微小区画内に保持された細胞の電位変化を測定するための、前記溝またはトンネル内に設けられた電極とを備える、細胞培養マイクロアレー。
2. 基板と、
   前記基板上に、
   複数の細胞を特定の空間配置に規定するための複数の区画であって、前記各区画に実質１個ずつの細胞が保持される複数の区画と、
   隣接する前記区画間を連絡する溝またはトンネルと、
   前記溝またはトンネル内に設けられた、前記細胞の電位変化を計測するための複数の電極と、
   前記複数の区画の上に配置された、光学的に透明な半透膜および培養液槽とを備える、神経細胞培養マイクロチャンバー。
3. 基板と、
   前記基板上に、
   アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層と、
   前記アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層内に形成された、複数の細胞を特定の空間配置に規定するための複数の区画であって、前記各区画に実質１個ずつの細胞が保持される複数の区画と、
   前記アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層内に形成された隣接する前記区画間をつなぐトンネルと、
   前記トンネル内に設けられた、前記区画内に保持された前記細胞の電位変化を測定するための電極とを備える、
   細胞培養マイクロアレー。
4. 基板と
   前記基板上に、
   アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層と、
   前記アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層内に形成された、複数の細胞を特定の空間配置に規定するための複数の区画であって、前記各区画に実質1個ずつの細胞が保持される複数の区画と、
   前記アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層内に形成された、隣接する前記複数の区画間を連絡するトンネルと、
   前記微小区画内に保持された細胞の電位変化を測定するための、前記各トンネル内に配された１個以上の電極とを備える、細胞培養マイクロアレー。
5. アガロース上面に任意に溶液を替えることの出来る培養液槽を配した請求項３または４記載の細胞培養マイクロアレー。
6. 基板と、
   前記基板上に、
   アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層と、
   前記アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層内に形成された、複数の細胞を特定の空間配置に規定するための複数の区画と、
   前記複数の区画間に設けられた電極と、を備える細胞培養マイクロアレーを用いて、
   各前記区画に実質1個ずつの細胞を保持させ、
   各前記細胞が軸索などを延ばし細胞間のインタラクションを確保する方向を任意に規定すべく収束光で前記アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層を局所加熱して隣接する前記複数の区画間にトンネルを形成して前記区画を連結し、
   各前記トンネルに配置された前記電極を用いて前記細胞間のインタラクションに起因する電位変化を計測する、電気的細胞計測法。
7. 基板と、
   前記基板上に、
   アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層と、
   前記アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層内に形成された、複数の細胞を特定の空間配置に規定するための複数の区画と、
   前記複数の区画間に設けられた電極と、を備える細胞培養マイクロアレーを用いて、
   各前記区画に実質1個ずつの細胞を保持させ、
   各前記細胞が軸索などを延ばし細胞間のインタラクションを確保する方向を任意に規定すべく収束光で前記アガロースまたはアガロース誘導体のゲル層を局所加熱して隣接する前記複数の区画間にトンネルを形成して前記区画を連結し、
   各前記トンネルに配置された電極を用いて前記細胞間に電気的刺激を与え、前記細胞が応答する電位変化を計測する、電気的細胞計測法。
8. ペプチドやアミノ酸などの生体物質ないし、内分泌かく乱物質や毒性を疑われる化学物質を添加し、前記細胞の応答を電位変化で測定する請求項６または７記載の電気的細胞計測法。
9. 基板と、
   前記基板上に、
   樹脂層またはアガロースゲル層と、
   前記樹脂層またはアガロースゲル層内に形成された、複数の細胞を特定の空間配置に規定するための複数の区画と、
   前記樹脂層またはアガロースゲル層内に形成された、隣接する前記複数の区画間を結ぶ溝またはトンネルと、
   各前記トンネル内に設けられた、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンと、
   前記区画の上に配置された、光学的に透明な半透膜および培養液槽と、を備える神経細胞培養マイクロチャンバーを使用して、
   各前記区画に実質１個ずつの細胞を保持させ、
   各前記溝またはトンネル内に配置する前記電極を用いて前記細胞間に電気的刺激を与え、前記細胞が応答する電位変化を計測する、電気的細胞計測法。

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